专利名称：食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物体中提取超氧化物歧化酶技术，具体为一种食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺。
背景技术：
超氧化物歧化酶(以下简称SOD)，是一种生物活性蛋白质，是目前为止发现的唯一以自由基为底物的酶。具有抗衰老、提高机体对多种疾病的抵抗力、增强机体对外界环境的适应能力等生理功能。现有的SOD提取来源主要有动物血、动物肝脏、植物可食部分、酵母等。但是随着疯牛病、口蹄疫等蛋白传染疾病的出现，人们也发现动物血SOD因子中也含有治病因子，所以现在世界血防组织已经明令禁止使用动物血提取SOD。而使用植物原料提取SOD要消耗掉大量的农产品，在社会现有的阶段仍然无法规模化生产。微生物中提取SOD是最好的途径之一，但这方面除酵母之外，在微生物中还没有其它开发的材料。而我国食用菌年产量达到近900万吨，食用菌种类很多，关于食用菌SOD的研究有不少报道，既有其含量的报道，也有分离提纯后对其性质研究的报道；既有子实体的报道，也有菌丝体的报道。从这些报道可知，SOD广泛的存在于各种食用菌中，不同的食用菌其含量不同。对于现有技术中食用菌进行SOD提取技术的文献主要有“蛹虫草超氧化物歧化酶分离纯化及其稳定性的研究”《生物技术》第15卷第5期，(利用超声波破碎，然后离心，然后沉淀，最后用柱层析的方法分离)；双孢蘑菇子实体超氧化物歧化酶的分离纯化及部分性质《河北大学学报(自然科学版)》第22卷第3期；……等，然而上所述资料均为在实验室的条件下，对食用菌的子实体中含有的SOD进行的提纯分离研究。上述提出的工艺流程的特点是工艺简单，设备一般，经济实用，而在我国现实生产生活中，食用菌种类、产量和消耗量都很大，而且对于直接用食用菌本身提取SOD来说，会消耗掉大量的资源，而且也没有成熟的提取工艺，现有的文献中公开的一些提取方法虽然也能提取出高纯度的SOD(目的都是集中在对SOD的定性研究阶段)，但是成本很高，根本无法适用于工业化生产。在食用菌SOD研究方面，主要集中在理论研究上，虽然研究子实体SOD的报道不少，但是还没有人探讨从食用菌子实体中提取SOD工艺的研究，更没有人研究从菌糠的菌丝体提取SOD的工艺。(食用菌菌糠食用菌在固体培养基上(包括椴木)生长后形成的原料与菌丝体的混合物，无论是出菇还是未出菇，是固体还是粉末，均称为菌糠。但一般所指的菌糠为食用菌栽培后的剩余料，也叫下角料、菇渣、菇糠等。)我国每年培养食用菌而产生的废料——菌糠，内含有大量的菌丝体，研究发现菌糠中也含有大量的SOD，目前无任何文献资料公开过关于在食用菌菌糠中提取出SOD的工艺，现有的在植物中和微生物中提取SOD的工艺主要问题集中在以下四个方面一、粗酶液的制备。以子实体为原料是记载于现有文献中，而菌丝体，所有的报道均集中在用发酵液来提取SOD，二、细胞壁的破壁方法。由于食用菌的菌丝体有细胞壁，不利于SOD的提取，现有关于微生物破壁的方法主要有物理法，化学法、生物法，具体那种办法适用于菌丝体，还未见报道；三、SOD的提纯。SOD的提纯过程实际是杂蛋白的去除过程。第四是色素的去除。在以固体培养基菌丝体为原料时，由于培养基主要组成是棉籽壳，含有大量色素，必须予以去除。
发明内容
本发明为了解决现有技术中没有从食用菌菌糠中提取SOD的工艺的问题而提供了一种食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺。
本发明是由以下技术方案实现的，一种食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，包括以下步骤(粗酶液的制备，超声波破壁、分离提纯、色素去除)1、菌糠加水振荡20～60分钟，过滤，得到混合液，即SOD粗酶液；2、混合液离心得到菌丝体沉淀物和上清液(胞外酶)，由于菌丝体附着于棉籽壳组成的培养基上，需要将菌丝体与培养基分离，由于SOD存在胞内酶和胞外酶两种形式，在制备粗酶液时需要将二者全部收集。
3、菌丝体沉淀物破壁后离心得到胞内酶液。破壁可采用超声波或甲苯破壁法；超声波功率范围60～150W，时间3～10min，4、上清液和胞内酶液混合得到浓缩的粗酶液，5、浓缩的粗酶液在45～60℃保温30～60分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，调整PH值为(4.0～6.0)，得到混浊液，再离心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.5～1倍的丙酮得到混浊液，对混浊液离心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.5～1倍丙酮得到混浊液，对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀，得到SOD粗品，
6、粗品加水溶解得水溶液，水溶液加硫酸铵得混浊液，离心收集沉淀，脱盐即可得到最终产品。
整个工艺流程图详见附图18一、最佳提取SOD材料的选择研究1目的和意义为了能在众多的食用菌中选取最佳的品种，选种最佳的生长状态(子实体、菌丝体、菌糠)的SOD提取原料，以生产车间培育的食用菌子实体和菌糠为材料对它们不同生长期的SOD含量进行测定。根据研究结果，结合经济效益，首先选定食用菌的品种，然后确定是用子实体还是菌丝体，在哪个时期进行SOD的提取，从而确定最佳提取材料。
2材料与方法2.1材料2.1.1食用菌白灵菇、杏鲍菇不同生长期的子实体即小蕾、大蕾、小子实体、成品子实体；不同生长期即养菌期、出菇期、出菇后期的菌糠。猴头菇、灵芝、蛹虫草成品子实体。
2.2方法粗酶液制备和SOD活性测定见本申请相关部分3结果与分析3.1白灵菇不同生长期子实体SOD活性据有关资料报道，生物体内SOD含量随着生长期的不同而不同，为了能了解食用菌不同生长期SOD含量的变化，我们依次选定了白灵菇不同生长期子实体(见图1)用于测定SOD活性。
经过测定，其SOD活性分别为大子实体SOD活性＝360.82U/g小子实体；SOD活性＝428.57U/g大蕾SOD活性＝484.47U/g小蕾SOD活性＝550.09U/g白灵菇子实体不同生长期SOD活性有比较见图2。
由结果可见，在白灵菇的四种子实体中，SOD活性由高到低依次是小蕾、大蕾、小子实体、大子实体。这是因为小蕾处于生长旺盛时期，氧代谢过程中产生了大量的O2-·，而小蕾体内细胞增殖迅速，活性物质SOD也会大量产生，从而维持了动态平衡。小蕾发育成大子实体后，细胞分裂缓慢，SOD合成减弱，所以，随着子实体的生长成熟，SOD活性逐渐降低。虽然小蕾SOD活性高，但是其绝对量不大，考虑到提取SOD的量，还是应选择大子实体。
3.2杏鲍菇不同生长期子实体SOD活性我们依次选定了杏鲍菇不同生长期子实体(见图3)用于测定SOD活性。
经过测定，其SOD活性分别为大子实体SOD＝569.44U/g小子实体SOD＝630.30U/g大蕾SOD＝704.21U/g小蕾SOD＝746.64U/g不同生长期杏鲍菇子实体SOD活性比较见图4。
由结果可知，杏鲍菇不同生长阶段子实体内超氧化物歧化酶的含量并不相同，其含量变化规律是小蕾＞大蕾＞小子实体＞大子实体，即越幼嫩的子实体中超氧化物歧化酶的含量越高。说明在幼嫩的组织中细胞的代谢旺盛，细胞代谢过程中产生过多的自由基，相应的细胞就合成较多的超氧化物歧化酶用于清除体内过多的自由基，维持自由基的代谢平衡。这个结果与白灵菇子实体的结果是相同的。
不同生长期白灵菇和杏鲍菇子实体的结果提示我们，虽然食用菌子实体SOD活性是小蕾最大，随着子实体的生长，其SOD活性不断下降。但是每个子实体的总重在不断增加，SOD总活性在不断增加。因此如果选择子实体作为提取SOD的材料，应该选择成品子实体。
3.3干品食用菌SOD活性我们分别测定了材料中的干品食用菌，测定结果如下(表1)表1 不同干品食用菌SOD活性
这些结果告诉我们，在四种干品食用菌子实体中。猴头菇的SOD活性是最高的，达4235.73U/g可以作为子实体提取SOD的首选材料。
灵芝的SOD活性较低于猴头菇，是由于其木质化程度高于猴头菇，鉴于灵芝是价值较高的食用菌，所以不宜选用它作为提取SOD的材料。
银耳的SOD活性水平位于所试食用菌的中游，不宜作为提取SOD的材料。
蛹虫草子座SOD活性并不高，同时考虑到蛹虫草的市场价格比较高，所以它不宜作为提取SOD的材料。
菌糠不同提取时间和方法提取效果的比较由于菌丝体紧密附着于培养基，况且，菌糠中含有大量的胞外SOD，必须经过一定时间的提取，并且提取过程中振荡与静置提取也有区别。该方面结果见图5由图5可知，振荡提取效率始终比静置提取高。振荡提取到30min以后酶活性不再增长，说明提取效率达到最大。结果提示我们，应该用振荡法提取30min可以达到好的提取效果。
3.4菌糠SOD活性3.4.1杏鲍菇菌糠中菌丝体胞SOD内酶与胞外酶的比较文献报道在大多数的生物中超氧化物歧化酶为胞内酶，主要存在于细胞的线粒体等细胞器中，但少数生物如真菌和动物中也存在一定数量的胞外酶。为了研究食用菌菌丝体胞内酶与胞外酶的分布，我们以杏鲍菇、蛹虫草菌丝体为材料进行了研究。其结果为在杏鲍菇刚长满菌丝体时超氧化物歧化酶胞外酶含量为544.88U/g。
刚长满菌丝体时破壁后粗酶液中超氧化物歧化酶含量为1134.45U/g。
由结果可知，菌丝体胞外超氧化物歧化酶含量比较高，占菌丝体总中总酶量的48％。说明在杏鲍菇菌丝体中超氧化物歧化酶在胞外存在量约占总酶量的50％。这个结果提示我们，在提取过程中，既要注意胞内SOD，又要注意胞外SOD。
3.4.2杏鲍菇不同生长阶段菌糠中SOD含量比较我们比较了杏鲍菇不同生长阶段菌丝体中超氧化物歧化酶的含量，意在找出超氧化物歧化酶的含量随菌丝体生长的变化规律。杏鲍菇不同生长阶段菌丝体粗酶液中SOD含量见表2。
表2 杏鲍菇不同生长阶段菌糠的菌丝体粗酶液中SOD含量
杏鲍菇不同生长阶段菌糠中SOD含量比较见图6由结果可知不同生长阶段的菌丝体中SOD含量也不相同，随着菌丝体的生长经历了从低到高再到低的过程。
杏鲍菇菌丝体处于养菌后期时SOD的含量达到最高点，但是到出菇后期其SOD活性依然为1088.26U/g。这也是一个相当不错的活性。
从以上结果我们可以得知，杏鲍菇菌糠SOD活性很高，即使到了出菇后期，其SOD活性依然高于其他菇类。各种菇类的子实体中，猴头菇子实体SOD活性最高，其次是灵芝和银耳，但是它们是干品，若按鲜品算，最高的是蛹虫草，其次是杏鲍菇。用蛹虫草作为提取SOD的原料有些得不偿失，所以所试子实体材料中，杏鲍菇是最佳选择。从子实体生长不同时期SOD活性看，酶活性由高及低也依次是小蕾、大蕾、小子实体、大子实体。从经济效益看，应该选择大子实体。菌糠与子实体综合考虑。由于杏鲍菇子实体有着相当不错的市场价格，可以为生产单位创造利润，而出菇后期的菌糠只是废料，所以我们选定杏鲍菇出菇后期的菌糠为提取SOD的材料。
二、细胞壁破壁方法的研究1研究的目的和意义由粗酶液制备结果可知，食用菌SOD既有胞内酶，也有胞外酶。食用菌的菌丝体有细胞壁，要想提高SOD的提取率，必须要破壁。现在常用的破壁方法有机械法，即使用匀浆器、研钵、组织捣碎机等利用机械力浆细胞破碎；有化学法，即利用丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶剂溶解细胞膜，使细胞结构破坏的方法；有物理处理法，包括反复冻融法、冷热交替法、超声波振荡法、渗透压冲击法等；有酶解法，即利用溶菌酶破碎微生物细胞壁。这些方法中，最常用的是氯仿破壁法、甲苯破壁法和超声波破壁法。由于氯仿毒性比较大，我们一般用甲苯和超声波破壁法分别以杏鲍菇菌丝体为材料，分别进行了处理，并对这两种方法的条件进行了试验。目的在于确定一种安全有效的破壁方法。
2材料与方法2.1材料2.1.1菌丝体。杏鲍菇菌丝体，来源于众成公司食用菌生产车间，处于养菌后期。
2.1.2试剂。磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸二钠、邻苯三酚(焦性没食子酸)、抗坏血酸、盐酸、Tris-Base、考马斯亮蓝G250、磷酸、95％乙醇、牛血清白蛋白、氯化钠、甲苯、丙酮等，其中考马斯亮蓝为进口分装，牛血清白蛋白为生化试剂，其余均为国产分析纯。
2.1.3仪器。HY-5调速多用振荡器，TDL-5离心机，7200型可见分光光度计，UV-2000型紫外可见分光光度计，JY92-II超声波细胞粉碎机，PHS-2C型精密酸度计，三用电热恒温水箱。
2.2方法2.2.1直接法(对菌丝体不作任何处理)按每g杏鲍菇菌糠培养基加入4ml磷酸缓冲液(20mmol/L，pH7.8，含0.1mmol/L EDTA)，放在振荡器上洗涤30min，四层纱布过滤，收集液体，静置30min，收集上清液，此即SOD粗提液。
2.2.2甲苯破壁法用直接法获得SOD提取液，4000r/min离心20min，收集上清液与沉淀，上清夜备用；每g沉淀加入0.8g甲苯，35℃破壁45min，以20mmol/L pH7.8磷酸缓冲液(含0.1mmol/L EDTA)提取30min，4000r/min离心20min，收集上清液，与原上清液混合，此即甲苯破壁法的SOD粗提液。
2.2.3超声波破壁法用直接法获得SOD提取液，4000r/min离心20min，收集上清液与沉淀，上清夜备用；沉淀以20mmol/L pH7.8磷酸缓冲液(含0.1mmol/L EDTA)溶解，100W超声波破壁5min，静置提取30min，4000r/min离心20min，收集上清液，与原上清液混合，此即超声波破壁法的SOD粗提液。
3结果与讨论3.1甲苯破壁法3.1.1工艺流程设计。根据资料报道和我们以前的工作经验，设计了甲苯破壁法工艺流程见图73.1.2破壁时间的选择甲苯破壁是比较温和的办法，完全使细胞壁破壁需要一定的时间。我们在25-65min范围内作了破壁时间的选择试验，其结果见图8。
由结果可知，在25-45min范围内，随着甲苯处理时间的延长，溶液中酶活性不断上升，到45min以后，酶活性基本稳定，这说明甲苯破壁的最佳作用时间为45min。
3.1.3破壁温度的选择温度对甲苯破壁的效果如何影响，报道很少，为了了解温度对破壁效果的影响，我们在20-45℃范围内研究了破壁温度对提取效果的影响。结果见图9。
由结果可知，在低于25℃时，提取的SOD活性比较低，当高于25℃后提取的酶活性变化不大，但以35℃最高。这结果提示我们甲苯的破壁温度需在25℃以上，以35℃最好。
3.1.4甲苯破壁后提取时间的确定甲苯处理菌丝体后，只是使细胞壁和生物膜出现漏洞，通透性增加，要使酶溶到提取液中，需要一定的时间。我们在15-45min范围内研究了甲苯破壁后的最佳提取时间，结果见表3。
表3 甲苯破壁后不同提取时间的SOD活性
由表3数据我们可以了解到，甲苯破壁后，随着静置时间的延长，提取液中SOD活性不断增长，说明即使已经破壁，菌丝体胞内SOD的渗出是需要一定时间的。当静置达到30min以后提取液中SOD别样基本不再增加，这说明，胞内SOD基本已经渗出。结果说明甲苯破壁后，再静置提取30min可以达到较好的提取效果。
3.1.5小结通过如上试验，我们了解到，甲苯破壁法实施最佳条件是在35℃条件下，甲苯作用样品45min，然后静置提取30min。
3.2超声波破壁法3.2.1超声波破壁法工艺流程设计超声波破壁法制备SOD全酶粗提液过程见图103.2.2超声波破碎功率对SOD的提取率及活性的影响在相同时间内，考察不同功率下的破碎情况。结果见图11。
由结果可知，在0～50W时，总蛋白含量与比活性基本不变，说明超声波对细胞破碎及酶活性作用不很明显；在60～160W时，总蛋白含量有所提高，酶比活在80W达到最大，以后逐步下降，在100W时蛋白量与酶比活达到平衡。说明最佳破碎功率为100W。
3.2.3超声波破碎时间对SOD的提取率及活性的影响在一定的功率下，考察不同破碎时间所得浸提液的总蛋白含量和总酶活性。结果见图12。
由结果可知，在0～3min时总蛋白含量基本接近，总酶活及比活基本不变，说明破碎的细胞数量没有增多，SOD的活性也没有损失；在3～7min时总蛋白含量提高了5％左右，但在6min后酶的比活有所下降，说明超声波使部分酶失活，由图12可以得出，最佳破碎时间为5min.
3.2.4小结根据试验结果，超声波破壁的操作为100W，破壁5min提取效果最佳。
4讨论与结论我们用出菇后期菌丝体固体培养基为材料，研究了不破壁，甲苯破壁和超声波破壁三种不同方法提取SOD的效果，其比较结果见表4。
表4 三种不同方法提取SOD效果的比较
结果表明，三种方法提取SOD粗酶液的总酶活力，甲苯破壁法最高，为10882.6U，超声波波破壁法次之，为10023.3U，不破壁最低，为5626.8U；说明利用菌丝体提取SOD必需要破壁。我们所用的两种方法差异不大，都可以用于生产。从酶比活力看，甲苯破壁法也最高，为566.44U/mg，直接法次之，为529.75U/mg，超声波波破壁法最低，为514.48U/mg。虽然有所差异，但是差异不大。考虑到虽然使用超声波法需购买价格较高的设备，但这只是一次性投入，而且超声波法无任何污染，所以选用超声波法破壁。
三、SOD提纯方法的研究(一)杂蛋白去除方法的研究1目的和意义粗酶液中除了水溶性的杂质之外，主要是杂蛋白。如何将杂蛋白与SOD分离是分离提纯SOD的关键。关于分离杂蛋白的方法有多种，有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、热变性沉淀法、凝胶层析法、离子交换法等，根据SOD的热稳定性、水溶性以及等电点等性质，根据多个研究微生物SOD的报道，我们拟采用热变性沉淀、酸沉淀和有机溶剂沉淀等几种方法的综合应用，以形成食用菌子实体和菌丝体SOD分离提纯方法。
2材料与方法2.1材料2.1.1食用菌杏鲍菇菌糠，由众成公司生产车间提供。
2.1.2试剂丙酮，盐酸为分析纯，其余试剂同SOD活性测定部分。
2.1.3设备UnicoUV-2000型紫外分光光度计，SHH.W21.600型三用电热恒温水箱，TDL-5型高速冷冻离心机，PHS-2C型精密酸度计，HY-5型调速多用振荡器。
2.2方法2.2.1粗酶液制备见本申请相关部分。
2.2.2热不稳定蛋白的去除将SOD粗提液置于50℃恒温水浴箱中保温30min，出现白色沉淀，4000r/min离心20min，沉淀为热不稳定杂蛋白，去除，收集上清液。
2.2.3酸不稳定蛋白的去除。将上述用上清液2mol/L HCl调节pH至5.0，用pH计测定酸碱度，出现沉淀，4000r/min离心20min，沉淀为酸不稳定杂蛋白，去除，收集上清液。
2.2.4丙酮沉淀杂蛋白。上述上清液加入0.6倍冷丙酮，搅拌均匀后，4000r/min离心20min，除去沉淀杂蛋白，收集上清液。
2.2.5丙酮沉淀SOD。上述上清液再加入0.6倍冷丙酮，搅拌均匀后，4000r/min离心20min，除去上清液，收集沉淀，此即SOD纯化产品。
3结果与分析3.1热不稳定杂蛋白的去除在较高温度下，蛋白质分子由于各个原子的动能增大，使得稳定蛋白质空间结构的作用力不足以保证其结构的稳定性，则蛋白质分子的空间结构发生变化，严重时会造成空间结构的破坏，即发生变性沉淀。不同的蛋白质其热稳定性不同。据报道SOD分子具有较好的热稳定性，75℃作用15分钟，活性不变。根据SOD的这个性质，我们将SOD粗酶液加热，让那些热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀，从而把这一部分杂蛋白分离去除。在这个步骤中，加热的温度和时间是必要的两个条件。
3.2.1热不稳定杂蛋白去除的温度温度越高，热不稳定杂蛋白越易去除，但是温度太高，又会影响到SOD的活性。所以需要对热不稳定杂蛋白去除的温度进行选择。我们在40-65℃范围内隔5℃设置一个温度，并保温25min，结果见图13。
由图13可知，45-50℃范围内，SOD比活力在上升，到50℃以后，略有下降，所以热不稳定杂蛋白去除的温度以50℃为好。
3.2酸不稳定杂蛋白的去除蛋白质具有一定的酸碱稳定性，如果偏离其稳定的酸碱范围，则其活性就会下降，如果酸碱偏离过大，就会造成酸碱变性，从而发生沉淀。据报道，SOD在pH5.3-9.6间稳定性能良好，在pH4.5-11.0间能稳定存在。我们通过调节提取液pH值，作了酸不稳定杂蛋白沉淀试验。结果见图14。
由结果可知，当pH为6时SOD比活力较小，因为此时溶液中杂蛋白沉淀比较少，虽然SOD多，但是蛋白总量也多，所以比活力小；当pH为4时SOD比活力也较小，这可能是虽然杂蛋白已部分去除，但SOD活性有所下降所致。酶活力最高的pH是5。所以酸沉淀杂蛋白的pH应选5.0。
3.3丙酮去除杂蛋白有机溶剂是常规的蛋白质沉淀剂。但是并不是所有的蛋白质都能被有机溶剂沉淀。比如乙醇和丙酮，能够使一些蛋白质沉淀，但是，有一些蛋臼质可以在这些溶剂中稳定存在。不同浓度的乙醇和丙酮，沉淀蛋白质的种类也不同。不同倍数冷丙酮沉淀杂蛋白的结果见图15。
由结果可知，随着丙酮的加入，提取液中SOD比活力提高，说明杂蛋白去除量增加，但超过0.6倍后SOD活力略有下降。说明0.6倍丙酮是沉淀杂蛋白的较好浓度。
3.4丙酮沉淀SODSOD属于在中等丙酮浓度下能够稳定存在的酶类。所以我们利用丙酮沉淀了杂蛋白质后，再增加丙酮浓度，使SOD得以沉淀。结果如图16。
由图16结果我们可以知道，要想使很好地SOD沉淀下来，需要再加入0.6倍的丙酮。
4讨论与结论在研究中，我们分别采用了热沉淀法分离杂蛋白、酸沉淀法分离杂蛋白和丙酮沉淀杂蛋白的方法，通过条件研究，分别确定了各自的最佳条件，从而得到了符合规定的产品。所以这个工艺流程是可行的。
具体工艺流程为首先粗酶液经50℃保温30min，4000r/min离心15min，除去热不稳定性杂蛋白；然后用2mol/L HCl调节pH至5.0，4000r/min离心15min，除去酸不稳定杂蛋白；上清液中加入0.6倍冷丙酮，搅拌均匀，4000r/min离心20min，除去沉淀杂蛋白；上清液中继续加入0.6倍的冷丙酮，离心收集沉淀，便可得到纯化的SOD产品。
四、产品中残余色素的去除1研究的目的和意义由于菌丝体附着于棉籽壳等组成的培养基上，这种培养基含有不少水溶性色素，虽然在提取过程中这些色素被逐步去掉，但是在最后产品中，还有少量色素存在。这些残余色素必须去除，才能保证产品的质量。
2材料与方法2.1材料2.1.1试验材料上述步骤得到的SOD。
2.1.2试剂硫酸铵，分析纯。
2.1.3设备TDL-5离心机3结果鉴于粗酶液的提取用的是水溶液，所以残余的色素都是水溶性的，可以通过水溶解法加以去除。我们采取二次水溶解法去除残余色素，即在得到的SOD产品中加入一定量的水，使SOD溶解，然后加入90％硫酸铵，使SOD二次沉淀，从而使色素和SOD分离，然后脱盐即可得到符合质量指标的产品。
操作流程见操作流程示意图174结论根据如上结果，水二次溶解，盐析沉淀所得到的产品符合要求，该方法可以用于SOD工艺。
五、动物血液、植物、食用菌提取(纯)SOD工艺的比较通过三类SOD提取(纯)工艺的比较，我们可以得知首先，从工艺成熟程度看，动物血液提取SOD的工艺流程相当成熟。植物提取SOD的工艺流程液比较成熟。微生物提取SOD的研究中，利用酵母生产SOD的工艺初步提出，而食用菌SOD的研究只是处于理论研究阶段，利用食用菌作为提取材料生产SOD还没有人进行研究，所以其工艺流程还没有形成。
其次从工艺的实用性看，由于经过多少年的生产实践，人们在不断探索动物血液提取SOD的新工艺，比如有以血液为材料，有以血块为材料，有的提出综合提取办法等，动物血液提取SOD的工艺流程相当实用。植物提取SOD的工艺研究虽然起步较晚，但是由于有动物血液的基础，其工艺流程也相当实用。在微生物提取SOD的工艺研究中，酵母SOD提取工艺正在走向实用，已经使用了生产中常用的有机溶剂(乙醇氯仿沉淀法，冷丙酮沉淀法)沉淀法等。而食用菌SOD提取还处于实验室阶段，使用的技术完全是实验室技术，如细胞壁酶解法，硫酸铵盐析法，DEAE离子交换法等。这些方法只能用于实验室极小批量的提纯研究，无法用于生产中的，该方面技术还是不实用的。
再次从工艺经济效益看。从动物血液和植物提取SOD的生产工艺，由于工艺流程成熟，所用技术都是生产化的技术，所以其经济效益显著的。从微生物提取SOD的研究中，虽然发酵法生产SOD产量高，但由于在技术使用上还有部分高投入技术；还需要人工培养酵母菌，这要求有技术和投入较高的培养基；特别是需要投入很大的资金配备发酵罐及其配套设备。所以发酵法生产SOD的经济效益不是很好。食用菌提取SOD只处于理论研究阶段，还不能和经济效益挂钩。
最后从工艺的原料来源和安全性看。我国动物血源丰富，牛血、猪血的价格较低，生产SOD工艺简单。所以，用牛血、猪血来提取SOD是目前市场SOD的主要来源。但随着国际上疯牛病、口啼疫等传染性疾病的漫延，动物血液中提取的SOD的使用给人们带来了不少的危险因素。动物原料来源充足，有安全隐患。
利用植物如玉米、大蒜、绿豆等生产SOD生产技术已经成熟，正在走向市场。与动物原料相比，植物原料易于收集存放。加工容易，副产物可以综合利用，植物SOD制剂比血液SOD制剂性能稳定使用安全。植物SOD克服了血液SOD的缺点，所用技术方法先进，产品安全可靠。但是植物原料易受农业生产和社会需求的影响。
由于食用菌生产SOD的全过程属于人工控制，食用菌的来源不受限制。食用菌更是在全国广泛种植，其出菇后的培养基毫无应用价值，该工艺的原料来源十分广泛。
不同材料生产SOD工艺的比较见下表5。
表5 不同材料生产SOD工艺的比较
这些工艺的比较结果显示，从动物血液和植物提取SOD各有不足，而以食用菌为材料提取SOD的原料来源非常丰富，产品安全性高，只要能有一个经济实用的工艺流程，其经济效益是显著的。所以本工艺流程具有很好的实用性和经济效益。
本发明的创新点在食用菌菌糠提取SOD工艺流程中，我们在其他人工作的基础上进行了创新，主要的创新点有1、现在正在使用的SOD生产工艺，其原料有动物血液，植物可食部分，酵母等，但是没有关于利用食用菌生产SOD的报道。正如前面述及，这些原料各有所长，但是也都有不可避免的不足。本工艺以出完菇的菌糠为原料，可以将食用菌生产的废料变废为宝，提高了食用菌生产的经济效益。也开辟了提取SOD的新途径，填补了国内外SOD生产原料不足的空白。同时，这个创新点的创立，形成了食用菌生产的综合模式，可以提高食用菌生产的经济效益，形成了该产业的又一个亮点。
2、在我们的生产工艺中，使用了三种新的技术——食用菌生产用固体培养基(料)菌丝体提取技术、菌丝体细胞壁破壁技术和残余色素去除技术。
在提取研究菌丝体SOD过程中，需要将菌丝体与培养基分离。由于现有的研究都是理论研究，其菌丝体都是从液体培养基中过滤而得或固体培养基上直接刮取。从食用菌固体培养基(即料)中如何提取SOD用菌丝体还无人报道。使用我们创立的食用菌生产用固体培养基(料)菌丝体提取技术，可以将SOD胞外酶和菌丝体一起分离得到，离心或过滤即可得到菌丝体。从而解决了从食用菌生产用固体培养基(料)提取菌丝体的问题。
食用菌菌丝体破壁现在只是实验室的方法，虽然微生物破壁方法很多，但是哪一种适用于食用菌菌丝体，哪一种可以用于食用菌SOD的生产报道甚少。经过试验，我们认为超声波破壁法使用方便，适于生产，均可以用于食用菌SOD的生产。
杂蛋白去除技术和残余色素去除技术是我们的又一个创新，这个技术解决了杂蛋白、色素影响产品稳定性和活性的问题，是产品质量研究的又一突破，具有国际影响意义。
本工艺的特点是流程简单，设备简单，试剂简单。从粗酶液的制备到得到产品也只需几个大步骤，所以是流程简单的工艺；整个操作过程，只需振荡器、搅拌机机、加热设备、普通离心机和普通玻璃器皿，而无需像其他微生物提取SOD工艺，需要发酵罐、超滤设备等，因此本工艺设备简单，投资不大；生产过程所需试剂只有丙酮，这是普通化学试剂。所以在工艺上也具有其他生产工艺所不可比拟的优势。
图1不同生长期的白灵菇子实体图2白灵菇子实体不同阶段SOD活性图3杏鲍菇不同生长期子实体图4杏鲍菇不同生长阶段子实体粗酶液中SOD活性图5菌糠不同提取时间和提取方法的提取效率比较图6杏鲍菇不同生长阶段菌糠粗酶液中SOD含量图7甲苯破壁法工艺流程图8甲苯破壁时间对提取效果的影响图9甲苯破壁温度对提取效果的影响图10超声波破壁法工艺流程设计图11超声波破碎功率对SOD的提取率及活性的影响图12超声波破碎时间对SOD的提取率及活性的影响图13不同温度下提取液中SOD的比活力图14不同pH时提取液中SOD的比活力图15加入不同倍数丙酮后SOD的比活力图16不同倍数丙酮沉淀SOD的变化图17分离色素操作流程示意图18本发明工艺流程图具体实施方式
实施例1一种食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，包括以下步骤以杏鲍菇菌糠为例，杏鲍菇菌糠为出菇后期的杏鲍菇固体培养基，在出完二茬菇后由菇棚直接转运到SOD生产车间，根据《原料标准》对菌棒进行逐个检查，剔除有杂菌的菌棒，去掉培养袋，人工拍碎，即为杏鲍菇菌糠。
(1)菌糠加水振荡30分钟，过滤，得到SOD粗酶液；菌糠和水的(重量)比例为1∶4，过滤用4层纱布，过滤后弃去残渣。
(2)粗酶液离心得到菌丝体沉淀物和上清液(胞外酶)，粗酶液离心4000r/min，15min(由于菌丝体附着于棉籽壳组成的培养基上，首先需要将菌丝体与培养基分离，由于SOD存在胞内酶和胞外酶两种形式，在制备粗酶液时需要将二者全部收集。)(3)菌丝体沉淀物超生波破壁后离心得到胞内酶液，超声波破壁100W时间5～8min(4)上清液和胞内酶液混合得到的粗酶液，然后浓缩(用超过滤机反渗透的方法浓缩)，(5)浓缩后的浓缩液在50℃度保温30分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，加2mol/L的HCl调整PH值为(5.0)，得到浑浊液，离心4000r/min，15min，离心后的沉淀为热不稳定蛋白，弃去。
再离心，收集上清液，离心4000r/min，15min，离心后的为酸沉淀热不稳定蛋白，弃去。
在收集到的上清液中加入0.6倍体积的冷丙酮得到的混浊液，(冷丙酮的温度为7℃)对混浊液离心收集上清液，离心4000r/min，20min，离心后的为杂酸沉淀热不稳定蛋白，弃去。
再在收集的上清液中加入0.6倍体积的7℃丙酮得到混浊液，对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀(SOD)，离心4000r/min，20min。
(6)加水溶解得水溶液，水溶液加90％的硫酸铵得到混浊液，离心收集沉淀，脱盐即可得到最终产品。4000r/min，15min。
安全评价根据卫生部《食品安全性毒理学评价程序》对按照本工艺提取出的超氧化物歧化酶进行毒理学评价，从实验结果看，ID50＞20ml/kg，根据急毒性分级属于实际无毒级。在三项突变实验(Ames试验，微核试验，精子畸变试验)中，其结果均为阴性，根据《食品安全性毒理学评价程序》该方法获得的SOD单位高，无污染，属纯天然活性酶。
实施例2步骤同实施例1，其中步骤(1)振荡时间为20分钟；步骤(2)的离心参数(离心2000r/min，时间持续30分钟)；步骤(3)超声波功率时间范围(60W，10min)；步骤(5)中，浓缩后的浓缩液在45℃保温60分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，调整PH值为(4.0)，得到浑浊液，再离心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.5倍的4℃冷丙酮得到的混浊液，离心2000r/min，时间持续30分钟；
对混浊液离心收集上清液，再在收集的上清液中加入1倍4℃冷丙酮得到混浊液，离心2000r/min，时间持续15分钟；对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀，得SOD粗品。离心2000r/min，时间持续15分钟；步骤(6)中，离心2000r/min，时间持续30分钟。
实施例3步骤同实施例1，其中步骤(1)振荡时间为60分钟；步骤(2)的离心参数(离心3000r/min，时间持续20分钟)；步骤(3)超声波功率时间范围150W，3min；步骤(5)中，浓缩后的浓缩液在60℃保温30分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，调整PH值为(6.0)，得到浑浊液，再离心，收集上清液，在收集到的上清液中加入1倍的0℃冷丙酮得到的混浊液，离心3000r/min，时间持续20分钟；对混浊液离心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.5倍0℃冷丙酮得到混浊液，离心3000r/min，时间持续20分钟；对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀，得SOD粗品。离心3000r/min，时间持续20分钟；步骤(6)中，离心3000r/min，时间持续20分钟。
实施例4步骤同实施例1，其中步骤(1)振荡时间为40分钟；步骤(2)的离心参数(离心3500r/min，时间持续25分钟)；步骤(3)超声波功率时间范围(80W，7min)；步骤(5)中，浓缩后的浓缩液在55℃保温50分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，调整PH值为(4.5)，得到浑浊液，再离心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.7倍的10℃冷丙酮得到的混浊液，离心2500r/min，时间持续25分钟；对混浊液离心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.7倍10℃冷丙酮得到混浊液，离心3500r/min，时间持续25分钟；对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀，得SOD粗品。3500r/min，时间持续20分钟；步骤(6)中，离心2500r/min，时间持续25分钟。
实施例5步骤同实施例1，其中步骤(3)采用甲苯破壁法，实施最佳条件是在35℃条件下，加甲苯作用于样品45min，然后静置提取30min。
权利要求
1.一种食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，其特征在于包括以下步骤(1)、菌糠加水振荡20～60分钟，过滤，得到SOD粗酶液，(2)、粗酶液离心得到菌丝体沉淀物和上清液，(3)、菌丝体沉淀物破壁后离心得到胞内酶液，(4)、上清液和胞内酶液混合得到的粗酶液浓缩，(5)、浓缩后的浓缩液在45～60℃保温30～60分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，调整PH值为4.0～6.0，得到浑浊液，再离心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.5～1倍的丙酮得到的混浊液，对混浊液离心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.5～1倍的丙酮得到混浊液，对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀，得SOD粗品，(6)、加水溶解得水溶液，水溶液加硫酸铵得到混浊液，离心收集沉淀，脱盐即可得到最终SOD纯品。
2.根据权利要求1所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，其特征在于包括以下步骤，(1)、菌糠加水振荡30分钟，过滤，得到SOD粗酶液，(2)、粗酶液离心得到菌丝体沉淀物和上清液(胞外酶)，(3)、菌丝体沉淀物超声波破壁后离心得到胞内酶液，超声波功率时间为100W，5min，(4)、上清液和胞内酶液混合得到的粗酶液浓缩，(5)、浓缩后的浓缩液在50℃保温30分钟得到混浊液，混浊液离心，收集上清液，调整PH值为5.0，得到浑浊液，再离心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.6倍的丙酮得到的混浊液，丙酮温度为0～10℃，对混浊液离心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.6倍的丙酮得到混浊液，丙酮温度为0～10℃，对混浊液离心分离，弃上清液，收集沉淀，得SOD粗品，(6)、加水溶解得水溶液，水溶液加90％的硫酸铵得到混浊液，离心收集沉淀，脱盐即可得到最终SOD纯品，离心4000r/min，时间持续15分钟。
3.根据权利要求1或2所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，其特征在于菌糠选用杏鲍菇菌糠。
4.根据权利要求1所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，其特征在于步骤(3)中菌丝体沉淀物破壁选用超声波破壁，超声波功率范围60～150W，时间3～10min。
5.根据权利要求1所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，其特征在于步骤(2)离心参数2000～4000r/min，时间持续15～30分钟，步骤(5)三次的离心均分别为2000～4000r/min，时间持续15～30分钟，步骤(6)离心2000～4000r/min，时间持续15～30分钟。
6.根据权利要求5所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺，其特征在于步骤(2)离心参数4000r/min，时间持续15分钟，步骤(5)三次的离心分别为4000r/min，时间持续15分钟；4000r/min，时间持续20分钟；4000r/min，时间持续20分钟，步骤(6)离心4000r/min，时间持续15分钟。
全文摘要
本发明涉及一种生物体中提取超氧化物歧化酶技术，具体为一种食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工艺。解决了现有技术中没有从食用菌菌糠中提取SOD的工艺的问题。包括以下步骤粗酶液的制备，超声波破壁、分离提纯、色素去除等。本工艺以出完菇的菌糠为原料，可以将食用菌生产的废料变废为宝，提高了食用菌生产的经济效益。也开辟了提取SOD的新途径，填补了国内外SOD生产原料不足的空白，本工艺的特点是流程简单，设备简单，试剂简单。
文档编号C12N9/08GK1924010SQ20061004829
公开日2007年3月7日 申请日期2006年9月13日 优先权日2006年9月13日
发明者王金胜, 杜双田, 张玉标, 秦革年, 郭诚, 申红兵 申请人:山西众成生物工程有限公司