专利名称：：结合黑皮质素受体的拟抗体、组合物、方法和用途的制作方法结合黑皮质素受体的拟抗体、组合物、方法和用途发明领域本发明涉及结合黑皮质素受体的拟抗体、编码这些拟抗体的多核普酸、包含所述多核苷酸或者表达所述拟抗体的细胞，和它们的制备和使用方法。
背景技术：
：肥胖症是一种慢性疾病，表现为与身体大小成比例的过量脂肪量.当今，认为每三个美国人就有一个超重(体重指数(BMI)>25kg/m2)，从而促^吏美国疾病控制和预防中心(UnitedStatesCentersforDiseaseControlandPrevention)(CDC)宣布肥胖症正达到该"餘的比例(Cummings和Schwartz,Annu,Rev.Med.54:453-471((2003))。肥胖症是发生诸如2型糖尿病、充血性心力衰竭、骨关节炎和睡眠性呼吸暂停等疾病的潜在病因或者危险因素这一事实强调了治疗肥胖症的重要性。此外，肥胖症与"代谢综合征"有关，代谢综合征是特征为肥胖、致动脉粥样化的血脂异常、血压升高和胰岛素抗性的一种医学状况.代谢综合征影响越来越多的美国人。重要的是，已经表明即使体重的适度降低(最初体重的5-10%)也可以显著改善代谢综合征并且降低发生肥胖症相关的疾病的危险因子(Wing等人，Arch.Intern.Med.147:1749-1753(1987);Tuomilehto等人，NewEngl.J.Med.344:1343-1350(2001);Knowler等人，NewEngl.JMed.346:393-403(2002);Franz等人，DiabetesCare25:148-198(2002))。此外，由于在某些文化中，社会耻辱通常与肥胖个体有关，从精神健康角度看，肥胖症的治疗也是重要的。黑皮质素受体在调节人和啮齿动物中的总体能量平衡和肥胖症中起重要作用。a-促黑素细胞激素(a-MSH)是13个氨基酸的肽激素，是黑皮质素系统的重要组分。a-MSH是由脑垂体释放的阿黑皮素原(POMC)的蛋白酶解加工产生的。a-MSH以高亲和力结合黑皮质素4受体(MC4R)，也以较低的亲和力结合黑皮质素3受体(MC3R)4和黑皮质素5受体(MC5R)。MC4R是在脑中发现的G-偶联蛋白受体，其当受a-MSH结合的刺激时，导致食物摄入减少和脂肪氧化增加。最终，刺激黑皮质素受体如MC4R引起体重减轻。在人和啮齿类动物中，黑皮质素系统的不同组分中功能突变的丧失与肥胖症和相关状况密切相关。在小鼠中，在POMC或MC4R和MC3R内的突变产生肥胖症、胰乌素抗性和饮食过多(Goodfellow和Saunders，Curr.TopicsMed.Chem.3:855-883(2003);Huszar等人，Cell88:131-141(1997);Yaswen等人，Nat.Med.5:1066-1070(1999))。在人类中，POMC或MC4R内的突变导致发生与食物摄入增加有关的肥胖症(Krude等人，Nat.Genet.19:155-157(1998);Yeo等人，NatureGenetics20:111-112(1998);Branson等人，NewEngl.J.Med.348:1096-1103(2003);Vaisse等人，J.Clin.Invest.1(^6):253-262(2000);Ho和MacKenzie，J.Biol.Chem.275:35816-3，82(1999))。体重减轻可以由黑皮质素系统活性的药理学刺激引起.在啮齿动物中，黑皮质素受体如MC4R的药理学刺激引起食物^t入减少、能量消耗增加和体重减轻(Pierroz等人，Diabetes51:1337-1345(2002))。在人类中，养内施用a-MSH以刺激非肥胖人中的MC4R导致由于脂肪减少而不是瘦体重引起的体重减轻(Fehm等人，J.Clin.gndo.Metabol.86:1144-1148(2001))。当前通过几种不同的策略治疗肥胖症仅仅取得了有限的成功.这些策略主要包括"生活方式"改变(例如，饮食和锻炼)、基于小分子的药物治疗或者手术除去一部分胃(胃分流术)。此外，刺激体重减轻的黑皮质素受体结合肽如a-MSH由于此类肽的极短的血清半寿期而作为药物的用途受限，从而，需要额外的肥胖症治疗法，尤其克服黑皮质素受体结合肽如a-MSH的短的血清半寿期的黑皮质素受体结合分子.附图简述图l显示了结合黑皮质素受体的拟抗体多肽的组成部分。图2显示了结合黑皮质素受体的拟抗体的示意图。图3显示了结合黑皮质素受体的a-MSH拟抗体的氨基酸(SEQIDNO:62)和cDNA(SEQIDNO:61)序列。各拟抗体组成部分的氨基末端部分用下划线标出。图4显示了在竟争性结合测定中，a-MSH拟抗体与MC4R的结合。图5显示了在表达高水平MC4R的细胞中MC4R的a-MSH拟抗体激活。图6显示了在表达低水平MC4R的细胞中MC4R的a-MSH拟抗体激活。图7显示了动物食物摄入的a-MSH拟抗体介导的降低。图8显示了动物体重的a-MSH拟抗体介导的降低。发明概述本发明的一方面是式(I)的多肽(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Mp是黑皮质素受体结合分子，Lk是多肽或者化学键，V2是免疫球蛋白可变区的C-末端的一部分，Hg是免疫球蛋白可变铰链g的至少一部分，CH2是免疫球蛋白重链CH2恒定区，CH3是免疫球蛋白重链Ch3恒定区，t独立地是l到IO的整数。本发明的另一方面是包含SEQIDNO:60或62的多肽。本发明的另一方面是包含SEQIDNO:59或SEQIDNO:61的多核苷酸或者与SEQIDNO:59或SEQIDNO:61互补的多核苷酸。本发明的另一方面是一种多核苷酸，包含编码SEQIDNO:60或SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸。本发明的另一方面是改变细胞、组织或者器官中黑皮质素受体的生物活性的方法，其包括将本发明的拟抗体组合物与细胞、组织或者器官接触。本发明的另一方面是调节至少一种黑皮质素受体介导的状况的方法，其包括对需要其的患者施用本发明的拟抗体组合物。发明详述本文中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请都完整引入本文作为参考。本发明提供了具有结合黑皮质素受体和模拟抗体免疫球蛋白分子的不同同种型如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，和其任何亚类如IgAi、IgA2、IgGbIgG2、IgG3或IgG4或者其组合的性质的多肽，其在本文中一般称作"拟抗体(mimetibody)"。在一些实施方案中，本发明的拟抗体多肽含有a促黑素细胞激素肽(a-MSH)序列并且称作结合黑皮质素受体的a-MSH拟抗体。此类a-MSH拟抗体多肽可以结合黑皮质素受体4(MC4R)，并且以相等或者较低的亲和力分别结合MC3R和MC5R。这种黑皮质素受体结合的一种结果可以是刺激或者抑制黑皮质素受体活性。刺激可以导致体重减轻而抑制可以导致体重增加。在一个实施方案中，本发明的多肽具有通式(I):(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Mp是黑皮质素受体结合分子，Lk是多肽或者化学键，V2是免疫球蛋白可变区的C-末端的一部分，Hg是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白重链CH2恒定区，CR3是免疫球蛋白重链CH3恒定区，t独立地是l到10的整数。本文使用的"黑皮质素受体结合分子"指可以结合至少一种黑皮质素受体如人MC4R(SEQIDNO:77)的分子。其他人黑皮质素受体的实例包括MCR1(SEQIDNO:71)、MCR2(SEQIDNO:73)、MCR3(SEQIDNO:75)和MCR5(SEQIDNO:79)。给定的肽链是"黑皮质素受体"的条件是它与已知的黑皮质素受体序列或者已知的黑皮质素受体的成熟形式具有至少85%氨基酸序列同一性并且可以作为G-蛋白偶联的受体。^f吏用VectorNTIv.9.0.0(InvitrogenCorp"Carslbad，CA)的AlignX模块的默认设置，通过逐对比对可以确定两条肽链之间的同一性百分数。示例性黑皮质素受体结合分子是具有(SEQIDNO:2)中所示的氨基酸序列的13个氨基酸的a-MSH肽。其他黑皮质素受体结合分子包括SEQIDNO:2的生物活性片段和可以结合黑皮质素受体的其他氨基酸序列。本文使用的术语"生物活性片段"指a-MSH肽的可以结合黑皮质素受体如MC4R的部分。肽序列HFRW(SEQ.ID.NO.81)是a-MSH狀序列SYSMEHERB^GKPV(SEQIDNO:2)的示例性"生物活性片段"。已经将HFRW片段掺入合成的黑皮质素受体激活分子melanotanII(MTII)中(Fan等人，Nature385:165-168(1997))。黑皮质素受体结合分子在本发明的拟抗体多肽中的掺入提供了以宽范围的亲和力结合黑皮质素受体。本发明的拟抗体多肽可以以小于或者等于约107、10-8、10-9、101()、10"或10-"M的Ka结合黑皮质素受体。对aMHS肽、MTII肽和aMSHMMB得到的IC50值的范围分别为260-400nM、5-30nM和200-300nM。使用任何合适的方法，可以通过实验测定拟抗体多肽对黑皮质素受体的亲和力。此类方法可以利用Biacore或KinExA仪器操作、ELISA或者竟争性结合测定法.通过本领域技术人员已知的技术可以从变体或者片段文库选择以所希望的亲和力结合特定黑皮质素受体的拟抗体多肽。可以对具有SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的a-MSH肽进行修饰以得到其他黑皮质素受体结合分子。此类修饰可以包括向肽中掺入C-Xn-C基序以通过形成二硫键在构象上限制肽。在C-Xn-C基序中，C是半胱氨酸残基，X是一种氨基酸残基并且n是实现构象限制必需的整数。在该情况中，n可以小至l个残基和高至50.示例性C-[Xn-C修饰的肽序列在SEQIDNOs:4、6、8和10中显示。修饰还可以包括向肽中掺入Wa-[Xn-Wa基序以通过形成色氨酸拉链在构象上限制肽.在Wa-Xn-Wa基序中，W是色氨酸残基，X是一种氨基酸，a是整数，通常为2，但是可以为1到10,n是实现所需的构象限制必需的整数，在该情况中，n可以小至l个残基和高至50,示例性Wa-Xn-Wa肽在SEQIDNOs:12、14、16和18中显示。此外，在a-MSH肽中存在的序列HFRW(SEQIDNO:81)还可以通过用F、H、W和M的任一个替代该序列中的任一个残基进行修饰；例如，HFRW(SEQIDNO:81)可以替代成FHWM(SEQIDNO:83)。在本发明的多肽中，接头部分(Lk)通过允许拟抗体具有备选的取向和结合性质而提供了结构柔性。示例性接头包括非肽化学键或者通过肽键连接的1到20个氨基酸，其中氨基酸选自20种天然存在的氨基酸或者其他氨基酸(例如，D-氨基酸、非天然存在的氨基酸，或者罕见的天然存在的氨基酸)。接头部分可以包括多数不受立体位阻的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸并且可以包括GS、聚GS(例如GSGS(SEQIDNO:20))、GGSG(SEQIDNO:22)、GSGGGS(SEQIDNO:24)、GSGGGSG(SEQIDNO:26)、GSSG(SEQIDNO:28),或GSGGGS(SEQIDNO:30)或GGGS(SEQIDNO:85)或者其任一组合或者聚合物。在本发明范围内的其他示例性接头可以长于20个残基并且可以包括甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸之外的残基。在本发明的多肽中，V2是免疫球蛋白可变区如重链可变区的羧基末端结构域的一部分。示例性V2氨基酸序列是GTLVTVSS(SEQIDNO:32)和TLVAVSS(SEQIDNO:34)。在本发明的多肽中，Hg是免疫球蛋白可变区如重链可变区的铰链结构域的一部分。示例性Hg氨基酸序列包括EPKSCDKTHTCPPCP(SEQIDNO:36)、EPKSADKTHTCPPCP(SEQIDNO:38)、ESKYGPPCPSCP(SEQIDNO:40)、ESKYGPPCPPCP(SEQIDNO:42)、CPPCP(SEQIDNO:44)和CPSC(SEQIDNO:46)。在本发明的多肽中，CH2是免疫球蛋白重链CH2恒定区。示例性Ch2氨基酸序列包括APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:48)，APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:50),KCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQIDNO:52)和YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQIDNO:54)。在本发明的多肽中，CH3是免疫球蛋白重链CH3恒定区。示例性Ch3氨基酸序列包括EALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:56)和ALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQIDNO:58)。本领域技术人员将认识到，当在某些重组系统中表达本发明多肽的CH3区时，可以切除其C-末端氨基酸。在本发明的拟抗体多肽中，Hg、CH2或CH3可以是IgGi或IgG4亚类的。序列是lg&或IgG4亚类的序列的条件是它分别从yl或y4重链形成或者发育而来。给定的肽链如果与给定种类的已知yl或y4重链序列至少80%同一，那么该肽链是yl或y4重链。使用VectorNTIv.9.0.0(InvitrogenCorp.,Carslbad，CA)的AlignX模块的默认设置，通过逐对比对可以确定两条肽链之间的同一性百分数.在本发明的拟抗体多肽中，Hg、Cu2或CH3可以分别是Ig&或IgG4亚类的.本发明的拟抗体还可以包含来自每个亚类的Hg、Ch2或Ch3组成部分的组合。例如，Hg可以是IgG4亚类的，而CH2和CH3是IgGi亚类的，备选地，Hg、CH2和Cu3可以都是IgGi或IgG4亚类的。多肽EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCKSLSLSPGK(SEQIDNO:65)是示例性多肽，其中Hg(SEQIDNO:65的残基1-15)，CH2(SEQIDNO:65的残基16-125)，和Ch3(SEQIDNO:65的残基126-232)都是IgGi亚类的。IgGi和IgG4亚类的差别在于铰链区中半胱氨酸的数目。多数IgG类型抗体如IgGi是由两个相同的重(H)链和两个相同的轻(L)链组成的同型二聚体分子，通常缩写为H2L2。从而，由于形成重链间二硫键并且IgG分子的两个抗原结合(Fab)臂具有相同的结合特异性，这些分子对于抗原结合通常是二价的。相反，IgG4同种型重链在它们的铰链区含有CPSC(SEQIDNO:46)基序，其能够形成重链间或者重链内二硫键，即，CPSC基序中的两个Cys残基可以与其他H链(链间)中的对应Cys残基形成二硫键，或者给定CPSC基序内的两个Cys残基可以相互形成二硫键(链内)。因为在铰链区中具有重链内键的那些IgG4分子中HL对不相互共价结合，所以它们可以解离成HL单体，其然后与来自其他IgG4分子的HL单体重新締合，形成双特异性异二聚体IgG4分子。体内异构酶可以促进该过程。在双特异性IgG抗体中，抗体分子的两个Fab"臂"差别在于它们结合的表位。将lgG4的铰链区中的Ser残基用Pro替代，导致"lgG4样行为"，即，分子在重链之间形成稳定的二硫键并且因此，对于与其他IgG4分子的HL交换不敏感。通过修饰参与二硫键形成并且存在于拟抗体多肽的Hg-CH2-CH3部分中的位点，可以使本发明的拟抗体多肽更像IgG4或更像IgGh通过除去、缺失、插入或者用其他氨基酸替代可以修饰此类位点。通常，除去或者替代二硫键締合的基序中存在的半胱氨酸残基。这些位点的除去可以避免与产生拟抗体的宿主细胞中存在的其他含有半胱氨酸蛋白质的共价二硫键生成或者基于IgG4的构建体中重链内二硫键生成，而允许拟抗体Hg-CH2-CH3结构域的非共价二聚化。此类位点的修饰可以允许形成具有两个不同的M部分的双特异性拟抗体多肽或者防止形成此类双特异性种类.IgGt和IgG4亚类的差别还在于它们介导补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)的能力。CDC是在补体存在下把细胞的裂解。补体激活途径通过补体系统的第一种组分(Clq)与和相关抗原复合的分子的结合引起。Ig&是补体级联和随后的CDC活性的强的诱导剂，而lgG4几乎没有补体诱导活性。ADCC是细胞介导的过程，其中参与ADCC的表达Fc受体(FcRs)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后导致靶细胞的裂解。IgGi亚类以高亲和力结合参与ADCC的Fc受体并且促进ADCC，而lgG4仅微弱地结合此类受体并且具有很小的ADCC诱导活性。IgG4激活效应物功能如ADCC的相对无能是所希望的，因为向细胞递送拟抗体多肽而无细胞杀伤是可能的。通过改变拟抗体多肽的Hg-CH2-CH3部分中存在的参与CDC和ADCC的位点，可以修饰本发明的拟抗体多肽的CDC和ADCC活性。通过除去、缺失、插入或者用其他氨基酸替代可以修饰此类位点。在本发明的拟抗体中，参与CDC的位点，如Clq结合位点通常被除去或者修饰以减小CDC活性。此外，可以类似地修饰本发明的拟抗体中参与ADCC的Fc受体结合位点。通常，此类修饰将从本发明的拟抗体除去参与ADCC活性的Fc受体结合位点。用Ala残基替代本发明的多肽的CH2部分中的Leu残基是一种修饰的实例，其可以减小本发明的多肽中的ADCC活性。CH2氨基酸序列APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQIDNO:52)是在残基4和5(上面序列中)上这种Leu到Ala替代的实例。此外，可以除去VI结构域，从而切除信号肽后，肽的N-末端是游离的并且可以接近并且被酶如乙酰基转移酶修饰。IgG4和IgGi同种型的抗体含有FcRn补救受体结合位点。FcRn补救受体通过再循环或者转运IgG型抗体穿过内皮细胞层如体腔和血管内衬的内皮细胞层而帮助保持身体中的IgG抗体水平。FcRn补救受体通过已经通过非特异胞饮作用进入内皮细胞的IgG并且阻止这些IgG抗体分子在细胞的溶酶体中降解来实现保持身体中的IgG抗体水平。这种FcRn受体活性的结果是具有FcRn结合位点的分子的血清半寿期相对于缺少这种位点的其他方面相同的分子延长了。希望本发明的拟抗体的Hg-CH2-CH3部分在CH2和CH3区的接合处含有FcRn结合位点。预期这种FcRn位点将增加本发明的拟抗体的血清半寿期以及相对于黑皮质素受体结合分子如单独a-MSH改进其他药物代谢动力学性质。在本发明的拟抗体中，通过氨基酸的除去、缺失、插入或者替代可以修饰或者添加FcRn位点。通常，此类修饰用于改善给定位点与FcRn的结合。人FcRn结合位点的一个实例是在Ig^和lgG4抗体中都发现的序列MISRTPTVLHQHNHY(SEQ.ID.NO.:69)。其他FcRn结合位点是本领域技术人员公知的。具有不同的同种型如IgG4和IgGi的抗体可以含有糖基化位点。这些位点的糖基化可以改变抗体分子的性质和活性。抗体分子可以是N-糖基化的或者O-糖基化的。含有氮原子的抗体氨基酸残基侧链(例如，Asn)的N-糖基化可以通过对N-糖基化的抗体分子赋予细胞溶解活性而调节抗体Fc效应物功能，如ADCC。这种与细胞溶解活性有关的ADCC导致此类N-糖基化的抗体实现的细胞的裂解。备选地，通过修饰含有氧原子的氨基酸残基侧链(例如，Ser或Thr)可以O-糖基化抗体分子。O-糖基化可以通过增加O-糖基化的抗体分子从血清的凝集素介导的清除而缩短抗体分子的血清半寿期。此外，O-糖基化可以由于不同抗体分子之间O-糖基化的不同程度而导致抗体异质性的不希望的增加。最后，O-糖基化和N-糖基化都可以改变抗体分子的依赖结构的性质，如结合亲和力和免疫原性。像它们模拟的抗体分子一样，本发明的拟抗体多肽还可以通过N-糖基化和O-糖基化在翻译后修饰。在多数情况下，希望限制本发明的拟抗体的N-糖基化以减小细胞溶解活性。通过除去或者替代通常N-糖基化的氨基酸残基如Asn，可以限制N-糖基化.还希望限制拟抗体O-糖基化以降低凝集素介导的清除、拟抗体异质性和依赖结构的拟抗体性质如结合亲和力和免疫原性的改变。减小本发明的拟抗体中O-连接的糖基化的一种途径是将本发明多肽的V2部分中的Thr残基用Ala残基替代.V2氨基酸序列TLVAVSS(SEQIDNO:34)是这种Thr替代为Ala的例子；该具体的V2替代还可以通过在SEQIDNO:62的47位上Thr替代为Ala得到。本领域技术人员将认识到控制N-连接的和O-连接的糖基化包括调节糖基化酵活性的其他方法。本发明的拟抗体多肽的单体结构Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3可以连接到"t"个其他单体，其中t是l到10的整数。此类连接可以通过非共价相互作用或者共价连接如Cys-Cys二硫键发生.以这种方式，可以形成本发明多肽的多聚体结构如二聚体和更高级的多聚体.预期本发明的多肽的二聚化将增加这些多肽对黑皮质素受体如MC4R的亲和力.本文使用的术语"多聚体"指具有四级结构并且通过两个或多个亚单位締合形成的分子.本发明的多肽可以任选在氨基末端包含免疫球蛋白可变区的氨基末端部分，称作V1，如式II所示(Vl-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(II)示例性VI氨基酸序列包括QIQ和QVQ。本发明的多肽还可以包含促进蛋白质分泌所需的分泌信号或者细胞中蛋白质运输所需的其他信号。示例性分泌信号序列是MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQIDNO:69)。本领域技术人员将认识到其他分泌信号。在一个实施方案中，本发明的多肽包含SEQIDNO:60或62。SEQIDNO:62代表通式(II)的结合(Vl-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)黑皮质素受体的a-MSH多肽，其具有融合到它的氨基末端的分泌信号MAWVWTLLFLMAAAQSIQA(SEQIDNO:69)。SEQIDNO:60代表通式(I)的结^(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3h)黑皮质素受体的a-MSH多肽。在SEQIDNO:60中不存在分泌信号。本发明的另一方面是多核苷酸，其包含与编码至少一种结合黑皮质素受体的拟抗体互补或者具有显著同一性的多核苷酸.本发明的其他方面包括载体，其包含编码结合黑皮质素受体的拟抗体的至少一种多核香酸分子。在不同的方面，本发明提供了包含本发明的载体的细胞或者表达本发明的拟抗体多肽的细胞。所述多核苷酸、载体和细胞可以用于产生本发明的拟抗体多肽。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQIDNO:59或SEQIDNO:61或者与SEQIDNO:59或SEQIDNO:61互补的多核苷酸。SEQIDNO:59是编码通式(I)的结合(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)w黑皮质素受体的a-MSH多肽的cDNA，其缺少信号序列。SEQIDNO:61是通式(II)的编码结合(Vl-Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)的黑皮质素受体的a-MSH多肽的cDNA，其具有融合在它的氨基末端的分泌信号。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸包含编码SEQIDNO:60或SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸。编码SEQIDNO:60或SEQIDNO:62中显示的多肽序列的示例性核酸序列分别在SEQIDN059或SEQIDNO:61中显示。还提供了与上述多核苷酸基本同一的多核苷酸。在多核苷酸的上下文中术语"基本同一"指给定多核苷酸序列与本发明的多核苷酸序列或者其部分在至少60%或者至少70%或者至少约80%或者至少约90%或者至少约95-98%的核苷酸同一。使用VectorNTIv.9.0.0(InvitrogenCorp"Carslbad，CA)的AlignX模块的默认设置，通过逐对比对可以确定两条多核苷酸序列之间的同一性百分数。通常，本发明的多核苷酸用于表达载体中用来制备本发明的拟抗体多肽。在本发明范围内的载体提供了真核生物表达的必要元件并且包括病毒启动子驱动的载体，如CMV启动子驱动的载体，例如，pcDNA3.1、pCEP4，和它们的衍生物、杆状病毒表达载体、果蝇表达载体，和哺乳动物基因启动子如人Ig基因启动子驱动的表达载体。其他实例包括原核生物表达载体，如T7启动子驱动的载体，例如，pET41、乳糖启动子驱动的载体和阿拉伯糖基因启动子驱动的载体。本发明还涉及表达本发明的拟抗体或者包含本发明的载体的细胞。此类细胞可以是原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞是哺乳动物细胞，如但不限于，COS-l、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC誦1、HepG2、653、SP2/0、NSO、293、HeLa、骨髄瘤、淋巴瘤细胞或者其任何衍生物。最优选地，真核细胞是HEK293、NSO、SP2/0或CHO细胞。大肠杆菌是示例性原核细胞。根据本发明的细胞可以通过转染、细胞融合、永生化或者本领域公知的其他方法产生.转染到细胞中的多核苷酸可以是染色体外的或者稳定整合到细胞的染色体中。通过修饰多肽的Hg-CH2-CH3部分，可以使本发明的拟抗体与给定宿主细胞更相容。例如，当本发明的拟抗体在细菌细胞如大肠杆菌中重组表达时，通过大肠杆菌酶脯氨酸亚氨基肽酶可以除去Hg元件中的Pro-Ala序列以防止消化。类似地，可以缺失Hg元件的部分或者用本发明的拟抗体中的其他氨基酸替代以防止所选的宿主细胞中表达的产物中的异质性。本发明还提供了产生拟抗体多肽的方法，其包括培养本发明的细胞并纯化所表达的本发明的拟抗体多肽的步骤。细胞组分，如体外转录和翻译必需的那些组分也可以用于表达本发明的多肽。本发明包括通过两种方法产生的拟抗体。通过本领域公知的方法可以从基于细胞或者细胞组分的系统回收并纯化所表达的拟抗体多肽，所述方法包括但不限于，蛋白A纯化、硫酸铵或者乙醇沉淀、酸提取、阴离子或者阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。高效液相层析(HPLC)也可以用于纯化。通常的纯化将需要几种不同方法的组合。本发明的另一方面是药物组合物，其包含有效量的至少一种拟抗体多肽和可药用载体或者稀释剂。术语"有效量"通常指有效治疗，即治疗所针对的症状或者病症的部分或者完全緩解所必需的拟抗体的量。组合物可以任选包含用于治疗肥胖症和下文描述的其他状况的至少一种其他化合物、蛋白质或者组合物。组合物中的可药用载体或者稀释剂可以是溶液剂、混悬剂、乳剂、胶体或者粉剂。本领域技术人员将认识到其他可药用载体和稀释剂。本发明的另一方面是改变细胞、组织或者器官中黑皮质素受体的生物活性的方法，其包括将本发明的药物组合物与所述细胞、组织或者器官接触。该方法可以用于改变脑、脑组织或者脑细胞中的黑皮质素受体活性。备选地，本发明的方法可以用于改变其他外周细胞或者组织如肌肉或者其他器官如胃中的黑皮质素受体活性。本领域技术人员将认识到可以使用的其他细胞、组织或者器官。本发明的另一方面是调节至少一种黑皮质素受体介导的状况的方法，其包括对有需要的患者施用本发明的药物组合物。可以以任一合适的途径施用本发明的药物组合物，此类途径可以是鞘内的、鼻内的、外周(例如，皮下、肌内、皮内、静脉内)或者通过本领域中已知的任何其他方法.如前面描述，异常的黑皮质素受体活性与许多病理状况，如肥胖症和2型糖尿病有关。本发明的拟抗体多肽还可以用于调节其他黑皮质素受体介导的状况，如男性和女性勃起机能障碍、炎症、充血性心力衰竭、中枢神经系统病症、神经损伤、感染性疾病、肺部疾病、皮肤疾病、发热和疼痛.本发明还参考下面的实施例进一步描述。这些实施例仅仅说明本发明的方法并且不意在作为本发明的限制.实施例1oc-MSH拟抗体和表达载体构建设计了a-MSH拟抗体蛋白质，其包含分泌信号序列、a-MSH肽序列、接头序列、Vh序列、铰链序列、人IgGiCH2序列和人Ig^CH3序列(图3和SEQIDNO,62)。分析数据，例如质谱法证实产生了成熟多肽(对于G1/G1形式，61,344.6)。使用标准分子生物学技术产生了编码该a-MSH拟抗体蛋白质的核酸序列(图3;SEQIDNO:61)。将编码a-MSH拟抗体序列的核酸序列亚克隆到p2389表达载体中以产生a-MSH拟抗体表达载体(SEQIDNO:63)。实施例2oc-MSH拟抗体表达a-MSH拟抗体在HEK293E细胞中瞬时表达。使用标准条件培养细胞并l吏用Lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad,CA)如生产商教导的用a-MSH拟抗体表达栽体瞬时转染。转染后24h，将细胞转移到无血清的培养基制剂中并培养5天。然后除去培养基并离心除去残渣。将澄清的培养基与蛋白A-Sq>haroseTM(HiTraprProteinAFF，AmershamBiosciencies，Piscataway，NJ)温育并如生产商教导的从蛋白A-SepharoseTM缀合物洗脱蛋白质，然后通过SuperoseTM12大小排阻层析(Superose1210/300GL，AmershamBiosciencies,Piscataway,NJ)使用标准方法进一步纯化洗脱的蛋白质溶液。然后将柱洗脱液进行SDS-PAGE并通过银染和考马斯蓝染色显色。然后制备蛋白质印迹并将印迹用Fc特异性一级抗体或者a-MSH特异性一级抗体检测。总之，蛋白质印迹和SDS-PAGE染色结果表明已经从瞬时转染的HEK293细胞得到了由两条多肽链组成的纯化的a-MSH拟抗体。实施例3a-MSH拟抗体结合MC4Ra-MSH拟抗体结合MC4R并且可以与放射标记的[Nle(4)，D-Phe(7)-a-MSH(NDP-a-MSH)激动剂分子竟争MC4R结合(图4)。MC4R是a-MSH的受体。通过竟争结合测定法检查结合到HEK293细胞膜(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA)中重组表达的MC4R的a-MSH，在该测定法中，将增加量的未标记的MC4R激动剂(阳性对照)和人抗体的Fc结构域(阴性对照)加入到含有[^1-NDP-a-MSH的测定混合物中，如图4所示，未标记的MC4R激动剂是melanotanII(MTII;—种aMSH类似物)、a-MSH和NDP-a-MSH。在PBS(磷酸緩冲盐水)中41C、-20TC,和-80TC保存两周后结合MC4R的a-MSH拟抗体是稳定的，如通过竟争结合测定法评定。4吏用ScintillationProximityAssays斷闪烁亲近测定'法XAmershamBiosciencesCorp,Piscataway,NJ)如测定法生产商所教导的进行竟争结合测定法。测定混合物含有EC80即约0.5nM的[^I-NDP-a-MSH，0.1jigMC4R膜，lmMMgS04，1.5mMCaCl2，25mMH印es，0.2%BSA，1mMl，lO-phenthroline，测定法生产商推荐量的蛋白酶抑制剂混合物(RocheDiagnosticsCorp"Indianapolis,IN)和SPA珠，用PackardTopCountNXTInstrument(PerkinElmerLifeandAnalyticalSciences,Boston,MA)测量从ScintillationProximityAssay(闪烁亲近测定法)珠的光发射5分钟。实施例4a-MSH拟抗体激活MC4Ra-MSH拟抗体可以激活MC4R信号传递以增加表达MC4R的CHOKl细胞中的cAMP产生(图5和图6)。MC4R是7次跨膜(7TM)G蛋白偶联的受体。配体或者激动剂对MC4R的激活导致环状AMP水平(cAMP)的升高。使用用MC4R表达栽体稳定转染并且表达MC4R的两种不同的克隆CHOKl细胞系进行MC4R受体激活测定.克隆l(图5)相对于克隆2(图6)以高水平表达MC4R。使用标准培养条件，克隆1和克隆2细胞作为单层生长到约100，000细胞/孔的密度，然后与增加量(0-100pM)的a-MSH、MTII或者a-MSH拟抗体温育15分钟，如图5和图6中指出。然后裂解细胞并使用cAMP-ScreenDirectTM化学发光免疫分析系统(ChemiluminescentImmunoassaySystem)(AppliedBiosystems，FosterCity,CA)如生产商的教导进行cAMP测定。使用克隆l(图5)和克隆2(图6)，来自cAMP测定的ECso值在下表l中列出。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>实施例5oc-MSH拟抗体施用减少动物食物摄入和体重对褐家鼠(Rattusnorvegicus)脑室施用a-MSH拟抗体以减少动物食物摄入(图7)和体重(图8)。经由手术插入左侧脑室的导管通过脑室内注射(ICV)对脑室施用a-MSH拟抗体。将导管手术插入体重为250g到350g的雄性Sprague-Dawley或Wistar大鼠。导管放置坐标如下距离前囟点-0.8mm，-4.5mm腹侧和-1.5后侧-前侧。手术后动物恢复7到10天。通过每日处理或者伪注射使动物习惯实验步骤，以便减小应激。此外，对动物进行反复的暗-光周期。通过血管紧张肽II测试证实正确的导管放置。如果通过导管ICV施用10ng血管紧张肽II导致大鼠在30分钟内饮水5-10ml，那么该测试证实正确的导管放置。仅通过该血管紧张肽II测试的动物用于食物摄入实验中。动物禁食18-24小时，然后通过导管以9lul/min的注射速率对脑室施用a-MSH拟抗体、a-MSH(阳性对照)或者PBS(阴性对照)。每个治疗组具有最少7只动物。治疗和剂量如图7和图8中指出。注射后对动物给予食物和水。注射后0h、4h、24h、48h和72h测量消耗的食物和水的量(图7)。如图6中所示在注射后72小时测量体重.现在完整描述了本发明，本领域技术人员将理解可以对其做出许多修改和修饰而不背离所附权利要求的精神或范围。权利要求1.根据式(I)的多肽(Mp-Lk-V2-Hg-CH2-CH3)(t)(I)其中Mp是黑皮质素受体结合分子，Lk是多肽或者化学键，V2是免疫球蛋白可变区的C-末端的一部分，Hg是免疫球蛋白可变铰链区的至少一部分，CH2是免疫球蛋白重链CH2恒定区，CH3是免疫球蛋白重链CH3恒定区，t独立地是1到10的整数。2.权利要求l的多肽，其中M是SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16或18的生物活性片段。3.权利要求l的多肽，其中M具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16或18中显示的氨基酸序列.4.权利要求l的多肽，其中该多肽结合至少一种黑皮质素受体。5.权利要求4的多肽，其中所述黑皮质素受体是黑皮质素4受体。6.包含SEQIDNO:60或62的多肽。7.编码根据权利要求l到6任一项的多肽的多核苷酸.8.包含SEQIDNO:59或SEQIDNO:61的多核苷酸或与SEQIDNO:59或SEQIDNO:61互补的多核苷酸。9.多核苷酸，其包含编码SEQIDNO:60或SEQIDNO:62的多肽的多核苷酸。10.包含权利要求8或9的多核苷酸的载体。11.权利要求10的载体，其包含SEQIDNO:63。12.细胞，其表达权利要求l到6任一项的多肽。13.包含权利要求10的载体的细胞。14.权利要求13的细胞，其中该细胞是HEK293衍生的细胞。15.产生多肽的方法，其包括培养权利要求12的细胞并纯化所表达的多肽的步骤。16.药物组合物，其包含有效量的至少一种根据权利要求1到6任一项的多肽和可药用栽体或者稀释剂。17.改变细胞、组织或者器官中黑皮质素受体的生物活性的方法，其包括将权利要求16的药物组合物与所述细胞、组织或器官接触。18.调节至少一种黑皮质素受体介导的状况的方法，其包括对有需要的患者施用权利要求16的药物组合物。19.权利要求18的方法，其中黑皮质素受体介导的状况是肥胖症。全文摘要公开了结合黑皮质素受体的拟抗体多肽。还公开了编码这些多肽的多核苷酸、包含这些多核苷酸或者表达所述拟抗体的细胞，和制备和使用它们的方法。文档编号C12N15/62GK101437540SQ200580044790公开日2009年5月20日申请日期2005年10月25日优先权日2004年10月25日发明者J·罗,K·奥奈尔,M·坎宁安,V·斯托亚诺维克-苏苏利克,冲黄申请人:森托科尔公司