专利名称：一种利用城市污泥制备的根瘤菌接种剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种根瘤菌接种剂，具体地说，涉及一种利用城市污泥制备的根瘤菌接种剂及其制备方法。
背景技术：
豆科植物——根瘤菌共生固氮是已知固氮能力最强的生物固氮体系。接种根瘤菌剂已成为世界各国豆科作物增产的一项常规措施，在许多国家都有大规模的商品菌剂生产和出售，应用面积正在不断扩大。我国豆科植物与豆科绿肥应用根瘤菌接种有50多年历史，其中大豆、花生、紫云英及豆科牧草接种面积较大，它不仅增产效果显著，而且不污染环境。它也是微生物肥料中使用最早，应用面积最大，效果最稳定的微生物制剂。
根瘤菌固氮的基本原理是，根瘤菌侵染豆科植物根内形成根瘤，并在根内成为能固氮的类菌体形态，利用豆科作物提供的光合作用与氧屏障系统将大气中的氮转化为氨，进而转化为谷氨酰胺一类的优质化合物供豆科作物利用。据统计，全球每年生物固氮量达1.75×108吨，为世界工业氮肥产量的4.37倍。
当前，根瘤菌接种剂的主要生产工艺是液体深层发酵与载体吸附。具体地说，就是人工选用高效根瘤菌大量繁殖，然后用适宜载体吸附制成根瘤菌剂。其中发酵环节中的常规原料主要是甘露醇、黄豆粉、葡萄糖、酵母膏等工农业产品，原料成本过高是制约根瘤菌接种剂工业化生产与应用的重要因素之一。因此，如何采用低成本、当地可得的工农业废弃物为原料，发酵生产根瘤菌剂是近来国内外的研究热点。例如，乳清、玉米浆、味精废水、废酵母浸出液、麦芽根等都曾被尝试用作根瘤菌的发酵原料。这些原料虽含有根瘤菌生长增殖所需的碳源、氮源等营养元素，但需要进行复杂的预处理，而且来源不稳定，因而不能完全取代根瘤菌的常规培养原料。
城市污泥是污水处理过程中产生的沉淀物。污泥的不规范处置已成为当今城市环境的新隐患。如何妥善处置这些数量日益庞大、高度集中的有机固体废弃物，是污水处理厂最头痛的问题之一。目前，我国城市污泥年产生量约600万吨干重，并且正在以每年约10％的速度增长。一般来说，污泥处理与处置费用约占污水处理总费用的30-40％。现行的污泥填埋、焚烧、土地利用或用作建材等处置方式都存在各自难以克服的缺陷，并且也不能满足当前的实际需要。
污泥中含有大量可被微生物利用的碳、氮、磷以及微量元素等营养物质，利用这一特性，国内外已有几个专利报道采用污泥作为主要原料发酵培养有用产品。例如，WO95/35365(1995)与CN 1772879A(2006)公开了以污泥作为发酵原料、以苏云金杆菌作为发酵菌种，采用液体深层发酵法生产生物杀虫剂。经文献与专利检索，尚未发现污泥发酵生产根瘤菌接种剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于弥补现有技术中的不足，提供一种利用城市污泥制备根瘤菌接种剂的方法。
本发明的另一个是提供上述制备方法所得到的根瘤菌接种剂。
为了实现上述目的，本发明通过液体深层发酵技术，具体包括如下步骤g/L是指每1L培养基液体中加入目标物的克数；％是指每百份质量的培养基液体中目标物的质量份数；V/V/分是指每分钟向1份体积的培养基中通入空气的体积份数；1)污泥培养基调理调节污泥含固率为1-5％，加入0.05-0.5％消泡剂，用酸或碱调pH为6.0-8.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟，冷却备用。所用的消泡剂是指泡敌、聚丙二醇、豆油、花生油等，最好是泡敌。所用的酸是指H2SO4、HCl或HNO3，其中最好是H2SO4，所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是NaOH。
2)摇瓶培养从保藏正常的根瘤菌斜面培养基上挑取一环根瘤菌接种到装有根瘤菌液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28-32℃，摇床转速150-250转/分，三角瓶装液量20-40％，培养时间18-36小时。本发明所用菌株为快生型大豆根瘤菌(Sinorhizobium fredii)ACCC15067、苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)ACCC17512，中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心购得。所用的根瘤菌液体培养基的成分为甘露醇10.0g；酵母膏3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO40.25g，CaCO33.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，氯化钠0.1g，蒸馏水1000mL，pH为6.8-7.0，在15磅压力与121℃下灭菌30分钟。所用的酸是指H2SO4、HCl或HNO3，其中最好是H2SO4；所用的碱是指NaOH、KOH或Ca(OH)2，其中最好是NaOH。
3)种子罐发酵以1-5％的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为1-5％污泥的种子罐，进行发酵培养。条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶0.8-1.2(V/V/分)、搅拌速度180-240转/分、发酵时间18-36小时。
4)发酵罐发酵按2-8％的接种量用压差法将菌液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中。培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、通气量1∶0.8-1.2(V/V/分)、搅拌速度180-240转/分、发酵时间48-72小时。
5)发酵液后处理发酵结束后，用传统的板框压滤或高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-6倍。浓缩液按5)①或5)②方式生产的液体与固体两种剂型的根瘤菌接种剂5)①是液体剂型用酸或碱调节pH为6.0-7.2，搅拌均匀，分装；5)②是固体剂型用酸或碱调节pH为6.0-7.2，按1∶1-3比例加入泥炭，搅拌均匀，分装；所述泥炭在与浓缩液混合前，需过孔径0.18毫米的标准筛，用氢氧化钠调pH值6.5-8.0，并高压湿热灭菌；泥炭灭菌的条件为15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
6)产品质量检验按中华人民共和国农业行业标准《根瘤菌肥料标准》(NY410-2000)进行。液体根瘤菌接种剂根瘤菌活菌数≥5.0×108个/mL，杂菌率≤5％，pH为6.0-7.2，有效期≥3月；固体根瘤菌接种剂水分含量为25-50％，根瘤菌活菌数≥2.0×108个/mL，杂菌率≤10％，pH为6.0-7.2，有效期≥6月。所述的根瘤菌活菌数、杂菌率、pH、水分含量与有效期的测定方法参照《根瘤菌肥料标准》(NY410-2000)。
本发明的技术原理是以污泥所含丰富的有机碳、氮和无机盐为营养物质，在适宜pH、温度与通气量的条件下，根瘤菌得以生长与增殖，发酵液经过适当后处理后制成根瘤菌接种剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)为城市污泥提供了一条崭新资源化处置途径，同时降低了根瘤菌接种剂的生产成本。
(2)与现有污泥处置技术相比，本方法不仅处置了污泥，而且可获得附加值较高的根瘤菌接种剂产品，从而降低了污泥处置成本。
(3)现有微生物灭蚊剂的生产原料主要是甘露醇、黄豆粉、葡萄糖、酵母膏等工农业产品，原料价格过高是其难于普及的主要限制因素。本发明中根瘤菌主要依靠城市污泥中自身的可利用成分(糖分、蛋白质与矿质盐等)生长与增殖，添加的成分较少，因而可降低发酵成本，促进根瘤菌接种剂的工业化生产与应用。
(4)本发明所得到的根瘤菌接种剂产品可制成液体或固体剂型，可有效促进豆科植物的结瘤与生物固氮，为豆科作物提供氮素营养，减少化学氮肥的施用，改善土壤的理化性状，提高作物的产量和质量。
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施例方式
实施例1、快生型大豆根瘤菌液体菌剂的制备1)城市污泥样品取广东省广州市某污水处理厂的浓缩污泥，该污泥的基本性质见表1。
表1.供试污泥基本性质
2)污泥培养基调理调节污泥含固率为3％，加入0.06％的泡敌，用H2SO4或NaOH调pH为6.5，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌60分钟，冷却备用。
3)摇瓶培养从快生型大豆根瘤菌ACCC15067斜面培养基上挑取一环根瘤菌接种到装有根瘤菌液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度30℃、摇床转速180转/分，500mL三角瓶装液量为200mL，培养时间24小时。所用的根瘤菌液体培养基的成分为甘露醇10.0g；酵母膏3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO40.25g，CaCO33.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，氯化钠0.1g，蒸馏水1000mL，pH为6.8，在15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
4)种子罐发酵以3％的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为3％污泥的种子罐，进行发酵培养。条件为罐温30℃，罐压0.06MPa，通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度180转/分，发酵时间24小时。
5)发酵罐发酵按5％的接种量将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中。培养条件为罐温30℃，罐压0.06MPa，通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间52小时。
6)发酵液后处理发酵结束后，用HCl或NaOH调pH为6.8，用板框压滤法浓缩1倍，发酵液用高速搅拌均匀，分装。
7)成品质量检验按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，按批抽样检验。检验方法按中华人民共和国农业行业《标准根瘤菌肥料标准》(NY410-2000)进行。经检验，根瘤菌活菌个数为6.5×109个/mL，杂菌率为0.02％，pH为6.9，该产品为合格产品，可用于大豆接种。
实施例2、快生型大豆根瘤菌固体菌剂的制备1)城市污泥样品同实施例1。
2)污泥培养基的调理调节污泥含固率为5％，加入0.5％的花生油，用H2SO4或NaOH调pH为7.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30分钟，冷却备用。
3)摇瓶培养从快生型大豆根瘤菌ACCC15067斜面培养基上挑取一环根瘤菌接种到装有根瘤菌液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度29℃、摇床转速160转/分，500mL三角瓶装液量为150mL，培养时间36小时。所用的根瘤菌液体培养基的成分为甘露醇10.0g；酵母膏3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO40.25g，CaCO33.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，氯化钠0.1g，蒸馏水1000mL，pH为7.0，在15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
4)种子罐发酵以1％的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为5％污泥的种子罐，进行发酵培养。条件为罐温28℃、罐压0.05MPa、通气量1∶1.1(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间32小时。
5)发酵罐发酵按2％的接种量将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中。培养条件为罐温30℃、罐压0.05MPa、通气量1∶1.1(V/V/分)、搅拌速度180转/分、发酵时间64小时。
6)发酵液后处理发酵结束后，用HCl或NaOH调pH为7.0，用高速离心法浓缩4倍，以1∶2的比例加入灭菌泥炭，搅拌均匀，分装。所述泥炭在与浓缩液混合前，需过孔径0.18毫米的标准筛，用1mol/L NaOH调pH值6.2，并高压湿热灭菌；泥炭灭菌的条件为15磅压力与121℃下灭菌40分钟。
7)成品质量检验按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，按批抽样检验。检验方法按中华人民共和国农业行业《标准根瘤菌肥料标准》(NY410-2000)进行。经检验，根瘤菌活菌数为5.1×109个/mL，杂菌率为1.5％，pH为6.3，水分含量为35％，该产品为合格产品，可用于大豆接种。
实施例3、苜蓿根瘤菌固体菌剂的制备1)城市污泥样品取广东省深圳市某污水处理厂的浓缩污泥，该污泥的基本性质见表2。
表2.供试污泥基本性质
2)污泥培养基的调理调节污泥含固率为1.5％，按0.2％的比例加入聚丙二醇，用H2SO4和NaOH调pH为6.8，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌50分钟，冷却备用。
3)摇瓶培养从苜蓿根瘤菌ACCC17512斜面培养基上挑取一环根瘤菌接种到装有根瘤菌液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度28℃、摇床转速200转/分，三角瓶装液量100mL/500mL，培养时间24小时。所用的根瘤菌液体培养基的成分为甘露醇10.0g；酵母膏3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO40.25g，CaCO33.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，氯化钠0.1g，蒸馏水1000mL，pH为7.0，在15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
4)种子罐发酵以2％的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为1.5％污泥的种子罐，进行发酵培养。条件为罐温29℃、罐压0.04MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间24小时。
5)发酵罐发酵按5％的接种量将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中。培养条件为罐温29℃、罐压0.04MPa、通气量1∶1.2(V/V/分)、搅拌速度200转/分、发酵时间60小时。
6)发酵液后处理发酵结束后，用HCl或NaOH调pH为6.5，浓缩6倍，按1∶2.5的比例加入泥炭，搅拌均匀，分装。所述泥炭在与浓缩液混合前，需过孔径0.18毫米的标准筛，用1mol/L NaOH调pH值7.8，并高压湿热灭菌；泥炭灭菌的条件为15磅压力与121℃下灭菌40分钟。
7)成品质量检验按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，按批抽样检验。检验方法按中华人民共和国农业行业《标准根瘤菌肥料标准》(NY410-2000)进行。经检验，根瘤菌活菌数为8.5×109/mL，杂菌率为0.5％，pH为7.0，水分含量为32％，该产品为合格产品，可用于紫花苜蓿接种。
实施例4、苜蓿根瘤菌液体菌剂的制备1)城市污泥样品同实施例3。
2)培养基的调理调节污泥含固率为3％，加入0.2％的泡敌，用HNO3和Ca(OH)2调pH为7.0，搅拌均匀后，在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌60分钟，冷却备用。
3)摇瓶培养从苜蓿根瘤菌ACCC17512斜面培养基上挑取一环根瘤菌接种到装有根瘤菌液体培养基的三角瓶中，进行摇瓶培养。条件为温度29℃、摇床转速240转/分，500mL三角瓶装液量为150mL，培养时间20小时。所用的根瘤菌液体培养基的成分为甘露醇10.0g；酵母膏3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO40.25g，CaCO33.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，氯化钠0.1g，蒸馏水1000mL，用酸或碱调pH为6.9，在15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
4)种子罐发酵以4％的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为3％污泥的种子罐，进行发酵培养。条件为罐温30℃、罐压0.06MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间32小时。
5)发酵罐发酵按5％的接种量将培养液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中。培养条件为罐温30℃、罐压0.05MPa、通气量1∶1.0(V/V/分)、搅拌速度220转/分、发酵时间52小时。
6)发酵液后处理发酵结束后，用板框压滤法浓缩1倍，搅拌均匀，分装。
7)产品质量检验按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，按批抽样检验。检验方法按中华人民共和国农业行业《标准根瘤菌肥料标准》(NY410-2000)进行。经检验，根瘤菌活菌数4.8×109/mL，杂菌率为0.1％，pH为7.2，该产品为合格产品，可用于紫花苜蓿接种。
权利要求
1.一种利用城市污泥制备根瘤菌接种剂的方法，其特性在于包括如下步骤(1)污泥培养基调理调节污泥的含固率为1-5％，加入0.05-0.5％消泡剂，用酸或碱调pH为6.0-8.0，搅拌均匀后，灭菌，冷却备用；(2)摇瓶培养将根瘤菌接种到装有根瘤菌液体培养基的瓶中，进行摇瓶培养，培养条件为温度28-32℃，摇床转速150-250转/分，瓶装液量20-40％，培养时间18-36小时；(3)种子罐发酵以1-5％的接种量将摇瓶菌液移入装有含固率为1-5％污泥的种子罐，进行发酵培养，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的0.8-1.2倍、搅拌速度180-240转/分、发酵时间18-36小时；(4)发酵罐发酵按2-8％的接种量将菌液从种子罐移至已灭菌冷却的发酵罐培养液中，培养条件为罐温28-32℃、罐压0.02-0.06MPa、每分钟的通气量为培养基体积的0.8-1.2倍、搅拌速度180-240转/分、发酵时间48-72小时；(5)发酵液后处理发酵结束后，用板框压滤或高速离心法浓缩发酵液，浓缩倍数为1-6倍；将浓缩液调节pH为6.0-7.2，搅拌均匀，分装，得到液体剂型根瘤菌接种剂；将浓缩液调节pH为6.0-7.2，按1∶1-3比例加入泥炭，搅拌均匀，分装，得到固体剂型根瘤菌接种剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消泡剂为泡敌、聚丙二醇、豆油或花生油。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中所述的酸为H2SO4、HCl或HNO3。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中所述的碱为NaOH、KOH或Ca(OH)2。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的灭菌是指在种子罐或发酵罐中经15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的根瘤菌为快生型大豆根瘤菌或苜蓿根瘤菌。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的根瘤菌为快生型大豆根瘤菌。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的根瘤菌液体培养基的成分为甘露醇10.0g；酵母膏3.0g，KH2PO40.25g，K2HPO40.25g，CaCO33.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，氯化钠0.1g，蒸馏水1000mL，调pH为6.8-7.0，在15磅压力与121℃下灭菌30分钟。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述泥炭在与浓缩液混合前，需过孔径0.18毫米的标准筛，用氢氧化钠调pH值6.5-8.0，并高压湿热灭菌，灭菌的条件为15磅压力与121℃下灭菌30-60分钟。
10.利用权利要求1～9任一项所述方法得到的根瘤菌接种剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用城市污泥制备的根瘤菌接种剂及其制备方法。本发明采用液体深层发酵方法，包括污泥培养基调理、摇瓶培养、种子罐发酵、发酵罐发酵、发酵液后处理与产品质量检验等过程。本发明不仅为处置了污泥，而且可获得附加值较高的根瘤菌接种剂产品，从而降低了污泥处理处置成本。所得到的根瘤菌接种剂产品为液体或固体剂型，可有效促进豆科植物的结瘤和固氮，为豆科作物提供氮素营养，减少化学氮肥的施用，改善土壤的理化性状，提高作物的产量和质量。
文档编号C12R1/41GK1916162SQ20061003754
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月7日 优先权日2006年9月7日
发明者周顺桂, 王跃强 申请人:广东省生态环境与土壤研究所