专利名称：一种分离纯化嗜铁钩端螺旋菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物培养方法，特别是一种嗜铁钩端螺旋菌 (Ae—柳>/""辺femWh'"历)纯培养物的分离方法。
背景技术：
嗜铁钩端螺旋菌ae/^o邵介/L "迈/em'/^'7i"迈)是一类专性化能自养 铁氧化细菌，革兰氏阴性，最适生长pH 2.5，最适生长温度4CTC，能够直接 氧化硫化矿物，在微生物浸矿过程中具有重要作用。该菌种不易于纯培养， 在普通琼脂固体培养基平板上很难形成菌落，目前它的分离纯化主要是采用 琼脂糖双层平板培养基方法，D. B. Johnson及刘缨，刘相梅，田克立在《微生 物学通报》，2003， 30 (6)，"氧化亚铁钩端螺旋菌在固体平板上的培养及形 态观察"中所记载的方法.他们利用琼脂糖作固化剂，在底层平板中加入嗜酸 性异养细菌(〃eterotrop力力"心p&7/咖SJH)消耗上层无磷培养基中琼脂
糖的一些寡糖类物质而促进嗜铁钩端螺旋菌菌落的形成。该方法显示，菌落 形成时间较短，得率较高，但是，该方法使用双层平板，步骤较单层平板要 复杂，使用琼脂糖作凝胶剂其价格比琼脂高出约10倍，另外需要嗜酸性异养 细菌(//efer"roM ^"W2'/ 力/h'咖SJH)作为辅助细菌，增加了分离工作的 额外工作量以及引进了新的影响因素。
发明内容
本发明提供了一种用单层平板分离方法得到纯的嗜铁钩端螺旋菌的方 法，采用改良的固体培养基成分以及优化的培养条件实现分离，它较双层平 板分离方法简便很多，用普通琼脂作凝胶剂降低费用，且不需要添加任何其 它细菌辅助分离，能大大地减少工作量，并且菌落形成率较高，形成菌落时 间在两周左右。
本发明将采集的酸性矿坑水样品用9K无机盐液培养基富集培养一代，然 后将其传代用一种新的选择性液体培养基A-M培养，选择性液体培养基A-M
成分为(NH4)2S04 3 g/L， KC1 0. 1 g/L， K2HP04 0. 5 g/L， MgS04 7H20 0. 5 g/L， Ca(N03) 0.01 g/L， MnS04 1.0 g/L， Al2 (S04):3 18H20 2.1 g/L, FeS04 7^0 44. 5-60. 0 g/L.设定培养基PH值为1. 5-1. 7，并设定其培养温度为38-42°C， 传代培养3 4次且每次稀释5-10倍传代，最后将处于对数生长期培养物取 适量稀释20-IOO倍，取其中lOOuL在改良的单层固体培养基上均匀涂布。 改良的单层固体培养基配方由A， B和C三部分组成A成分同于上述选择性 液体培养基A-M成分(NH4)2S04 3 g/L， KC1 0.1 g/L， K2HP04 0. 5 g/L， MgS04 7H20 0. 5 g/L， Ca(N03) 0. 01 g/L, MnS04 1. 0 g/L， A12(S04)3 18H20 2. 1 g/L，溶于400 mL蒸馏水；B:普通琼脂10-15g溶于300 mL蒸馏水；C: FeS04 7H20 44. 5-60 . 0' g/L， KSCN 15. 5-25. 0 g/L溶于300 mL蒸馏水。将A 和B部分分开高压蒸汽灭菌116-121°C， 20-30 mins，最后将A， B和C三部 分混合，调pH值2.0-3.5，倒平板，在平板上均匀涂布菌液。涂有菌液的固 体培养基平板先正置5 10分钟，待菌液吸收后倒置于36-45"C恒温培养箱培 养。固体培养基颜色为红褐色，两周左右长出十多个大小不一的黄色光滑菌 落，大的菌落直径可达3隨左右。
本发明只要用单层平板就能分离得到纯的嗜铁钩端螺旋菌，采用普通琼 脂作凝胶剂，不需要添加任何其它细菌辅助分离，菌落形成率较高，较双层 平板方法更简单易行。
具体实施例方式
实施例l:分离嗜铁钩端螺旋菌D1菌株(Ze/7tos/77'n77"历/em》/^7/〃迈 strain Dl， GenBank登录号为DQ665909)，将采集的酸性矿坑水样品Dl用 9K无机盐液培养基在3(TC条件下富集培养一代，然后将其传代用一种新的选 择性液体培养基A-M培养，选择性液体培养基A-M成分为(NH4)2S04 3 g/L， KC1 0. 1 g/L， K2HP04 0. 5 g/L， MgS04 7H20 0. 5 g/L， Ca(N03) 0. 01 g/L， MnS04 1. 0 g/L， AUS04)3-跳0 2.1 g/L， FeS04'7H20 55.0 g/L.设定培养基pH值为 1.65，并设定其培养温度为4(TC，传代培养3 4次且每次稀释6倍传代，最 后将处于对数生长期培养物取适量稀释20倍，取其中lOOtiL在改良的单层 固体培养基上均匀涂布。改良的单层固体培养基配方由A, B和C三部分组成 A成分同于上述选择性液体培养基A-M配方(NH4)2S(X 3 g/L, KC1 0. 1 g/L， K2HP04 0. 5 g/L， MgS04'7H20 0.5 g/L, Ca(N03) 0.01 g/L， MnS04 1.0 g/L，A13(S04)3 18H20 2. 1 g/L，溶于400 mL蒸馏水；B:普通琼月旨12g溶于300 mL 蒸馏水；C: FeS(WH20 55.0 g/L, KSCN 20.0 g/L溶于300 mL蒸馏水。将 A和B部分分开高压蒸汽灭菌121°C， 20mins，最后将A， B和C三部分混合， 调pH值2.8左右，倒平板，在平板上均匀涂布菌液。涂有菌液的固体培养 基平板先正置5 10分钟，待菌液吸收后倒置于38. 5'C恒温培养箱培养。固 体培养基颜色为红褐色，两周左右长出十多个大小不一的黄色光滑菌落，大 的菌落直径可达3mm左右。
实施例2:同样分离嗜铁钩端螺旋菌Dl菌株，从富集培养一用选择性液 体培养基A-M稀释传代培养，步骤同例l， FeS04 7H20为45. 0 g/L，培养基 pH值为1.58，其培养温度为38'C，传代培养3 4次且每次稀释8倍传代， 最后将处于对数生长期培养物取适量稀释60倍，同实施例1步骤进行固体培 养基平板分离其中FeSO; 7H20浓度为为45. 0 g/L， KSCN为16. 5 g/L，琼脂 为10g，调pH值2.5，培养温度设为37.(TC，将A和B部分分开高压蒸汽灭 菌116°C， 25 miris。结果两周左右长出十个左右嗜铁钩端螺旋菌单菌落，菌 落与例1中相比稍小些，最大为1 2mm。
实施例3:分离嗜铁钩端螺旋菌D1菌株，从富集培养一用选择性液体培 养基A-M稀释传代培养，步骤同实施例1， FeS04 7H2()浓度为60.0 g/L，将 培养基pH值设为1. 70，培养温度为4rC，传代培养3 4次且每次稀释6倍 传代，最后将处于对数生长期培养物取适量稀释100倍，同实施例1方式进 行固体培养基平板分离，FeS04 7H20浓度为60. 0 g/L， KSCN浓度为23. 5 g/L， 琼脂增加为15g，调pH值3.0，培养温度设为40'C，将A和B部分分开高压 蒸汽灭菌12(TC， 30mitis。结果获得嗜铁钩端螺旋菌单菌落数量较多20 30 个，但是个头都较小0.5 lmm左右。
权利要求
1.一种分离纯化嗜铁钩端螺旋菌的方法，其特征在于包含以下步骤(1)将采集的酸性矿坑水样品用无机盐液培养基富集培养一代，然后将其传代用一种新的选择性液体培养基A-M培养，选择性液体培养基A-M成分为(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.1g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Ca(NO3)0.01g/L，MnSO4 1.0g/L，Al2(SO4)3·18H2O 2.1g/L，FeSO4·7H2O 44.5-60.0g/L，培养基pH值为1.5-1.7，培养温度为38-42℃；(2)制作单层固体培养基平板 其配方由A，B和C三部分组成A成分同于上述选择性液体培养基A-M成分(NH4)2SO4 3g/L，KCl 0.1g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，Ca(NO3) 0.01g/L，MnSO4 1.0g/L，Al2(SO4)3·18H2O 2.1g/L，溶于400mL蒸馏水；B普通琼脂10-15g溶于300mL蒸馏水；CFeSO4·7H2O 44.5-60.0g/L，KSCN 15.5-25.0g/L溶于300mL蒸馏水；将A和B部分别在115-121℃蒸汽灭菌，时间20-30mins，最后将A，B和C三部分混合，调pH值至2.0-3.5，倒于平板上；(3)将步骤(1)所得培养物传代培养3～4次且每次稀释后传代，最后将处于对数生长期培养物取适量稀释20-100倍；取菌液均匀涂布在单层固体培养基上，涂有菌液的固体培养基平板先正置5～10分钟，待菌液吸收后倒置于36-45℃恒温培养箱培养，得到菌落。
全文摘要
一种分离纯化嗜铁钩端螺旋菌的方法，本发明从酸性矿坑水中分离嗜铁钩端螺旋菌，将采集的酸性矿坑水样品用无机盐液培养基在30℃条件下富集培养一代，然后将其传代用一种新的选择性液体培养基A-M培养，并在培养基A-M中添加MnSO<sub>4</sub>1.0g/L，Al<sub>2</sub>(SO<sub>4</sub>)<sub>3</sub>·18H<sub>2</sub>O 2.1g/L，培养基pH值设为1.5-1.7，培养温度设为38-42℃；稀释传代培养后，在改良的单层固体培养基上均匀涂布。本发明只要用单层平板就能分离得到纯的嗜铁钩端螺旋菌，采用普通琼脂作凝胶剂，不需要添加任何其它细菌辅助分离，菌落形成率较高，较双层平板方法更简单易行。
文档编号C12N1/20GK101109009SQ20061003198
公开日2008年1月23日 申请日期2006年7月19日 优先权日2006年7月19日
发明者柳建设, 王秀美, 田卓力, 肖升木, 谢学辉 申请人:中南大学