使用病毒检测样本中活细胞的方法

专利名称：：使用病毒检测样本中活细胞的方法使用病毒检测样本中活细胞的方法本申请涉及样本内存在的活细胞的检测方法，以及用于该方法的试剂盒。在公共安全领域，对细菌和其它生物的快速检测是非常重要的。特别重要的是，在食品工业中务必使食品和饮料不会受到有害细菌和其它樣史生物(例如大肠杆菌0157)的污染。在兽医学和医学诊断领域，快速鉴定潜在的有害细菌和其它生物，使感染得到控制，动物或病人得到正确治疗也是非常重要的。使医药制品、化妆品和兽医制品免受细菌等有害污染物污染也是重要的。另夕卜，某些细菌和其它生物(例如炭疽芽孢杆菌(万ac/〃tw朋^rac&))具有用作生物武器的潜在危害。因此，能够快速检出样本中存在的所述生物体是重要的。例如，据估计初期吸入炭疽芽孢杆菌的芽孢后仅有6小时窗口期，这期间可进行有效治疗。目前有多种可用于检测细菌和其它生物的方法。例如，采用传统培养方法可检测样本中存在的细菌。然而，用这些方法常常遇到的一个难题就是样本中的生物浓度普遍很低。因此，为了将生物培养至可检测水平，在进行试验前需要将样本孵育一定时间。在公共卫生处于危险的许多情况下，这种延误是不可接受的。另一方面，PCR和其它核酸扩增技术为检测细菌和其它生物的存在提供了一种基于DNA的快速而灵敏的检测方法。这些技术通常依赖于使用扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)来检测细菌DNA。然而，存在着与所述扩增技术相关的缺点，这是因为DNA是一种具有顽强生命力的化学物质，当宿主细胞死亡时它也能完整地幸存下来。例如，如果家禽产品已被致病菌例如沙门氏菌污染，那么煮熟后将认为食品是安全的。基于培养的传统检测方法将显示食品是安全的，但方法本身需花费长时间进行，而DNA实时快速法将显示假阳性结果，这是因为沙门氏菌DNA仍然存在于样本中。另一方面，WO2003/035889描述了用含有标记序列的修饰噬菌体检测活细胞的技术。在该方法中，将修饰噬菌体导入待测样本中。如果存在活细胞，那么噬菌体能够使用细胞机器进行复制，结果检测到标记序列增多。然而，存在着与该技术相关的缺点。首先，既然噬菌体必须经特异性工程改造使其含有所需标记序列，那么需要插入标记序列就必然增加了检测的复杂性。因此，所述修饰噬菌体将增加所述检测的成本和复杂性。另外，既然将标记序列加入待测样本中，由于它在噬菌体中存在，因此有必要定量检测样本中该标记序列量的任何升高。这意味着必须孵育足够长时间以确保不会产生假阳性结果。因此，有必要提供一种可靠的检测方法来应对潜在生物危害，该方法要容易操作，且可靠性方面要达到低水平假阳性或假阴性结果。因此，本发明提供样本内活细胞的检测方法，所述方法包括(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下，将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸。通过检测病毒复制特异性获得的核酸，有可能确定样本中存在活细胞(只是相对死细胞而言)。在一个具体的实施方案中，本发明提供样本内活细胞的检测方法，所述方法包括(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下，将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸，假如当病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么被检测的核酸为病毒在细胞内复制所独特产生的核酸。为了确保步骤(i)期间所有活细胞都被感染，可将活细胞作预处理，例如加入病毒前，使其在例如37。C-42。C温度下孵育合适时间，例如2.5-4.5小时。例如，如果样本中含有应激菌，例如由于保存或分离过程(如免疫磁性分离法(MS)),那么进行预处理就是特别有必要的。然后可将它们在孵育温度下保持一段时间，使得可以发生感染和某些复制。所用病毒可为单链(ss)或双链(ds)RNA或DNA病毒。病毒本身可存在步骤(ii)中被检测的核酸。既然这样，有必要定量检测样本中该核酸量的升高。因为不必修饰病毒使其包含标记序列，所以该方法优于WO03/035889中所述的方法。然而，优选病毒本身并不含有步骤(ii)中被检测的核酸，该核酸是病毒在细胞内复制所独特产生的。因为需要利用样本内的活细胞来产生病毒，这意味着检测到任何具有该特定序列的核酸将表明样本内存在活细胞。病毒可为野生型病毒或修饰病毒。当病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么被检测的核酸为病毒在细胞内复制所独特产生的核酸。在一个具体的实施方案中，病毒并不修饰成含有任何标记序列，例如耙重复序列。然而，为了其它目的，例如为了提高病毒的感染性或特异性，可对病毒进行修饰。所述病毒可为商品化病毒，因此提供优于天然存在的病毒而不会显著增加方法的复杂性或成本的优点；或者所述病毒可使用常规转化方法来产生。选捧哪种检测方法将取决于所使用的具体病毒。在一个具体的实施方案中，所述病毒为RNA病毒，特别是单链此外，编码RCS23家族其它成员、具有与根据SEQIDNO:1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的RCS23蛋白、具有与SEQIDNO:1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。本发明还涉及经分离的多核苷酸，其可在严谨条件下(优选地，高度严谨条件下)与本发明的多核苷酸(例如，SEQIDNO:1所示的多核苷酸)杂交。有利地，此类多核苷酸可从能将给定的碳源直接转化为维生素C的微生物(牛寺另lj是G/wco"o6acferox_y<iara，i"尤选地，G/wcowo6(3"ero;cjy/朋5DSM17078)中获得。本文中用到的术语"杂交"被用来描述杂交和洗涤，在所述杂交和洗涤条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50%、至少约60%、至少约70%、更优选为至少约80%、进一步优选为至少约85%到90%、最优选为至少95%的核苷酸序列保持相互杂交的状态。在一种实施方式中，本发明的核酸与SEQIDNO:l所示的核酸序列或其互补序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同源或更同源。此类严谨杂交条件的一个优选的非限制的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，大约45。C下杂交，随后在lxSSC、0.P/。SDS中，50°C下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55。C下，更优选在60。C下，进一步优选在65。C下进行。高度严谨条件包括使用经标记的DNA探针(例如，用地高辛(DIG)标记的DNA探针)在42。C温育数天(例如2-4天)，接着在2xSSC禾P0.1%SDS中于室温下洗一次或多次，以及在65-68°C，于0.5xSSC和0.1%SDS或0.1xSSC和0.1%SDS中洗一次或多次。特别地，高度严谨条件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100/xg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(RocheDiagnosticsGmbH)中，或包含50%甲酰胺、5xSSC(150mMNaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02%十二烷基磺酸钠、0.1%N-月桂酰肌氨酸和2%封闭试剂(RocheDiagnosticsGmbH)生的正链RNA。为了仅产生一种互补DNA分子，优选在逆转录步骤中使用一种引物进行检测。在一个具体的实施方案中，然后通过设计扩增cDNA内某个区域，使用常规PCR扩增对该cDNA进行检测。为了确保污染降至最低，在该扩增前优选对RNA链进行消化。或者，病毒本身核酸量的升高可用作存在活细胞的指示物。再者，这是因为病毒复制仅能在活细胞内发生。在该实施方案中，被检测核酸与净艮告序列不同，优选为野生型序列。例如，当病毒为DNA病毒，例如单链II类病毒或双链I类病毒时，常常有必要检测感染后DNA总量升高以确定样本内存在特异性活细胞。可采用各种方法进行检测，但可能最简便的将是使用定量PCR方法，例如TAQMANTM方法或类似方法扩增DNA。当病毒为RNA病毒时，有必要使用例如RT-PCR检测RNA的增多。本发明方法中的待测样本可为疑似或已知含有原核细胞和/或低等真核细胞和/或高等真核细胞的任何样本。落入本发明范围之内的样本实例包括食品样本、人或动物体液样本或组织样本(特别是临床样本)、医药制品、化妆品或兽医制品或药物、植物样本、土壤样本、空气样本、水样本和细胞培养物样本。样本最优选为食品样本。本发明的所述方法可用于检测病毒能感染的任何活细胞样本。这些活细胞包括原核细胞和真核细胞。细胞可为例如4故生物，例如细菌。可^r测的细菌的具体实例包括大肠杆菌(5.co/z)、沙门氏菌属(/SWmowe〃a)、李斯特菌属(丄/对en'a)、弯曲沐亍菌属(Cam/7y/oZ)a"er)、军团菌属(丄eg/o"e〃a)、分一支3于菌属(A^co6orc&n'wm)、葡萄5求菌属(S啤/2y/0c0cc—或链球菌属(S哗tococc—。或者，细胞可包含在昆虫、植物或真菌等小的生物体内。另外，它们又可存在于细胞或细胞系，包括哺乳动物细胞系、植物细胞系和真菌细胞系。例如在筛选药物或其它试剂期间，或者在生物学分析中，常常对细胞系中的活细胞进行检测，本文所述方法可用于该情况下。例如，在分析含有细胞的病人(已用抗生素对特定细菌感染进行治疗)样本时，所述方法是特别有用的。可根据本文所述方法检测从这些病人身上采集的合适样本，以判断抗生素治疗是否有效。病毒可为野生型病毒或重组病毒。如果细胞为活细胞，病毒将能够感染该细胞并进行复制，对于正链RNA而言产生cDNA,或者其它情况下会产生更多种RNA，特别是mRNA。当用修饰病毒检测例如病毒在细胞内复制所独特产生的插入标记序列的互补序列时，那么可提供清楚的指示物表明存在活细胞。合适的标记序列可包括抗生素抗性基因。一般而言，本质上可用上述方法检测可被病毒感染的任何类型细胞的生存力。例如，如果必须检测样本中活的大肠杆菌0157细胞，那么可使用能感染大肠杆菌0157细胞的任何病毒。在某些样本例如牛奶样本或土壤样本中，存在的细菌或其它细胞类型数量非常高。可以理解的是，很难在所述样本中检测具体细胞类型的生存力。然而，在本发明的一个优选实施方案中，所用病毒对细胞类型是特异性的，存在的活细胞是在检测范围之内。换言之，在该实施方案中，使用的病毒必须仅仅能感染在检测范围内的细胞类型且在其中复制。例如，从英国的国立工业和海洋微生物保藏有卩艮公司(theNationalCollectionofIndustrialandMarineBacteria,Aberdeen,UK,保藏号为NCIMB10359)可获取已知的大肠杆菌噬菌体。从英国沃特福德巴斯德诊断公司(赛诺菲)(DiagnosticsPasteur(Sanofi)WatfordUK)获得的Felix01噬菌体能够感染沙门氏菌属菌抹，特别是新港沙门氏菌在该优选实施方案中，不管存在多少其它类型的细菌或其它细胞，如果检测到活细胞存在，所用特异性病毒将仅产生可检测核酸。在判断细胞是否是活细胞之前，这意味着不必分离被检测细胞，这一点很有优势。当检测不止一种细胞的生存力时，病毒可以单独使用或者用作多特异性混合物。在后一情况下，接着使用各病毒的相应特征来检测多种核酸序列，例如cDNA序列。病毒感染和复制循环将常常导致被感染细胞破裂，释放出细胞内含物。如果是这种情况，无需主动裂解或均化细胞，就可检测到上述方法步骤(ii)中的被检测核酸。然而，如果需要或有必要的话，在步骤(ii)前可对样本内任何细胞进行裂解或均化。使用常规方法，例如加热或者例如加热至94°C、超声处理或加入裂解剂如去污剂可进行裂解或均化。在一个优选的实施方案中，当例如步骤(ii)中检测由病毒产生的cDNA或由复制RNA获得的DNA时，优选使用扩增反应例如聚合酶链式反应(PCR)进行检测。既然这样，为了扩增任何存在的靶DNA，如果有必要，在步骤(i)后裂解细胞，再加入各种试剂，包括众所周知的引物、聚合酶、核苦酸和緩冲液，最后进行常规热循环。然后，可使用常规方法例如凝胶电泳，再使用染料显现，对扩增产物进行检测。随着不断发展，优选采用扩增反应进行检测，其方式使得扩增产物可以产生可检测信号，特别是可见信号，例如荧光信号。所述信号的许多产生方法是本领域已知的。这些方法可以利用DNA结合剂等试剂(例如嵌入染料)，当染料嵌入DNA当中时，与含有荧光标记的探针和引物一样，通过重排进行荧光能量转移(FET),特别是焚光共振能量转移(FRET)来发光，特别是发高强度的荧光。有两种类型的常用FET或FRET探针，一种是使用核酸探针的水解作用使供体和受体分开，一种是使用杂交改变供体和受体分子1的空间关系。商品化的水解探针有TaqManTM探针。该探针由标记供体和受体分子的DNA寡核苷酸组成。探针被设计为与PCR产物一条链上的特异性区域相结合。PCR引物退火至该链后，Taq酶利用5'—3'聚合酶活性延伸DNA。Taq酶也显示5'—3'外切核酸酶活性。在3'端通过磷酸化将TaqManTM探针保护起来，以阻止其引发Taq延伸。如果TaqManTM探针与产物链杂交，延伸中的Taq分子也可水解探针，使供体从受体释放出来以作为检测基础。该情况下信号是累积的，自由供体分子和受体分子浓度随着每个扩增反应循环的增加而升高。可用的杂交探针有多种形式。分子信标是具有互补5'和3'序列，能形成发夹环的寡核苷酸。当形成发夹结构时，末端焚光标记紧紧靠近以便发生FRET。分子信标与互补序列杂交后，使得荧光标记分离，因此不发生FRET,构成检测基础。也可使用双标记寡核苷酸。它们在PCR产物链上紧紧靠近杂交，使得供体和受体分子在一起以便发生FRET。增强的FRET为检测基础。该类型的变体包括使用标记扩增引物与单条相邻探针。然而，当已知存在其它检测扩增反应方法时，可使用任何一种检测方法。这些方法的具体实例如WO99/28500、英国专利号2,338,301、WO99/28501和WO99/42611中所述。WO99/28500描述了一种非常成功地检测样本中存在靶核酸序列的方法。在该方法中，将DNA双链体结合剂和对所述把序列具有特异性的探针加入样本中。探针含有活性分子，能从所述DNA双链体结合剂吸收焚光或将焚光能量供给至所述DNA双链体结合剂。然后，使该混合物进行扩增反应，扩增靶核酸，诱发条件是在扩增过程期间或扩增过程结束后探针与靶序列杂交。监测从所述样本产生的荧光。该方法的一种替代形式是利用能从探针上的荧光标记吸收荧光能量，但并不发射可见光的DNA双链体结合剂，参见同时待审的英国专利申请号223563.8。为了检测靶cDNA序列，任何一种所述方法可用于本发明方法情况中。可采用定量方式来实施许多所述方法，这一点是本领域众所周知的，例如，在扩增反应每个循环期间至少监测一次从扩增混合物产生的信号。法涉及原始样本中的活细胞数量，或者可用所述方法来确定因病毒在活细胞内复制而引起的核酸量升高。如上所述，被检测的具体核酸可为病毒感染活细胞产生或复制的任何特征性序列。当检测中使用单特异性病毒时，被检测核酸可为来源于病毒的任何序列，或在制备重组病毒期间插入重组病毒的任何其它序列。当病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么核酸为病毒在细胞内复制所独特产生的核酸。当所述方法中使用病毒的多特异性混合物时，为了判断样本中特定细胞类型是否为活细胞，那么有必要检测核酸序列，该核酸序列是由每种所用病毒转录所得的特征性序列。既然这样，因此，最好是检测病毒在细胞内复制所独特产生的序列，且与每种所用病毒中特异性插入标记序列一致。既然这样，当被检测序列为DNA序列时，为了检测产生的各种序列，可进行使用不同信号试剂或系统的多重PCR反应。例如可通过在扩增反应中使用不同标记物，例如发不同波长萸光的标记物来标记所用探针或引物而实现。然后进行检测每种标记信号，例如每种不同波长的信号，当波长重叠时，必要时可进行合适的信号分辨。在本发明方法中，当被检测核酸为病毒本身存在的核酸时，仅用所述核酸量的升高就可表明存在活细胞。因此，步骤(ii)中检测样本即为检测所述核酸序列浓度的任何升高。靶核酸序列量的升高表明样本内存在活的宿主细胞。反之，靶核酸量没有升高表明事实是被才企测样本中不存在活的宿主细胞。在该实施方案中，孵育前需要从病毒加入至样本中形成的混合物中提取样本，检测该提取样本内的核酸量可提供基线进行比较。或者或又可在孵育期间的任何时候检测其它提取样本。最优选使用合适方法来确定孵育前后存在的核酸量。例如，可使用定量扩增反应(例如定量PCR)检测DNA浓度，尽管也可以使用不包括扩增的其它检测DNA的方法。可使用RT-PCR检测RNA浓度，如果合适的话，可结合PCR反应检测由此生成的DNA。必须同样处理孵育前后样本以便直接比较结果。最优选还使用水对照。本发明的另一方面提供实施上述方法的试剂盒。合适的试剂盒包含病毒以及一种或多种检测核酸所必需的试剂。在优选的实施方案中，试剂盒包含病毒以及一种或多种必需试剂，所述试剂用来检测病毒在所述细胞中复制所获得的核酸，假如当病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么一种或多种试剂对于检测病毒在细胞内复制所独特产生的核酸是必需的。病毒最优选为噬菌体，然而，也可使用其它能感染低等和/或高等真核细胞的DNA或RNA病毒，这取决于待检细胞性质。当所用病毒为RNA病毒时，优选步骤(i)前至少部分但优选完全纯化病毒以去除污染DNA。所述病毒构成了本发明的另一方面。合适的试剂盒可包含RNA病毒以及一种或多种试剂，所述试剂用来检测通过逆转录所述RNA病毒内的序列所获得的cDNA。所述一种或多种试剂最优选包含一对引物，该引物对通过逆转录所述RNA病毒内序列所获得的cDNA是特异性的。或者，试剂盒可包含DNA病毒以及一种或多种适合定量才企测DNA的试剂。所述一种或多种试剂最优选包含一对引物，该引物对病毒DNA序列是特异性的。或者，试剂盒可包含进行RT-PCR反应以检测RNA所必需的试剂，例如引物。试剂盒内可能的其它成分包含其它适合用于检测核酸序列的试剂。特别是试剂盒可包含嵌入染料或探针，使用上述方法通过它们检测产生的任何核酸。可采用直接检测扩增产物的方式来合适地标记引物。例如，引物可包含如上所述的焚光标记或其它标记。或者，试剂盒还可包含探针，该探针对扩增产物是特异性的，且被标记以协助检测产物。探针可包括单标记或双标记水解探针或杂交探针。适当的时候，它们可包括嵌入染料或其它DNA双链体结合剂，以组成检测系统成分。下面通过实施例并结合附图对本发明作出具体的描述，附图中图1用示意图说明本发明的检测方法；图2显示下文实施例2中所有检测样本的扩增曲线；图3显示使用正向引物尝试扩增任何cDNA的结果，说明所有检测样本都没有产生扩增cDNA;图4显示使用反向引物扩增任何cDNA的结果，说明原始样本、1:10、1:100和1:1000检测样本分别于约25、29、32和34个循环处^r测到扩增；和图5显示使用正向和反向引物扩增cDNA的结果，说明原始样本、1:10和1:100检测样本分别于约20、23和27个循环处检测到扩增。实施例1在图1所示实施方案中，具有单链负义基因组的V类病毒制品适用于样本。样本可为任何合适样本，但可包括在肉汤培养基或磷酸缓冲盐溶液(PBS)中的细菌浸液，其中细菌并不是应激菌，因此容易被感染。必要时将样本稀释，例如稀释至样本每毫升可含有6xl06~2xl03个细胞。之前可适当地处理病毒制品以去除污染DNA，例如，用DNA酶(DNAse)进行处理。病毒制品也可进行离心纯化，并重悬于例如緩沖蛋白胨水(BPW)中，以制成噬菌体滴度为例如101Q/ml。然后加入所述制品，例如大约20jil噬菌体，接着轻轻混合30秒。此后，合适地使混合物静置5分钟以促进噬菌体吸附。然后进行合适孵育，例如37。C水浴30分钟，期间可轻轻搅动培养物。在此期间，噬菌体将感染活细胞(如上所述)，且在所述细胞内产生多拷贝正链RNA。该过程结束后，必要时可裂解细胞，例如通过加热至94°C，用所获得的混合物进行RT-PCR,由正链RNA产生互补DNA序列。使用对正链RNA特异性单引物可合适地进行RT-PCR。鼠逆转录酶或AMV反应中典型条件的实例如下緩沖液10mMTris.ClpH8.3(室温)(终浓度)l-6mMMgCl20.1%明胶(任选)，10-50mMKC1，BSA级分V1-100pg/ml核苦酸50-400|iM引物P逸;K六核苷酸，特异性(如PCR中)或多聚脱氧胸苷核苷酸(连串"t，s")0.1-1酶0.25-5单位/)Li1(因酶而异)任选胎盘RNA酶(RNAse)抑制剂1-20单位用RNA酶处理产物，消化RNA模板，仅留下cDNA,该cDNA可用常规PCR反应进行扩增和检测。所有这些步骤都是快速的，因此，提供了一种快速检测活细胞的方法。实施例2说明书第13/15页链选择性MS2RT-PCR实验进行该实验以表明使用链定向RT-PCR可产生和检测cDNA。准确地说，该实验研究了在MS2噬菌体中链特异性两步法RT-PCR。当在MS2中仅存在一种类型RNA时，期望仅使用一种引物(例如正向引物或反向引物)就能产生会在PCR中扩增的DNA。方法本实验中所使用的引物和探针序列见表l。引物均用DEPC处理水稀释至浓度为10|iM。探针也稀释至浓度为2^M。第一探针用0.1xTE稀释，笫二探针用DEPC处理水稀释。表l:MS2引物和探针<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>对于逆转录步骤，使用表2所示的浓度和试剂来制备三种反应混合液。表2:逆转录步骤中使用的试剂<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>*如果加入的话用DEPC处理水补充逆转录反应混合液至71nl。接下来，每个管中加入8^tlMS2(浓度为4x107rnl)。混合样本，分装成两管，每管35^1,于9(TC变性10分钟。然后将管置于冰上，每个管中加入0.5|il逆转录酶MMuLV(60单位/jLi1，批号173)。轻轻混勻样本，置48。C水浴30分钟进行cDNA转录。按一式两份制备下列检测样本用于PCR分析DEPC处理水，阴性对照(ntc)4x10倍稀释系列的cDNA,用正向引物制备4xIO倍稀释系列的cDNA,用反向引物制备3x10倍稀释系列的cDNA,用正向和反向引物制备MS2纯化的DNA产物，1:1000稀释，阳性对照使用Corbett机器人制备PCR反应混合液。每个反应中所用试剂浓度见表3。表3:PCR混合液中使用的试剂浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>将PCR混合液(18pl)与2pl检测样本一起加入LightCycler毛细管中。盖上盖子，3000rpm短时离心。在LightCycler1.0(Roche)上进行下列程序扩增(50个循环)变性95°C5秒退火55°C20秒单次荧光读数延伸74°C5秒解链(l个循环)保持50°C15秒Temp.Ramp95°C4要0.rC/s连续焚光读凄史运用LightCycler数据分析程序对数据进行分析。结果见图2至图5。图2显示所有检测样本的结果。图3显示含有正向引物的检测样本的结果。图4显示含有反向引物的检测样本的结果。图5显示含有正向和反向引物的检测样本的结果。结论使用正向引物产生的cDNA不足以在PCR中检出。然而，^f吏用反向引物产生的cDNA足以在PCR中检出。当使用正向和反向引物，能以较高效率扩增cDNA,在PCR扩增中能尽早地检出。因此，现已证明使用链定向RT-PCR可特异性检测通过逆转录RNA所独特产生的cDNA。权利要求1.一种检测样本内活细胞的方法，所述方法包括(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下，将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸，假如当所述病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么被检测的核酸为病毒在细胞内复制所独特产生的核酸。2.权利要求1的方法，其中所述病毒本身并不含有步骤(ii)中被检测的核酸，该核酸是病毒在细胞内复制所独特产生的。3.权利要求2的方法，其中所述病毒是RNA病毒。4.权利要求3的方法，其中步骤(ii)中被检测的核酸为通过逆转录细胞中所述RNA病毒内的RNA序列所产生的cDNA。5.权利要求3或4的方法，其中实施步骤(ii)前用RNA酶处理样本。6.权利要求l的方法，其中所述病毒是天然存在的DNA或RNA病毒，且病毒内存在步骤(ii)中被检测的核酸，步骤(ii)中检测样本内所述核酸量的升高。7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述病毒是天然存在的、对所述细胞具有特异性的病毒。8.前述权利要求中任一项的方法，其中4吏用扩增反应检测步骤(ii)中被检测的核酸。9.权利要求8的方法，其中扩增反应为聚合酶链式反应(PCR)。10.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(ii)检测前，对样本内任何完整细胞进行裂解。11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述样本为食品样本或临床样本。12.前i^f又利要求中任一项的方法，其中所述细胞为细菌细胞，所述病毒为噬菌体。13.权利要求12的方法，其中所述细胞为大肠杆菌(五.co")、沙门氏菌属、李#斤特菌属(丄/对eh")、弯曲岸亍菌属(C"wpy/o6"cfer)、军团菌属(丄eg/owe〃")、分冲支斥干菌属(A^co^r"en'ww)、葡萄球菌属(iS啤/zy/ococcw力或链球菌属(;？哗tococ(:w力。14.一种实施前ii^又利要求中任一项的方法来检测特定细胞的试剂盒，所述试剂盒包含病毒以及一种或多种必需试剂，所述试剂用来检测病毒在所述细胞内复制所获得的核酸，假如当所述病毒为经修饰含有标记序列的修饰病毒时，那么所述一种或多种试剂对冲企测病毒在细胞内复制所独特产生的核酸是必需的。15.权利要求14的试剂盒，其中所述病毒并不含有被检测的核酸，所述一种或多种试剂对检测病毒在细胞内复制所独特产生的核酸是必需的。16.权利要求14或15的试剂盒，所述试剂盒包含RNA病毒以及一种或多种试剂，所述试剂用来检测通过逆转录所述RNA病毒内的序列所获得的cDNA。17.权利要求14的试剂盒，其中所述病毒是天然存在的、含有被检测核酸的DNA或RNA病毒，所述一种或多种试剂对检测所述核酸量的升高是必需的。18.权利要求14-17中任一项的试剂盒，其中所述一种或多种试剂包含一对扩增引物。19.一种RNA病毒制品，所迷制品已经过处理去除了污染DNA。20.权利要求14-16或18中任一项的试剂盒，其中所述病毒是权利要求19的病毒制品。全文摘要本发明涉及样本内活细胞(例如细菌细胞)的检测方法，所述方法包括(i)在使病毒感染细胞并在任何感染活细胞内能复制的条件下，将所述样本与能够感染所述细胞的病毒一起孵育；(ii)检测病毒在所述细胞内复制所获得的任何核酸。文档编号C12Q1/02GK101160410SQ200680012458公开日2008年4月9日申请日期2006年2月16日优先权日2005年2月16日发明者D·J·斯奎雷尔,M·A·李申请人:恩尼格马诊断有限公司