专利名称：反应器培养海绵或其细胞生产生物硅质材料的方法及装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用生物方法获得生物硅质材料的方法，具体说是反应器 培养海绵或其细胞生产生物硅质材料的方法及装置。
背景技术：
海绵是最低等的多细胞动物，具有利用水体中低浓度原硅酸合成自身 骨骼的能力。相比常规方法，这种生物合成过程是在自然环境、极低的底 物浓度下进行的。海绵骨骼的基本组成单位是骨针，其化学成分是带有结晶水的二氧化硅((Si02)2 5*H20)，与商用光学玻璃的化学组成一致，同时， 研究表明这种生物硅质材料具有良好的生物相容性和化学稳定性，其材料 性能如断裂强度等优于同等尺寸的人造玻璃材料，因此在生物、化工、光 学、半导体等领域具有巨大的应用前景。但是，由于天然海绵骨针的主要 成分是二氧化硅，其化学稳定性也影响了对海绵生物硅质材料的进一步应 用。硅烷偶联剂是一类广泛应用于化工领域的化学品，能够用于改善或调 解硅橡胶的高分子材料的理化性质。因此，在骨针合成过程中引入硅烷偶 联剂将是一个有益的尝试。
同时，海绵还是重要的药源生物，海绵的反应器养殖或海绵细胞培养 将是是未来解决生物量来源的最可能途径，但是海绵中的硅质材料占了海 绵干重生物量的50%以上，目前大多被作为加工废料处理，造成了极大的资源浪费。这部分骨针的合理利用将会产生巨大的经济效益和环境效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种反应器培养海绵或其细胞生产生物硅质材料 的方法，构建与海绵运动生长相适应的培养体系，通过调控水体中硅源组 成，引入硅烷偶联剂，进行化学成分可控的海绵来源生物硅质材料生产。
方法原理在海绵硅质材料产生过程中起重要作用的是一类被称为硅 聚合酶(silicatein)的蛋白，这类蛋白具有催化原硅酸聚合成二氧化硅 聚合物的能力，同时体外实验表明这类蛋白还能催化苯基三甲氧基硅烷聚 合的能力。这使得通过改变培养体系中硅源种类最终在海绵硅质材料中引 入有机基团进行改性成为可能。
海绵组织在生长运动过程中，不断产生新的骨针材料，并抛弃旧的部 分。在水流以及生长载体的导向下，海绵组织能够不断运动。因此，合理 的构建海绵生长反应器，将能够在不损伤海绵组织的前提下直接获得海绵 骨针。受到目前海绵组织培养水平的限制，将海绵组织的生长其定为6周。
海绵细胞聚集体培养过程中，也会产生骨针，以满足其生长需要，并 且在原有海绵骨针在细胞离散过程中已经被去除，因此，产生的新生骨针
将完全是改性后的骨针。为实现上述目的，本发明釆用的技术方案为本发明基于海绵组织块反应器培养体系或海绵细胞培养体系的、生产 具有一定化学修饰或改性的海绵来源生物硅质材料的方法；利用海绵自身 生物学性质进行生物硅质材料的生产，以改变海绵生长体系中硅源种类为 基础生产改性生物硅质材料；具体为，于反应器采用天然海水、投入常规的海绵馎料微藻培养海绵 或其细胞，在反应器中设置有与水平方向成45-135度生长面的附着基，海 绵或其细胞可沿生长面生长，在天然海水添加有硅烷偶联剂，硅烷偶联剂 于天然海水中的摩尔浓度为10-100 UM，利用海绵组织生长运动过程中抛弃 部分原有骨骼的现象进行骨针收获，或在离体海绵细胞培养体系中进行生 产骨针，得到生物硅质材料。进一步，可以对得到生物硅质材料进行纯化，将所其中的骨骼残余物或 海绵组织进行酸洗，去除有机质，得到具有特定化学修饰的海绵来源生物 硅质材料；所述酸为浓硝酸或体积比为O. 1-4: l的浓硫酸与浓硝酸的混合 酸，酸洗的处理温度为25-80°C，处理时间为O. 5小时或0. 5小时以上。所述硅烷偶联剂为以原硅酸为基础的硅氧烷及其衍生物(如四甲氧基硅 烷、四乙氧基硅烷等)；具有一个硅碳键的硅氧烷及其衍生物(如丙基三甲 氧基硅垸、3-脲基丙基三甲氧基硅烷等)；或其它具有与原硅酸发生聚合反 应的硅烷衍生物。通过反应器培养海绵生产海绵来源生物硅质材料，进行生物硅质材料化 学修饰，具体操作过程为，1) 将采集的野生海绵利用经过0. 22 u m滤膜过滤除菌的天然海水清洗 表面，将表层泥沙、附生藻类等污染物去除；2) 将清洗后的海绵用手术刀切成面积约为1-3cm X l-3cm的小块；3) 将步骤2)中切好的海绵小块转移进经过0.22um滤膜过滤除菌并 加入200-400mg/L庆大霉素的天然海水中，静置5-10分钟；4) 在反应器中加入经0.22um滤膜过滤除菌的天然海水，其中添加有 硅烷偶联剂，待用；5) 将步骤3)中经处理的海绵小块固定在反应器中的附着基上，在反 应器中进行培养，培养温度15 23摄氏度；6) 加入终浓度10-30万cells/mL的微藻(如硅藻、扁藻、金藻)作为饵料。在海绵组织块培养过程中，通过玻璃针，将海绵组织块固定到培养底 座上，在液升式培养反应器中进行培养；在培养体系中加入一定量的硅烷 偶联剂；在培养过程中，定期将海绵生长运动过程中抛弃的原有骨骼收集; 6周后，海绵组织将全部海绵组织收集。在海绵细胞培养过程中，在标准培 养方式下在培养体系中加入硅烷偶联剂，进行培养；在30天后收集所获得 的细胞聚集体。将所收集骨骼(或细胞聚集体)利用混酸(浓硫酸浓硝 酸二3: 1 (体积比))进行处理，去除有机质；利用去离子水将所获得骨针进行清洗并风干。最后取部分样品利用红外确认有机基团的引入。本发明 构建了一种新颖的海绵生物反应器，并利用了生物的本能进行生物硅质材 料的生产，环境友好，条件温和，是一种首创的、新颖的工艺。参照文献(Primmorphs from archaeocytes-dominant cell population of the sponge Hymeniacidon perleve: Improved cell proliferation and spiculogenesis (Biotechnology and Bioengineering， v84 —5， 583 — 590))所描述的海绵细胞离体培养方法，建立海绵细胞离体培养系统，进 行海绵来源生物硅质材料生产，具体操作过程，1) 将湿重1克的海绵组织利用含有摩尔浓度2-10mM乙二胺四乙酸的无 钙镁海水进行离散，将所获得的细胞利用密度梯度离心方法收集原细胞富 集层，调整至终浓度为5X106cells/mL进行接种；培养基为经0. 22 u m过滤 的天然海水加10-30uM的柠檬酸铁；培养温度18 23摄氏度；2) 在培养基中加入硅垸偶联剂进行培养，每两天至三天100%更换培 养基1次；3) 第二十至三十天终止培养，收集培养所获得细胞聚集体；4) 按照权力要求4步骤4 6进行处理，收获海绵来源生物硅质材料。 所述反应器可为液升式插块培养反应器其包括一容器，容器内底部设置有中空板，中空板上设置有小孔，中空 板通过管路与水泵相连，培养海水经过水泵循环进入到中空板内部，从中 空板表面分布的出水孔道向上流出；中空板上放置有竖直的带有玻璃底座的细长玻璃针，用以固定海绵组织 块，海绵组织插块通过玻璃针的固定排布于中空板上；海绵组织固定于插块上，并能够在水流作用下沿着插块上的玻璃针向上 生长；容器内设置有与气泵相连的进气管路，通过气泵对体系补气； 一海绵组织自下向上生长，每周将海绵组织下方的剩余骨骼从附着基上剥 离并收集。本发明与现有技术相比具有如下优点1. 本发明提供了一种基于海绵运动生长特性的全新的液升式插块培养 反应器，能够使海绵组织在培养过程中延特定方向运动，便于产物的收集。2. 本发明所描述的是一个全新的工艺流程，与以往化学合成方法有着 本质区别，是利用生物体自身特性结合独特的生长反应器进行生物硅质材 料的生产。通过构建海绵组织液升式插块培养反应器(或海绵细胞培养反 应器)，以硅烷偶联剂和天然海水中的原硅酸为底物进行海绵骨针的生产； 具体为，构建符合海绵组织运动生长规律的海绵组织块液升式插块培养反 应器，将硅烷偶联剂引入到培养体系的天然海水中，对海绵骨针的化学组 成进行调控，使得海绵或海绵细胞成为生产特定生物硅质材料的"工厂"， 也为海绵硅质骨针合成的深入应用提供了可能。3. 环境友好。本发明完全在近似于自然环境中进行。对于以生物量获 取为目的的海绵生产，还能够有效地利用其生产"废弃物"骨针。4. 底物浓度低。本发明的工艺路线是在天然海水基础上添加适量硅烷 偶联剂，所涉及底物浓度不超过60 " M,因此扣除海绵利用和自身降解，基 本没有残留，能够直接排放。5. 可以有效与其他工艺流程结合。海绵本身还能够用在养殖水体的有 机颗粒清除和净化方面，作为操作单元，本发明方法能够作为其中的一个 单元操作与整体系统结合，提高整体效益。总之，本发明是一种新颖、环保并行之有效的生物硅质材料的生产工艺。
图1为本发明培养体系示意图；图A为侧视图，其中l为培养所用容 器，2为附着基上的海绵组织，3为进入培养系统的水流，4为带有玻璃针 的附着基，5为带有出水孔的中空板；图B为俯视图，其中6为中空板上的出水孑L.图2为本发明液升式插块反应器中生物量变化趋势图； 图3为液升式插块反应器中的海绵组织照片； 图4为骨针的红外检测结果；图5为细胞培养体系中的新生骨针(箭头所示)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法与结果进行说明，本发明中使用的培养系统是为1. 8L液升式插块反应器，使用的硅烷偶联剂是标准商用试剂， 这里以3-脲基丙基三甲氧基硅垸为代表进行描述，海水为经0. 22^M过滤的 天然海水，海绵为生长在大连潮间带地区的繁茂膜海绵，骨针中化学组成 的红外检测利用Bruker Tensor 27 FT-IR进行。 实施例1将新鲜采集的繁茂膜海绵，用200mL经0. 22一滤膜过滤的天然海水洗 净，去除表面附着藻类以及泥沙等，在实验室中暂养三天；用手术刀将海 绵切成0.5X0.5cm2小块，共十块，约1克，转移进200mL经过0. 22 u m滤 膜过滤除菌并加入400mg/L庆大霉素的天然海水中，静置10分钟；在液升 式插块反应器中加入1. 8L经0. 22II m滤膜过滤除菌的天然海水；将处理过 的海绵块插在液升式插块反应器的玻璃底座上，在培养反应器内培养；每 周加入终浓度为20万cell/mL的金藻作为食物；每周将海绵连同插块一同 取出，清除表面污物并拭干表面海水，进行称重。海绵组织在前三周表现 出了生物量的增加，但是随着组织运动中不断将原有骨骼抛弃，海绵生物 量在6周时回落到初始值，停止试验。表明该反应体系适宜进中、短期培 养，并且生物硅质代谢活动强。结果见图2，图3。实施例2 取实验室暂养海绵，经手术刀切成0.5X0.5cm2小块，共十块，1.3g，转 移进200mL经过过滤除菌并加入400mg/L庆大霉素的天然海水中，静置10 分钟；在液升式插块反应器中加入1. 8L经0. 22 u m滤膜过滤除菌的天然海 水；将处理过的海绵块插在液升式插块反应器的玻璃底座上，在培养反应 器内培养；每周加入终浓度为20万cell/mL的金藻作为食物，同时加入 60 um的硅烷偶联剂3-脲基丙基三甲氧基硅烷；每周称重时将海绵抛弃的 骨骼收集，晾干；第六周结束后，将海绵组织收集，称重约1.2g;将全部 海绵组织及骨骼残余物用浓硫酸浓硝酸=3: 1 (体积比)的混合酸20mL 在8(TC处理一小时；利用酸式漏斗抽滤所得到的混合溶液，滤饼为骨针； 利用去离子水清洗滤饼至中性，风干，称重，得到最终的海绵来源生物硅 质材料。其中来源于培养中被抛弃骨骼的骨针重约O. 17g。以繁茂膜海绵重 量干湿比1: 10，骨针约占干重50%计算，这些骨针相当于3.4g湿重繁茂 膜海绵组织所提供的骨针量。也就是说，利用这种方式，虽然到了第六周 所获得的生物量与初始生物量相近，但是，所获得的骨针量远高于直接将 这些海绵直接处理，其差额就是这种特殊的"生物工厂"所制造出来的。 通过对所获得的骨针进行红外检测，以天然海绵的骨针作为对照，发现， 利用这种方式获得的骨针成功地引入了有机基团，见图4。图中标示处为 3-脲基丙基三甲氧基硅烷C-C骨架震动的特征峰(上)，而在正常海绵骨针中是不存在明显的这种特征峰(下)。检测中对照所用的天然骨针用量为10 倍于3-脲基丙基三甲氧基硅垸添加组。说明，利用这种方法不仅能够进行 海绵来源的生物硅质材料的生产，还能有效地在海绵来源生物硅质材料中 引入化学改性基团。 实施例3海绵采集后，经24小时暂养后利用7ppmCuS04和400mg/L Gentamycin Sulfate (Justaware Pharmaceutical Co. Ltd)处理三小时。参照文献 (Pri,orphs from archaeocytes-dominant cell population of the sponge Hymeniacidon perleve: Improved cell proliferation and spiculogenesis (Biotechnology and Bioengineering， v84 —5， 583 — 590))的方法进行Ficoll细胞密度梯度分离，取12 15%层细胞进行ADCP 培养。细胞培养在9cm培养皿(Corning)中进行，接种密度5X10Bcell/mL。 培养基为经0. 22 u m过滤的天然海水，加入60 u M硅烷偶联剂3-脲基丙基 三甲氧基硅垸和30uM柠檬酸铁。18。C避光静止培养，每两天100%换液。 培养后在细胞聚集体内能够发现新生骨针的存在，见图5。箭头所示为新生 骨针。
权利要求
1.反应器培养海绵或其细胞生产生物硅质材料的方法，其特征在于于反应器采用天然海水、投入常规的海绵饵料微藻培养海绵或其细胞，在反应器中设置有与水平方向成45-135度生长面的附着基，海绵或其细胞可沿生长面生长，在天然海水添加有硅烷偶联剂，硅烷偶联剂于天然海水中的摩尔浓度为10-100μM，利用海绵组织生长运动过程中抛弃部分原有骨骼的现象进行骨针收获，或在离体海绵细胞培养体系中进行生产骨针，得到生物硅质材料。
2. 按照权利要求l所述方法，其特征在于可以对得到生物硅质材料 进行纯化，将所其中的骨骼残余物或海绵组织进行酸洗，去除有机质，得 到具有特定化学修饰的海绵来源生物硅质材料；所述酸为浓硝酸或体积比 为O. 1-4: 1的浓硫酸与浓硝酸的混合酸，酸洗的处理温度为25-8(TC，处 理时间为0. 5小时或0. 5小时以上。
3. 按照权利要求l所述方法，其特征在于所述硅垸偶联剂为以原硅 酸为基础的硅氧烷及其衍生物；具有一个硅碳键的硅氧烷及其衍生物；或 其它具有与原硅酸发生聚合反应的硅烷衍生物。
4. 按照权利要求1所述方法，其特征在于所述原硅酸为基础的硅氧 垸及其衍生物为四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷；具有一个硅碳键的硅氧烷 及其衍生物为丙基三甲氧基硅烷或3-脲基丙基三甲氧基硅烷。
5. 按照权利要求l所述方法，其特征在于通过反应器培养海绵生产 海绵来源生物硅质材料，进行生物硅质材料化学修饰，具体操作过程为，1) 将采集的野生海绵利用经过0. 22 u m滤膜过滤除菌的天然海水清洗 表面，将表层污染物去除；2) 将清洗后的海绵用手术刀切成面积约为0. 5-3cm X 0. 5-3cm的小块;3) 将步骤2)中切好的海绵小块转移进经过0.22um滤膜过滤除菌并 加入200-400mg/L庆大霉素的天然海水中，静置5-10分钟；4) 在反应器中加入经0.22um滤膜过滤除菌的天然海水，其中添加有硅垸偶联剂，待用；5) 将步骤3)中经处理的海绵小块固定在反应器中的附着基上，在反 应器中进行培养，培养温度15 23摄氏度；6) 加入终浓度10-30万cells/mL的微藻作为饵料。
6. 按照权利要求l所述方法，参照常规的海绵细胞离体培养方法，建 立海绵细胞离体培养系统，进行海绵来源生物硅质材料生产，其特征在于: 具体操作过程，l)将湿重1克的海绵组织利用含有摩尔浓度2-10mM乙二胺四乙酸的无 钙镁海水进行离散，将所获得的细胞利用密度梯度离心方法收集原细胞富 集层，调整至终浓度为5X106cells/mL进行接种；培养基为经0. 22 u m过滤 的天然海水加10-30 u M的柠檬酸铁；培养温度18 23摄氏度；2) 在培养基中加入硅烷偶联剂进行培养，每两天至三天100%更换培 养基1次；3) 第二十至三十天终止培养，收集培养所获得细胞聚集体；4) 按照权力要求4步骤4 6进行处理，收获海绵来源生物硅质材料。 7.按照权利要求1所述方法的装置，其特征在于所述反应器为液升式插块培养反应器，包括一容器，容器内底部设置有中空板，中空板上设置有小孔，中空板 通过管路与水泵相连，培养海水经过水泵循环进入到中空板内部，从中空 板表面分布的出水孔道向上流出；中空板上放置有竖直的带有玻璃底座的细长玻璃针，用以固定海绵组织 块，海绵组织插块通过玻璃针的固定排布于中空板上；海绵组织固定于插块上，并能够在水流作用下沿着插块上的玻璃针向上 生长；容器内设置有与气泵相连的进气管路，通过气泵对体系补气；海绵组织自下向上生长，每周将海绵组织下方的剩余骨骼从附着基上剥 离并收集。
全文摘要
本发明涉及反应器培养海绵或其细胞生产生物硅质材料的方法及装置，于反应器采用天然海水、投入常规的海绵饵料微藻培养海绵或其细胞，在反应器中设置有与水平方向成45-135度生长面的附着基，海绵或其细胞可沿生长面生长，在天然海水添加有硅烷偶联剂，利用海绵组织生长运动过程中抛弃部分原有骨骼的现象进行骨针收获，或在离体海绵细胞培养体系中进行生产骨针，得到生物硅质材料。本发明涉及海绵来源生物硅质材料生产方法，通过构建海绵培养反应器，引入硅烷偶联剂，利用海绵组织块或细胞，进行具有化学修饰硅质材料的生物合成，使得海绵或海绵细胞成为生产特定生物硅质材料的“工厂”，同时也为海绵硅质骨针合成的深入应用提供了可能。
文档编号C12N5/06GK101130764SQ20061004751
公开日2008年2月27日 申请日期2006年8月23日 优先权日2006年8月23日
发明者卫 张, 曹旭鹏, 虞星炬, 金美芳 申请人:中国科学院大连化学物理研究所