专利名称：：检测高危型人乳头瘤病毒的方法及试剂盒的制作方法检測高危型人乳头癍病毒的方法及试剂盒所属领域本发明涉及检测临床样品中人乳头瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术检测临床样品中高危型人乳头瘤病毒，以为诊断宫颈癌、尖锐湿疣提供实验室依据的临床检测方法及完成该方法所使用的试剂盒。发明背景宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。近年，随着生活方式的改变，宫颈癌患者的发病年龄更趋年轻化，并且病例数有不断上升的趋势。宫颈癌是目前唯一一种发病原因比较清楚的的肿瘤，主要病因是由高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续或反复感染所致[Walb(還ers肌JacobsMV,ManosMM,eta丄H丽npapillomavirusisanecessarycauseofinvasivecervicalcancerworldwide.JPathol,1999:189(1):50-53]。目前确定的HPV型别约有80个，依其感染的上皮所在部位分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV，其中约35个型别涉及生殖道感染。依据不同型别HPV与宫颈癌发生危险性的高低，又分为低危险型HPV和高危型HPV，约20个型别与肿瘤相关。在世界范围内，宫颈癌主要危害那些未进行高危型人乳头瘤病毒筛查的妇女。研究表明，HPV16、18型与宫颈癌高度相关，31、33和35型中度相关。HPV型别分布有地域差别，在中国人群中，HPV16、52、58型相对多见。HPV的阴性预测价值达100%，即无HPV感染时可基本排除宫颈癌的发生。宫颈癌早期手术治疗效果极佳，以预防为主的策略作为降低宫颈癌死亡率的主要途径是简单而有效的[NobbenhuisMAE，WalboomersJ固，HelmerhorstTJM，etal.Relationofhumanpapi1lomavirusstatus1.0cervicallesionsandconsequencesforcervical-cancerscreening:aprospectivestudy.Lancet，1999:354:20-25]。如果能早期检查出并成功地治疗(特别是癌前千预性治疗)发生在宫颈组织的癌前病变(可以潜伏多年)，就可有效地阻断癌前病变向宫颈癌的发展。人乳头瘤病毒感染病例的诊断主要依靠实验室检查。实验室检查包括细胞形态学检测和分子生物学检测(测序、原位杂交、杂交捕获、PCR等)。细胞形态学检测方法灵敏度与特异性均较低，受操作者的主观影响比较大；测序、原位杂交技术复杂，对操作者的要求较高，在临床应用中受到限制；杂交捕获方法已被美国FDA批准并已应用于临床，但该方法成本高、操作复杂、存在假阳性，因此也限制了其在宫颈癌普查中的大规模应用；定性PCR方法虽然灵敏度高并能对病毒进行早期检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而也限制了它的临床使用。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的(终点检测)PCR技术相比，实时定量检测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。实时荧光PCR技术是在聚合酶链反应(PCR)体系中加入荧光标记探针，使用一种带有电荷偶联装置(CCD)的PCR扩增仪，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平。CCD能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，并通过软件分析汇总到工作站得到扩增曲线。通过对扩增曲线以及循环阈值(Ct)的分析，能够对被检样品进行定性和定量分析。TaqManPCR技术是实时荧光PCR的一种(MackayIMa/.Real-timePCRinvirology..NucleicAcidsRes.20025;30(6):1292-1305;Lie,Y.S.,Petropoulos,C丄，AdvancesinquantitativePCRtechnology:5'nucleaseassays.CurrentOpinioninBiotechnology1998.9,4348.)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有耙序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定耙核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性，一个关键性的基本技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本发明人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，将该技术应用于人乳头瘤病毒的所有已知变异体之基因组多核苷酸的检测和定量分析，成功地完成了本发明。
发明内容本发明的一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测样品中HR-HPV病毒的方法，该方法包括(1)提供包括样品、核酸扩增体系和荧光监测体系在内的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的耙多聚核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，并结合定量标准曲线确定靶多聚核苷酸的存在及其相对量(即靶核酸序列的拷贝数)；其中核酸扩增系统包括可与靶聚多核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光实时监测系统包括一个可与靶多聚核苷酸特异性结合的寡核苷酸探针；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，(SEQIDNO:1)、5，-gacaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDN0:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3，(SEQIDN0:3)和5，-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4),并且所使用的寡核苷酸探针是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3,(SEQIDNO-5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的样品是可疑高危型HPV感染者的临床样品。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的高危型HPV选自中国人群中常见的、与宫颈癌发生发展有关系的各型HPV。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的高危型HPV选自HPV16、18、31、33、35、39、45、52、58、59、67型。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶多聚核苷酸来自高危型HPV。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸扩增系统是聚合酶链反应，并且所说的扩增反应循环是大约重复40次的聚合酶链反应循环。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b)2'-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的荧光实时检测体系包括能够与耙多聚核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。根据本发明的一个优选实施方案，所说的方法进一步包括(1)确定样品中的靶多聚核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将己确定的样品中靶多聚核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量耙多聚核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中耙多聚核苷酸的量。本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中HPV的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有浓縮液、DNA提取液、纯水、PCR扩增反应液、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。其中浓缩液由PEG8000组成；DNA提取液由异硫氰酸胍、氢氧化钠、SDS组成的溶液。PCR反应管内为PCR体系，由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs、H20和缓冲液组成；稀释液为TE溶液。本发明的试剂盒中使用带有目的基因片段的重组质粒作为强阳性标准品，其浓度为lXl()S拷贝/ml，使用带有目的基因片段的重组质粒作为临界阳性标准品，其浓度为lXl()S拷贝/ml，并使用生理盐水作为阴性对照。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于耙多聚核苷酸扩增体系的正向和反向引物分别是5，一Ugatgaaaatggcaatcc一3'(SEQIDNO:1)、5'一gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5，-catcgtUtccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多聚核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸探针是5'_accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。本发明涉及实时定量荧光PCR方法及试剂盒，特别是涉及实时定性定量荧光聚合酶链反应方法及其试剂盒在中国人群中常见的高危型HPV感染的实验室诊断中的应用。本发明提供了一种使用实时荧光定量PCR技术定性定量检测临床样品中高危型HPV存在的方法，该方法包括(1)提供包括HPV基因组核酸的样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多聚核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的耙多聚核苷酸间接结合，(4)4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，并结合定量标准曲线确定耙多聚核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多聚核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光检测体系包括可与靶多聚核苷酸结合的寡核苷酸探针；特征在于所说的扩增反应中所使用的正向和反问寡核苷酸引物分别是5'-ttgatgaaaatggcaatec-3'(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcl,tc-3'(SEQIDNO:3)禾口5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)，并且所使用的寡核苷酸探针是5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5，-accacgtccttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。与基于扩增反应完成后进行单一终点检测的传统PCR方法不同，实时定量聚合酶链反应方法可以在扩增反应的进程中随时监测扩增产物的产生，从而大大提高了定量检测的准确性和精密度。众所周知，实时荧光定量PCR是在PCR扩增中同时加入引物和5'、3'末端分别标记有荧光报告基团(例如6-FAMamidite羧基荧光素6)和荧光淬灭基团(例如6-羧基四甲基若丹明)的特异性寡核苷酸探针。如果探针没有与靶序列互补结合，其序列保持完整，报告基团发射的荧光信号将被淬灭基团吸收，所以没有荧光信号产生；而当PCR扩增反应进行时，DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将降解荧光探针，导致荧光报告基团与荧光淬灭基团分离，因而荧光监测系统可接收并记录到荧光信号。每扩增一条DNA链即有一个荧光分子产生，从而实现荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，实时地监测整个PCR反应进程，并可借助标准曲线对未知靶多聚核苷酸(模板)进行定量分析。与通常的实时定量荧光PCR技术相似，本发明的检测样品中HPV病毒基因组双链靶多聚核苷酸存在的方法中同样包括U)提供包括(a)待检样品，(b)耐热DNA聚合酶和(c)2-脱氧核苷三磷酸(dNTP)的扩增反应体系，以及包括(a)能够与待检双链靶多聚核苷酸的第一条互补链结合的正向引物，(b)能够与待检双链靶多聚核苷酸的第二条互补链结合的反向引物，以及(c)能够与双链靶多聚核苷酸的任一条链结合并且两末端分别标记有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针的荧光检测体系；(2)通过一次或多次聚合酶链反应扩增所说的靶多聚核苷酸；(3)退火后使所说的荧光发生基团通过探针与靶多聚核苷酸的结合并在Taq酶的外切活性作用下释放荧光发生基团而产生荧光信号；(4)检测并确定荧光发生基团所产生的荧光量；(5)分析一次或多次扩增循环所发出的荧光量，以检测靶多聚聚核苷酸的存在；特征在于其中所说的靶多聚核苷酸是HPV基因组多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别5，-Ugatgaaaatggcaatec-3，(SEQIDNO:1)、5'-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDNO:2)、5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾口5，-catcgttttccttgtcctc-3，(SEQIDNO:4)，并且所使用的寡核苷酸探针是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecttgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的高危型HPV病毒，并能够准确有效地将高危型HPV病毒感染与低危型HPV病毒、单纯疱疹病毒2型、生殖支原体、巨细胞病毒、解脲脲原体、沙眼衣原体、淋病双球菌及其他常见泌尿生殖道感染病原体鉴别开来，设计并制备实现这些目的的寡核苷酸引物和探针是一个非常重要的技术环节。为此，我们在使用适当的核酸分析软件对已知HPV病毒型的基因组核苷酸序列进行同源性比较，并在找出同源区段的基础上，进一步使用适当的引物设计软件(例如PrimerPremier5.5)选择并设计具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物1:5，-ttgatgaaaatggee.atec-3,(SEQIDNO:1)，引物2:5，-gacaaaaacggaaatccagt-3'(SEQIDN0:2)，弓l物3:5'-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)禾U弓I物4:5'-catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4);以及具有下示序列的寡核苷酸探针5'-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3，(SEQIDNO:5)和5'-accacgtecUgagaaaaaggatt-3'(SEQIDNO:6)。引物所对应的扩增区段相当于HPV病毒E1基因编码序列的保守区，长度为107bp-120bp。所设计的这些引物和探针均具有互补于高危型HPV病毒基因组保守区的序列，而且与其他泌尿生殖道感染相关病原体的核苷酸序列没有同源性，也不包括任何常见的核酸内切酶，所以大大减少甚至避免了HPV病毒检测的假阴性和假阳性，提高了检测的可靠性和准确度。可使用DNA合成装置合成所需的寡核苷酸引物，用分子筛和快速蛋白质液相层析法(FPLC)纯化并进行氨解处理。同样合成所需的检测探针，氨解处理后分别在其5，端标记作为荧光发生基团(报道基团)的6-FAMamidite，并在其3'端标记带有活性连接臂的、作为荧光淬灭或抑制基团的TAMRA。以FPLC层析法纯化荧光标记的探针。然后，可使用变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶(20%)电泳法和分光光度法物理鉴定所合成的引物和探针。使用常规DNA提取方法或市售的DNA提取试剂盒，从得自受试者的宫颈脱落细胞样品中提取DNA用于后继的PCR扩增。在含有引物l、2、3和4(各10pmo1)、探针5和6(各3pmo1)、DNA模板(PCR扩增靶序列)、dNTPs(IOmM)、耐热DNA聚合酶(PlantiniumDNA聚合酶)、PCR缓冲液和水的反应体系中，使用ABI7000型或其他结构类型的自动荧光检测热循环仪对如上得到的DNA序列进行PCR扩增。所使用的反应条件是93'C预变性3分钟后，93°C30秒，55°C45秒，共进行40次循环。反应完成后，借助装置上配有的自动分析系统进行结果分析。在本研究中，如果循环阈(Ct)值等于或大于25,结果即为阴性；如果Ct值小于25，结果则为阳性。其中以反应的前10个循环所产生的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置为卜10个循环的荧光信号标准偏差的10倍。一般说来，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数呈线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。因为在扩增反应的Ct值之前的阶段，扩增系统中的酶、引物、探针和dNTPs均大大过量，而且系统的pH值和离子浓度等也相对稳定，所以此时扩增反应的效率是一个与模板数无关的饱和定值。与Ct值相关的只有起始模板数(多聚核苷酸样品的拷贝数)和与样品无关的PCR系统效率。可利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，其中以耙多聚核苷酸起始拷贝数的对数为横坐标，并以如上测得的Ct值为纵坐标。获得未知量靶多聚核苷酸的Ct值后，即可从基于平行实验得到的数据制作的标准曲线上得知其起始拷贝数的对数，然后计算出该靶多聚核苷酸的起始拷贝数(当扩增循环达到Ct值即初始进入指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一靶多聚核苷酸在不同时间扩增或同一时间在不同管内扩增所得到的Ct值总是恒定的)。也就是说，为了基于上述的扩增反应结果推算出靶多聚核苷酸的量(起始拷贝数)，本发明的方法还应进一步包括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多聚核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多聚核苷酸的阈循环次数相比较，从而计算出样品中靶多聚核苷酸的量。本发明的另一个目的是提供一种使用实时荧光定量PCR技术定量检测临床样品中高危型HPV病毒的试剂盒，该试剂盒包括(l)分别装有浓縮液、DNA提取液、纯水、含有本领域已知的常规成分的PCR扩增反应液、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和DNA阳性对照品并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。根据本发明的一个优选实施方案，其中浓縮液用于浓縮液态待检样品。根据本发明的另一个优选实施方案，其中稀释液用于稀释阳性定量标准品。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多核苷酸扩增体系的正向和逆向引物引物分别5'—Ugatgaaaatggcaatcc-3'(SEQIDNO:1)、5'—gficaaaaacggaaatccagt-3，(SEQIDNO:2)、5，-categgtgtctgcatcttc-3'(SEQIDNO:3)和5'—catcgttttccttgtcctc-3'(SEQIDNO:4)。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于靶多聚核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是5，-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'(SEQIDNO:5)禾口5，-accacgtecttgagaaaaaggatt-3，(SEQIDNO:6)。可按照如上所述的步骤或试剂盒中所附使用说明书中指出的方法使用本发明的试剂盒。如前所述，为了检测出临床样品中可能存在的高危型HPV病毒，并准确有效地将高危型HPV病毒感染与低危型HPV病毒、单纯疱疹病毒2型、生殖支原体、巨细胞病毒、解脲脲原体、沙眼衣原体、淋病双球菌及其他常见泌尿生殖道感染病原体鉴别开来，本发明基于对不同型别HPV和相关病毒基因组核苷酸序列的同源性比较，特别设计了适用本发明试剂盒的寡核苷酸引物和探针。使用这些引物和探针完成的实时定量检测，大大减小了高危型HPV病毒多核苷酸检测的假阳性和假阴性。我们的实验证明，本发明检测高危型HPV病毒基因组核苷酸的精确度几乎为100c/。，灵敏度达到102个拷贝。值得特别说明的是，为了确保本发明的高危型HPV病毒检测方法的准确性，我们还使用携带有HPV病毒核苷酸序列的重组质粒作为DNA定量检测标准品。借助这些标准品并使用本发明的试剂盒，在相同条件下进行平行检测并制作所谓的外标定量标准曲线，以进一步验证本发明试剂盒的检测精确度和准确性，并作为生产本发明试剂盒的附加的质量控制标准。图l显示(Stdcurve)窗口下的标准曲线。针对模板数为102107拷贝的反应体系进行T叫ManPCR分析。当拷贝数为100时，被检样品的Ct值在25左右，即检测下限灵敏度可到达100拷贝。图2显示强中弱三份阳性标本的检测曲线。三份标本的Ct值分别是25.95、21.45和13.47;结合扩增曲线呈S形，即可判定三份样品均为阳性。图3显示阴性标本的检测曲线。三个标本的扩增曲线为较平直的折线，与荧光检测阈值线没有交点，或者显示Ct值在2530之间的范围内，并且扩增曲线不具有S形特征。图4显示HPV16、18、31、33、52、58型等标本的检测曲线，标本均经反向斑点杂交和测序确认为相应型别。扩增曲线呈S形，可判定被检样品均为阳性。图5显示阳性标本重复性实验的检测曲线，可看出不同的曲线均在同一CT值范围内，此结果表明试剂盒具有良好的重复性。具体实施方式实施例l:高危型人乳头瘤病毒检测试剂盒及其使用(1)制备包括下列组成成分的试剂盒DNA提取液(500pl/管)l管、PCR反应管(未贴标签管)IO管、H20(2000pl/管)l管、强阳性标准品(50pl/管)l管、临界阳性标准品(50ulZ管)l管、阴性对照(50pl/管)l管。(2)标本采集、运送和保存以无菌棉拭子或宫颈刷取疑似人乳头瘤病毒感染患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，置于低温冰箱(一70'C或一20°C)内冷冻保存。如集中检验，标本需在(TC以下环境中运送并于24小时内送达实验室。(3)检测步骤和结果分析-宫颈刷、宫颈拭子加入lml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子。吸取全部液体转至1.5ml离心管中，12，000离心5分钟。去上清，沉淀直接加入50n1DNA提取液充分混匀(由于提取液内含有不溶于水的物质，故取样时需先用加样器充分混匀；如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪掉一截)。10(TC加热处理10分钟(误差不超过1分钟)后，12,000rpm离心5分钟，取上清液2y1用于PCR反应。组织活检、切片标本用适量灭菌生理盐水洗去送检组织沾带的血液，取约50mg组织，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆并转移至1.5ml离心管中.12，000rpm离心5分钟后，去上清，向沉淀物中加入50ulDNA提取液充分混匀，IO(TC恒温处理10分钟(误差不超过1分钟)。12,OOOrpm离心5分钟后，收集上清液2ii1用于PCR反应。将强阳性标准品6000rpm离心15秒，加入稀释液450ul，充分混匀后标示为105。然后另取3支新的0.5ml离心管，对标准品依次进行10倍梯度稀释(分别标示为104、103、]02)，-2(TC保存备用。然后分别取待检样品(每份2ul)、同体积的定量标准品和阴性对照品，加样于PCR反应体系中进行PCR扩增。PCR循环条件是93。C预变性3分钟，93°C45秒，55'C60秒，进行10次循环，此!O个循环内不检测荧光信号；93°C30秒，55。C45秒，进行30次循环，在反应的延伸阶段检测荧光信号。反应结束后保存检测数据文件。调节分析参数，使标准曲线(Stdcurve)窗口下的标准曲线图达到最佳(即相关性数值<-0.95)(参见图l)。由图2和图3可分别看出，阳性标本的荧光曲线与设定的阈值线有一交点，而阴性标本的荧光曲线则低于阈值。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)，即标本中HPV病毒的DNA含量(参见图2和3)。实施例2:对确定HPV型别的标本进行检测具体步骤同实施例l，不同的是所用标本均经反向斑点杂交和测序确认为HPV16、18、31、33、52、5趣，HPV16、18、31、33、52、58型是中国人群感染最多的型别。标本提取核酸后用本发明的试剂盒进行PCR扩增，在扩增的同时由仪器自动监测并收集荧光信号的变化。反应结束后分析，应用本发明的试剂盒均能检测出已知型别的标本(参见图4)。实施例3:临床标本检测的重复性测试具体步骤同实施例l，不同的是所用标本为确定阳性的标本。提取核酸后用本发明的试剂盒进行PCR扩增，每一份标本设置多个复管。在扩增的同时由仪器自动监测并收集荧光信号的变化。反应结束后分析，应用本发明的试剂盒检测结果显示同一标本不同的曲线均在同一CT值范围内，此结果表明试剂盒具有良好的重复性。(参见图5)。实施例4:20份临床标本检测并与其他药盒的比较20例临床标本取自广东省人民医院，具体步骤同实施例l，不同的是所用标本同时用西班牙BIOTOOLS國Labs,S.A.公司BIOPAPQTS试剂盒检测，该试剂盒已经通过欧盟CE认证，能够检测常见的高危型人乳头瘤病毒。BIOPAPQTS试剂盒使用荧光染料的方法对临床标本进行实时定量检测。通过比较本发明中所说的试剂盒与BIOPAPQTS试剂盒在临床标本检测所得的结果，来鉴定本发明所说试剂盒在临床检测中的有效性。表1:本发明中的试剂盒与BI0PAPQTS试剂盒检测结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>上表中'一'表示试剂盒检测均为阴性，CT值表示标本中的靶多核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数。如上表，两种方法得到的结果进行对比，显示了良好的一致性，说明了本发明试剂盒的高可信性。由于本发明使用荧光探针，较染料法有更高的特异性；本发明的试剂盒较目前市场上使用的美国Digene公司杂交捕获(hybridcapureII，HCII)方法在对仪器和操作人员的要求方面更易应用，检测的灵敏度也高于杂交捕获方法。序列表<U0>中山大学安达基因股份有限公司<120>检测高危型乳头瘤病毒的方法及试剂盒<140><141><160>6<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>1ttgatgaaaatggcaatcc<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>2geicaaaaacggsaatccagt<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>3catcggtgtctgcatcttc<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。<400>4catcgttttccttgtcctc<210>5<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增过程中检测荧光信号增长的探针。<400>5accatgtcctttcaaaaaaacatttc<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增过程中检测荧光信号增长的探针。<400>6accacgtccttgagaaaaaggatt权利要求1一种使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测样品中常见高危型HPV病毒存在的方法，该方法包括(1)提供包括HPV病毒基因组核酸的样品、核酸扩增体系，和荧光监测体系的反应与检测混合物，(2)通过扩增反应循环扩增所说的靶多聚核苷酸，(3)使所说的荧光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合，(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，并结合定量标准曲线确定靶多聚核苷酸的存在及其相对量；其中核酸扩增体系包括可与靶多聚核苷酸结合的寡核苷酸引物，并且荧光检测体系包括可与靶多聚核苷酸结合的寡核苷酸探针；特征在于所说的扩增反应中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分别是5’-ttgatgaaaatggcaatcc-3’(SEQIDNO1)、5’-gacaaaaacggaaatccagt-3’(SEQIDNO2)、5’-catcggtgtctgcatcttc-3’(SEQIDNO3)和5’-catcgttttccttgtcctc-3’(SEQIDNO4)，并且所使用的寡核苷酸探针是5’-accatgtcctttcaaaaaaacatttc-3’(SEQIDNO5)和5’-accacgtccttgagaaaaaggatt-3’(SEQIDNO6)。2、根据权利要求1的方法，其中所说的核酸扩增体系包括(a)耐热DNA聚合酶、(b)2，-脱氧核苷三磷酸、(c)能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向引物，和(d)能够与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向引物。3、根据权利要求1的方法，其中所说的荧光检测体系包括能够与靶多聚核苷酸结合并且两末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。4、根据权利要求1的方法，所说的方法进一步包括(1)确定样品中的靶多聚核苷酸经扩增后所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的阈循环次数；(2)将已确定的样品中靶多聚核苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量耙多聚核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶多聚核苷酸的量。5、根据权利要求1的方法，其中所说的高危型HPV病毒是中国人群中常见的宫颈癌相关人乳头瘤病毒。6、根据权利要求l的方法，其中所说的高危型人乳头瘤病毒选自16、18、31、33、35、39、45、52、58、59和67型人乳头瘤病毒。7、根据权利要求l的方法，其中所说的靶多聚核苷酸来自中国人群中常见的高危型人乳头瘤病毒。8、使用实时荧光定量聚合酶链反应技术定量检测临床样品中高危型人乳头瘤病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)分别装有浓縮液、DNA提取液、纯水、扩增反应液、稀释液、阴性对照样品、强阳性标准品和加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，特征在于其中用于靶多聚核苷酸扩增体系的正向和反向引物分别是5'-ttgatgaaaatggcaatcc-3，,5，_gacaaaaacggaaatccagt-3，，5'-catcggtgtctgcatcttc-3'，5'-catcgtUtccttgtcctc-3;其中用于耙多聚核苷酸扩增和监测体系的寡核苷酸是5'-accatgtectttcaaaaaaacatttc-3'禾口5'-accacgtecttgagaaaaagga1t_3'。全文摘要本发明涉及检测临床样品中宫颈癌、尖锐湿疣的病原体—高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)存在的方法及试剂盒，特别是涉及以实时定量荧光聚合酶链反应技术诊断HR-HPV感染的方法及所使用的试剂盒。文档编号C12Q1/68GK101130824SQ200610037188公开日2008年2月27日申请日期2006年8月25日优先权日2006年8月25日发明者何蕴韶,王伟毅,王方金,钢程申请人:中山大学达安基因股份有限公司