专利名称：一种原核分泌表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程表达载体，具体的说，涉及一种原核分泌表达载体及其应用。
背景技术：
基因工程中可通过真核或原核表达系统以获得外源基因表达产物。原核表达是一类在E.coli等原核细胞中以发酵表达重组蛋白的方式，引起操作相对简便，表达快速、高效而在实践中被广泛采用，是目前最成熟的表达系统。
原核表达大体可分为三类非融合表达、融合表达和分泌表达。以非融合方式表达外源基因时，所得到重组蛋白的氨基酸序列与目的产物一致。但此种方式对翻译起始序列的二级结构要求十分严格，不同的二级结构表达量可相差几个数量级，并且表达的多肽往往不能够正确折叠，表达产物大部分归于不具有任何生物活性的包涵体形式，及时通过繁琐的包涵体复性处理后，活性产物的得率仍十分低。融合表达利用了一类特定的融合伴体与外源蛋白融合，协助外源蛋白的正确折叠，容易获得较高水平的表达，同时表达产物的水溶性一般较好。但是在融合蛋白的纯化过程中必须将融合伴体切除以获得外源蛋白的单体。通常使用化学裂解或酶解法。化学裂解(溴化氰等)产物难以得到蛋白的天然构象；酶解法(凝血酶、胰蛋白酶等)切割效率低，产物的最终收率仍有待提高。
分泌表达是一种比较先进的表达方式。通过将一段信号肽序列嵌合到目的基因上游，蛋白质的转运和定位序列得以整合到表达产物新生肽的N端序列上，它们与细胞膜或质膜的特异受体识别并结合，引导目的多肽分泌到细胞外周质或培养基中，分泌完成后，信号肽被E.coli基因组编码的信号肽酶切除。
然而，现有的分泌表达载体只注意到利用信号肽协助蛋白质的转运和定位，而不具有帮助蛋白质正确折叠和装配的能力。少数信号肽或引导肽(如DsbA/C)可能同时兼具有催化折叠的功能，但这些序列本身十分短小，在共翻译运输的模型中，合成的新生肽N端与膜上受体相结合，此时肽链形成天然构象或亚基装配成复合物之前，它们原来包埋在蛋白质中心的疏水区瞬间会暴露而错误折叠或聚集形成不正确的产物，导致活性蛋白的表达量下降。
发明内容
本发明的目的在于克服现有分泌表达载体存在的不足，提供一种在表达外源基因时能有效提高表达产物的正确折叠率和水溶性的原核分泌表达载体。
本发明的另一个目的是提供上述原核分泌表达载体在表达外源基因中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案本发明通过信号肽将新生多肽引导到细胞周质，在确保分泌型表达载体的高效率的前提下，利用分子伴侣能够帮助蛋白质正确装配的特性，避免多肽链在胞内细胞周质错误折叠或聚集成包涵体，使新生肽保持输出天然活性的构象，同时，串联的第二信号肽，加强目的蛋白的导引，更有利于其的跨膜转运。最后，在转运完成后，伴体蛋白和信号肽序列可以在周质中被切除，从而直接获得所需要的外源蛋白表达产物。
本发明的原核分泌表达载体，含有一种特定的核苷酸片断，该核苷酸片断由启动子和双信号肽-伴体蛋白的复合装置构成。
双信号肽-伴体蛋白的复合装置的结构如下5’(启动子)信号肽序列-伴体蛋白-信号肽序列-多克隆位点3’所述信号肽序列为gene III。Gene II编码pIII蛋白，一种来源于纤维状噬菌体的外壳蛋白。pIII是由18个氨基酸组成N段信号序列，可以定位原核表达系统将重组蛋白引导到周质空间(Boeke and Model，1982；Boeke et al.，1982；Davis et al.，1985；Rapoza and Webster，1993)。
所述伴体蛋白是大肠杆菌硫氧化还原蛋白(thioredoxin，Trx)。Trx是12kDa的小蛋白，构象严密，热稳定性好，在胞内可协助蛋白正确折叠，其保守序列(Trp-Cys-Gly-Pro-Cys-Lys)中有两个半胱氨酸残基，可作为氢供体还原其他蛋白中的二硫键，调节靶蛋白巯基的状态。Trx含量可占细菌总蛋白的40％而不被细菌蛋白酶降解，十分有利于驱动二硫键形成。二硫键对蛋白的可溶性起到重要的作用。需要注意的是，对于分泌表达而言，引导端是必须的，但并不足以使之运输到周质中。E.coli中蛋白跨膜运输的原理目前尚不完全清楚。然而，一个明显的因素是空间运输取决于目的蛋白的成熟结构域，它可被负责输出的蛋白伴侣SecB所识别(Wickner et al，1991)。由此可见，一个分子内伴侣Trx的存在可能同时增强了跨膜转运的效率。
所述的启动子可以是araBAD启动子(包括araC元件)，也可以是其它启动子如T7或T71ac等。
5’(araBAD启动子)geneIII-Trx-gene III-多克隆位点3’的双gene III-Trx复合装置的分泌表达质粒pGTG。该质粒的分泌表达系统同时具有信号肽和分子内伴侣的特征。3’端gene III编码蛋白作为新生肽N段序列协助多肽链定位到膜上受体，Trx防止胞内的错误折叠并帮助细胞质内二硫键的形成。当转运完成后，5’端gene III编码蛋白被宿主菌信号肽酶切除，从而脱离外源蛋白。通过优化多克隆位点与内切酶的选择，可使双gene III-Trx复合装置与外源基因之间的连接序列减到最低。
上述核苷酸片断的核苷酸序列如下 ATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCATGGATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGTCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCAAGCTTCCCGGGGGGCCCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAG
CCATAGCACCATGGAGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA本发明的原核分泌表达载体还含有高拷贝复制原点，如pUC复制原点。
将rhEGF编码基因插入到质粒pGTG的多克隆位点中，转化E.coli并诱导表达，便可实现rhEGF的高效分泌表达。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明结合了融合表达和分泌表达的优点，同时具备高表达效率、产物高正确折叠率、高水溶性、纯化简易的特征，免去了以往复性、切割等繁琐步骤，一步获得重组蛋白。该方法大大提高了重组蛋白或多肽表达的效率，降低了成本，尤其适用于如rhEGF等富含二硫键、水溶性较差的异源多肽和蛋白活性物质的生产。
图1为gene III-Trx复合装置和多克隆位点的序列图；图2为融合表达载体pGTG的构建示意图；图3为TOP10/pGTG-rhEGF的重组蛋白rhEGF表达的SDS-PAGE分析图。
其中，图3中，1为分子量标准；2为IPTG诱导空载体pET 32a；3为未经诱导的重组质粒；4为经诱导的重组质粒。
具体实施例方式
实施例1 含双gene III-Trx复合装置的重组质粒pGTG的构建1、大肠杆菌Trx基因的PCR扩增合成如下一对引物(SEQ ID NO2)(1)5’-CATGCCATGGATATGAGCGATAAAAATTATTCACCTGAC-3’
(2)5’-CCCCCGGGGGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3’以E.coli K12基因组为模版扩增Trx基因。为方便克隆，在5’端引入NcoI酶切位点，在3’端引入XmaI酶切位点。
2、gene III信号肽的PCR扩增合成如下一对引物(SEQ ID NO3)(1)5’-CCCCCCGGGATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTG-3’(2)5’-CATGCCATGGTGCTATGGCTATAGAACGGCACCACCAGCGGAAT-3’利用PCR技术扩增gene III信号肽。为方便克隆，在5’端引入XmaI酶切位点，在3’端引入NcoI酶切位点。以上PCR反应参照Sambook方法进行。(Sambook，et al.1989.Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold springHarbor Laboratory Press.USA)3、双gene III-Trx复合装置的组装经PCR扩增得到的Trx基因和gene III信号肽通过琼脂糖凝胶电泳检测回收，用NcoI和XmaI双酶切，得到具有3’端XmaI粘端的Trx基因和具有5’端XmaI粘端的gene III信号肽基因。使用T4 DNA连接酶将二者同时插入到pBAD/gIII A(购自Invitrogen Corp.)的NcoI酶切位点，得到含双重geneIII-Trx复合装置的重组质粒pGTG。gene III-Trx复合装置和多克隆位点的序列结构如图1，融合表达载体pGTG的构建如图2。
实施例2 重组人表皮生长因子分泌表达载体pBAD-GTG-rhEGF的构建与rhEGF的分泌表达1、设计四对引物，通过全基因合成，得到重组人表皮生长因子(rhEGF)编码基因，将rhEGF基因插入pGTG的多克隆酶切位点中，得到重组人表皮生长因子分泌表达载体pGTG-rhEGF。
2、将分泌表达质粒pGTG-rhEGF转化到表达宿主菌E.coli TOP10，筛选阳性克隆，接种20ml含Amp的培养液，37℃振荡过夜培养，把过夜培养的菌液按1∶100接种于1L LB培养液中，加50mg/ml的Amp(1μl/ml)，37℃振荡培养5-6h，至OD600＝0.5-0.6。加2ml，0.02ml的诱导剂果糖(1mg/ml)，37℃培养4h。将表达后菌体溶于高渗液(含20mmol/L Tris(pH8.0)，2.5mmol/LEDTA，20％蔗糖)，4℃放置15min后，9000rpm离心10min，吸去上清，加入与高渗液等体积的4℃预冷的低渗液混匀，冰上放置30min，13000rpm离心10min，上清液为渗透休克释放的蛋白。采用改进的SDS-PAGE方法，设制0.46mol/LTris-0.047mol/Lglycine(pH 9.5)+1.0g/LSDS连续缓冲体系，在分离胶T＝15％(C＝3％)和浓缩胶T＝4％(C＝3％)时，分析目的蛋白表达部位和溶解性，结果见图3，说明TOP10/pGTG-rhEGF的重组蛋白rhEGF表达能被信号肽引导而分泌到细胞周质中，绝大部分以水溶性的目的蛋白存在。
3、表达和纯化后rhEGF的生物活性检测纯化后rhEGF可通过MTT(3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑)微量酶反应比色法测定其细胞增值活性。取生长旺盛的人结肠上皮细胞系T84细胞用0.03％胰酶消化制细胞悬液，以含10％胎牛血清DEME/F12培养液稀释成1×105个/ml，以每孔100μl加入96孔培养板。37℃、5％CO2培养24小时，吸弃上清培养液，加入无血清的DEME/F12，培养24小时。每孔加入不同浓度并已经millipole过滤除菌的rhEGF(终浓度为7，70，700，7000ng/ml)，每一浓度设三个复孔，并设对照孔(未加药物)和空白孔(未加细胞)，继续培养72小时，每孔加MTT(1mg/ml)100μl，37℃反应4小时后经板式离心，弃去培养液及未反应MTT，每孔加入100μl二甲亚砜，反应30分钟后，测每孔570nm波长处A值(吸光度)。增殖促进效果＝(添加因子组/未添加因子组)×100％。统计分析采用SPSS软件进行方差分析，结果表明rhEGF浓度为700～7000ng/ml对T84上皮细胞增殖有促进作用，与对照组相比，均有显著的增殖作用，其中浓度为700ng/ml具有最大促增殖效果，见表1。
表1 不同浓度rhEGF对人结肠上皮细胞系T84细胞增殖的作用
*P＜0.05，**P＜0.01
一种原核分泌表达载体及其应用序列表SEQUENCE LISTING<110>中山大学<120>一种原核分泌表达载体及其应用<130>
<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>519<212>DNA<213>人工序列<400>1atgaaaaaac tgctgttcgc gattccgctg gtggtgccgt tctatagcca tagcaccatg 60gatgagcgat aaaattattc acctgactga cgacagtttt gacacggatg tactcaaagc120ggacggggcg atcctcgtcg atttctgggc agagtggtgc ggtccgtgca aaatgatcgc180cccgattctg gatgaaatcg ctgacgaata tcagggcaaa ctgaccgttg caaaactgaa240catcgatcaa aaccctggca ctgcgccgaa atatggcatc cgtggtatcc cgactctgct300gctgttcaaa aacggtgaag tggcgtcggc aaccaaagtg ggtgcactgt ctaaaggtca360gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc caagcttccc ggggggccca tgaaaaaact420gctgttcgcg attccgctgg tggtgccgtt ctatagccat agcaccatgg agctcgagat480ctgcagctgg taccatatgg gaattcgaag ctttctaga 519<210>2<211>
<212>DNA<213>引物<400>25’-CATGCCATGGATATGAGCGATAAAAATTATTCACCTGAC-3’5’-CCCCCGGGGGCCAGGTTAGCGTCGAGGA-3’<210>3<211>
<212>DNA<213>引物<400>35’-CCCCCCGGGATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTG-3’5’-CATGCCATGGTGCTATGGCTATAGAACGGCACCACCAGCGGAAT-3’
权利要求
1.一种原核分泌表达载体，其特征在于含有一种特定的核苷酸片断，该核苷酸片断由启动子和双信号肽-伴体蛋白的复合装置构成。
2.如权利要求1所述的原核分泌表达载体，其特征在于所述双信号肽-伴体蛋白的复合装置的结构如下所示5′信号肽序列-伴体蛋白-信号肽序列-多克隆位点3′。
3.如权利要求1所述的原核分泌表达载体，其特征在于所述启动子是araBAD启动子、T7启动子或T7lac启动子。
4.如权利要求2所述的原核分泌表达载体，其特征在于所述信号肽是geneIII序列。
5.如权利要求2所述的原核分泌表达载体，其特征在于所述伴体蛋白是硫氧化还原蛋白。
6.如权利要求1所述的原核分泌表达载体，其特征在于所述核苷酸片断的核苷酸序列如下所示 ATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCATGGATGAGCGATAAAATTATTCACCTGACTGACGACAGTTTTGACACGGATGTACTCAAAGCGGACGGGGCGATCCTCGTCGATTTCTGGGCAGAGTGGTGCGGTCCGTGCAAAATGATCGCCCCGATTCTGGATGAAATCGCTGACGAATATCAGGGCAAACTGACCGTTGCAAAACTGAACATCGATCAAAACCCTGGCACTGCGCCGAAATATGGCATCCGTGGTATCCCGACTCTGCTGCTGTTCAAAAACGGTGAAGTGGCGTCGGCAACCAAAGTGGGTGCACTGTCTAAAGGTCAGTTGAAAGAGTTCCTCGACGCTAACCTGGCCAAGCTTCCCGGGGGGCCCATGAAAAAACTGCTGTTCGCGATTCCGCTGGTGGTGCCGTTCTATAGCCATAGCACCATGGAGCTCGAGATCTGCAGCTGGTACCATATGGGAATTCGAAGCTTTCTAGA
7.如权利要求1所述的原核分泌表达载体，其特征在于还包括高拷贝复制原点。
8.如权利要求7所述的原核分泌表达载体，其特征在于所述高拷贝复制原点为pUC复制原点。
9.权利要求1所述原核分泌表达载体在表达外源基因中的应用。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述外源基因是指重组人表皮生长因子编码基因。
全文摘要
本发明公开了一种原核分泌表达载体及其应用。本发明的原核分泌表达载体含有双信号肽－伴体蛋白的复合装置，araBAD强启动子和pUC高拷贝复制原点。利用两个gene III信号肽序列和一个硫氧化还原蛋白序列，该载体能供在高效表达外源基因的同时有效提高表达产物的正确折叠率和水溶性，一步即可得到具生物活性的单体蛋白。本发明适用于重组蛋白的大量生产，对表达二硫键多、水溶性差的活性蛋白尤其适用。
文档编号C12N15/63GK1908175SQ20061003714
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月22日 优先权日2006年8月22日
发明者张擎, 洪明晃, 张文泽, 赖文珊, 罗东华, 胡质毅, 谢骏, 陈 峰, 王倩倩, 王平 申请人:中山大学