专利名称：人食管癌细胞ezrin基因启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因表达调控，具体地说，涉及一种人食管癌细胞的ezrin基因启动子。
背景技术：
食管癌是我国常见恶性肿瘤，在河南、河北、山西、江苏和四川等省的部分地区发病率高。广东省潮汕沿海地区食管癌的发病率也高，是中国六大食管癌高发区之一，而且是唯一的沿海食管癌高发区。目前，食管癌的发病机制尚不明确。我们最近的研究结果显示，ezrin是食管癌侵袭转移相关基因之一。
Ezrin基因又称VIL2，定位于染色体6q25.2～q26，人类ezrin DNA长度约为24kb，含13个外显子，cDNA长度为1761bp，其表达产物Ezrin蛋白是ERM(ezrin-radixin-moesin)家族成员之一，主要参与细胞中细胞骨架与胞膜之间的连接，具有维持细胞形态和运动、连接黏附分子及调节信号转导等功能。Ezrin蛋白具有3个结构域N端的FERM(即Four.1 protein，Ezrin，Radixin，Moesin)结构域大约由300个氨基酸残基组成；C末端结构域约由100个氨基酸组成；N端和C端结构域之间是由约200个氨基酸残基组成α螺旋区。FERM结构域伸向细胞膜，参与ERM蛋白与膜分子的结合，C末端结构域则伸向细胞浆，为肌动蛋白结合区，其末端有一高度保守的34个氨基酸序列，可与F-actin结合，该区内还有ERM蛋白的磷酸化位点。
越来越多的证据表明Ezrin调控肿瘤发展。转移与非转移肿瘤细胞系及组织样品中基因表达的对比结果显示，来自啮齿动物乳腺、人胰腺和结肠的癌转移细胞中Ezrin的表达显著提高；同时，Ezrin在多种人类肿瘤中强烈表达，这些肿瘤包括骨肉瘤、黑色素瘤、星细胞瘤、胰腺癌、肺癌、子宫内膜癌等；进一步的研究显示抑制Ezrin蛋白能消除鼠科动物横纹肌肉瘤和骨肉瘤细胞，Ezrin很可能是恶性肿瘤的关键调节分子。目前的研究主要集中在Ezrin蛋白的功能、细胞中与Ezrin蛋白相互作用的分子及其作用机制，而关于ezrin基因的上游转录表达调控机制的研究，尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人食管癌细胞ezrin基因启动子，确定人ezrin基因的5’上游转录调控区域。
本发明的另一个目的在于提供含有上述基因启动子的载体。
本发明的进一步目的在于提供含有上述载体的宿主细胞。
为了实现上述目的，本发明利用分子生物学软件对食管癌细胞ezrin基因翻译起始位点(+135)前的转录调控区(-1759～+134)进行了分析，发现这一区域的平均GC含量为70.15％，存在CpG岛和20多个潜在的转录调控元件，提示在食管癌中ezrin基因表达调控存在多种因素，从中找出关键的转录调控区域或调控元件，对阐明食管癌细胞中ezrin基因的表达调控机制有重要意义。
本发明中含有人食管癌细胞ezrin基因启动子的序列，命名为EZ1.759，其长度为1893bp，核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，保留了ezrin基因5’上游-1759～+134的片段，为翻译起始位点(+135)前的一段序列，在SEQ ID NO1中，+1为转录起始位点。
本发明提供的人食管癌细胞ezrin基因启动子，命名为EZ0.146，其长度为280bp，核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，保留了ezrin基因5’上游-146～+134的片段。
为了鉴别控制ezrin基因表达的调控元件，必须对人ezrin基因的5’调控区域进行缺失分析。在一项缺失分析中，利用嵌套缺失技术，控制外切核酸酶III(ExoIII)的消化时间，使ezrin 5’侧翼区从-1759处开始逐渐缩短，得到一系列启动子序列长度不同的表达质粒，利用萤火虫荧光素酶报告基因，检测这些质粒在食管癌细胞EC109中的转录活性。为减少细胞培养微环境所造成的误差，以表达海肾荧光素酶的质粒pRL-TK作为内参照，与上述嵌套缺失质粒同时转染EC109，测定萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的酶活性，用二者的比值，即相对荧光素酶活性表示启动子转录活性。结果显示-146～-32之间为主要转录活性调控区段。
对-146～-32bp之间的序列分析表明这段序列中含有一个Sp1结合位点(-75～-69，GGGCGGG)，一个GC_Sp1结合位点(-75～-70，GGGCGG)，一个Ap1结合位点(-64～-58，TGACTCA)，一个GCN4结合位点(-64～-59，TGACTC)和一个CAC结合位点(-59～-55，CACCC)，其中Sp1和GC_Sp1结合位点之间有部分序列重叠，Ap1、GCN4和CAC结合位点之间也有部分序列重叠。本发明选择Sp1和Ap1两个位点作进一步修饰，即分别删除两个位点、对两个位点分别或同时进行碱基突变，检测修饰调控元件的重组质粒的表达能力，分析上述两个调控元件对启动子转录活性的影响。结果显示，Sp1和Ap1结合位点是启动子转录活性的关键调控元件。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明首次鉴定了人食管癌细胞ezrin基因启动子，并将5’端序列逐渐缺失和部分调控元件被修饰的启动子序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人ezrin基因启动子在食管癌细胞中转录活性的关键调控元件。本发明对研究Ezrin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Ezrin为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制，为食管癌的防治提供新的理论依据。
图1为质粒pEZ1.759构建流程图；图2为启动子5’端嵌套缺失质粒构建流程图；图3为启动子定点修饰质粒的构建流程图；图4为ezrin启动子区嵌套缺失质粒在EC109细胞中的相对荧光素酶活性分析；图5为ezrin启动子调控元件修饰质粒的转录活性比较。
其中，图4中，(a)为ezrin 5’侧翼区(-1759～-32)系列缺失重组质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应缺失子的相对荧光素酶活性。实验至少被重复3次，在此显示来自3次实验中有代表性的数据，误差线代表标准差。
图5中，(a)为ezrin启动子Sp1和Ap1修饰质粒(在pGL3-Basic载体上)的模式图；(b)为对应质粒的相对荧光素酶活性。实验至少被重复3次，在此显示来自3次实验中有代表性的数据，误差线代表标准差。
具体实施例方式
实施例1 含有ezrin基因启动子的真核表达质粒的构建1、人ezrin基因5’上游片段(-1759～+134)的克隆根据文献发表的人ezrin基因序列，设计并合成了扩增ezrin翻译起始密码子上游1893bp片段的一对引物P1和P2，所述引物序列如下P15’-CGGGGTACC-1759AGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’(下划线为Kpn I位点)P25’-CCCAAGC+134TTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’(下划线为Hind III位点)应用此对引物，从人食管癌细胞EC109基因组DNA中经PCR扩增出与预期一致的约1.9kb的DNA片段。回收所扩增的目的片段，Kpn I/Hind III双酶切后，与经Kpn I/Hind III双酶切的载体pGL3-Basic(Promega公司)连接。pGL3-Basic为萤火虫荧光素酶报告基因前不含启动子的表达载体。测序结果证明人ezrin基因-1759～+134片段已定向克隆至萤火虫荧光素酶基因上游，该重组质粒命名为pEZ1.759。该质粒的整个构建流程如图1所示。
人食管癌细胞ezrin基因启动子EZ1.759的测序结果见SEQ ID NO1。与GenBank已知序列比较，核苷酸相同性为99.79％。
2、以pEZ1.759为基础的启动子5’端嵌套缺失载体的构建StuI位于启动子EZ1.759的-1447处，该内切酶可使DNA形成平滑末端，进一步被外切核酸酶ExoIII降解；Kpn I位于-1765处，该内切酶可使DNA形成3’末端突出片段，不被ExoIII降解。将质粒pEZ1.759经StuI/Kpn I双酶切后，再经ExoIII酶切。取不同反应时间的酶切后产物，用S1核酸酶切除单链DNA，Klenow补平末端后，T4DNA连接酶使片段自连，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，得到一系列启动子5’端缩短的真核表达质粒，构建流程参见图2。所有构建质粒通过测序验证。
3、启动子定点修饰质粒的构建双荧光素酶报告基因检测结果显示ezrin基因启动子序列从5’端的-146处截短到-32处时，启动子活性显著降低，提示-146～-32之间为调控转录活性的关键区域。针对Sp1(-75～-69，GGGCGGG)和Ap1(-64～-58，TGACTCA)结合位点设计一系列寡核苷酸序列，删除或突变修饰Sp1和Ap1结合位点，以进一步确定影响ezrin基因启动子转录活性的关键调控区段。所述寡核苷酸序列如下mut15’-CTCCCCATGCCCGCAGTGC-76T-------68GCGCTGACTCACCCGGGCCCG-3’
mut25’-GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCG-65C--------57CCCGGGCCCGGGCTGGCCGGTTC-3’mut35’-CTCCCCATGCCCGCAGTGCT-75AATATTTGCGCTGACTCACCCGGGCCCG-3’mut45’-GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGC-64GTC-GATCCCGGGCCCGGGCTGGCCGGTTC-3’mut55’-CCTCCCCATGCCCGCAGTGCT-75AATATTTGCGC-64GTCGGATCCCGGGCCCGGGCTGGCCGG-3’mut65’-CTCCCCATGCCCGCAGTGCT-75GTTCGGGGCGC-64TGACTTGCCCGGGCCCGGGCTGGCCGG-3’上述寡核苷酸序列分别与P2组成一对引物，以质粒pEZ0.146为模板进行PCR扩增。T4DNA聚合酶补平PCR产物，经Hind III酶切，与pGL3-Basic的SmaI/Hind III双酶切回收片段连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，进行抗性筛选及测序，即得到一系列ezrin基因启动子上定点修饰Sp1和Ap1结合位点的真核表达质粒，构建流程参见图3。
实施例2 细胞培养、DNA转染和人食管癌细胞ezrin基因启动子活性分析用QIAprep Spin Miniprep Kit提取需转染的实验质粒、对照质粒pGL3-Basic及内参照质粒pRL-TK，测定其含量和纯度。取上述表达萤火虫荧光素酶的实验质粒和对照质粒用Buffer EB(10mmol/L Tris·Cl，pH 8.5)稀释至100ng/μl，表达海肾荧光素酶的内参照质粒pRL-TK用Buffer EB稀释至20ng/μl。将实验质粒与内参照质粒按50∶1混合，即1μg∶20ng(10μl∶1μl)。
食管癌细胞EC109进行常规传代培养，接种于24孔培养板中，每孔0.5ml。24h后细胞达50％～60％满度时即可用于转染。
转染方法如下在超净工作台中，取7ml玻璃离心管若干支，做好标记，加入70.5μl含12.5mmol/L HEPES的199基础培养液和4.5μl Fugene6转染试剂(Roche公司)，涡旋1sec，室温下放置5min。再加入相应的质粒混合液16.5μl，空白管中加入16.5μl Buffer EB，涡旋1sec，室温下放置15min。将24孔板做好标记，每个样品设3个平行孔，每孔加入28μl转染液，轻轻摇匀，于37℃ 5％ CO2培养箱中继续培养48h，收获细胞，进行双荧光素酶活性分析。
双荧光素酶报告基因的检测采用Promega公司的Dual-Luciferase ReporterAssay System进行分析。将转染有目的DNA的贴壁细胞用1×PBS洗涤一次，去尽残液，加入100μl新鲜配制的1×PLB，室温下，摇床上剧烈振荡15min以裂解细胞。取20μl上述细胞裂解液加入含100μl LARII溶液的1.5ml离心管中，测定荧火虫荧光素酶活性，再向同一离心管中加入100μl新鲜配制的1×STOP液，测定海肾荧光素酶(内参照)活性，计算出两种荧光素酶活性比值，即相对荧光素酶活性。
嵌套缺失质粒实验结果(图4)表明在人食管癌细胞中，ezrin基因翻译起始密码子上游的1893bp序列具有明显的转录活性，当启动子EZ1.759从5’端-1324处缩短到-696时，其转录活性有所下降，显示这一区段可能有增强子序列；当片段从-696缩短到-146时，转录活性没有变化，说明在这一区段没有明显影响转录活性的调控元件；当片段从-146处缩短到-32时，pEZ0.032的转录活性显著下降，表明在-146～-32之间存在重要的转录调控元件。
定点修饰质粒实验结果(图5)表明在人食管癌细胞中，删除ezrin基因启动子-75处的Sp1结合位点(mut1)，启动子转录活性降低到pEZ0.032的水平；Sp1和-64处的Ap1结合位点同时全部突变(mut5，各突变7个碱基)和关键位点的部分突变(mut6，各突变2个碱基)，也得到同样的结果。删除Ap1结合位点(mut2)、仅突变Sp1结合位点(mut3)和仅突变Ap1结合位点(mut4)时启动子转录活性也有所降低。可见ezrin基因启动子-75处的Sp1结合位点和-64处的Ap1结合位点是转录活性的关键调控元件，Sp1结合位点对于转录活性的影响大于Ap1结合位点。
人食管癌细胞ezrin基因启动子序列表SEQUENCE LISTING<110>汕头大学医学院<120>人食管癌细胞ezrin基因启动子<130>
<160>4<170>Patent In version 3.2<210>1<211>1893<212>DNA<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>1-1759 AGTGAATGCT GTTGCTGCTC GTCTGGAAGC CAGACGTTGA GAACCCCTTC-1709 TAGAGTGAGC TCTCCCGCAG CAAATTCTAC TGGCCCCCAA AGTATGTGTT-1659 TTGTGTGTCT TAAAAATTTG TTGAGAACCA TTAGCAAAAA AACAAACAAA-1609 AAAACTTAAT TCCTAGAATT CCAGAGAAAT CCCATGGAGC TTTTTGCCAG-1559 TCACGTCAAG AGAGGCCACA AACGTGCCAC TTAACCAGAG CTTCGGAAAG-1509 GCGGCGGCTG GGCCGGCCAC GTGCACCGAG ACTCGGGGCC AGGTGCAGCC-1459 GCCCCAGGGC CGAGGCCTCG GAACTGGCCC CCGGTCCCGG CCCCAAGCGG-1409 TCCAGCGATT CCCCCAAGCC GTCCGCCCCT CCAGATTTAT TTACGTTTTC-1359 CTGACTTCCC CCTGCCCGCT GTGGGACAAA CAGCCTCCCC ACTTGCATCT-1309 GCGAGGGGAG TAGCGCGCAC TTCCGCCAAG TTCCGCCCCC ACCCAGCCCG-1259 AGGCCCGGCT GCCGCCATCT TGCGGGGGGC GCACCTCACA GGTCGGGAGC-1209 TGGGCGGGAA GGGGCGTGGT CCCGGGACCC GCCCCGCCGG GGCTTTTGGG-1159 AGCGCGGGCA GCGAGCGCAC TCGGCGGACG CAAGGGCGGC GGGGAGCACA-1109 CGGAGCACTG CAGGCGCCGG GTGAGGCGTG CGGCGGCCGG GGTCGGGACG-1059 GGGGTTCTGG GCGGGGGGTT CCTGGTGGAG GGCCCGGGCG GGCGGCGGGG-1009 TTCGGCGGCA GGTGCGGCGG GCAGCCTAGG GGGCGCGGCG CGGGGTTCTC-959 GCCCGGCACC CCCGGGGCAG GTGGAGCTGA GCCGGCCCGC GGCCCCGCGA-909 CCTTCCCCTC GGCGCCGGGT CCCCTCAGGT CTCTCCCGAA GGAAACGCGG-859 AGCCTGGGTG CCTGGGCGCC GTCCCTCGGC GGCTCCCGAG CGGTTGCAGT-809 TTTTGAAAGA GTTTCTCAAA GGCTTGACGG TTGTGACTGC AGCCGCGGGG-759 CAACGGTTGC TACACAAAGT GAAACTTGCC GAGTGCTCGG CTTCTCACGG-709 GCTTCCTGGC AGCCCCGGGA AGTTCCTCGG CGGACCCCGA GCCCGCGCCC-659 CCTCTCCACG GATCCCTCCC CAGCGAGTGC CCCCCCGCCC GCCCTGTGCC-609 CCCTCTCCCC TGACCCCTCC CTGTCGGGTG CCCCGCGGGC TCGCGCTGGC-559 TGTCCTGGGA CTCCTTCCTC CTAGGTGTTC CTCCTGCCCC TCGCCCTCTC-509 TCTCCCAGGC GCGCGCTCCC TCTCCCCGGG CCTTTCCCCG CCGGGTATCC-459 CTGGGCCCGC GCCCCGTCTT CTCCGCCTCT CTCCGCTGGG TGCACCTCGA-409 GTGTCCCCCA GACCCCTCCC CGCCCGGCCG GCGCTCTCTC CCCTGACCCT-359 CCTGGCCGAG TGTTCCCCGG GGCCCGCGCC CCCTCCCCCC GATCCTCCCC-309 ACTGAGTGTT CCCCCTGCCC TCTCTCTCCC GGGCCTGCGC CCCCCACCAG-259 CCCCTTCATG CTGGGGGTCC CCTGGGTGCG CACCCCCTCT CCTCGGACCC-209 ACCCCCAACT GGGGGGCACC TCCAGTGCCC GCCGGCTGCC CCTTGGGCGC-159 GCGCCCCCGC TCTCGGGCGC CTCCTCGCCG GGGGCCCGGC CCGGCCCCGC-109 CCCGCCCGTG CCCCCTCCCC ATGCCCGCAG TGCTGGGCGG GGCGCTGACT-59 CACCCGGGCC CGGGCTGGCC GGTTCTTAAG CGGCAGCGCG CTGCGGGCGC-9CGAGTGTCGG GCGCGGCAGG AGGACGAGGC AGGGCGGGCG GGCGCTCTAA+42 GGGTTCTGCT CTGACTCCAG GTTGGGACAG CGTCTTCGCT GCTGCTGGAT+92 AGTCGTGTTT TCGGGGATCG AGGATACTCA CCAGAAACCG AAA<210>2<211>280<212>DNA<213>人食管癌细胞(HUMAN ESOPHAGEAL CANCER CELLS)<400>2-146 CGGGCGCCTC CTCGCCGGGG GCCCGGCCCG GCCCCGCCCC GCCCGTGCCC-96 CCTCCCCATG CCCGCAGTGC TGGGCGGGGC GCTGACTCAC CCGGGCCCGG-46 GCTGGCCGGT TCTTAAGCGG CAGCGCGCTG CGGGCGCCGA GTGTCGGGCG+5CGGCAGGAGG ACGAGGCAGG GCGGGCGGGC GCTCTAAGGG TTCTGCTCTG+55 ACTCCAGGTT GGGACAGCGT CTTCGCTGCT GCTGGATAGT CGTGTTTTCG+105 GGGATCGAGG ATACTCACCA GAAACCGAAA<210>3<211>
<212>DNA
人食管癌细胞ezrin基因启动子序列表<213>引物<400>3P15’-CGGGGTACCAGTGAATGCTGTTGCTGCTCGTCTGGAAG-3’P25’-CCCAAGCTTTCGGTTTCTGGTGAGTATCCTCGATCCC-3’<210>4<211>
<212>DNA<213>引物<400>4mut15’-CTCCCCATGCCCGCAGTGCTGCGCTGACTCACCCGGGCCCG-3’mut25’-GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCCCCGGGCCCGGGCTGGCCGGTTC-3’mut35’-CTCCCCATGCCCGCAGTGCTAATATTTGCGCTGACTCACCCGGGCCCG-3’mut45’-GCCCGCAGTGCTGGGCGGGGCGCGTCGATCCCGGGCCCGGGCTGGCCGGTTC-3’mut55’-CCTCCCCATGCCCGCAGTGCTAATATTTGCGCGTCGGATCCCGGGCCCGGGCTGGCCGG-3’mut65’-CTCCCCATGCCCGCAGTGCTGTTCGGGGCGCTGACTTGCCCGGGCCCGGGCTGGCCGG-3’
权利要求
1.一种人食管癌细胞ezrin基因启动子，其核苷酸序列选自下组(1)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，(2)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的互补序列，或(3)SEQ ID NO2所示的核苷酸序列中发生一处或多处缺失突变或替换突变的功能等价物。
2.如权利要求1所述的人食管癌细胞ezrin基因启动子，其特征在于含有至少一个控制ezrin基因表达的调控元件。
3.如权利要求2所述的人食管癌细胞ezrin基因启动子，其特征在于所述调控元件含有SEQ ID NO2中的核苷酸-75～-69。
4.如权利要求2所述的人食管癌细胞ezrin基因启动子，其特征在于所述调控元件含有SEQ ID NO2中的核苷酸-64～-58。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的人食管癌细胞ezrin基因启动子。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，它还含有所述的启动子可操作地连接的外源基因。
7.如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述外源基因是报告基因。
8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是哺乳动物细胞。
10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞是人的细胞。
全文摘要
本发明涉及基因表达调控，公开了一种人食管癌细胞的ezrin基因启动子。本发明首次鉴定了人食管癌细胞ezrin基因启动子，并将5’端序列逐渐缺失和部分调控元件被修饰的启动子序列插入报告基因上游构建了一系列真核表达质粒，转染哺乳动物细胞瞬时表达，确定了人ezrin基因启动子在食管癌细胞中转录活性的关键调控元件。本发明对研究Ezrin在肿瘤细胞中的表达调控机制以及以Ezrin为靶点的临床治疗具有重要意义。将有助于从分子水平上探索食管癌的发病机制，为食管癌的防治提供新的理论依据。
文档编号C12N15/85GK1908169SQ20061003699
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月9日 优先权日2006年8月9日
发明者许丽艳, 高书颖, 李恩民 申请人:汕头大学医学院