专利名称：新型的l－赖氨酸－诱导型启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子、包含该核酸分子的载体、用该载体转化的宿主细胞和使用L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
背景技术：
棒状细菌(Coryneform bacteria)是生产在动物饲料工业、药品工业、食物工业和类似工业中具有多种应用的化学物质的工业微生物，所述化学物质包含L-赖氨酸、L-苏氨酸和多种核酸。为了通过基因工程或代谢工程从这些棒状细菌中开发高效价菌株，在棒状细菌中涉及几个代谢途径的基因表达应该被有选择地调节。因此，需要对该基因调节有用的启动子序列。
在棒状细菌上一旦发生基因表达，基因通常从它们自己的启动子表达(Vasicova，P.，等，J.Bacteriol.181，6188-6191，(1999)，等等)。然而，不像其它的工业微生物例如大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，没有关于在棒状细菌中负责基因表达的启动子序列的基本结构的信息。因为这个原因，通过以下步骤开发出启动子从与抗生素抗性相关的基因中除去启动子区，抗生素例如氯霉素；引导从棒状细菌分离的并使用适当的限制性内切酶消化的染色体DNA进入启动子位点；使用所形成的DNA分子转化棒状细菌；评估所获得的菌株的抗生素抗性(Eikmanns，B.J.等，Gene，102，93-98(1991)；Patek，M.等，Microbiology，142，1297-1309(1996))。然而，考虑到目标基因的选择性表达和表达效率，先前开发的启动子序列仍然需要进一步改进。
涉及启动子分离的传统方法包括(1)启动子探针载体系统在报道基因上游的基因组DNA片段的随机克隆中的使用，该报道基因仅当克隆的片段中包含启动子活性时才进行表达；(2)基于基因特异性探针的杂交，通过该杂交，基因和它的启动子从基因组文库分离出来；以及(3)诱导性的cDNA探针和非诱导性cDNA探针与基因文库的差示杂交。
近来发展的使用2维(2-D)凝胶电泳的比较蛋白质组分析是鉴别在不同的生理状态下差异表达的蛋白质的技术。基于差异表达的蛋白质，许多研究已被施行以便鉴定能增加蛋白质表达的调节基因。
基于这个背景，本发明人对存在赖氨酸时表达被诱导的蛋白质进行了2-D凝胶电泳，以及通过比较蛋白质组分析检测和鉴别了显示差异表达图式(pattern)的蛋白质。当与鉴定的蛋白质的推定的启动子区相对应的多核苷酸通过PCR扩增并被引入缺少启动子的lacZ基因的上游时，观察到在存在赖氨酸时β-半乳糖苷酶的活性显著增加，从而导致了本发明，其提供能在赖氨酸存在时诱导基因表达的新型启动子核酸分子。
发明内容
因此，本发明的一个目标是提供新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
本发明的另一个目标是提供包含该新型的启动子核酸分子的载体。
本发明的进一步的目标是提供用该载体转化的宿主细胞。
本发明的还有另外一个目标是提供使用新型的启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
附图简述[11]结合附图，通过下面的详细描述，本发明的上述和其它的目标、特征和其它优点将被更清楚的理解，在附图中[12]
图1表示存在和不存在赖氨酸情况下培养的谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)的全细胞裂解产物的2-D凝胶电泳的结果，其中差异表达的蛋白质用箭头表示；以及[13]图2是构建用于监控启动子活性的载体的方法的图示，其中β-半乳糖苷酶被用于检测启动子活性。
实施本发明的最好的方式[14]一方面，本发明涉及新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
具体而言，本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子具有SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列。
依照本发明的启动子核酸分子的核苷酸序列可使用几个近来发展的方法中的任意一个修饰到一定的程度，这些方法例如定向进化或定点诱变。本领域技术人员容易地认识到，经过这种人工修饰具有70％或更高同源性的核苷酸序列衍生自本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列，只要它保持了用于表达靶基因的启动子活性。
因此，本发明的L-赖氨酸诱导型启动子核酸分子包括与上述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-赖氨酸-诱导型启动子的核苷酸序列。
在这里使用的术语“同源性(homology)”意欲指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的核苷酸序列具有优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的DNA序列。同源性的评价可用肉眼或商业上可获得的软件进行。使用商业可获得的计算机程序，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，相邻序列之间的同源性(％)可被评价。
另外，本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子包括选自与上述核苷酸序列互补的核苷酸序列的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
在这里使用的术语“互补的(complementary)”涉及在核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对，例如诸如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物和将被测序或扩增的单链核酸上的引物结合位点之间。
本发明的L-赖氨酸诱导型启动子核酸分子也包括行使与L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子相同活性的功能等价物。包括功能片段在内的功能等价物可包括这样的变体，在该变体上，一个或多个核苷酸碱基通过取代、缺失、插入或其组合进行改变。
本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子源自棒状细菌，并且在原核细胞中，特别在大肠杆菌和棒状细菌中，作为用于基因表达的启动子是有效用的。
在这里使用的术语“启动子(promoter)”涉及RNA聚合酶与之结合以启始基因转录的DNA区域，和在mRNA转录启始位点的5’方向的位置。依照本发明的目的，本发明的启动子指L-赖氨酸-诱导型启动子，在存在外部信号L-赖氨酸时，其足以去指导启动子依赖性的基因表达。
本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子可使用标准的分子生物学技术分离或制备。例如，它可通过使用适当的引物序列的PCR来分离。它也可以通过使用自动DNA合成仪的标准合成技术来制备。
在这里使用的术语“棒状细菌”包括属于棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。这些棒状细菌包括谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032；其它野生型菌株，已知作为棒状杆菌属、特别是种谷氨酸棒状杆菌的适当的菌株、热氨基棒状杆菌(CorynebacteriumThermoaminogene)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067以及乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)ATCC 13869；以及由此制备的产L-氨基酸的突变体或菌株，例如谷氨酸棒状杆菌KFCC 10881和谷氨酸棒状杆菌KFCC 11001。
另一方面，本发明涉及包含新型的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的载体。
在这里使用的术语“载体”涉及包含可操作地连接到适合的控制序列的DNA序列的DNA构建物。这些控制序列可包括指引转录的启动子、控制该转录的某些操纵子序列、在mRNA上编码合适的核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入片段。一旦转化进入合适的宿主，载体可以独立于宿主基因组进行复制和行使功能，或者可以在一些情况下，自身整合入基因组。
这里使用的术语“可操作地连接(operably linked)”指将准备表达的基因以某种方式连接到它的控制序列以被表达。
在施行2-D凝胶电泳之后，本发明人通过比较蛋白质组分析鉴定显示出增加的表达的蛋白质，以及使用报道基因从此类蛋白质搜寻启动子序列。报道基因是通过其表达使得目标启动子的活性能够被很容易地检测的基因。可利用的报道基因包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酸酶、荧光素酶、氯霉素乙酰基转移酶和荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白等等)。
在本发明的详细实践中，为了通过测量从LacZ基因表达的β-半乳糖苷酶的活性来确定本发明的新型启动子核酸分子是否是L-赖氨酸诱导型的，构建重组载体，pLCP。在本发明的另外一个详细实践中，包含本发明的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的pLCP载体在存在250mM L-赖氨酸时，其显示的β-半乳糖苷酶活性是不存在L-赖氨酸的情况下的β-半乳糖苷酶活性的2倍或更多倍。
为了重组产生靶基因，包含L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的本发明载体可操作地连接到编码多种蛋白的任一基因上。使用本发明载体容易表达的靶基因包括但不限定于asd、daβA、dapC、dapF、fbp、lysC和pyc。在这些靶基因中，asd、dapA、lysC和pyc是特别优选地。
在进一步的方面，本发明涉及用载体转化的宿主细胞。
上述包含L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子的载体可操作地连接到编码靶蛋白的基因上以诱导靶蛋白的表达。用这种方式构建的载体被转化进入宿主细胞，例如原核细胞，优选地为大肠杆菌和棒状细菌，更优选地为棒状细菌。
在这里使用的术语“转化(transformation)”指引导DNA以这样的方式进入宿主，即它能作为染色体外的成分复制，或者通过染色体整合进行复制。
如此转化的宿主细胞(转化体)的培养可以按照本领域的普通方法进行。已知的培养方法被Chmiel所描述(Bioprozesstechnik 1.Einfuhrungin die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))；以及被Storhas所描述(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))。
在还有另一方面，本发明涉及诱导靶基因表达的方法，其是以使用L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子为基础的。
本发明的新型L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子能诱导可操作地被连结到其上的靶基因的高水平的表达，因此在靶蛋白的大量生产中是有效用的。
对本发明的更好的理解可以通过下述实施例获得，这些实施例被提出以举例说明本发明，而不是解释为对本发明的限制。
实施例1在谷氨酸棒状杆菌中其表达被L-赖氨酸诱导的蛋白质的筛选和鉴定。
(1)从培养在不同浓度L-赖氨酸中的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032中制备蛋白质样品。
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032被培养在不存在和存在L-赖氨酸(0、250和500mM)的情况下，细胞通过离心获得。用10mM Tris-Hcl缓冲液(pH7.5)洗细胞三遍。
洗过的细胞被重新悬浮在裂解缓冲液中(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基-铵]-1-丙磺酸盐)，0.4％二硫苏糖醇)，在冰上使用超声波仪经超声波处理而破裂，并在4℃下12,000×g离心15分钟。如此获得的细胞裂解产物与最终浓度为700单位/ml的核酸内切酶(Sigma)和1×蛋白酶抑制剂混合物(Roche)混合。蛋白质浓度使用布拉德福(Bradford)方法测定。
(2)通过2-D凝胶电泳的蛋白质分离。
每一个得到的蛋白样品中的500μg与溶解缓冲液(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS(3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基-铵]-1-丙磺酸盐)，0.4％二硫苏糖醇，1％溴酚蓝)混合得到最终体积500μl，然后在4℃下20,000×g离心15分钟。上清液与0.5％固定化电介质(immobiline)pH梯度(IPG)缓冲液(pH4.5-5.5载体两性电解质，Amersham PharmaciaBiotech)混合。所形成的溶液被装载到IPG干条再水化盘(IPG dry striprehydration tray)上，含pH4.5-5.5线性梯度的18cm IPG干条在再水化盘上与蛋白质样品再水化12小时。
再水化的条在Multiphor II电泳槽(Amersham PharmaciaBiotech)上进行等电聚焦，90kVh。
在第一向等电聚焦完成后，聚焦的IPG条用平衡缓冲液(0.2mM三丁基膦、6M尿素、2％SDS、375mM Tris-HCL、pH8.8、20％甘油和2.5％丙烯酰胺)搅拌下平衡15分钟。
平衡的IPG条用1×SDS-PAGE分离缓冲液(192mM甘氨酸、0.1％SDS、24.8mM Trisma Base)轻微润湿，然后如下进行第二向电泳。
平衡的IPG条被置于8-16％的梯度聚丙烯酰胺凝胶的顶部，并在每凝胶15mA下跑胶16小时来分离蛋白质。
(3)显示增加的表达水平的蛋白质点的检测。
双向凝胶用250ml三重蒸馏水(triple-distilled water)清洗，在固定溶液(40％甲醇、5％磷酸)中温育1小时。凝胶用考马斯亮(Coomassie brilliant)G-250(sigma)染色5个小时，然后在去染色溶液(1％醋酸)中去染色12小时以除去过多的染色。
利用PDQuest软件(Bio-rad)，对用蛋白质样品制备的双向凝胶进行相互比较，所述蛋白质样品是从存在0、250和500mM的L-赖氨酸下培养的细胞中获得的。结果如图1所示。五个表示出增加的表达的蛋白质点被检测到。
实施例2其表达被L-赖氨酸诱导的蛋白质的鉴定(1)从蛋白质点的肽提取[48]在图1中所示的目标蛋白质点从凝胶上切下来，转移到微量离心管。凝胶块三次用120μl在25mM碳酸氢铵(pH7.8)中的50％乙腈去染色15分钟，伴随温和的搅动，并被完全干燥。干燥的凝胶块在37℃下在胰蛋白酶消化液(25mM碳酸氢铵，pH7.8，0.015μg/μl胰蛋白酶)中温育16个小时，以消化凝胶中的蛋白质。在凝胶内胰蛋白酶消化完成以后，消化的凝胶块用8μl肽提取液(50％乙腈和0.5％三氟乙酸的混合物)覆盖，并且被超声处理10分钟以从凝胶中提取肽。然后，凝胶块被离心，回收包含从凝胶中释放的肽的上清液并使用冷冻干燥器浓缩到大约5μl的体积。
(2)通过质谱法的蛋白质鉴定[49]1μl的每个浓缩样品与1μl的基质溶液(10mg/ml α-氰基-4-羟基肉桂酸、0.5％三氟乙酸和50％乙腈)混合，然后被装载到用于基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱的采样板上，并被干燥以结晶。结晶肽的质量用MALDI-TOF质谱分析。为了蛋白质的鉴定，测量的肽质量被用于搜寻美国国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/nr.Z)的蛋白质数据库和其它来源，这使用MS-Fit软件(http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.4/msfit.htm)或者Profound软件(http://prowl.rockefeller.edu/cgi-bin/ProFound)进行。结果被列在下面的表1里。如表1所示，五个蛋白质点被鉴定为Cgl1910编码点a、Cgl2134编码点b、Cgl2754编码点c、Cgl2818编码点d以及Cgl3209编码点e。
表1[50]存在赖氨酸情况下显示增加的表达水平的蛋白
实施例3包含启动子序列的重组载体的构建(1) 对应于推定的启动子区的DNA片段的扩增[51]谷氨酸棒状杆菌基因组基因的核苷酸序列已经完全被测定并广为人知了。列于表1中的蛋白质的遗传信息(Cgl1910、Cgl2134、Cgl2754、Cgl2818和Cgl3209)可从NIH GenBank数据库中得到。为了扩增位于每个蛋白质ORF上游的推定的启动子区(SEQ ID No.1Cgl1910的启动子区；SEQ ID No.2Cgl2134的启动子区；SEQ ID No.3Cgl2754的启动子区；SEQ ID No.4Cgl2818的启动子区；SEQ IDNo.5Cgl3029的启动子区)，如下面表2所示，基于报道的核苷酸序列设计引物以包含BamHI位点，并将其合成。为了扩增五个启动子区，用谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的染色体DNA作为模板与合成的引物一起进行PCR[Sambrook等，Molecular Cloning，a Laboratory Manual(1989)，Cold Spring Harbor Laboratories]。PCR的条件包括25个循环在94℃下变性1分钟，在58℃下退火1分钟以及在68℃下聚合30秒。
表2
(2)用于检测启动子活性的载体的构建[52]图2示意性的说明了构建检测每一个推定的启动子活性的重组载体的方法。
在实施例3的(1)中扩增的DNA片段被分别地克隆到包含LacZ基因的pRS415的BamHI位点(Simons，R.W.等，Gene，53，85-96(1987))。每一个重组载体用HindIII和XbaI消化，以便在插入的推定启动子之前和LacZ基因的后面都进行切割，并在琼脂糖凝胶上电泳。每一个DNA片段被从凝胶上切除，并用凝胶提取试剂盒(Gel ExtractionKit(Qiagen))进行纯化。
纯化的DNA片段被插入pXMJ19载体(Jakoby，M.J.，等，Biotechniques，13，437-441(1999))，因此产生了检测启动子活性的载体pLCP-1910、pLCP-2134、pLCP-2754、pLCP-2818和pLCP-3029。通过LacZ基因产物β-半乳糖苷酶活性的测量，这些载体可进行推定的启动子活性的检测。
如此获得的重组载体依照Van der Rest等(Appl.Microbiol.Biotechnol.52，541-545，(1999))描述的方法被引入到谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的感受态细胞。转化的细胞被涂在补充以17mg/ml氯霉素的LB琼脂平板(0.5％酵母提取物、1％Nacl、1％胰化蛋白胨和1.5％琼脂)上，在30℃下培养以选择生长的菌落。
实施例4谷氨酸棒状杆菌中启动子序列活性的测量(1)在存在和不存在250mM赖氨酸的情况下，启动子序列活性的测量[56]转化的菌落被培养以分析启动子序列的活性，如下。
每一个转化的谷氨酸棒状杆菌的菌落在包含25ml基本培养基(5g葡萄糖、5g硫酸铵、2g尿素、0.5g NaCl、1g KH2PO4、0.5gMgSO4·7H2O、200μg生物素、100μg维生素B1和1ml微量元素溶液，于1升蒸馏水中，pH7.2)的250ml带挡板的瓶中以1∶20的比率接种，该基本培养基可补充或不补充250mM的L-赖氨酸，然后在30℃和200rpm持续摇动的情况下被培育。当培养物达到指数生长期的中期(mid-exponential growth phase)(吸光度为5)时，培养的细胞通过离心收集，悬浮在100mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中，通过超声波处理裂解，然后高速离心。按照Rosenthal的方法(Rosenthal，N.，Methods Enzymol.152，704-720(1987))，使用2μl上清液测量β-半乳糖苷酶的活性。结果是，当赖氨酸存在下培养时，转化的细胞显示β-半乳糖苷酶的活性高于赖氨酸不存在的情况下培养的活性，具体来说对Cgl1910，高2.1倍；对Cgl2134，高2.1倍；对Cgl2754，高2.0倍；对Cgl2818，高3.4倍以及对Cgl3029，高2.7倍(表3)。这些结果表明每一个启动子在存在赖氨酸的情况下诱导了β-半乳糖苷酶的表达。
表3在存在和不存在赖氨酸情况下启动子活性的比较
(2)存在或不存在250mM NaCl时启动子序列活性的测量[58]每一个启动子的活性依照与实施例4的(1)中相同的方法进行测量，除了细胞被培养在存在或不存在NaCl而不是赖氨酸的情况下。结果被列在下面的表4里。如表4所示，在两种培养条件下观察到相似的β-半乳糖苷酶活性，也就是存在和不存在NaCl的条件下。这些结果排除了LacZ基因表达被赖氨酸以外的因素诱导的可能性，因此证明了，每一个启动子以对赖氨酸的特异性反应而诱导基因表达。
表4在存在和不存在NaCl情况下启动子活性的比较
工业适用性[59]像在上文中描述的，本发明提供了对赖氨酸特异性反应的、诱导基因表达的启动子核酸分子，因此本发明对开发高效价细菌菌株十分有用，该菌株能高水平的表达编码目标蛋白的基因。
<110>希杰公司<120>新型的L-赖氨酸-诱导型启动子<160>15<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>578<212>DNA<213>谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)<220>
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<223>用于扩增Cgl2134基因的启动子的引物<400>9taggatcctg aaatcatgcc tttctcg27<210>10<211>26<212>DNA<213>人工序列
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<223>用于扩增Cgl2754基因的启动子的引物<400>10taggatccat ttcagcctga accttc 26<210>11<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Cgl2754基因的启动子的引物<400>11caggatccat aaagttcgat tccttaaa28<210>12<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Cgl2818基因的启动子的引物<400>12acggatcctg cttaatttcc tcggca 26<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Cgl2818基因的启动子的引物<400>13atggatccgt gtttgaagtt gccttt 26<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Cgl3029基因的启动子的引物<400>14aaggatccat ggctgcgcat actgttg 27<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增Cgl3029基因的启动子的引物<400>15atggatccgg ggcacctacc gaggaa 2权利要求
1.一种L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子，其选自(a)SEQ ID No.1、2、3、4或5的核苷酸序列；(b)与(a)中所述核苷酸序列具有70％或更高同源性、并且可用作L-赖氨酸-诱导型启动子的核苷酸序列；以及(c)与(a)或(b)中所述核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.一种载体，包含权利要求1所述的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子。
3.一种原核宿主细胞，其用权利要求2所述的载体转化。
4.如权利要求3中所述的原核宿主细胞，其是棒状细菌。
5.一种使用权利要求1所述的L-赖氨酸-诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
全文摘要
公开的是新型的L－赖氨酸－诱导型启动子核酸分子。也公开的是包含该核酸分子的载体、用该载体转化的宿主细胞以及使用该L－赖氨酸－诱导型启动子核酸分子诱导靶基因表达的方法。
文档编号C12N15/31GK101087881SQ200580044917
公开日2007年12月12日 申请日期2005年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者朴英薰, 具贤敏, 文准玉, 金成俊, 金孝珍, 李廷基 申请人:希杰株式会社