利用超滤进行病毒纯化的制作方法

专利名称：：利用超滤进行病毒纯化的制作方法
技术领域：
：本发明涉及病毒制备的领域，更具体地，涉及用于制备疫苗或基因治疗产品的病毒的纯化，由此得到疫苗和基因治疗产品。
背景技术：
：病毒，不论是天然的还是重组形式，都可用于疫苗接种和基因治疗领域。许多病毒或者类似病毒的颗粒可以安全而有效地在细胞中繁殖(如WO01/38362，描述了在El-永生化视网膜细胞中培养各种病毒)。重组腺病毒是基因治疗和免疫接种中的一类优选的病毒载体。这种重组腺病毒通常缺乏至少E1区域，可以在提供E1区域的互补细胞中繁殖，例如293细胞，或者El-永生化视网膜细胞，例如？￡11(6@细胞(见美国专利5,994,128)。病毒在细胞内繁殖后，对于几乎所有应用，在进一步使用前，必须先对病毒进行纯化。国际专利项目WO98/22588描述了生产和纯化腺病毒载体的方法。方法包括使细胞生长，用腺病毒感染细胞，收获并裂解细胞，浓缩裂解液，置换裂解液缓冲体系，用核酸酶处理裂解液，以及进一步用层析方法纯化病毒。其他一些文献也描述了从细胞中纯化病毒的方法，大部分是讨论用特殊的层析介质从细胞裂解液中纯化病毒，见美国专利申请6,008,036、6,586,226、5,837,520、6，261，823、6,537,793和国际专利申请WO00/50573、WO02/44348和WO03/078592。在一些纯化病毒的工业化工艺中，特别是对于那些腺病毒，通常使用了超滤步骤，主要是用于浓缩病毒并置换保存有病毒的缓冲液。尽管目前已经有关于几种主要针对不同层析介质的纯化工艺的描述，对于病毒的纯化，仍然需要有其它可以选择并且优选改进的方法。本发明就提供了这样一些方法。图1.已知的细胞收获方法(T/B)和本发明中的方法(B/T)的对比图解，见例1。T:Triton，B:Benzonase。p丄:感染后。图2.T/B法或B/T法之后，澄清时宿主细胞蛋白的去除。的对比(图解见图1)。图中显示5份独立的纯化处理样品的银染SDS-PAGE(4-12%bis-trisNuPAGE，Invitrogen)分析(样品见例1和表1)。图2为T/B收获产物，其中裂解先于核酸酶的添加；图3—7为B/T收获产物，其中核酸酶的添加先于裂解。收获物(泳道l)用0.5pm的Clarigard过滤器澄清过滤(泳道2)，接着用0.8/0.45pm的Sart叩ore2过滤器过滤(泳道3)。M:标图3.病毒纯化方法的图解(见实施例1;也见于PCT/EP2005/050739)。图4.低纯度TFF渗余物(retentate)样品(A)和高纯度TFF渗余物样品(B)的RP-HPLC图谱。详见实施例2。图5.低纯度TFF渗余物样品(A，TFF过程中无背压)和高纯度TFF渗余物样品(B，TFF过程中有背压)的阴离子交换洗脱图谱。详见实施例2。图6.跨膜压力(TMP，图A)效果的统计分析和每滤过面积(图B)的进液量。详见实施例2。图7.回收腺病毒时施加背压到渗透物侧的统计分析。详见实施例2。图8.TFF实验的图解表示。A.在渗透物侧无背压(符合本
技术领域：
状况的病毒纯化TFF)。B.在渗透物侧有背压(本发明的病毒纯化TFF)。P0:P。ut，Pi:Pin,PP:Pp函。见实施例3。图9.无背压时的对照TFF(A)的流量和本发明中有背压时TFF(B)的流量。详见实施例3。图IO.TFF渗余物的SDS-PAGE。1:标记物，2:A实验(无背压对照)，3:B实验(本发明中的有背压实验)。4:CsCl纯化的Ad35.详见实施例3。图11.TFF渗余物的RP-HPLC分析。A.无背压(对照)。B.有背压(本发明)。详见实施例3。图12.从20L裂解液中用带背压的TFF获得的渗余物的SDS-PAGE分析。除了条带2外的所有条带都含有5E9的病毒粒子。1:澄清后的病毒。2:5倍浓縮后的渗透液。3:渗滤过的病毒。4:捕获的病毒(MustangQ阴离子过滤后)。5:预先配比后的原液(基团分离和除菌过滤后)。6:标记物。详见实施例4。图13.从20L裂解液中用带背压的TFF获得的渗余物的RP-HPLC分析(如同图12中的样品)。3:渗滤过的病毒。4:捕获的病毒(MustangQ阴离子过滤后)。5:预先配比后的原液(基团分离和除菌过滤后)。6:标记物。详见实施例4。图14.本发明中的腺病毒纯化工艺图解。图15.CsCl梯度离心纯化的Ad5(A)和实验Bl的渗滤渗余物(B，详见实施例5)的RP-HPLC分析。图16.TFF纯化的Ad5的SDS-PAGE分析。1:标记物。2:渗滤的病毒B1(详见实施例5)。3:CsCl纯化的Ad5病毒。图17.TFF纯化的Ad35的SDS-PAGE分析。每条带包含5x108Ad35-TB-S病毒粒子。1:澄清过滤后的收获液。2:5倍浓縮后的渗余物。3:TFF后的渗余物(16DFV)。4:仅通过过滤纯化的病毒。5:CsCl梯度离心纯化的病毒。图18.TFF纯化的Ad35的RP-HPLC分析。A:6DFV透析后的渗余物。B:IODFV透析后的渗余物。C:14DFV透析后的渗余物。D:16DFV透析后的渗余物。pVI:先驱蛋白VI。本发明的描述本发明提供了一种包含了超滤步骤的病毒纯化方法，其中渗余物包含所述病毒，其特点是在渗透物侧上施加了背压。在优选的实施方案中，上述方法还包含了在上述的超滤之前的步骤a)培养所述病毒感染的细胞，b)添加核酸酶到细胞培养物中。在更优选的实施方案中，对于需要裂解步骤的病毒，例如腺病毒，在b)步骤后，上述细胞被裂解得到含有病毒裂解液。在更优选的实施方案中，上述方法在裂解步骤c)后还包括了这样的步骤d)裂解液的澄清过滤，优选为深层过滤然后是膜过滤，其中步骤d)先于超滤步骤。在更优选的实施方案中，超滤步骤使用切向流过滤，优选使用中空纤维模块。在一些实施方案中，通过泵给渗透物侧提供背压。在一些实施方案中，渗透物侧的背压在大约3—80kPa(6.89kPa:lpsi)之间。在优选的实施方案中，跨膜压力小于4psi，优选小于3psi，小于2psi，或者小于lpsi。在一些实施方案中，上述超滤包含用0.8M到2M氯化钠或其它提供相等离子强度的盐的缓冲液对渗余物进行缓冲液置换，，优选随后采用这样的缓冲液进行缓冲液置换，其离子强度为包含低于0.5MNaCl的缓冲液的离子强度。在一些实施方案中，所述病毒为重组的腺病毒。在一些实施方案中，所述方法不包括大小排阻层析步骤和/或阴离子交换层析或阴离子交换过滤，在一些实施方案中，所述方法不包括层析步骤。在另外一些实施方案中，该方法包括用至少一个层析步骤对重组腺病毒进一步纯化的步骤，所述层析可为例如阴离子交换层析，或者阴离子交换过滤，和/或大小排阻层析。本发明也提供了一种纯化重组腺病毒的方法，上述方法主要包括a)裂解上述的细胞，去除和/或破坏游离核酸，得到含有重组腺病毒的裂解液，b)澄清裂解液，得到腺病毒制备物，c)对腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，从而浓縮所述腺病毒制备物，d)对d)步骤的腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，并用至少5倍渗滤体积(DFVs)的缓冲液对所述腺病毒制备物进行置换，其中1DFV为d)步骤中的浓缩之后得到的渗余物体积，e)优选对腺病毒制备物进行无菌过滤，所述方法特征在于步骤d)和e)中施加于渗透物侧的背压为至少5kPa。在一些可选择的实施方案中，本发明也提供了一种纯化重组腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培养用所述重组腺病毒感染的细胞,b)裂解上述的细胞，去除和/或破坏游离核酸，得到含有重组腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制备物，d)对c)步骤的腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，并用至少5倍渗滤体积(DFVs)的缓冲液对所述腺病毒制备物进行置换，其中lDFV为c)步骤之后得到腺病毒制备物的体积，e)优选对腺病毒制备物进行无菌过滤，所述方法特征在于步骤d)中施加于渗透物侧的背压为至少5kPa。本发明也提供了一种在超滤步骤过程中增加重组腺病毒回收率或产率的方法，其渗余物中含有重组腺病毒，其特点是有背压施加于渗透与已知的其中渗余物包含病毒的含超滤步骤型病毒纯化方法最重要的区别是，在其它方法中，无背压施加于渗透物侧，因而滤出物能够自由地流走，通常流到废液收集桶中。而按照本发明的方法，有背压(也叫做反压)施加在渗透物侧上，其有时候也被指作渗透压。正如这里所说，我们意外发现到这种方法相比于那些无背压作用的方法造成改善。按照本发明中的方法，相比于在渗透物侧无背压作用的方法，能够提高病毒的回收率和/或提高病毒纯度。本发明的详细描述细胞病毒适合在细胞(有时叫做"宿主细胞")中繁殖。本发明所指的细胞可以是任何细胞，其中合意的病毒可以在其中繁殖。例如，重组腺病毒载体的繁殖就是在一种能够弥补腺病毒中缺陷的细胞中生长的。这种细胞在它们的基因组中含有至少腺病毒E1序列，因而，能够和那些缺失了El区域的重组腺病毒互补。还有的腺病毒是缺少E3区域，但是这在腺病毒基因组中不是必要的，因而不需要互补。任何E1—互补细胞都可以使用，例如被E1永生化的人视网膜细胞，象911(见美国专利5,994,128)，El转化的羊水细胞(amniocytes)(见欧洲专利1230354)，El转化的A549细胞(见WO98/39411，美国专利5,891,6卯)，GH329:Hela(Gaoeta1，2000，人类基因治疗11:213-219)，293和其它相似的细胞。PER.C6TM细胞(美国专利5,994,128)，或者由它衍生出的其它细胞通常被用作所述细胞，因为它们适合很多不同种类的病毒繁殖(见WO01/38362)，包括但不仅限于重组腺病毒。进一步的对细胞系和繁殖重组腺病毒载体的方法在美国专利6,492,169禾PWO03/104467中有详细的描述。其它可以被直接用于繁殖病毒或转化成能够繁殖缺陷型病毒的互补细胞的哺乳动物细胞系有Vero细胞系，Hda细胞系，中国仓鼠卵巢细胞系，W138，BHK,COS-7,HepG2，3T3，RIN，以及MDCK细胞，这些都为本领域技术人员所知。细胞通过培养来增加细胞的数量和病毒的数量和/或滴度。按照本发明，将细胞进行培养，使之新陈代谢，和/或生长，和/或分裂并且产生本发明所需的病毒。这可通过本领域已知方法进行，这些方法包括(但不仅限于)给细胞提供养分一例如适合的培养基。培养细胞可以通过贴壁培养，悬浮培养，或者两者的结合。培养可以在培养瓶，转瓶或者生物发酵罐中，利用分批次操作、流加式操作，连续式系统或中空纤维膜中进行。为了通过细胞培养得到大批量(连续的)病毒产物，在本领域内，倾向于使用可以悬浮培养的细胞，并且优选其不需要动物或人来源的血清或者这些血清的成分。细胞培养的适合条件已经被发现(见TissueCulture,AcademicPress,KruseandPaterson，editors(1973),禾卩R.LFreshney,Cultureofanimalcells:Amanualofbasictechnique,fourthedition(Wiley陽LissInc.,2000,ISBN0-471-34889-9))。在某些实施方案中，本发明包含将培养的被病毒感染过的细胞进行裂解。培养细胞和病毒感染的技术已为本领域技术人员所知。用病毒感染细胞，最简单的方法就是在生理条件下将病毒暴露于适宜细胞，使病毒被细胞摄取。对于某些病毒，甚至不用使用病毒本身，因为它们的核酸序列就可以在培养的细胞中重新构建成病毒。培养繁殖腺病毒的细胞的许多方面和系统也可以在专利wo98/22588，p.11-28中找到。培养细胞以及繁殖病毒的方法也可以在许多专利中发现，例如美国专利6,168,944，5,994,134，6,342,384，6,168,941，5,948,410，5,840,565,5，789，390，6,309,650，6,146,873和国际专利申请WO01/38362，WO01/77304，WO03/084479。病毒本发明的方法适用于范围很广的病毒，包括但不仅限于腺病毒、痘病毒、虹彩病毒、疱疹病毒、乳头状病毒、副粘病毒、正粘病毒(如流感病毒)、逆转录酶病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、轮状病毒、黄病毒(如西尼罗河病毒)等等；腺病毒是具体优选的。病毒优选重组病毒，但也可以是临床分离株，减毒疫苗株，等等。在某些实施方案中，本发明是用于纯化重组病毒，优选腺病毒，带有异源的转基因，用于基因治疗或接种免疫。为了更具体的说明，本发明将详细讨论重组腺病毒，但不表明本发明仅限于重组腺病毒。腺病毒腺病毒载体优选在腺病毒基因组的El区域中至少一个关键基因功能中有缺陷，例如Ela区域或Elb区域，它们是病毒复制所必须的。在某些实施方案中，载体在E1区域中至少一个关键基因功能和至少部分非关键的E3区域(例如E3区域的Xbal缺失)中有缺陷。腺病毒可以是"多重缺陷(multipledeficient)",意思是指腺病毒载体在两个或更多的腺病毒基因组的每一个中的一个或多个关键基因功能上有缺陷。例如上述的El缺失或E1、E3缺失腺病毒载体，可以进一步在E4区域的至少1个关键基因和/或E2区域上至少1个关键基因缺失(例如E2A区域和/或E2B区域)。腺病毒载体全部缺失E4区域后会引起宿主免疫反应的降低。适合的腺病毒载体例子包括这样的腺病毒载体，其缺失a)所有或部分E1区域和所有或部分E2区域，b)所有或部分E1区域，所有或部分E2区域，所有或部分E3区域，c)所有或部分El区域，所有或部分E2区域，所有或部分E3区域，所有或部分E4区域，d)至少部分Ela区域，至少部分Elb区域，至少部分E2a区域，至少部分E3区域，e)至少部分E1区域，至少部分E3区域，至少部分E4区域，和f)所有关键腺病毒基因产物(例如腺病毒扩增子仅包含ITRs和包装信号)。在腺病毒基因组关键区域被缺失时，必须反式提供这些基因所编码的功能，优选地由细胞提供，也就是，当腺病毒中部分或全部的E1，E2禾B/或E4区域被缺失时，这些区域必须存在于细胞中，例如，被整合进细胞的基因组，或者在那些辅助腺病毒或辅助质粒上。复制缺陷型腺病毒载体可以用腺病毒或嵌合腺病毒的任何物种、菌株、亚型或这些的混合物，或腺病毒和当作载体DNA来源而产生(例如WO96/26281，WO00/03029)，这有可能提供给腺病毒载体感染某种合意细胞的能力。腺病毒载体可以是任何有在细胞中生长能力的任何腺病毒载体，这些载体的某些重要部分(虽然不是必须在实质上)源自或基于腺病毒的基因组。腺病毒载体可能包含C组野生型腺病毒基因组，具体是血清型5(例如Ad5)或Ad2。腺病毒载体可能也包含腺病毒基因组或至少来源于B组腺病毒的纤维蛋白，例如Adll，Ad35，Ad51等等(见WO00/70071)，这个实施方案的优点是在群体中对抗这些血清型的中和抗体较少，使得这些腺病毒载体可以作用于其它细胞类型，因而它们的取向和那些来源于Ad5的不同。当然，该领域内技术人员也知道其它血清型也可以被应用。本领域技术人员将意识到在特殊的细胞中繁殖不同血清型的腺病毒的可能性，使用的方法可见于美国专利6,492,169或WO03/104467，以及它们的参考文献。腺病毒载体的构建和繁殖方法，在本领域内很常见，在很多专利中都有描述。例如美国专利5,559,099,5,837,511，5,846,782，5,851,806,5,994,106，5,994,128，5,965,541，5,981,225，6,040,174，6,020,191，禾卩6,113,913，以及ThomasShenk的"腺病毒和它们的复制",M.S.Horwitz的"腺病毒"，分别在病毒学的第67和68章，(B.N.Fieldsetal.,eds.，第三版，RavenPress,Ltd.,NewYork(1996))，还有这里提及的其它参考文献。构建腺病毒载体的方法在本领域中已经被熟知，并包含标准分子生物学技术的应用，例如在Sambrook等人的分子克隆(一本实验室手册，第二版，ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989))，Watson等人的重组DNA(第二版，ScientificAmericanBooks(1992))，和Ausubel等人的分子生物学现代规范(CurrentProtocolsinMolecularBiology,WileyIntersciencePublishers,NY(1995))，以及这里提及的其它参考文献中描述的那些。转基因在一个实施方案中，本发明所指的病毒是野生型病毒，或者其变种或部分变种，但仍然有感染本发明所述的细胞的能力。在另外一个实施方案中，病毒是指重组病毒，包含异源信息，其可用于以基因治疗为目的的治疗背景中，或者是用于免疫接种的抗原。优选的实施方案利用例如腺病毒。这些异源信息称为"转基因"。本发明的方法适用于病毒，优选包含任何转基因的腺病毒，因此，转基因本身与本发明无直接关系。一些转基因的实例描述于WO98/22588，p.42-49中。根据本发明，病毒中的转基因可以是治疗基因，例如肿瘤抑制基因，包括但不仅限于p53，p16,APC，DCC,NF-1,WT-1,p21,BRCA1,BRCA2，以及其它类似物；酶，例如胞(核)嘧啶脱氨酶，HGPRT，葡糖脑苷脂酶，单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶或人类胸苷激酶等等；激素，例如生长激素，催乳素，红细胞生成素，绒膜促性腺激素，甲状腺刺激素，脂痩素，ACTH，血管紧张素，胰岛素，胰高血糖素，生长激素抑制素，降血钙素，抗利尿激素等其它类似物；白细胞介素和细胞因子，例如IL-1，IL-3，IL-12，G-CSF,GM-CSF，TNF等；某些特殊疾病中的缺失或突变的替代基因，例如ADA,因子IX，CFTR等；其它治疗基因例如血管生成抑制子，细胞循环抑制子等；抑制例如原癌基因表达的反向构建体，例如ras，myc，jun,bcl，abl等；也可以是用于疫苗的抗原，例如病毒抗原，比如来自小核糖核酸病毒，冠状病毒，囊膜病毒(togavirus)，黄病毒，棒状病毒，副粘病毒、正粘病毒、痘病毒，嗜肝DNA病毒，呼吸道肠道病毒，逆转录酶病毒、疱疹病毒等，更具体地，为来自以下病毒的抗原例如流感病毒(具有HA和/或NA作为潜在抗原)，乙肝(乙肝表面抗原作为潜在抗原)，西尼罗河病毒，狂犬病毒，SARS病毒，单纯疱疹病毒1和2，麻疹病毒，天花病毒，小儿麻痹症病毒，HIV(具有抗原例如来源于HIV-1的gag,env,nef，或者它们的修饰形式，包括密码子优化版本，见WO02/22080)，埃博拉病毒，青猴病毒(Marburg)，拉沙病毒(Lassa);或者细菌抗原，真菌抗原，寄生虫(包括锥体虫，绦虫，蛔虫，蠕虫，疟疾等)抗原，等等。明显地，本领域技术人员会挑选他们感兴趣的基因，用于例如基因治疗和/或免疫接种的预期治疗背景中，并且不限于此。同时我们也清楚地知道，这些转基因的控制区域优选地存在于重组病毒载体中，并用于表达这些转基因，例如包括启动子和polyA信号。这些已为本领域技术人员所知。一些控制区域描述于WO98/22588，p.49-55。裂解细胞用腺病毒感染后，病毒在细胞内复制并扩增。腺病毒感染最终会造成被感染细胞的裂解。腺病毒的这种细胞裂解特性使得病毒生产可以有两种不同的模式。第一种是在细胞裂解前收获病毒，这需要加入外来的因子裂解细胞。第二种是在细胞被病毒几乎完全裂解后收获位于上清液中的病毒(见美国专利6,485,958，描述了不用外来因子裂解细胞收获腺病毒)。对于第二种模式，需要更长的保温时间来保证细胞完全被裂解，才能得到高的病毒产量。而且，细胞内物质逐步地释放到培养液中，会对病毒的完整性和产量有一定影响。因此，优选使用外来因子主动地裂解细胞。裂解细胞的方法己经为本领域内的专家所知，例如WO98/22588,p.28-35中所讨论的一样。这方面有用的方法例如，冻融法，固体剪力，高渗和/或低渗裂解，液体剪力，超声波，高压推挤，去垢剂裂解，以及上述方法的结合，等等。在本发明的一个实施案例中，至少使用一种去垢剂裂解细胞。用去垢剂裂解细胞的好处在于它是简便的方法，而且很容易规模化。去垢剂去垢剂的使用方法已经为本领域内的专家所知。一些示例也在WO98/22588，p.29-33中有所讨论。这里使用的去垢剂可以包括，阴离子，阳离子，两性离子和非离子去垢剂。举例说明(但不仅限于)有牛磺胆酸，去氧胆酸，双羟基牛黄胆酸，十六院基吡啶，氯化苯甲烷铵，ZWITTERGENT-3-14吸，CHAPS(3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammomol]-l-丙石黄酸7K化物(propanesulfonatehydrate),Aldrich),BigCHAP,DeoxyBigCHAP,TritonX-100,TritonX-114,C12E8，Octyl-B-D-吡喃葡萄糖苷(Glucopymnoside)，PLURONIC-F68,TWEEN-20,TWEEN-80(CALBIOCHEMBiochemicals)，Thesit,NP-4(f,Brij-58⑧，10。/。辛基糖苷，等等。本领域内的专家清楚地知道，去垢剂的浓度可以多种多样，例如大约在0.1。/。-5。/。(w/w)之间。在一些实施方案中，去垢剂在裂解溶液中的浓度为l%(w/w)。在发明者的一些中试实验中，使用Triton后使得溶液的粘性低于使用其它的去垢剂(Tween20，Tween80，去氧胆酸)。在本发明的一个实施方案中，去垢剂为TritonX-IOO。核酸酶本发明在优选的实施方案中利用核酸酶去除或破坏游离的或污染性且大部分来自于细胞的核酸。适合于本发明的核酸酶有Benzonase气Pulmozyme,以及其它任何在本领域内常用的DNase禾H/或RNase。在优选的实施方案中，核酸酶为Benzonase,因为它能通过水解内在的特定核苷酸间磷酸二酯键来快速水解核酸，因此降低细胞裂解物的粘性。Benzonase⑧可以从MerckKGaA处购买到(货号W214950)。核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml的范围。根据本发明的某些优选的实施方案，核酸酶在细胞裂解前添加(也参见WO2005/0805565)。它可以在裂解步骤前的几秒钟(实际上可以同步)加入，但优选在裂解步骤l分钟前添加到培养物中。加入核酸酶的细胞培养物可以在以下温度保温高于保温温度例如大约40。C，，或者在保温温度(例如在大约35°C到37°C)，或者室温(大约20°C)，或者更低(大约0°C)，通常，保温温度越低，所需的培养时间越长，才能达到同样的效果(见Benzonase⑧手册，MerckKGaAcodeW214950)。作为一个非限制性示例，培养可以在37。C进行10分钟，之后细胞进行裂解。显然，核酸酶可以并且优选能在裂解步骤后仍具有降解核酸的活性，在本发明的某些实施方案中，细胞和核酸内切酶在裂解后一起保温可以延长到大约50分钟(使得核酸酶的总体作用时间为1小时，当然时间也可以更长，因为预期核酸酶有可能继续发生效用直到下一步的纯化步骤)。这比WO98/22588中所述的保温过夜要来得短。当然，按照本发明的方法，使用更长的时间保温，例如2小时，或过夜，或更长(在861120旭56@手册MerckKGaAcodeW214950中，提供了长达30小时保温时间的数据)也可以，但对于获得可接受的结果来说并不必要。在这些实施方案中使用的裂解步骤(在这里也就是将含有病毒的细胞进行裂解)，意思是指利用外来因子(见上述"裂解细胞"部分)，例如去垢剂的裂解步骤。显然，在培养繁殖有腺病毒的细胞的过程中，有些细胞可能由于病毒的作用，在没有外来因子的情况下发生了裂解。因此，在优选的实施方案中，这种在外来因子不存在的情况下发生的裂解出现于少于50%，优选少于40%，更优选少于30%，更优选少于20%的细胞，条件是当核酸酶处理开始时，也就是在加入核酸酶的时候，活细胞优选要占50%，60%,70%,80%。尽管不优选(见上)，但是在没有外来因子存在的情况下裂解细胞的方法仍然被使用。上面已经描述了"自发"裂解的工艺，其中不推荐使用Benzonase(见美国专利6,485,958)。但是，按照本发明者的发现，在这种系统中在培养的最后阶段加入核酸酶也有好处，也就是优选当繁殖有病毒的细胞还有至少5%存活的时候，优选还有至少10%存活，更优选还有至少20%存活(也就是分别有95%，90%，80%的细胞被裂解)。可预见，利用该步骤可以提高获得的病毒的质量。在本发明的这些方面中，要找到添加核酸酶最佳的时间(也就是细胞自发裂解的百分数)，取决于添加的核酸酶的数量和在保温中核酸酶比活性降低的程度，本领域内的专家可以根据经验找到这样的最佳点，现在，添加核酸酶到培养物中的优点已经被揭示(参见WO2005/080556)。按照本发明所获得的裂解物可以用这里所描述的方法，例如超滤和任选的层析进行进一步的纯化。国际专利WO03/097797描述了从细胞裂解物中纯化腺病毒的可选择的方法，包含了添加选择性沉淀剂沉淀DNA杂质。这种方法可以和本发明的纯化方法相结合，包括了渗透物侧施加了背压的超滤步骤。这是除了用核酸酶破坏核酸外，可选择的去除游离核酸的方法，虽然在WO03/097797中指出，如果使用这样的方法则不需要核酸酶，但是在程序后期添加一步这样的步骤还是会有很好的效果。在上述的实施方案中，包括在细胞裂解前添加核酸酶，可能也适用于和裂解后添加沉淀剂的步骤相结合，使得在处理后期添加核酸酶的步骤(见WO03/097797)可能多余。对于一些病毒，例如出芽病毒，象流感病毒或西尼罗河病毒，不推荐使用外来因子裂解，因为在细胞培养一段时间后，病毒会存在于培养液中，这样benzonase可以在澄清步骤前加入到培养液中去。澄清化在本发明优选的实施方案中，含有病毒的细胞裂解物要进行澄清化。澄清可以通过过滤步骤来实现，去除细胞碎片和其它杂质。适合的过滤器可以利用纤维素滤器，再生纤维素滤器，纤维素和无机滤器结合(例如硅藻土，珍珠岩，熏硅)，纤维素和无机滤器以及有机介质结合，或者上述任何方式的结合，以及聚合体滤器(包括但不限于尼龙，聚丙烯，聚醚砜膜)来获得有效的去除率和可接受的回收率。通常，推荐使用多步结合的工艺，但不是必须的。举例来说2到3步的工艺的实例可能包括去除大的沉淀物和细胞碎片的连接滤器(coursefilter),接着是标注的(nominal)孔径大于0.2小于1微米的抛光型第二阶段过滤器(polishingsecondstagefilter)。最佳的组合可能是根据沉淀物大小和其它变量的分布进行的结合功能。而且，使用相对紧密的滤器的单阶段操作(singlestageopemtion)或离心，也可以用于进行澄清化。更通常地，任何可以用于澄清化的方法，包括但不限于端点过滤，微孔过滤，离心或过滤辅助物(例如硅藻土)和端点过滤或深层过滤(提供具有适当澄清度的滤过液，可以不污染到后续步骤中所使用的滤膜或树脂)相结合，都可以用于本发明的澄清步骤。在一个实施方案中，使用的是深层过滤和膜过滤。可以提供这个用途的商业化产品在WO03/097797，p.20-21中有提到。可使用的膜可能含有不同的材料，具有不同的孔径，可以组合使用。它们可以从多个供应商那里获取。在本发明的某些实施方案中，0.8jurn和0.45jLim滤器的组合，例如Sartopore-2滤器，被用于澄清化步骤。超滤/渗滤(UF/DF)根据本发明，在工艺过程中病毒悬液至少用超滤(当用于缓冲液置换时也叫渗滤，见下)处理一次，例如进行浓缩病毒和/或缓冲液置换，或用于澄清后收获液的浓縮和渗滤，可以用于去除污染物，例如宿主细胞蛋白，宿主细胞DNA片段，培养液成分，去垢剂和benzonase。根据本发明，用于浓縮病毒的工艺可以包含任何过滤工艺(例如超滤(UF))，让溶剂强行通过滤器，使得病毒制品中的液体被去除，而病毒却不能通过滤器而以浓缩的形态被保留下来，以此来提高病毒的浓度。UF在诸如《MicrofiltrationandUltrafiltration:PrinciplesandApplications,LZemanandA.Zydney(MarcelDekker,Inc.,NewYork,NY,1996)》禾口《UltrafiltrationHandbook,MunirCheryan(TechnomicPublishing,1986;ISBNNo.87762-456-9)》等书中都有详细描述。优选的过滤工艺是切向流("TFF")，在MILLIPORE公司产品目录中名为'TharmaceuticalProcessFiltrationCatalogue"pp.177-202(Bedford,Massachusetts,1995/96)的章节有描述。TFF广泛地在生物产业工艺中，用于细胞收获，病毒产品的澄清，纯化和浓縮。该系统包含3个不同的液体流进料液，渗透物和渗余物。根据应用的情况，使用不同孔径的滤器。在本发明中，渗余物包含病毒产品，可以根据需要进一步进行纯化。这里，特定超滤膜的选择将使得膜孔径足够小因而能截留住病毒，但是又足够大可以有效去除杂质。根据厂家和膜类型的不同，对于腺病毒来说，理论(nominal)分子量的截留(cutoffs)值(NMWC)可以在100到1000kDa之间，例如NMWC为300或500kDa的膜。膜的组分可以是(但不局限于)再生纤维素，聚醚砜膜，聚砜或衍生物。膜可以是平板(flatsheets)(也称作平滤板(flatscreens)),或中空纤维。UF通常指使用孔径小于O.lpm滤器的过滤步骤。产品(这里指腺病毒)通常被截留住的同时，溶液体积通过渗透而减少(或者在渗滤过程中，当含有缓冲液和杂质的渗透物从渗透物侧被除去时，以和渗透速率相同的速率加入缓冲液而使得溶液体积保持稳定)。在生物制药工业中两个最常用的TFF几何学为板框(平板)和中空纤维膜。用于超滤和微滤的中空纤维最早由Amicon和Ramicon在70年代早期发明(Cheryan，M.超滤手册)，直到现在还有多家供应商，例如Spectrum和GEHealthcare。中空纤维模块(module)由一个自我支撑的纤维矩阵组成，并包有一层厚密的表皮，赋予膜选择渗透性。纤维直径范围从0.5mm到3mm。中空纤维模块的优点在于，可以获得的滤器的膜面积范围很广，从很小的ca.16cn^到很大的ca.20m2，方便于简单的线性放大。在本发明的某些优选的实施方案中，就使用中空纤维用于TFF。有报道指出中空纤维比平滤板具有更小的剪切力和更好的病毒颗粒/感染单位(VP/IU)比值。而且，在中空纤维中的跨膜压力通常用在平滤板的情况要小。在某些实施方案中，本发明使用0.05pm孔径的中空纤维。超滤可能包含有使用超滤器的渗滤步骤(DF)，该步骤是去除和交换盐、糖、非水溶剂，分离游离和结合物质，去除低分子量物质，或快速改变离子或pH环境的好方法。在超滤过程中，以和超滤一样的速率加入溶剂，对微溶质的去除效果优选。这种方法用恒定体积的溶液洗去微小物质，纯化了被截留住的病毒。本发明利用DF步骤来置换裂解液的缓冲液，可选在进一步的层析或其它纯化步骤之前，但主要是为了去除病毒制品中的杂质。按照本发明的一个实施方案，进行利用TFF的DF用于缓冲液置换，其中加入缓冲液的速率相等于渗透物去除的速率。按照本发明，UF/DF可以用于在纯化工艺的不同阶段进行病毒悬液的浓缩或缓冲液置换，所述病毒悬液例如裂解液或经过进一步纯化如层析的病毒悬液。但是，使用本发明的这个方法，其中在渗透物侧施加了背压，我们意外地发现，它足以纯化腺病毒而不需要进一步的层析或离子交换步骤。这有几个好处a)工艺变得简单，不需要昂贵的柱材料，因而所述柱材料不需要验证、清洗，等等；b)工艺变得快捷，因为不需要那些诸如层析和分级法等耗费时间的步骤；c)总体产量的提高，因为任何在超滤之后的额外的纯化步骤都将不可避免地造成病毒产品的损失。因此，本发明提供了一种新的，有利的方法，用于纯化重组腺病毒，该方法包括纯化重组腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培养用所述重组腺病毒感染的细胞，b)裂解上述的细胞，去除和/或破坏游离核酸(例如核酸杂质，诸如宿主细胞DNA)，得到含有重组腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制备物，d)对腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，从而浓縮所述腺病毒制备物，e)对d)步骤的腺病毒制备物进行超滤(渗滤)，其中腺病毒制备物在渗余物中，并用至少5倍,优选至少6、至少7、至少8、至少9、至少10倍渗滤体积(DFVs)的缓冲液对所述腺病毒制备物进行置换，其中1DFV为d)步骤中的浓缩之后得到的渗余物体积，f)优选对腺病毒制备物进行无菌过滤，，该方法的特点在于在步骤d)和e)中有背压施加于渗透物侧，而且该方法不包括阴离子交换或大小排阻层析步骤。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种纯化重组腺病毒的方法，该方法主要包括a)培养用所述重组腺病毒感染的细胞，b)裂解上述的细胞，去除和/或破坏游离核酸，得到含有重组腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制备物，d)对腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，从而浓缩所述腺病毒制备物，e)对d)步骤的腺病毒制备物进行超滤(渗滤)，其中腺病毒制备物在渗余物中，并用至少5倍,优选至少6、至少7、至少8、至少9、至少10倍渗滤体积(DFVs)的缓冲液对所述腺病毒制备物进行置换，其中1DFV为d)步骤中的浓縮之后得到的渗余物体积，该方法的特征在于在步骤d)和e)中有背压施加于渗透物侧。因此该方法不包括大小排阻层析步骤，进而也不包含阴离子交换层析或阴离子交换过滤步骤。如果有需要可以增加这些步骤，但本发明的其中一个优点就是层析步骤的数目减少到零，因而才能得到上述所描述的其它好处。我们意外的发现用本发明的工艺所获得的重组腺病毒，很可能达到了临床用重组腺病毒批次的标准(hcDNA残留量〈10ng/剂，推定剂量为1E11vp/ml，VP/IU比率<30)。该方法的步骤d)严格上来说不是必须的，但在步骤e)中进行渗滤来置换缓冲液前减少病毒悬液的体积有好处，因此本发明也提供了没有d)步骤的方法，但优选包括d)步骤的方法。在这些方法的一个优选的实施方案中，步骤b)包括b，i)添加核酸酶到细胞培养物中，然后b,ii)裂解上述细胞得到含有重组腺病毒的裂解液。通过按这样的顺序，先添加核酸酶再裂解细胞，宿主细胞DNA的含量比先裂解细胞再用核酸酶处理的情况要少(见上和WO2005/080556)。在该工艺的最后，也就是在渗滤TFF步骤以后，腺病毒制备物优选要经过除菌过滤，因为这是制药级别材料的常用工艺，已经为本领域内的专家所知。这样的除菌过滤步骤可以用例如0.22|_im的滤器过滤。可选择地，在0.22pm过滤之前，可以增加一步0.45pm的过滤，可以理解这样的步骤也包含在了本发明工艺的范畴之内(也就是不会添加偏离上述主要包括步骤a)-e)或a)-f)的工艺的步骤)。在除菌过滤步骤后，腺病毒制备物就可以用于临床试验。除了用诸如Benzonase这样的核酸酶片段化游离核酸(主要是宿主细胞DNA)之外，在裂解后的细胞培养液中也可以选择性地沉淀(去除)杂质DNA，例如，用适量选择性沉淀试剂沉淀，例如度米芬(DB)，CTAB(十六基三甲基铵溴化物(cetyltrimethylammoniumbromide))，十六基吡啶氯化物(cetylpyridiniumchloride)(CPC)，苄索氯铵(benzethoniumchloride)(BTC),十四烷基三甲基氯化铵(tetradecyltrimethyl-ammoniumchloride)(TTA),聚乙烯亚胺(polyethyleneimine)(PEI),等等，详见WO03/097797。这里所使用的优选的超滤/渗滤方法包含TFF。按照本发明，有背压施加于渗透物侧。这导致本文揭示的改进的结果，第一次使得一种工艺可以获得足够纯度的达到临床试验标准的腺病毒，而不需要使用柱层析步骤，或繁琐且不经济的氯化铯密度梯度离心。在渗透物侧施加的背压使本发明有别于本领域中用于纯化腺病毒的超滤方法，在这些方法中，没有背压作用，也就是说渗透物侧完全敞开(在这些例子中背压为O[这里所指的压力都是与大气压作比较，大气压设为0])。在渗透物侧提供背压的方法对本发明不是至关重要的，只要能在渗透物侧产生背压(相反的压力)，可以通过任何合适的方法来获得这个背压。这种在渗透物侧的背压举例来说可以用一个合适的泵来提供，这个泵在渗透物侧提供背压。一种提供背压的简单方法是部分关闭渗透物侧的出口，例如将渗透物侧的管道部分夹住，或使用一个渗透物侧泵，像软管泵，离心泵，转子泵，循环泵等等，就是通过提供一种方法阻止渗透物侧完全敞开到大气压中，等等。对于那些本领域技术人员一旦知道了本发明的好处，这些方法就显而易见。使用渗透物侧泵可能会造成背压的一些跳动(pulsation)(波动)，但这并不影响在这里所揭示的方法，反而会带来好处。用泵来提供背压的好处是背压可以很容易地被控制。按照本发明，所提供的背压(渗透压力)至少3kPa，优选不低于5kPa。在某些实施方案中背压至少10kPa，或者至少15kPa，至少20kPa，至少25kPa，至少30kPa,至少40kPa，至少50kPa，至少100kPa,至少150kPa，至少200kPa，至少250kPa。在某些实施方案中，举例来说背压大约在3-80kPa。本领域技术人员凭经验可以容易地决定合适的背压，背压也可以根据渗滤膜的结构(比如说长度)来决定。通常推荐使用和渗余物侧出口压力相近的背压，因为如果背压太高，渗滤模块的使用效果较差。越长的中空纤维所导致的出口压力越高，所以在这些时候，也需要增加背压。通常，本发明所指的背压不超过400kPa。在某些实施方案中，本发明所指的背压不超过300kPa，或不超过200kPa，不超过100kPa，不超过80kPa。中空纤维最小的进口压力大约在10kPa，它的进口压力高于出口压力，所能承受的最大压力大约500kPa。在渗透物侧施加背压可以减小超滤步骤中的跨膜压力(TMP)，TMP的减小可以导致这里所描述的结果。TMP可以按照下列公式计算TMP={(Pin+P。ut)/2}—Pperm(这里Pjn是指进口压力，P。ut是指出口压力，Pperm是指渗透物侧压力[迄今为止有关病毒纯化工艺的报导中，渗透物侧压力都为O，而在本发明中至少3kPa])。在某些实施方案中，跨膜压力保持在低于150kPa，或低于100kPa,低于50kPa,低于27kPa,低于月20kPa，低于约13kPa,低于约7kPa。这些值为沿中空纤维长度的压力的平均值，本领域内的专家可以根据渗余物侧的进口和出口压力以及渗透物侧的背压来建立合适的跨膜压力。这些值也是在TFF步骤过程中的平均值，在优选的实施方案中，这些值是对于TFF步骤整个过程的至少20%,30%,40%,50%,更好地60%,70%,80%,卯％，95%而言的最大压力。此外，膜的结构，例如长度可以影响到TMP压力的值举例来说越长的中空纤维通常会造成越高的TMP(由于高的出口压力)，除非按照本发明施加的背压也根据上述公式相应地增加。在渗透物侧施加背压(结果导致跨膜压力的降低)提高了所获得的腺病毒的产量(见实施例3)，同时也提高了纯度(这样就不需要后续的纯化步骤)。在优选的实施方案中，超滤首先被用于减少病毒悬液的体积，例如5倍，只要在超滤的时候不往渗余物(包含病毒)中添加缓冲液。在这一步中应当己经在渗透物侧施加了背压。接着，对病毒悬液进行渗滤(使用和超滤相同的膜，优选是中空纤维TFF模块)，其中可能用不同的缓冲液进行置换。在渗滤的过程中，应使用至少5倍，优选不少于6、7、8、9或10倍渗滤体积(DFVs)，同样地也需要按照本发明在渗透物侧施加背压。如果需要进一步提高病毒的纯度，应适宜地使用更多倍的缓冲液进行渗滤，例如至少11,12，13,14，15,20，30,40,50或更多倍的DFVs。这一歩的渗滤通常是等体积渗滤，这通过以和从渗透物侧去除含缓冲液和杂质的滤出物的速率相同的速率来向渗余物(细胞悬液)中添加缓冲液来进行。在优选的实施方案中，纯化工艺的最后，病毒用合适的(腺)病毒配比缓沖液渗滤，这些配比溶液已为本领域技术人员所知。如果有需要的话，病毒也可以用适合后续工艺步骤的缓冲液渗滤，例如适合后续的阴离子交换的缓冲液(例如0.25NaCl，将其上样到用来纯化Ad35的MustangQ阴离子交换的滤器)。本发明的特征在于在病毒纯化的超滤部分中(病毒存在于渗余物中)，渗透物侧施加了至少3kPa的背压。在本领域以往所描述的病毒纯化的工艺中没有施加背压，例如US2002/182723，WO98/22588或WO03/097797。而且美国专利5，947，689描述了一种自动化过滤系统，其中渗余物的流速(横向流动)基于测定的压力来控制。当压力增加的时候横向流速降低，造成压力降低。其中没有对滤出液(渗透物侧)施加压力。此外，美国专利4,579,662描述了一种过滤方法，该方法通过迫使一种洗涤液从渗透物侧(过滤端)流向渗余物端来清洗脏的表面。清洗过程中，过滤被临时打断，液体的流向被反转(渗透物侧到渗余物侧)。这个发现并没有描述在液体连续地从渗余物侧过滤到渗透物侧时在渗透物侧施加了压力。进一步的纯化尽管需要提供一种尽可能简单而且经济的腺病毒纯化工艺，以获得本文所揭示的方法所获得的结果，所述方法中在超滤/渗滤过程中在渗透物侧施加背压，并优选在UF/DF步骤后不需要进一步的纯化，但是如果有需要，仍然可以在UF/DF步骤后添加进一步的纯化步骤。因此，按照本发明的某个实施方案，可对按照本发明的方法所获得的病毒悬液进行进一步的纯化，例如使用本领域专家所知的方法，比如说密度梯度离心(WO98/22588，p.59-61)，或者优选层析(WO98/22588,p.61-70)。很多方法被用于病毒的进一步纯化，其中包括了层析步骤。本领域技术人员应该了解这些工艺，并能通过不同的层析方法来优化本发明的工艺。举例来说，可以通过阴离子交换和阳离子交换层析步骤来纯化某些病毒(美国专利6，008，036)。也可能用羟磷灰石培养液来纯化腺病毒(见WO02/44348)。也可以使用一种反相吸附步骤(见WO03/097797,p.26)。对于腺病毒的纯化，通常推荐使用至少一个阴离子交换层析步骤。用阴离子交换层析来纯化腺病毒已经被广泛地描述过，所以对于本领域技术人员来说可以轻易地获取到相关的信息(见美国专利5,837,520;Huygheetal.,1995,人类基因治疗6:1403-1416;美国专利6,485,958;WO00/50573;美国专利6,586,226;美国专利6,537,793)。除了阴离子交换柱，阴离子交换膜层析产品(阴离子交换滤器)也可以使用。这些滤器的使用方法和他们在腺病毒纯化中的优点可见于WO03/078592。显而易见地，使用这些滤器也包含于这里所用到的"阴离子交换层析"的范畴中。适用于本发明中这些方法的阴离子交换滤器，已为本领域技术人员所知，并可以购买到(见WO03/078592，段落[40]-[41]，例如Pall的Mustang系列和Sartorius的Sartobind系列)。如上面所描述的，这种工艺也可以适宜地使用大小排阻层析步骤(见WO97/08298;美国专利6,261,823)。在大小排阻步骤中，通过基团分离将病毒颗粒从低分子量的杂质中分离出来。举例来说，可以将大约5-30%，优选10%柱体积的样品上样到大小排阻柱子上(基团分离模式的大小排阻层析)。因此，在本发明的某些实施方案中，按照本发明的方法所制备的腺病毒悬液通过阴离子交换层析和大小排阻层析进行进一步的纯化。缓冲液根据本发明的方法纯化病毒时，可以使用很多种缓冲液。在本发明的一些实施方案中，用于UF/DF和阴离子交换层析的缓冲液通常包含0.1-1.0MNaCl和TRIS缓冲液(50mM，pH7.5)。在某些实施方案中，包含0.25NaC1/0.05%PS80，2mMMgC12/50mMTrispH8.0的缓冲液用于纯化Ad35。在本发明的一些实施方案中，渗滤过程中将腺病毒制备物的缓冲液置换成含有1MNaCl的缓冲液，然后再置换成含有低离子强度的缓冲液。在国际专利WO2005/080556中指出通过这种步骤可以提高制品中蛋白和DNA的去除率。但是这种步骤并不是必须的，而且由于在高离子强度的条件下会增加聚合的风险，本发明者测试了不包含这样高盐步骤的工艺是否能够获得足够纯的(Ad35)病毒。尽管用含有1MNaCl的缓冲液进行渗滤能够略微提高DNA和蛋白的去除率，人们发现用高盐(含有1MNaCl)渗滤对于按照本发明的较好腺病毒纯化工艺来说并不是必须的。因此，渗滤过程中的离子强度可以维持在含有1MNaCl溶液的离子强度以下。但是，由于这不能够提供足够纯的病毒制备物，它优选包括这样的步骤，用含有0.8M到2M氯化钠或含有产生相同离子强度的其他盐的缓冲液液来对渗余物进行缓冲液置换。优选地，这种工艺包含随后用离子强度小于0.5MNaCl的缓冲液进行缓冲液置换。这种高盐渗滤步骤的需要(例如用离子强度与含有至少0.8M，优选小于2MNaCl，如1MNaCl的溶液相同的缓冲液来置换)取决于起始物质中病毒浓度和/或宿主细胞的浓度，本领域技术人员通过中试实验中对病毒材料DNA成分和纯度的分析，可以决定是否要包含这样的步骤。在本发明的一个实施方案中，腺病毒的缓冲液在基团分离时被置换成一并最终储存于一腺病毒国际标准缓沖液(Hogansonetal，Developmentofastableadenoviralvectorformulation,BioprocessingMarch2002，p.43-48):20mMTrispH8，25mMNaCl，2.5%甘油。但是在一个优选的实施方案中，不需要基团分离步骤，腺病毒的缓冲液在渗滤中直接被置换成配比缓冲液。显然，也可以使用很多其它缓冲液，一些适用于储存和药物学给药的(腺)病毒制品的配方示例可以在欧洲专利0853660和国际专利WO99/41416，WO99/12568,WO00/2卯24，WO01/66137，WO03/049763中找到。本说明书中引用的参考针对所指出的特定部分并入本文，若未指出特定部分，则以其全文并入本文。下面的示例通过一些本发明的具体实施方案来进一步阐述本发明的内容，但并不是要将本发明的范围局限在这些实例中。实施例实施例1.添加核酸酶到细胞培养物中而不是到细胞裂解液中以改进病毒纯化工艺在这个实施例中说明了在裂解细胞以前，添加核酸酶到细胞培养物中可以减少最终的纯化后原液中宿主细胞的残留DNA量。在实验1和2中，10升PER.C6细胞培养物在用腺病毒载体感染2.5天后用1X的TritonX-10(f(Sigma)裂解。裂解30分钟后，加入核酸酶Benzonase(MerckKgaA，50units/ml)禾BMgCl2(2mM)。再经过30分钟后，TritonX-10(f/Benzonase⑧(T/B)的收获液进行澄清过滤。这是按照本领域内已知的工艺进行的实验。在实验3—8中，先将Benzonase(50U/ml)禾卩MgCl2(2mM)力口入到10升PERC.6细胞培养物中(感染2.5天后)，培养10分钟后细胞用1%Triton乂-100@裂解。再培养50分钟后，对Benzonase/TritonX-100(B/T)的收获液进行澄清化。与本领域内已知的方法不同的是核酸酶(Benzonase⑧)和裂解剂(TritonX-10(f)添加的顺序传统上细胞先裂解然后再加入核酸酶(这里指T/B收获液)，而在本发明的工艺中，先加入核酸酶然后才裂解细胞(这里指B/T收获液)。示意图见图1。对样品进行进一步的纯化。澄清化如下进行进行深层过滤(0.5)imClarigardfilter,Millipore)，然后用0.8/0.45pmSartopore2(Sartorius)滤器进一步澄清。澄清后的样品用0.05中空纤维(Spectrum)浓縮5倍，然后用6倍体积的1.0MNaCl/50mMTRISpH7.5和4倍体积的0.4MNaCl/50mMTrispH7.5溶液进行渗滤。渗滤后的渗余物上样到SepharoseQ-XL(Amersham)柱子上，病毒级分用0.55MNaCl/50mMTRISpH7.5溶液洗脱。该级分进一步用Sepharose4FF(Amersham)纯化并进行缓冲液置换。生成的纯化原液用中空纤维(0.05pmporesize,Spectrum)浓縮到所需的浓度，再进行0.22pm过滤和分装。最后，纯化好的原液样品用Q-PCR检测残留宿主细胞DNA含量。T/B处理方式能降低填充的且为最终的(filledandfinal)物质中的DNA含量，使得在下游纯化工艺后，恰好达到所需的规格。对含有活病毒的配方中残留宿主细胞DNA含量的规程要求是每剂<10ng(以每剂含1E11个病毒粒子为准预测)。如表1所示，颠倒TritonX-10(f和Benzonase⑧步骤可以很大程度上降低纯化液中宿主细胞DNA的残留量。在主动裂解细胞前加入核酸酶，可以使宿主细胞DNA残留量减少10到40倍，达到少于0.1ng/lEll病毒粒子。而且，从SDS-PAGE分析(图2)中也可以清楚看到，B/T收获液在经过深层过滤和膜过滤的澄清化后，大量的宿主细胞蛋白，其中包括大量组蛋白(分子量在10—20kD之间，通过质谱分析确定)在澄清过程中去除，而在澄清后的T/B收获液中，这些蛋白还仍然存在。因此，在裂解细胞前加入核酸酶比以往本领域内所采用的方法(见PCT/EP2005/050739)有很大的优势。抛开理论的约束，这里发现的实验1、2(T/B)和实验3—8(B/T)之间存在的差别可能的原因有如下几点1.当加入Benzonase⑤后，从由于病毒产生而从细胞释放的DNA可以容易地消化。当用Triton裂解细胞释放DNA，由于已经存在Benzonase,可以立即消化DNA，因此阻止形成大的DNA聚合物。消化未聚合的DNA可能比消化大的DNA聚合物来的容易。2.Benzonas^总的保温时间增加了30分钟，使消化更有效(见Benzonase⑧手册MerckKGaAcodeW214950)。3.在DNA刚释放就被降解的情况下有可能会形成较大的组蛋白复合物，这些较大的颗粒会在随后的澄清过滤中被截留住。这种在澄清过程中对组蛋白一DNA复合物的截留作用可能也会造成宿主细胞DNA残留量的减少。我们测试了几种阴离子交换树脂，例如QAE550C和SuperQ650M(从Tosoh购买)，QSepharoseHP,ANXSepharose4FF,DEAESepharose，QSepharoseXL,QSepharoseBigBead禾口QSepharoseFF(从Amersham购买)。虽然这些树脂都适用于纯化重组腺病毒，但是我们发现QSepharoseXL最适合我们的从宿主细胞的蛋白质和DNA中分离病毒的目的和流动特性。而且，用Sartobind75过滤器(包含有阴离子基团的带电过滤器，Sartorius)代替阴离子交换柱也取得很好的结果。我们测试了几种大小排阻树脂，例如SephacrylS300,SephacrylS500Sepharose4FFandSepharose6FF(所有都是从Amersham购买)。虽然这些树脂都适用于纯化重组腺病毒，但是我们发现Sepharose4FF最适合我们的从宿主细胞的蛋白质和DNA中分离病毒的目的。基于上述和其它的实验结果，可用于纯化腺病毒的工艺在图3中以图解表示(也参见WO2005/080556)。实施例2:在UF/DF中在渗透物侧施加背压可以提高腺病毒的纯度和回收率PER.C6细胞在转瓶中培养到细胞密度在0.9到2.6百万个细胞/毫升之间。用包含有CS转基因(疟原虫密码子优化的[疟原虫]环子孢子(CS)基因，克隆02-659，描述于WO2004/055187;重组腺病毒叫作Ad35.dE3.Ad5orf6/7.AdApt535，或者简称Ad35.CS，也参见WO2005/080556)的Ad35载体感染细胞，感染复数(MOI)为40vp/细胞(vp:病毒颗粒)。经过3—4天的病毒产生，被感染的细胞培养物用Benzonase和Triton(B/T方法)处理，见实施例1。B/T收获液(滴度大约2E11vp/ml)用深层过滤和随后的膜过滤来澄清化。澄清后的收获液作为多种使用0.05中空纤维TFF实验的进液料(feed)。TFF实验以减少TFF步骤中的沉积物的方式进行。减少沉积物将有助于提高最终渗余物的纯度，提高病毒颗粒的回收率，并且增加流通量。测试的参数为进液的相对数量(升/每平方米过滤面积)，跨膜压力(TMP)和渗透物侧的压力。在所有的实验中，进液料被浓缩5倍，然后用10倍渗滤体积的TRIS缓冲液(pH7.5-8.0，包含不同浓度的NaCl，0.1-1.0M之间)渗滤(用TFF)。在一些实验中，渗滤缓冲液里还添加了0.05。/。PS80和2mMMgCl2。Ad35病毒颗粒的回收率用HPLC-AEX测量，纯度用RP-HPLC测定或者当用进一步纯化最终渗余物时产生的层析图谱(用阴离子交换或基团分离柱层析)测定。高和低纯度渗余物的RP-HPLC图谱实施例可见图4。如果在RP-HPLC图谱中约60分钟时的峰值<0.01AU，样品可以被认为是高纯度样品，而当这个"60分钟峰值">0.1AU时则样品被认为是低纯度。如果没有RP-HPLC数据，渗余物纯度就用阴离子交换层析来判定。"60分钟RP-HPLC峰值"内的物质不会结合到阴离子交换树脂或带电过滤器中，而会出现在流出级分里。当流出峰的面积小于洗脱峰的面积时，样品被认为是高纯度的。否则则被认为是低纯度(图5)。实验得到的渗余物被分为高纯度和低纯度，并相对于不同的TMP，每平米过滤面积的进液量，以及渗透物侧压力作图。统计分析表明，TMP和每平米过滤面积进液量对于纯度有显著的影响(图6)。图7显示在渗透物侧施加压力对回收率有正面的显著影响未施加渗透物侧背压的回收率为46%(n=7)，施加背压后的平均回收率为81%(n=4)。回收率的提高可能是因为渗透物侧背压本身的作用也可能是由于背压的作用而使得TMP减少的缘故TMP,in+P叫t)/2卜Pp醒。实施例3:UF/DF时有无背压的比较PER.C6细胞在转瓶中培养到细胞密度为2.4百万个细胞/毫升。细胞用Ad35.CS感染，感染复数40vp/ce11。病毒产生3天后，感染的细胞培养物用Benzonase(50U/ml,10min37。C)处理，之后添加入1%TritonX-100裂解细胞。B/T收获液用深层过滤和随后的膜过滤来澄清化。这个实验的收获液的病毒滴度均为2E11vp/ml，在粗收获物和澄清后的B/T中均如此。澄清的收获液用于2个TFF实验的进液料。两个TFF实验都使用0.05nm孔径的中空纤维(纤维长度20cm，面积0.105m2)。在两次实验中，6.7L/n^的进液料都以2000s"的剪切速率进液。在实验A中渗透物侧完全打开(Pin大约25-35kPa,P。ut大约12-20kPa,Pperm0kPa)，使得跨膜压力为24kPa(渗透物侧压力为0，Ppem=0);在实验B中渗透物侧用渗透物泵(permeatepump)部分关闭，因此产生了在渗透物侧的压力(Pjn大约45-48kPa，P。ut大约10kPa,Pperm大约10kPa)，跨膜压力约为17kPa。在两次实验中，进液料都被浓縮5倍，之后用10倍体积的Tris缓冲液渗滤。这个TFF的图解在图8中表示。图9显示在实验A中的初始高流通量(28L/h/m2)，随着浓縮过程降低到15L/h/m2。实验B的初始流通量较低(10.5L/h/m2)，但在浓縮和渗滤的过程中保持恒定。渗余物A和B的纯度和回收率已被测量。宿主细胞的DNA在两份渗余物中都保持在规定的10ng/剂以下，也就是1.0nghcDNA/1E11vp(见表3)。SDS-PAGE分析显示渗余物A和B之间无区别(图10)，在两份渗余物中，主要的条带都被鉴定为Ad35蛋白。但是，反相HPLC结果显示，在渗余物A中主峰在约60分钟处(高度0.4AU)，而渗余物B中的该峰值降低至少10倍(高度0.03AU)(图11)。这个峰包含有TritonX-IOO。在渗透物侧施加背压(有时候也叫作渗透压)，回收率从75%提高到90%(见表4)。这些数据表明，使用在渗透物侧施加背压的工艺将能得到高的纯度和回收率。更多使用渗透物侧背压的UF/DF工艺产生数据在表2中表示。本发明的这种在渗透物侧施加背压的工艺，也用于C组重组腺病毒载体(也就是以Ad5为基础的载体，见实施例5)，得到的结果相似。因此，本发明的工艺适用于不同血清型的重组腺病毒载体。实施例4:20升规模的本发明的工艺PER.C6细胞在2个10升发酵罐中生长，细胞密度达到2.3百万个细胞/ml。细胞用Ad35.CS载体感染，感染复数40vp/cdl。病毒产生3天后，感染的细胞用Benzonase(50U/ml，10min37。C)处理，之后添加入1%TritonX-100裂解细胞。B/T收获液用深层过滤和随后的膜过滤澄清。澄清的B/T收获液(21升)进液到3.3平米中空纤维(纤维长度40cm，孔径0.05^m)。截留端的泵启动时，渗透物侧关闭。5分钟循环后，渗透物侧泵缓慢开启直到达到所设定的压力为止。在整个TFF步骤中，测得下列压力Pin6psi，P。ut4-5psi禾BPperm2-3psi,平均TMP为2.6psi。最初，进液料被浓縮5倍，随后用10DFV的缓冲液(包含0.25MNaCl，50mMTris，2mMMgC12,0.05%Tween80,pH8.0)渗滤。获得的病毒在0.45um过滤，第二天用MustangQ阴离子交换滤器进一步纯化(获得的样品叫作捕获的病毒)和基团分离步骤(Sepharose4FF柱子)纯化。最后，经过0.45um过滤和除菌过滤，获得配比前原液。SDS-PAGE和RP-HPLC分析用于监控每个工艺步骤后样品的纯度。SDS-PAGE(图12)清晰地显示渗透物(泳道2)中绝大部分的宿主细胞蛋白被去除了。进一步通过MustangQ(泳道4)和基团分离(泳道5)对渗滤后病毒(泳道3)进行纯化，没有在纯度上有很大的提高。RP-HPLC的分析结果也相似(图13)。渗滤后的病毒(泳道3)已经被高度纯化了，仅有在60分钟截留时间检测到很少量的残留杂质。这些杂质很可能是残留的TritonX-IOO。从这个峰的高度判断，TritonX-100的残留量比最初的B/T收获液中的含量低至少100倍，使得残留的浓度少于0.01%。如果需要，可用相同的缓冲液再进行几次渗滤进一步地降低TritonX-100的残留量。基于RP-HPLC的分析，除了去除残留的Triton夕卜，MustangQ(条带4)或基团分离步骤(条带5)没有进一步提高样品的纯度。在渗滤后的病毒中宿主细胞DNA的残留量为I.4ng/1E11vp。这个实施例表明，按本发明的工艺，在TFF过程中在渗透物侧施加背压，足以得到有足够的腺病毒制备物，而不需要层析步骤。本发明的这种工艺在图14中用图解表示。实施例5:使用背压的Ad5纯化，高盐渗滤的效果PER.C6生长于10升(实验A)或2升(实验B)生物反应器中，达到细胞密度1百万个细胞/ml。细胞用Ad5.EBO.GP(S/G).mt(实验A)或Ad5.EBO.GP(Z).mt(实验B)载体感染，感染复数为60vp/细胞。病毒产生4天后，感染的细胞用Benzonase(50U/ml，10min37。C)处理，之后加入1%TritonX-100裂解细胞。B/T收获液用深层过滤和随后的膜过滤澄清。在澄清后的收获液中病毒滴度(用HPLC-AEX测量)为3.8E10vp/ml(实验A)和1.7E10vp/ml(实验B)。澄清后的收获液作为TFF实验的进液料。使用0.05Hm孔径的模块作为中空纤维膜模块(得自Spectrum)。TFF实验过程中使用了实施例2和3中所描述的渗透物侧背压。两个澄清后的收获液都被分为两份。最初，所有的样品都浓縮5倍。其中1份(A1和Bl)用6倍高盐缓冲液(含1.0MNaCl)渗滤，接着用4DFV低盐缓冲液(实验A0.4M，实验B0.3M)渗滤；另外1份(A2和B2)用10DFV低盐缓冲液(实验A0.4M，实验B0.3M)渗滤。在所有的实验中，平均TMP都等于或低于1psi。获得的渗滤后病毒样品通过RP-HPLC分析来测定残留的宿主细胞DNA的量和纯度，结果显示在表5。RP-HPLC分析结果显示纯度非常高(图15)，与表2中"背压操作程序"获得的Ad35结果相当。从以往的数据可以知道，如果不施加背压就无法得到如此高的纯度。通过低盐渗滤所得到的样品中hcDNA的残留量比表2中Ad35的数据要高。这个有可能是因为收获液中病毒滴度较低的缘故(Ad5的2-4E10vp/ml比Ad35的2E11vp/ml)。然而，如果使用高盐渗滤，残留的hcDNA量将低于10ng/剂的限制，推定剂量为1E11vp/ml。所获得的回收率大于80%，和表2中所示Ad35的数据一致。其中一份样品的SDS-PAGE分析在图16中表示。实施例6:用渗透物侧带有背压的UF/DF步骤纯化流感病毒PER.C6在转瓶中生长到细胞密度2—15百万个细胞/ml。细胞用A或B型流感病毒感染，感染复数10'2到10—3vp/细胞，同时加入胰蛋白酶。病毒复制4一6天后，细胞培养物用Benzonase(10U/ml，30min37。C)处理。处理后的收获液用深层过滤澄清。澄清后的收获液用中空纤维或平板膜模块(孔径为300到1000kD)进行TFF渗滤。在预实验中，评估在深绿过程中用高盐浓度缓冲液(例如1MNaCl)置换的效果并与其中利用低离子强度缓冲液进行置换的实验进行比较。而且，对在缓冲液中加入了其它添加剂，例如去垢剂(如Tween，Triton，DOC，CTAB)的效果也进行了评估。渗透物侧用渗透物泵部分关闭，因此产生了一定的渗透物侧压力。背压被设定为和出口的压力值相近，造成了平均TMP的降低。浓縮后，包含病毒的渗余物用配比缓冲液或后续纯化步骤所使用的缓冲液进行渗滤。在渗透物侧施加背压使纯度提高。实施例7:用单一过滤的工艺纯化腺病毒PER.C6细胞在2个10升规模的发酵罐中培养到细胞密度为2—3百万个细胞/ml。细胞用Ad35.TB-S载体(一种由腺病毒血清型35衍生来的载体，包含肺结核抗原(将Ag85A,Ag85B和TB10.4直接融合，也可参见PCT/EP2005/055984))感染，感染复数10vp/细胞。病毒繁殖3天后，感染的细胞用Benzonase(50U/ml，10min37。C)处理，之后加入1%TritonX-100裂解细胞。B/T收获液用深层过滤和随后的膜过滤澄清。这个实验中澄清后的B/T收获液的病毒滴度为2E11vp/ml。部分澄清后的收获液用作TFF实验的进液料。实验用0.05pm中空纤维(纤维长度20cm,面积0.105m"进行。6.7L/m2的进液料都以2000s"的剪切速率进液。渗透物侧出口用渗透物泵部分关闭，产生了渗透物侧压力(Pin大约38kPa,P。ut大约31kPa，Pp^大约17kPa)，跨膜压力大约为17kPa。进液料浓縮5倍后用10倍体积TRIS缓冲液渗滤，接着另外用6倍体积配比缓冲液渗滤。这个TFF在图8B中图解表示。渗滤后的病毒用0.8-0.45pm和0.22pm的滤膜过滤。确定纯化病毒的纯度和回收率。病毒纯化后的总体回收率为69%。宿主细胞DNA低于10ng/剂的标准，也就是0.8ngheDNA/1E11vp。SDS-PAGE分析中的主要条带被鉴定为Ad35病毒蛋白(图17)。渗余物经过16DFV渗滤后在反相图谱中的所有主要峰都被鉴定为Ad35蛋白(图18)。反相HPLC显示在渗滤过程中在大约60分钟时的峰有降低。这个峰含有TritonX-100。不同体积的TFF实验后，基于60分钟位置的峰的峰面积，对TritonX-100的残留量进行了估计，数据显示在表6。从这些数据中可以看出，在约10渗滤体积(DFV)后，TritonX-100的残留量(大约0.0135%)可能已经处于规程可接受的水平。例如，一种FDA批准的鸡卵来源的流感疫苗FLUARIX,0.5ml的剂量包含《0.085mg的TritonX-100(octoxynol-10)(商标信息www.fda.gov/cber/label/inflgla083105LB.pdf)，这相当于残留的TritonX-100浓度S0.017%。这些结果表明，腺病毒可以通过仅使用过滤技术以高回收率纯化到近似于均质。表格<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>表1:通过将T/B方法转变成B/T收获方法来减少纯化液中的宿主细胞DNA残留量。收获液的规模纯化为2—20升。详见实施例l。实验#60分钟RP-HPLC峰的高度宿主细胞DNA(ng/lE11vp)回收率11D0.0010.487%16/17C0.0020.789%<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表2:6个在渗透物侧施加有背压的实验。显示TritonX-100的残留量，表示为在截留时间为60分钟的位置的峰高度(RP-HPLC分析)，宿主细胞DNA残留量(通过Q-PCR测定)和病毒回收率(澄清化和UF/DF后)也显示在表中。详见实施例3。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表3:制备物A和B中的宿主细胞DNA。详见实施例3。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表4:实验A和B的数据。详见实施例3。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表5:4个在渗透物侧施加有背压的TFF实验。使用了两批澄清后的收获液(A和B)，并且先使用高盐缓冲液后使用低盐缓冲液进行渗滤(A1和B1)或者只用低盐缓冲液进行渗滤(A2和B2)。TritonX-100的残留量结果以截留时间60分钟时的RP-HPLC峰高度(RP-HPLC分析)表示，宿主细胞DNA残留量(通过Q-PCR测定)和病毒回收率(澄清化和UF/DF后)也显示在表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>表6:TritonX-100残留量的预测％。详见实施例7。权利要求1.包含超滤步骤的病毒纯化方法，其中渗余物包含该病毒，所述方法的特征在于在渗透物侧施加至少5kPa的背压。2.权利要求l的方法，其中在所述超滤步骤前，所述方法还包括以下步骤a)培养所述病毒感染的细胞，b)向细胞培养物中添加核酸酶，然后，c)任选将上述细胞裂解，提供包含该病毒的裂解液，d)任选澄清该裂解液，优选通过深层过滤和随后的膜过滤来进行。3.上述任何一项权利要求的方法，其中所述的超滤包括切向流过滤，优选采用中空纤维模块。4.上述任何一项权利要求的方法，其中至少5kPa的背压是通过用泵将背压提供给渗透物来施加的。5.上述任何一项权利要求的方法，其中的跨膜压力维持在低于20kPa。6.上述任何一项权利要求的方法，其中所述的超滤包括用含有0.8M到2M的氯化钠或其它产生相等离子强度的盐的缓冲液对渗余物进行缓冲液置换，优选随后釆用离子强度为包含少于0.5MNaCl的缓冲液的离子强度的缓冲液进行缓冲液置换。7.上述任何一项权利要求的方法，其中所述的病毒为重组腺病毒。8.权利要求7的方法，所述的方法不包括大小排阻层析步骤。9.权利要求7或8的方法，所述方法不包括阴离子交换层析或阴离子交换过滤的步骤。10.权利要求7—9中任何一项的方法，其特征为不包括层析步骤或离子交换过滤步骤。11.权利要求7的方法，所述方法进一步包括用至少一个层析步骤对重组腺病毒进一步纯化的步骤。12.权利要求ll的方法，其中所述方法包括阴离子交换层析步骤，任选通过将包含病毒的溶液施加到含有带正电基团的带电过滤器上来进行。13.权利要求11或12的方法，其中所述方法包括大小排阻层析步骤。14.纯化重组腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培养用所述重组腺病毒感染的细胞，b)裂解所述的细胞，去除和/或片段化游离核酸，提供含有该重组腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制备物，d)对腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，从而浓縮所述腺病毒制备物，e)对d)步骤的腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，并用至少5倍渗滤体积(DFVs)))的缓冲液对其进行置换，其中1DFV为d)步骤中的浓縮之后得到的渗余物体积，f)优选对腺病毒制备物进行无菌过滤，所述方法特征在于步骤d)和e)中在渗透物侧施加至少5kPa的背压。15.纯化重组腺病毒的方法，所述方法主要包括a)培养用所述重组腺病毒感染的细胞，b)裂解所述细胞，去除和/或片段化游离核酸，提供含有重组腺病毒的裂解液，c)澄清裂解液，得到腺病毒制备物，d)对c)步骤的腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒制备物在渗余物中，并用至少5倍渗滤体积(DFVs)的缓冲液对其进行置换，其中1DFV为c)步骤之后腺病毒制备物的体积，e)优选对腺病毒制备物进行无菌过滤，所述方法特征在于步骤d)中在渗透物侧施加至少5kPa的背压。16.权利要求14或15的方法，其中步骤b)包括b,i)添加核酸酶到细胞培养物中，然后，b，ii)裂解所述细胞，提供含有重组腺病毒的裂解液。17.权利要求14一16中任何一项的方法，其中的超滤包括切向流过滤，优选采用中空纤维模块来进行。18.权利要求14一17中任何一项的方法，其中的背压是通过用泵将背压提供给渗透物来施加的。19.权利要求14一18中任何一项的方法，其中超滤过程中的跨膜压力维持在20kPa以下。20.权利要求14一19中任何一项的方法，其中所述的渗余物缓冲液置换包含利用具有不同离子强度的缓冲液进行的缓冲液置换，包括用包含0.8M到2M氯化钠或其它产生相等离子强度的盐的缓冲液进行的缓冲液置换，优选随后采用这样的缓冲液进行缓冲液置换，所述缓冲液的离子强度为包含少于0.5MNaCl的缓冲液的离子强度。21.—种在超滤步骤过程中增加重组腺病毒回收率或产率的方法，其中渗余物包含重组腺病毒，所述方法特征是在渗透物侧施加至少5kPa的背压。全文摘要本发明提供了一种纯化病毒的方法，包含通过超滤步骤，其中渗余物含有该病毒，其中在渗透物侧施加的背压为至少在5kPa。本发明也提供了纯化重新腺病毒的方法，该方法主要包括a)培养用上述的重组腺病毒感染的细胞，b)裂解上述的细胞，去除游离核酸，得到含有重组腺病毒的裂解液，c)将裂解液澄清过滤，得到腺病毒制备物，d)将腺病毒制备物进行超滤浓缩，其中所述腺病毒制备物保留在渗余物中，e)将d)步骤得到的腺病毒制备物进行超滤，其中腺病毒在渗余物中，用至少5倍渗滤体积(DFVs)的缓冲液对其进行置换，其中步骤d)和e)中施加于渗透物侧的背压为至少5kPa。文档编号C12N7/02GK101155915SQ200680011815公开日2008年4月2日申请日期2006年4月11日优先权日2005年4月11日发明者M·韦格曼申请人:克鲁塞尔荷兰公司