专利名称：：Dna构建体的制作方法
技术领域：
：本发明是关于DNA构建体，以及掺入这种构建体的植物。具体而言，是关于启动子序列以及它们在使植物具有杀虫活性的基因表达中的应用。植物生物技术的进展已导致产生了能防御被昆虫幼虫吞食的转基因植物。许多生物机体能产生对昆虫有害的蛋白质，其中如Bacillusthuringiensis(苏云金芽孢杆菌)能产生一种晶体缔合的蛋白质δ内毒素，能杀死摄食它的昆虫幼虫。但是，它对哺乳动物无毒性。因此是一种非常有用的农业杀虫剂。已发现许多苏云金芽孢杆菌品系都具有防御害虫的活性，并且对编码这种杀昆虫内毒素的基因进行了特征描述。苏云金芽孢杆菌菌δ内毒素包括特异性杀鳞翅目幼虫的内毒素(如CryI型蛋白)，特异性杀鞘翅目幼虫的内毒素(如CryIII型蛋白)，以及对鳞翅目和鞘翅目幼虫都有杀虫作用的双重特异性内毒素(如CryV型蛋白)。为了改善内毒素在某些方面的特性，例如加快杀虫的速度，还设计了至少含有部分苏云金芽孢杆菌菌内毒素的嵌合蛋白质。还产生了表达编码这种杀虫内毒素基因的转基因植物。杀死昆虫的另一些方法包括，刺激植物产生杀虫代谢产物的代谢途径。我们设计了一种系统，其中编码杀虫活性蛋白质如苏云金芽孢杆菌菌内毒素的基因，将依赖于应用特异性激活化学物质，以可诱导的方式进行表达。或者是，可达到对产生杀虫代谢产物途径的诱导。这种方法具有包括如下的许多优点1.植物对昆虫抗性基因如苏云金芽孢杆菌菌内毒素基因的组成型表达，将导致大大增强对抗性昆虫种类的选择性压力。对昆虫抗性基因的可诱导性调控，将减少发生抗性害虫的风险。例如，可以只在生长季节中需要保护的时刻诱导杀虫基因表达。此外，可开关控制的对昆虫耐受性，可被用作害虫综合控制系统的一部分，其中用于诱导杀虫基因表达的化学处理，可以用标准的杀虫剂处理交替进行。2.由于存在强组成型启动子过度表达的危险，这种表达可能对植物产生有害的影响，导致异常的萌发开花或产量损失。诱导性表达将减少这种有害影响的危险性，因为可使该转基因避开发育敏感期在短时间内表达。3.可将这种开关控制性化学物质加入到标准的杀虫剂制剂中，以便既有化学物质的作用，又有基因的作用，因而通过二个独立的机制杀灭昆虫。我们已发展了一个以来自构巢曲霉(Aspergillusnidulans)菌的alcR调节蛋白为基础的可诱导性基因调控系统(基因转换开关)，这种调节蛋白可在某些醇和酮的存在下，激活基因从alcA启动子开始的表达。在我们的专利InternationalPatentPublicationNo.WO93/21334中，对此系统已作了描述，在此引入作为参考。对来自真菌构巢曲霉的AlcA/alcR基因激活系统也进行了充分的特征描述。在构巢曲霉菌中的乙醇利用途径，是负责降解醇和醛的。已发现有3个基因包含在乙醇利用途径中。并发现基因alcA和alcR紧靠在一起，位于连锁群VII上，而aldA排列在连锁群VIII中(PatemanJHetal，1984，Proc.Soc.Lond.，B217243-264；Sealy-LewisHMandLockingtonRA，1984，Curr.Genet.8253-259)。在A.nidulans菌中，基因alcA编码ADHI，而aldA编码AldDH，此第二个酶负责乙醇的利用。借助于转录激活子alcR，乙醇和其它许多诱导物可诱导alcA和aldA的表达(CreaserEHetal，1984，BiochemicalJ.，255449-454)。alcR基因和一个共诱导物负责alcA和aldA的表达，因为alcR中的许多突变和缺失会导致ADHI和aldDH丧失多效性(FelenbokBetal，1988，Gene，73385-396；Patemanetal，1984，Sealy-Lewis&Lockington，1984)。ALCR蛋白通过与alcA启动子中的3个特异性位点相结合来激活alcA表达(KulmbergPetal，1992，J.Biol.Chem，26721146-21153)。alcR基因已被克隆(LockingtonRAetal，1985，Gene，33137-149)和测序(Felenboketal，1988)。alcR基因的表达是可诱导的，自动调节的，并且受制于由CREA阻遏物介导的葡萄糖的阻遏作用(BaileyCandArstHN，1975，Eur.J.Biochem.51573-577；LockingtonRAetal，1987，Mol.Microbiology，1275-281；DowzerCEAandKellyJM，1989，Curr.Genet.15457-459；DowzerCEAandKellyJM，1991，Mol.Cell.Biol.115701-5709)。ALCR调节蛋白在其N未端附近含有6个半胱氨酸，并列在锌双核原子簇(zincbinuclearcluster)中(KulmbergPetal，1991，FEBSLetts.，28011-16)。此原子簇与在其它子囊菌类的转录因子中发现的高度保守DNA结合功能区有关。已发现转录因子GAL4和LAC9具有双核复合物，此复合物具有包含2个Zn(II)原子的三叶草式结构(PanTandColemanJE，1990，Biochemistry，293023-3029；HalvorsenYDCetal，1990，J.Biol.Chem，26513283-13289)。ALCK的结构除了在Cys-3和Cys-4之间存在16个残基的不对称环之外，其余部分与这种型式的结构相类似。ALCR通过在其启动子区与2个特异性位点相结合，对其自身的表达有正向激活作用(KulmbergPetal，1992，Mol.Cell.Biol.，121932-1939)。对此三个基因alcR，alcA和aldA，涉及乙醇利用途径的调节是发生在转录水平(Lockingtonetal，1987；GwynneDetal，1987，Gene，51205-216；Pickettetal，1987，Gene，51217-226)。在构巢曲霉菌中还存在另外2个醇脱氢酶。ADHII存在于生长在非诱导性培养基内的菌丝体中，并且，乙醇之存在对其有阻遏作用。ADHII是由alcB编码，并且也是在alcR的控制之下(Sealy-Lewis&Lockington，1984)。通过与S.cerevisiae(啤酒酵母)菌adh-株的互补作用，还克隆产生了第三个醇脱氢酶。此基因alcC排列在连锁群VII中，但不与alcA和aleR相连接。基因alcC编码ADHIII，对乙醇的利用非常微弱(McKnightGLetal，1985，EMBOJ.，42094-2099)。已发现在厌氧应激过程残存的构巢曲霉菌中含有ADHIII。葡萄糖存在并不阻遏alcC的表达，暗示它可能不受alcR的控制(RolandLJandStromerJN，1986，Mol.Cell.Biol.63368-3372)。总之，只有在存在各种醇和酮的情况下生长时，构巢曲霉菌才能表达由基因alcA编码的醇脱氢酶I(ADHI)。这种诱导作用是通过一种由alcR基因编码的组成型表达的调节蛋白所介导的。在诱导物(醇或酮)存在的情况下，此调节蛋白能激活alcA基因的表达。存在诱导物时，此调节蛋白还能刺激表达其本身。这意味着，在诱导条件下(即，有醇或酮存在时)产生了高水平的ADHI酶，相反地，不存在诱导物时，则不能表达alcA基因和它的产物ADHI。在葡萄糖存在的情况下，alcA的表达和此酶的产生也受到了阻遏。因此，alcA基因启动子，是一种在诱导物存在下由alcR调节蛋白激活的(即由该蛋白/醇，或该蛋白/酮的组合物激活的)可诱导性启动子。alcR和alcA基因(包括各自的启动子)都已被克隆和测序(LockingtonRAetal，1985.Gene，33137-149；FelenbokBetal.1988，Gene，73385-396；Gwynneetal，1987，Gene，51205-216)。已经对某几种植物的醇脱氢酶(adh)基因进行了研究。在玉米和其它一些谷类植物中，它们可被厌氧条件打开(switchon)。来自玉米的adh基因启动子区，包含有一段在厌氧条件下表达所必需的300bp的调节元件。但是，在任何植物均未发现相当于alcR调节蛋白的结构成分。因此，对植物中alcR/alcA类型的基因调节系统尚不知道。植物细胞中alcR的组成型表达并不导致激活内源性adh的活性。据本发明的第一方面，是提供了一种可化学诱导的植物基因表达盒，它包含有与来源于aleR基因的，并编码调节蛋白的调节序列有效连接的第一启动子，此基因表达盒还包含有与一个靶基因有效连接的可诱导性启动子，此靶基因能编码一种杀昆虫的蛋白质，或者其表达能诱发形成产生杀昆虫代射产物的代射途径，这种可诱导性启动子是在有效的外源性诱导物存在下，由调节蛋白激活的，借助使用诱导物可导致该靶基因表达。当该靶基因编码一种杀昆虫蛋白质时，便利的情况是此蛋白质是口服有活性的。口服有活性的杀虫蛋白质的实例是苏云金芽孢杆菌菌δ内毒素，因此，该靶基因至少能编码苏云金芽孢杆菌菌δ内毒素的一部分。根据至少如下的理由，我们发现alcA/alcR控制开关特别适合用于驱动编码苏云金芽孢杆菌菌内毒素的基因。alcA/alcR控制开关已被发展用于驱动高水平的基因表达。此外，以调节蛋白的alcR基因优选地驱动强组成型启动子如聚遍在蛋白基因。这样可以得到高水平的诱导性转基表达，与来自强组成型启动子如35CaMV的表达水平相类似。图1显示施用诱导性化学物之后，标志基因表达(CAT)的时间进程。此项研究表明，在对叶片施用诱导性化学物之后，CAT表达迅速增加(2小时)。诱导作用的立即早期动力学导致以组成型方式对调节蛋白进行表达，因此，在进行合成转录因子时，没有出现任何时间滞后。此外，我们还选择了一个不依赖于复杂的信号转导系统的，简单的二成分系统。我们以用于农艺学实践的一系列溶剂，对alcA/alcR系统的特异性进行了测定。通过水培籽苗系统显示，乙醇，丁-2-醇和环己酮都能引起高水平的诱导性报告基因表达(图2)。与此相反，当以表1中列举的，用于农艺实践的各种醇和酮作叶片喷洒施用时，只有乙醇能引起高水平的诱导性报告基因溶性(图3)。这很重要，因为偶然暴露于配制的溶剂不会引起不正常的转基因诱导作用。乙醇不是农业化学配方的常用成分，因此，可以把用以在田间作适当喷洒处理的乙醇认为是alcA/alcR基因控制开关的特异性诱导物。表11.异丁基甲基酮13.丙酮基丙酮2.葑酮14.JF5969(环己酮)3.2-庚酮15.N-甲基吡咯烷酮4.二-异丁基酮16.聚乙二醇5.5-甲基-2-己酮17.丙二醇6.5-甲基戊-2，4-二醇18.苯乙酮7.乙基甲基酮19.JF4400(甲基环己酮)8.2-戊酮20.丙-2-醇9.甘油21.丁-2-醇10.γ-丁内酯22.丙酮11.双丙酮醇23.乙醇12.四氢化糖基醇24.dH2O各种生物和非生物的应激状态，如病原体感染，热，冷，干旱，创伤，水淹等都不能诱导alcA/alcR控制开关。此外，各种非溶剂化学品处理，如水杨酸，乙烯，脱落酸，植物生长素，赤霉酸，以及各种农业化学品，都不能诱导alcA/alcR控制开关。本发明不局限于任何具体的内毒素，并且也很适合于嵌合内毒素。第一启动子可能是组成型的，或者是组织特异性的，按发育编程的，或者甚至是可诱导性的。调节序列alcR基因可从构巢曲霉菌得到，它编码alcR调节蛋白。可诱导性启动子优选的是从构巢曲霉菌得到的alcA基因启动子，或者是一个嵌合启动子，即由alcA启动子的调节序列和来自在植物细胞中起作用的基因启动子(包括任何植物的基因启动子)的核心启动子区产生的嵌合体。当施用醇或酮诱导物时，alcA启动子或相关的“嵌合”启动子可被alcR调节蛋白激活。可诱导性启动子还可能由来自构巢曲霉菌的aldA基因启动子，alcB基因启动子，或alcC基因启动子产生。诱导物可以是任何一个有效的化学品(如醇或酮)。适合用于alcA/alcR衍生盒的化学品，包括由Creaseretal(1984，BiochemJ.225，449-454)列举的那些化学品，例如丁-2-酮(乙基甲基酮)，环己酮，丙酮，丁-2-醇，3-氧丁酸，丙-2-醇，乙醇。该基因表达盒对施用的外源性化学诱导物是敏感的，此化学诱导物能够从外部激活由该表达盒调节的靶基因的表达。该表达盒是高度稳定可调的，适合在植物中普遍应用。表达盒的两部分可能在同一构建物上，或者在不同的构建物上。第一部分包括被亚克隆进入一个表达载体的调节cDNA或基因序列，此表达载体带有驱动其表达的有效的植物启动子。第二部分至少含有控制其下游靶基因表达的可诱导性启动子的一部分。在适当的诱导物存在下，由表达盒第一部分产生的调节蛋白，将通过刺激表达盒第二部分中的可诱导性启动子而激活靶基因的表达。在实践中含有本发明表达盒的构建物可通过转化作用被插入进植物中。然后，通过对植物施用一种化学诱导物，在本发明的化学可开关性启动子控制之下，可激活构建物中靶基因的表达。任何适合于靶植物或靶植物细胞的转化方法都可以采用，包括用含有重组下质粒的根瘤土壤杆菌(Agrobacterinmtumefaciens)感染，电穿孔法，对细胞的原生质体的显微注射，微投射体转化，以及花粉管转化。然后，可在适当的情况下使转化的细胞再生成为完整的植株，其中，新的核物质已被稳定地掺入进染色体组中。以这种方法，既可得到转化的单子叶植物，也可得到转化的双子叶植物。可产生的基因修饰植物的实例包括田间作物，谷类植物，水果和蔬菜等，例如canola，向日葵，烟草，甜菜，棉花，大豆，玉米，小麦，小麦，水稻，，高粱，蕃茄，芒果树，桃树，苹果树，梨树，草莓，香蕉，瓜，马铃薯，胡萝卜，莴苣，甘兰，洋葱。本发明进一步提供了含有本发明基因表达盒的植物细胞。通过转化作用，可将此基因表达盒稳定地掺入植物的基因组。本发明还提供了含有这种细胞的植物组织或植株，以及由它们产生的植物或种子。本发明还进一步提供了一种用于控制植物基因表达的方法，此方法包括以一种可化学诱导的植物基因表达盒转化植物细胞，此基因表达盒含有与来源于alcR基因的，并编码调节蛋白的调节序列有效连接的第一启动子，此基因表达盒还含有与一个靶基因有效连接的可诱导性启动子，此靶基因能编码苏云金芽孢杆菌菌δ内毒素，这种可诱导性启动子是在有效的外源性诱导物存在下，由调节蛋白激活的，在此使用诱导物可导致该靶基因表达。下面将借助于如下非限制性的实施例和附图，对本发明的多种优点和优选实施方案进行描述，其中图1是显示以7.5％乙醇诱导AR10分离群的时间进程直框图；图2是显示，在由根部浸润培育的AR10-30纯合系中，各种化学品诱导CAT活性的直框图。图3也是显示，在由根部浸润培育的AR10-30纯合系中，各种化学品诱导CAT活性的直框图。图4显示35S调节基因构建体的产生过程；图5显示报告构建体的产生过程；图6图解显示可开关控制的昆虫抗性载体；图7图解显示优化Cryla(c)基因的序列；图8显示优化Cryla(c)基因中的限制酶切位点；图9图解显示CryV基因的序列；图10显示含有CryV基因的载体5129bps；图11图解显示载体pMJB1的序列；以及图12是载体pJRI；的基因排列图。实施例1产生alcR调节构建体。alcR基因组DNA序列已被公开发表，可以分离出alcRcDNA样品。将alcRcDNA克隆进入表达载体pJR1(pUC)。pJR1中包含有烟草花叶病毒的35S启动子。此启动子是组成型植物启动子，将连续不断地表达调节蛋白。nos聚腺苷酸化信号被用于此表达载体中。图4说明，通过将alcRcDNA连接进入pJR1，产生35S调节构建体的过程。先用BamHI对alcRcDNA克隆作部分限制性酶切，随后进行琼脂糖凝胶电泳，切取并纯化出2.6Kb的片段。然后将此片段连接进入pJR1载体，此载体己用BamHI作了限制性酶切，并用磷酸酶处理，防止其重新环化。这样，就使alcR基因置于此“35S-alcR”构建体中的CaMV35启动子的nos3′聚腺苷酸化信号的控制之下。实施例2产生含有嵌合启动子的alcA-CAT报告构建体。质粒pCaMVCN在其35S启动子和nos转录终止子之间，含有细菌氯霉素转移酶(CAT)报告基因(“35S-CAT”构建体)。将alcA启动子亚克隆进入载体pCaMVCN中，产生“alcA-CAT”构建体。使alcA启动子部分与35S启动子部分融合，产生了一个能使基因表达在其控制之下的嵌合启动子。图5说明此报告构建体的产生过程。alcA启动子和35S启动子都具有相同的TATA盒，可用于借助重组PCR技术将这二个启动子连接在一起将来自alcA启动子的246bp区和来自pCaMVCN的CAT基因5′端(含有35S启动子的-70核心区部分)分别进行扩增，然后应用PCR技术将它们剪接在一起。再将此重组片段用BamHI和HindIII作限制性酶切消化。用BamHI和HimdIII对pCaMVCN载体进行部分消化，然后进行电泳，以便分离出所需的片段，并能够与该重组片段连接。将此连接混合物转化进入E.Coli，并在丰富琼脂培养基上进行平板接种。通过对生成的菌落进行小制备，分离出质粒DNA，并通过大小分级电泳和限制性酶切定位，回收重组体克隆。并对连接接合点进行测序，以便检查是否收到正确的重组体。实施例3基因构建体我们已产生了简明归纳在图6中的如下构建体载体1包含有与烟草花叶病病毒ω-序列翻译增强子(TMV)，苏云金芽孢杆菌CryIA(c)基因，以及胭脂碱合酶(nos)终止子融合的增强的35SCaMV启动子。载体2除了以苏云金芽孢杆菌菌CryV基因代替苏云金芽孢杆菌菌CryIA(c)基因之外，其余与载体1相同。载体3包含有来自构巢曲霉菌的alcR调节蛋白基因，该基因为35SCaMV启动子驱动，还含有alcA启动子区，TMV增强了，CryIA(c)，以及nos终止子。载体4除了以CryV基因代替CryIA(c)基因之外，其余与载体3相同。CryIA(c)基因是一个编码苏云金芽孢杆菌内毒素的最佳的鳞翅目昆虫特异性合成序列，图例说明显示在图7和图8中。此序列是从密执安州立大学PamelaGreen′s实验室得到。CryV基因是一种新颖的杀鞘翅目和鳞翅目幼虫的苏云金芽孢杆菌内毒素基因，已在我们的专利InternationalPatentPubilcationNoWO90/13651中描述了。CryV基因是一个经修饰的合成序列，已按植物中的密码子使用进行了优化，并已删除了RNA不稳定性区。图例说明显示在图9和图10中。实施例4载体制备载体1-组成型CryIA(c)为了扩增pMJB1中的TMVω-序列(见图9)，设计了PCR引物并且加入与XhoI位点邻接的SalI位点(见正向寡核苷酸)，并在反向寡核苷酸中破坏NcoI位点，加入SalI和BglII位点。正向寡核苷酸(SEQIDNO1)5′CTACTCGAGTCGACTATTTTTACAACAATTACCAAC3′XhoI反向寡核苷酸(SEQIDNO2)5′CTAGGTACCGTCGACGGATCCGTAAGATCTGGTGTAATTGTAAATAGTAATTG3′KpnISalIBamHIBglIIPCR反应是通过用pMJB1质粒DNA作模板，以正向和反向引物来实现。将生成的PCR产物克隆进入pTAg载体(用LigATor试剂盒，R&D系统)，然后通过用Asp718和XhoI消化使之释放出，并克隆进入XhoI/Asp718消化的pMBI(图10)，形成pMJB3。pMJB1是以pIBT211为基础构建的，并以胭脂碱合酶加Poly(A)信号(nos)为终止，含有带重复增强子的CaMV35启动子，而此重复增强子是连接于代替烟草蚀剂病毒5′非翻译前导的烟草花叶病毒翻译增强子序列。把CryIA(c)合成基因切割成BgIIIBamHI片段，并克隆进入pMJB3。用HindIII和ECORI将含有增强的35CaMV启动子，TMVω-序列，CryIA(c)，以及nos终止子的片段分离，再将此形成的片段连接进入以EcoRI/HindIII切开的pJRIi(图12)，产生了以植物转化载体为基础的Bin19。载体2-组成型CryV用HindIII将pMJB3切开，插入一个HindIII-EcoRI-HindIII接头。然后将此形成的载体用BamHI切开，再插入一个含有作为BamHI片段的CryV基因的片段。借助于限制性酶切及测序组合技术将CryV基因定位，并进行测序。将来自所形成载体，并含有增强的35CaMV启动子，TMVW-序列，CryV基因，以及nos终止子的EcoRI片段。转移至JRIRiMCS，这是一个以含有pUC18多克隆位点的载体为基础的Bin19。载体3-可诱导性CryIA(c)以SalI将含有CryIA(c)基因的pMJB3切开，释放出一个含有与CryIA(c)基因融合的TMVω-序列的片段。将所得到的片段克隆进入SalI切开的palcACAT，并通过限制性酶切消化进行定位。用HindIII切取一个含有与TMVω-序列CryIA(c)基因，以及nos终止子融合的alcA启动子的片段，并将它转移至HindIII消化的p35SalcRalcAcal，这是一个以含有融合于alcRcDNA的35CaMV启动子的载体为基础的Bin19，并通过HindIII消化，除去了alcAcat报告基因盒。载体4-可诱导性CryV以SalI将含有CryV基因的pMJB3切开，释放出一个含有与CryV基因融合的TMVω-序列的片段。将所得到的片段克隆进入SalIpalcACAT，并通过限制性酶切消化和序列分析进行定位。通过用HindIII消化，释放出含有alcA启动子，CryV基因和nos终止子的二个片段。对此二个HindIII片段进行了三种方式的连接反应，以便将alcACryVnos盒插入以HindIII消化的p35alcRalcAcat以除去alccar盒。通过限制性酶切消化，DNA印迹测定和序列分析，证实了此基因盒的正确装配。实施例5植物转化用土壤杆菌进行叶片段转化按照Bevan1984所述的方法进行转化作用。以生长在MS培养基上的3-4周令烟草(NicotianatabacumcvSamsum)无菌培养物用于转化作用。切去叶片的边缘，并把叶片切成片化。然后把它们放在转化的土壤杆菌细胞(LBA4404株)中，悬浮20分钟，此土壤杆菌细胞含有携带插入片段的pJRlRI质粒。将这些碎片放在含NBM培养基(补充了1mg/L6-苄基氨基嘌呤(6-BAP)，0.1mg/L萘乙酸(NAA)的MS培养基)的培养平皿上。二天之后，将外植体转移至含有补充了羧苄青霉素(500mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的NBA培养基的培养罐中。5周后，将每一叶片的1株小苗转移至补充了羧苄青霉素(200mg/L)和卡那霉素(100mg/L)的NBM培养基上。再2-3周之后，将带根的小苗转移至新鲜的培养基上。如果需要，可从每株幼苗取2段幼段，转移至不同的培养罐中，一份作为组织培养贮备保存，另一份在生根后转移至暖房的土壤中继续生长。应用这种转化方法，将四种载体导入了烟草，并产生了卡那霉素抗性的初级转化体。得到了用组成型CryIA(c)产生的53株初级转化体，54株用组成型CryV产生的，73株用可诱导性CryIA(c)产生的，以及62株用可诱导性CryV产生的。实施例6提取用于PCR反应的叶片DNA从生长在无菌条件下的3-4周植株采取叶片样品。将直径约5mm的叶碎片在200ul提取缓冲液(0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)，250mMNaCl，100mMTris-HCl(三羟甲基)氨基甲烷盐酸化物)。PH8)中研磨30分钟。将此样品以13000rpm的转速离心5分钟，然后，将150μl异丙醇加入到相同体积的此上清液中。将样品在冰浴上放置10分钟，再以13000rpm离心10分钟，并放置至干燥。然将它们再次悬浮在100μl去离子水中。取2.5μl按JepsonetalPlantMolecularBiologyReport9(2)，131-138所述的条件用于PCR反应。为了对含有全长转基因的植物进行鉴定，可通过PCR分析对产生的初级转基因进行测定组成型DryIA(c)对这些提取物用如下引物对进行了二次PCR反应TMV15′CTACTCGAGTCGACTATTTTTACAACAATTACCAAC(SEQIDNO3)CRY1A2R5′CGATGTTGAAGGGCCTGCGGTA(SEQIDNO4)该PCR反应条件是，95℃1.2分钟，62℃1.8分钟，72℃2.5分钟，以及延伸反应72℃6分钟，共35个循环。CRY1A15′GCACCTCATGGACATCCTGAACA(SEQIDNO5)NOS5′CATCGCAAGACCGGCAACAG(SEQIDNO6)该PCR反应条件是，95℃0.8分钟，61℃1.8分钟，72℃2.5分钟，以及延伸反应72℃6分钟，共35个循环。九个初级转化体对二组引物都产生了PCR产物，在暖房内将这些转化体和二个PCR阴性植株栽培在7.5″培养罐的土壤中。组成型CryV对这些提取物用如下引物对进行了二次PCR反应TMV1((见上))CryV1R5′GCTGTAGATGGTCACCTGCTCCA(SEQIDNO7)该PCR反应条件是，94℃0.8分钟，64℃1.8分钟72℃2.5分钟，以及延伸反应72℃6分钟，其35个循环。CRYV15′TGTACACCGACGCCATTGGCA(SEQIDNO8)NOS((见上))该PCR反应条件是，94℃0.8分钟，58℃1.8分钟72℃2.0分钟，以及延伸反应72℃6分钟，其35个循环。24个初级转化体对二组引物都产生了PCR产物，在暖房内将这些转化体和7个PCR阴性植株栽培在7.5″培养罐的土壤中。可诱导性CryIA(c)对这些提取物用如下引物对进行了三次PCR反应ALCR15′GCGGTAAGGCTTTCAACAGGCT(SEQIDNO9)NOS同上该PCR反应条件是，94℃1.0分钟，60℃1.0分钟，72℃1.5分钟，以及延伸反应72℃6分钟，其35个循环。如上所述应用引物对TMV1/CRY1A2R，CRY1Al/Nos。45株植物对全套引物产生了PCR产物，在暖房内，将这些植株和二个PCR阴性植株栽培在6″培养罐的土壤中。可诱导性CryV已经产生了62株初级转化体，目前尚来进行PCR分析。实施例7蛋白质印迹分析取来自生长在无菌条件中的3-4周令植株的叶片120mg，在4℃下，先后在用于吸附酚类化合物的0.06g聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中，以及在0.5ml提取缓冲液(1MTrosHCl，0.5MEDTA(乙二胺-四乙酸盐)，5mMDTT(二硫苏糖醇)，pH7.8)中研磨。然后再加入200ml提取缓冲液。将样品混匀后在4℃下离心15分钟。取出上清液，通过Bradford测定法，用牛血清白蛋白(BSA)作标准品，测定其蛋白质浓度。样品保存在-70℃备用。将加有33％v/vLaemmli染料(97.5％Laemmli缓冲液(62.5mMTrisHCl，10％w/v蔗糖，2％w/vSDS，pH6.8)，1.5％焦宁Y和1％β-巯基乙醇)的蛋白质样品25mg，加热煮沸2分钟后对SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶(17.7％300.174，丙烯酰胺双丙烯酰胺)加样。翻译产物在如下缓冲液中进行电泳分离(14.4％w/v甘氨酸，1％w/vSDS，3％w/vTris碱)。然后，应用电印迹技术(Biorad装置)，40mV，过夜，在如下印迹缓冲液中将它们转移至硝酸纤维素膜(Hybond-CO，Amersham)上(14.4％w/v甘氨酸，3％w/vTris碱，0.2％w/vSDS，20％v/v甲醇)。对蛋白质相等的加样可通过将新鲜印迹的硝酸纤维素滤膜在0.05％CPTS(四磺酸酞菁铜，四钠盐)和12mMHCl中染色来检查。然后通过在12mMHCl溶液中漂洗2-3次使印迹脱色，剩余的染料可通过用0.5MNaHCO3溶液处理5-10分钟，接着用去离子水漂洗来除去。用含有5％w/vBSA的TBS-Tween(2.4％w/vTrisHCl，8％w/vNaCl，5％Tween20(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸盐)，pH7.6)对滤膜封闭处理1小时。然后将它们在加有2％w/vBSA的TBS-Tween中漂洗20分钟，以1∶2000稀释的CryIA(c)或CryV抗血清作第一抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的，1∶1000稀释的兔抗兔血清作第二抗体来进行间接免疫测定。用补充有2％w/vBSA的TBS-Tween洗去任何过剩的抗血清。用Amersham所述的实验方案进行ECL(增强塑化学发光)测定。通过用上述的溶液对膜增加漂洗来消除背景发光。然后进行ECL测定。可用LKB2222-020UltroscanXL激光光密度计(Pharmacia)对苏云金芽孢杆菌菌基因的表达水平进行测定。以氦-氖激光束(波长633nm)，对放射自显影照片上，相应于翻译产物的频带中央部分2.4mm宽度的区域进行扫描。对每个峰以其面积来表征，可通过内存软件从光束位置的光吸收功能曲线来测定。实施例8Northern印迹分析总RNA在含有2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行分级分离。电泳之后，将此RNA通过在20XSSPE中作毛细管点样，转移至Hybond-N膜(Amersham)上。借助组合的紫外UV片层连接装置(Stratagene)使RNA固定在膜上并在80℃烘烤20分钟。对通过以EcoRI消化从pBluescriptSK-切取cDNA探针，用FeinbergandVogelstein所述的随机引物方案，以32PdCTP对此cDNA探针进行标记。在5×SSPE，0.1％SDS，0.1％Marvel(干奶粉)，100mg/ml变性鲑精DNA中，65℃预杂交4小时。杂交是在65℃，在含有标记探针的相同缓冲液中温育12-24小时来完成。将此滤膜在65℃，在3×SSC0.1％SDS中漂洗30分钟，并且，在-80℃放射自显影之前，以0.5×SSC0.1％SDS漂洗一次，30分钟。昆虫喂饲试验通过在有诱导物和没有诱导物(作为对照)存在的二种情况下，对昆虫幼虫喂给含有本发明构建体的转基因植物叶片，可方便地测定本发明的效果。实施例9初级筛选从植株采集叶片，并切成许多1cm2的碎叶片，用于进行初级筛选。将摹本(replica)叶片分别置于0.75％琼脂上，每片以大约10个无菌的Heliothisvirescent虫卵侵染。将这些叶片复盖好，在25℃，70％相对湿度(RH)下孵育5天，然后对幼虫吃食叶片的作用进行记分。对叶片的损失给予以0.5分递增的0至2分的记分范围，2分代表叶片无损失(完全的昆虫吃食保护作用)，0分意指叶片被完全吃掉。从所有的组成型CryIA(c)组织培养初级转化体烟草和野生型烟草采集了叶片，如上所述测定它们对Helithisvirescens幼虫的作用。结果显示在下面的表2中表2</tables></tables>在典型的生物测定实验中，野生型(wt)烟草的平均得分大致小于0.5分。实施例10初级筛选-重复试验用11株暖房中培养的组成型CryIA(c)烟草和1株野型烟草进行了重复试验。此试验是为了证明，在组织培养后，已在暖房条件的土壤中培育了三周的组成型CryIA(c)植株，也显示有减小Heliothisvirescens幼虫对叶片损害的作用。表3</tables>实施例11对CryY初级转化体的初级筛选按上述的方法，对来自组成型CryV初级转化体烟草的叶片和野生型烟草片叶进行了试验。被切割的叶片受到的损失记录在下面的表4中。表4</tables>实施例12第二级筛选为了证实由初级筛选得到的资料，进一步用第三令幼虫在转基因系较大的叶片上进行了第二级测定。从植株上切取烟草叶片，存放在冰上达1小时之后。将它们切成在经40mm的叶片，使表皮面朝下放置在50mm塑料罐中的3％琼脂上。将在25℃以LSU人工饲料喂养了5天后第三令Heliothiszea幼虫称重后侵染每个叶片，每个叶片1只幼虫。侵染后对培养罐加盖，并把它们存放在25℃，散射光照之下。三天之后，对试验按死亡率，发育阶段，和被吃含叶片的百分数来评价。在开始侵染昆虫时和3天之后对叶片称重。表5</tables>实施例13可诱导性杀虫活性对45株可诱导性CryIA(c)PCR阳性系，2株PCR阴性系烟草，以及野生型烟草，在6″培养罐中以100ml5％乙醇浸润其根部。28小时后，取4片摹本小叶片，以Heliothisvirescens虫卵侵染。结果显示在下面(表6)。在有乙醇存在下生长的45株中，66％显示在初级筛选试验中对Heliothisvirescens幼虫有完全的抗性。为了证明这些植株是可诱导性的，而不是组成型表达，8天后从7株高得分的植株采取叶片，以Heliothisvirescens虫卵侵染。从前面来自由35SalcRalcA开关控制启动子驱动的报告基因的资料表明，CAT蛋白质水平在24/48小时达到峰值，48小时之后逐渐下降(图1)。另有资料(未显示出)证明，诱导后第9天不能测定出CAT蛋白质。表7证明，来作乙醇浸润的植株，发现其致命性水平与在野生型对照看到的相当。表6</tables>表7</tables>为了测定诱导作用对昆虫吃食的影响，选取了几株烟草与10株组成型CryIA(c)系上野生型对照烟草一道，进行第二级筛选。在通过用100ml5％乙醇浸润根部诱导后12天从来自初级转化体的每株烟草取10个叶片，置于具盖的50mm培养罐中的3％琼脂上，在25℃，60％湿度下培养过夜。在12天之后预期CryIA(c)仅有低水平的蛋白度表达，或者能测定出。然后对植株以100ml5％乙醇浸润根部。22小时后切取叶片，取10个40mm的叶片置于具盖的50mm培养罐中的3％琼脂上。将5个未诱导的和5个乙醇诱导的叶片以3令Heliothiszea幼虫侵染，另有各5个叶片以如上述饲养的Heliothisvirescens幼虫侵染。表8证明，野生型对照烟草在存在或不存在乙醇的情况下，都显示有被吃食叶片的高百分率，而35S对照在此二种化学状况下都显示有良好的昆虫防治作用。含有AlcCryIA(c)构建体的转基因植株，在不存在乙醇处理下表现出很差的昆虫防治作用。表8显示，用乙醇诱导则产生了可与在35SCryIA(c)对照中看到的作用相似的昆虫防治作用。表8</tables></tables>序列表(1)一般信息(i)申请人(A)姓名ZENECALIMITEO(B)地址15StanhopeGate(C)城市London(D)国家英国(F)邮编W1Y6LN(ii)发明标题DNA构建体(iii)序列数9(iv)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IPM.PC.兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentInRelease#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)以前的申请资料(A)申请号GB9516241.8(B)申请日期1995.8.8(2)SEQ2DNO1的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO1CATCTCGAGTCGACTATTTTTACAACAATTACCAAC36(2)SEQ2DNO2的信息(i)序列特征(A)长度53个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO2CTAGGTACCGTCGACGGATCCGTAAGATCTGGTGTAATTGTAAATAGTAATTG53(2)SEQ2DNO3的信息(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO3CTACTCGAGTCGACTATTTTTACAACAATTACCAAC36(2)SEQ2DNO4的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO4CGATGTTGAAGGGCCTGCGGTA22(2)SEQ2DNO5的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO5GCACCTCATGGACATCCTGAACA23(2)SEQ2DNO6的信息(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO6CATCGCAAGACCGGCAACAG20(2)SEQ2DNO7的信息(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO7GCTGTAGATGGTCACCTGCTCCA23(2)SEQ2DNO8的信息(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO8TGTACACCGACGCCATTGGCA21(2)SEQ2DNO9的信息(i)序列特征(A)长度22个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型DNA(xi)序列描述SEQIDNO9GCGGTAAGGCTTTCAACAGGCT2权利要求1.一种可化学诱导性植物基因表达盒，它包含有与来源于alcR基因的，并编码调节蛋白的调节序列有效连接的第一启动子，它还包含有与一个靶基因有效连接的可诱导性启动子，此靶基因能编一种杀昆虫的蛋白质，或者其表达能诱导形成产生杀昆虫代射产物的代射途径，这种可诱导性启动子是在有效的外源性诱导物存在下，由调节蛋白激活的，借使用诱导物可导致该靶基因表达。2.权利要求1中的化学可诱导性植物基因表达盒，其中的靶基因编码一种口服有活性的杀昆虫蛋白质。3.权利要求2中的化学可诱导性植物基因表达盒，其中口服有活性的杀昆虫蛋白质，至少是苏云金芽孢杆菌δ内毒素的一部分。4.据权利要求1-3中任何之一的植物基因表达盒，其中可诱导性启动子是由alcA基因启动子产生。5.据权利要求1-4中任何之一的植物基因表达盒，其中的可诱导性启动子是一种嵌合启动子。6.一种植物细胞，它含有据上述任何权利要求的植物基因表达盒。7.据权利要求6的植物细胞，其中植物基因表达盒己被稳定地掺入到植物的基因组中。8.一种植物组织，它含有据权利要求6和7中二者之一的植物细胞。9.一种植物，它含有据权利要求6和7中二者之一的植物细胞。10.一种植物，它是由权利要求9的植物产生。11.一种植物种子，它是由权利要求9和10中二者之一的植物产生。12.一种防治昆虫的方法，包括以权利要求1-5中任何之一的植物基因表达盒转化植物细胞。全文摘要一种可化学诱导性植物基因表达盒,它包含有与来源于alcR基因的,并编码调节蛋白的调节序列有效连接的第一启动子,它还包含有与一个靶基因有效连接的可诱导性启动子,此靶基因能编码一种杀昆虫的蛋白质,或者其表达能诱导形成产生杀昆虫代谢产物的代谢途径,这种可诱导性启动子是在有效的外源性诱导物存在下,由调节蛋白激活的,藉使用诱导物可导致该靶基因表达。文档编号A01H5/00GK1199425SQ9619749公开日1998年11月18日申请日期1996年7月29日优先权日1995年8月8日发明者I·耶普森,J·A·M·派内申请人:曾尼卡有限公司