专利名称：固定化细胞有机－无机复合材料膜状载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞固定化载体材料，特别是一种应用于糖蜜或淀粉原料酒精酵母发酵的固定化细胞有机-无机复合材料膜状载体。
背景技术：
固定化细胞技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，与传统游离细胞发酵方法相比，具有处理效率高，稳定性好，微生物负载量大，有着游离细胞发酵无法比拟的优点，因此固定化细胞技术成为近10余年来研究的重点。
固定化微生物催化剂的活性与固定化载体的种类及其制备方法有很大关系，传统的固定化载体材料如聚丙烯酰胺、海藻酸钙、聚氯乙烯、硅藻土、陶瓷等，具有生化稳定性差、传质效果差、机械强度低、易被生物分解以及成本较高的缺点，很难符合工业化要求。美国专利4983299报道通过聚氨酯、吸附活性炭而作为固定化生物载体；中国专利CN1105649A通过在聚氨酯制备过程中添加活性炭、发泡成型后作为固定化微生物载体，中国专利CN1478891A在聚醚型聚氨酯发泡过程中添加活性炭、多异氰酸酯、吸水剂以改善载体微生物亲和性及吸水性，这些载体仍存在吸附能力差，微生物亲和性、吸水性及稳定性仍待加强的问题。开发新型固定化微生物载体材料，就要求克服传统载体的以上缺点，通过制备新型无机-无机、有机-无机复合材料并对材料进行改性与修饰，以调节载体负载性能对微生物进行固定化。与上述载体材料相比，聚氨酯、海藻酸钠，聚乙烯醇等作为常用的包埋载体，具有对微生物无毒、来源丰富，价格低廉等优点，但强度较差，比表面小。氧化铝及其前驱体如拟薄水铝石、薄水铝石以及介孔分子筛MCM-41，有着良好的生物相容性以及独特的孔道结构，可提供微生物细胞适宜的生长环境，将上述无机物加入高分子物质中改性后，复合载体强度增强，具有更多孔道网格结构，通透性更好，从而使微生物繁殖速度加快，单位体积内数量更多，提高了酒精发酵效率，而这些无机材料的添加改性高分子物质未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有微生物细胞高密度栖居、繁殖微环境的独特多孔道网格结构、形成一种具有独特孔道结构的固定化细胞有机-无机复合材料膜状载体。
本发明的膜状载体是在普通聚醚型聚氨酯泡沫、海藻酸钠、聚乙烯醇(聚合度1750±50，以下同)等高分子聚合物材料中添加氧化铝前驱体拟薄水铝石、薄水铝石、介孔分子筛等无机物质，制成有机-无机复合材料，利用这些无机物独特的孔道结构，并结合高分子物质细胞亲和性好，包埋量大及无机物质强度好，比表面大，通透性好，稳定性强，可再生利用等优点，以这种吸附包埋的耦合，得到具有有机-无机疏松网状结构载体，利于增殖和传质，有着广阔的工业应用前景。
本发明的技术方案是通过在普通聚醚型聚氨酯泡沫或海藻酸钠和聚乙烯醇等高分子聚合物材料中添加氧化铝前驱体拟薄水铝石、薄水铝石以及介孔分子筛MCM-41改性，这种固定化细胞复合膜状载体所用的原料配比为聚醚2.50-5.00，硅油0.02-0.05，三乙烯二胺0.01-0.02，辛酸亚锡0.01-0.02，甲苯二异氰酸酯1.20-2.40，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化铝前驱体0.40-1.00，水0.08-0.20；或者海藻酸钠1.00-7.00，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化铝前驱体0.40-1.00，MCM-41介孔分子筛0.40-1.00，菌悬液10.00-40.00，水88-90。
前者生产方法对于普通聚醚型聚氨酯泡沫，根据原料配比，将聚醚、硅油、三乙烯二胺、辛酸亚锡、水在20-24℃下混合搅拌均匀后，添加聚乙烯醇、氧化铝前驱体、MCM-41介孔分子筛无机材料，于搅拌下加入甲苯二异氰酸酯，混匀后置于模具中发泡成膜状，即制得微生物固定化载体成品；将此微生物固定化载体加入菌悬液后，放入糖蜜培养基中增殖培养，训化培养3-6天后，可用于酒精发酵过程。
后者生产方法对于海藻酸钠，根据原料配比将海藻酸钠、聚乙烯醇和水在100-120℃加热搅拌的条件下使其充分溶解混合，添加氧化铝前驱体、MCM-41介孔分子筛无机材料搅拌混合均匀，经灭菌后，加入菌悬液搅拌均匀，用制膜机涂膜后放入1％-5％wt的氯化钙溶液中交联1-5h，放入糖蜜培养基中增殖培养。以上固定化细胞有机-无机复合材料膜状载体，经过3-6天的培养增殖，载体包埋量可达到30-50亿个/mL，渗出游离细胞达1.2亿个/mL以上，可将其放入发酵罐中以糖蜜为原料进行发酵，其固定化发酵周期可缩短到10h之内。
本发明所提供的固定化复合材料膜状载体，利用在普通聚醚型聚氨酯泡沫、海藻酸钠、聚乙烯醇等高分子聚合物材料中添加氧化铝前驱体拟薄水铝石、薄水铝石以及介孔分子筛MCM-41改性，制备出新型有机-无机复合材料。利用这些无机物质独特的孔道结构，高分子物质细胞亲和性好，包埋吸附量大及无机物质强度好，比表面大，通透性好，稳定性强，可再生利用等优点，通过这种包埋吸附的耦合，得到具有疏松网结构有机-无机复合载体，增加了细胞负载量，及材料的弹性和稳定性，利于增殖和传质，从而增加了本发明提供的固定化复合材料膜状载体的工业化应用优势。
将其用于固定化细胞，特别是应用于酒精发酵领域，具有通透性强，机械强度好，化学稳定性好，微生物亲和性优良，包埋吸附量大(达30-60亿/mL)的特点。其酵周期缩短至10小时以内，载体乙醇产率可达175.50L.Et-OH/M3.h，容积乙醇产率可达11.00L.Et-OH/M3.h，使用寿命可达一年以上，可再生利用。本发明的制备方法简单，易于实现，本发明所制备的是一种高效的固定化细胞载体。
图1是本发明的二级边续流动固定化酵母发酵流程中，1-无油一级空气过滤器，2-无油二级空气过滤器，3-糖蜜配料罐，4-储罐，5-料液流量计，6-气体流量计，7-一级发酵罐，8-二级发酵，9-1#液面管，10-2#液面管，11-发酵液储罐，12-泵。
具体实施例方式
实施例1按照质量取聚醚2.50份、硅油0.02份、三乙烯二胺0.01份、辛酸亚锡0.01份、水0.08份在20-24℃下混合搅拌均匀后，添加聚乙烯醇10.00份、薄水铝石0.40份、MCM-41介孔分子筛0.40份，于搅拌下加入甲苯二异氰酸酯1.20份，混匀后置于模具中发泡成膜状得微生物固定化载体；将此微生物固定化载体加入酵母菌菌浓为15-20亿个/mL的菌悬液中，放入糖蜜培养基(添加成分与YEPD培养基类似，以下同)中增殖培养；训化培养3-6天后，载体包埋量可达到30-50亿个/mL，渗出游离细胞数达到1.0亿个/mL以上，转入发酵阶段。
在体积为1L的柱状发酵罐中，按照10.00％的填充率加入上述固定化载体，加入150g/L的原糖蜜，并不断鼓氧，进行批式发酵，发酵周期为5小时，残余总糖为7g/L，酒精度为9.3％(v/v)。载体使用6个月仍保持上述发酵效率。所使用设备及过程如附图所示，在两个体积为300L的发酵罐中，按照7.50％的填充率加入上述固定化复合材料膜状载体，将两个发酵罐串联为二级发酵罐，以0.10h-1的稀释率连续流加200g/L的原糖蜜，停留时间7.5h，发酵醪酒精度为11.00％(v/v)；糖醇转化率99.87％，载体乙醇产率为175.50L.Et-OH/M3.h，容积乙醇产率11.00L.Et-OH/M3.h；载体使用6个月仍保持上述发酵效率。
实施例2按照质量取聚醚5.00份、硅油0.05份、三乙烯二胺0.02份、辛酸亚锡0.02份、水0.18份在20-24℃下混合搅拌均匀后，添加聚乙烯醇3.00份、拟薄水铝石1.00份、MCM-41介孔分子筛1.00份，于搅拌下加入甲苯二异氰酸酯2.40份，混匀后置于模具中发泡成膜状。将此微生物固定化载体加入酵母菌菌浓为15-20亿个/mL的菌悬液中，放入糖蜜培养基中增殖培养。训化培养3-6天后，载体包埋量可达到30-50亿个/mL，渗出游离细胞数达到1.2亿个/mL以上，转入发酵阶段。
在体积为1L的柱状发酵罐中，按照15.00％的填充率加入固定化载体，加入200g/L的原糖蜜，并不断鼓氧，进行批式发酵，发酵周期为8小时，残余总糖为1.96g/L，酒精度为12.6％(v/v)；载体使用6个月仍保持上述发酵效率。所使用设备与实施例1相同。
实施例3
按照质量取海藻酸钠4.00份，聚乙烯醇8.00份，水88.00份在100-120℃搅拌加热条件下至溶解并混合均匀，依次加入0.40份薄水铝石，0.40份MCM-41混合均匀；灭菌后冷却至室温，加入酵母菌菌浓为15-20亿个/mL的菌悬液20份，搅拌均匀后，用涂膜机涂膜，膜厚3mm；将膜浸入2％的氯化钙溶液中固化4小时；用大量水冲洗后，放入糖蜜培养基中鼓氧增殖，培养40-72小时后，载体包埋量可达到30-50亿个/mL，渗出游离细胞数达到1.6亿个/mL以上，转入发酵阶段。
在体积为1L的柱状发酵罐中，按照10.00％的填充率加入上述固定化载体，加入150g/L的原糖蜜，并不断鼓氧，进行批式发酵，发酵周期为5h，残余总糖为7.80g/L，酒精度为9.0％(v/v)；载体使用6个月仍保持上述发酵效率。所使用设备与实施例1相同。
实施例5按照质量取海藻酸钠7.00份，聚乙烯醇3.00份，水90.00份在搅拌加热条件下至溶解并混合均匀，加入1.00份薄水铝石，1.00份MCM-41混合均匀；灭菌后冷却至室温，加入酵母菌菌浓为15-20亿个/mL的菌悬液30份，搅拌均匀后，用涂膜机涂膜，膜厚3mm；将膜浸入2％的氯化钙溶液中固化3小时；用大量水冲洗后，放入糖蜜培养基中鼓氧增殖，培养40-72小时后，载体包埋量可达到30-50亿个/mL，渗出游离细胞数达到1.2亿个/mL以上，转入发酵阶段。
在体积为1L的柱状发酵罐中，按照10.00％的填充率加入上述固定化载体，加入150g/L的原糖蜜，并不断鼓氧，进行批式发酵，发酵周期为5h，残余总糖为7.80g/L，酒精度为9.0％(v/v)；载体使用6个月仍保持上述发酵效率。所使用设备与实施例1相同。
权利要求
1.一种固定化细胞有机-无机复合材料膜状载体，其特征在于用以下配比的原料制成聚醚2.50-5.00，硅油0.02-0.05，三乙烯二胺0.01-0.02，辛酸亚锡0.01-0.02，甲苯二异氰酸酯1.20-2.40，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化铝前驱体0.40-1.00，水0.08-0.20；按此方法制备将聚醚、硅油、三乙烯二胺、辛酸亚锡、水在20-24℃下混合搅拌均匀后，添加聚乙烯醇、氧化铝前驱体、MCM-41介孔分子筛无机材料，于搅拌下加入甲苯二异氰酸酯，混匀后置于模具中发泡成膜状，即制得微生物固定化载体成品；或者用以下配比的原料制成海藻酸钠1.00-7.00，聚乙烯醇3.00-10.00，氧化铝前驱体0.40-1.00，MCM-41介孔分子筛0.40-1.00，菌悬液10.00-40.00，水88-90；按此方法制备将海藻酸钠、聚乙烯醇和水在100-120℃加热搅拌的条件下使其充分溶解混合，添加氧化铝前驱体、MCM-41介孔分子筛无机材料搅拌混合均匀，经灭菌后，加入菌悬液搅拌均匀，用制膜机涂膜后放入1％-5％wt的氯化钙溶液中交联1-5h，放入糖蜜培养基中增殖培养，经过3-6天的培养增殖，使载体包埋量达到30-50亿个/mL，渗出游离细胞达1.2亿个/mL以上时得到成品。
全文摘要
本发明是一种固定化细胞有机－无机复合材料膜状载体。该载体是在普通聚醚型聚氨酯泡沫、海藻酸钠、聚乙烯醇(聚合度1750±50)等高分子聚合物材料中添加氧化铝前驱体如薄水铝石、拟薄水铝石以及介孔分子筛MCM－41等无机物质进行改性，制备出的克服传统细胞固定化载体材料缺点的有机—无机复合材料，是一种有独特孔道结构能提供微生物细胞栖居、繁殖微环境的多孔网格结构膜状载体。包埋吸附量达30－60亿/ml，发酵醪游离细胞可达0.8－1.6亿/ml，将其用于固定化细胞，特别是应用于酒精发酵领域，发酵周期缩短至10小时以内，载体乙醇产率可达175.50L.Et－OH/M
文档编号C12N1/16GK1888061SQ20061001107
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月25日 优先权日2006年7月25日
发明者郑春明, 关乃佳, 耿长江, 陶耀佳, 钟元俊 申请人:南开大学云南研究院