近反向育种的制作方法

专利名称：：近反向育种的制作方法近反向育种所述纯合生物体可以进行杂交而获得杂种。本发明特别涉及植物。植物育种是一项人类的基本工作，其对于提供供应人类食物的驯化物种是极其重要的。因此，植物育种是古老的，并且最初是基于选择和繁殖那些在局部选择田地中表现优异的植物。当代的植物育种高度依赖于遗传学知识，并且在技术上得到了诸:i口欢单倍体(doubledhaploid，DH)(参见食'J:i口HaploidsinCropImprovementIIeds;PalmerC，KellerW和KashaK(2005)in:BiotechnologyinAgricultureandForestry56Eds;NagataT，L5rzH和WidholmJ.Springer-VerlagBerlinHeidelbergNewYork,ISBN3-500-22224-3)和分子标记(参见例如DeVienneed.(2003)MolecularMarkersinPlantGeneticsandBiotechnology.SciencepublishersInc.Enfield，NHUSA.ISBNl-57808-239-0)的方法的支持。有性生殖过程中的遗传机制已经进化为增加遗传变异，这增加了物种在变化的环境中的存活。减数分裂重組、独立染色体分离和交配系统是这方面的主要影响因素。然而，在植物育种中，这些机制可能起反作用，特别是在当遗传上杂合的植物已被鉴定为具有高的农学或园艺学价值时的那些情形中。遗传因子的重新分配导致产生遗传上不相似的并因而异质的植物，并因此丧失商业上所期望的性状。为了对抗这种效果，植物育种者可以利用许多技术。一种可能性是无性繁殖植物，这导致它们的遗传组成完全保留，因为通过有丝分裂仅发生倍增。对于许多植物物种，体外组织培养现在正用于无性繁殖植物，尽管也可以应用其他方法如产生体内插条(cuttings)。与通过种子进行繁殖相比较，无性繁殖(vegetativepropagation)的一个缺点是其为劳动密集的，并因而成本高。而且，难以保存植物较长的时间(引起后勤问题)，并且与植物材料通过种子进行繁殖的情况相比较，病原体如病毒感染植物材料的风险显著较大。备选地，无性繁殖可以通过形成无性种子(asexualseed)来完成，这通常称为无融合生殖。可以通过遗传工程在有性繁殖的植物物种中诱导在许多物种中自然发生的无融合生殖。然而目前，负责无融合生殖的不同步骤即未减数孢子生殖、孤雌生殖和自主胚乳发育的基因还没有被鉴定，并且可能以复杂的方式相互作用。因而，尽管已经广泛认识到无融合生殖技术用于植物育种的潜力很长时间了，但是仍需等待这一概念的验证。作为另一个备选方式，可以利用如WO-03017753中描述的反向育种技术。反向育种(reversebreeding)是基于通过遗传工程来抑制减数分裂重组并随后产生双单倍体植物(DH)，其源于含有未重组的亲本染色体的孢子。这些DH在它们的遗传组成方面是不同的，只是因为在减数分裂过程中发生的独立的亲本染色体分离。因此，足够的是，利用每个染色体的一个共显性的多态标记来确定DH或源于其的品系中的哪个应该通过杂交进行组合以重构原始起始植物的遗传组成。如保留，即使其遗传组成是未知的。然而，这种技术的一个缺点是减数分裂重组的完全抑制导致第一次减数分裂过程中没有交叉(chiasmata)并因而导致不合适的染色体分离，这可以导致配子的非整倍性并因而减少了生存力。当在第一次减数分裂过程中不形成交叉时，每个染色体具有独立的50%的机会移向两极的任何一端。这意味着产生一个具有完整染色体组的孢子的理论几率是(1/2)%其中x表示单倍染色体数目。平衡配子的频率因而随着单倍染色体数目增加而降低。尽管许多作物物种具有相对较低的染色体数目(例如黄瓜每个单倍体基因组具有7条染色体，菠菜仅具有6条)，但也存在具有相对商业上重要的物种，如番茄，其为最大的蔬菜作物之一，其每个单倍体基因组具有12条染色体。这种技术性约束显著地降低了反向育种技术的效率。因此，本领域对备选方法存在明显的需求，所述备选方法使得在有性后代中保留遗传组成。因此本发明的一个目标是提供用于保留亲本生物体，特别是亲本植物的遗传组成的方法。在导致本发明的研究中，令人惊讶地发现，通过利用从未减数孢子例如可由于第二次分裂重建(SecondDivisionRestitution,SDR)事件而获得的孢子(所谓的"SDR-0细胞，，)再生的植物，有可能提供这种方法。该方法也可以在其他除植物以外的非人生物体例如真菌或鱼上，并且使用其他生殖细胞例如配子来进行。法，所述纯合生物体可以进行杂交而获得杂种，所述方法包括a)提供杂合起始生物体；b)让所述生物体产生源于笫二次分裂重建的SDR-0细胞；c)从所述SDR-0细胞再生SDR-0生物体；和d)从如此获得的SDR-0生物体产生纯合生物体。这种方法在it匕将称为"近反向育种(NearReverseBreeding)"。未减数孢子优选由于省略了第二次减数分裂而形成。这种自然现象称为第二次分裂重建(SecondDivisionRestitution)或SDR。SDR在植物中可以在有性繁殖过程中与正常的减数分裂事件一起发生。本发明的近反向育种技术通过特定地选择经过自然或经改造的SDR而产生的未减数孢子用于再生来利用SDR事件。得到的植物，称为SDR-O植物，其大部分是纯合的，并在优选的实施方案中用于产生DH。然而，SDR-0植物中的纯合性水平也可以通过近交步骤或第二次SDR事件或其组合来增加。在起始植物的父本和母本基因组之间是多态的分子标记可用于鉴定那些SDR-0植物和源于其的DH，它们在它们的遗传組成方面基本上互补，并且在杂交后导致最初的起始植物的遗传构成几乎完全的重构。由于在SDR-O事件的形成过程中和在源于其的DH形成过程中的减数分裂重组，因而所述重构是"几乎完全的"。经重构的杂种将在一定程度上相互之间以及与原始的起始杂种植物在遗传上不同。然而，与其中DH直接源于正常的减数分裂事件的情况相比较，这种变异大大减少。而且，所述DH在遗传上是固定的，这意味着没有空间用于进一步选择。在该方法中整合SDR事件的优势是，遗传互补性的选择在两步过程中进行。第一个步骤集中于染色体的近端区，即包括着丝粒。第二个步骤指向染色体的远端，即由于重组而发生交换的那些区域。这种延緩的遗传固定减少了复杂性并增加了发现大部分互补的基因型的机会，特别是当分子标记可用于选择时。这种方法的另一个优势是SDR是一种自然过程，其在有性繁殖过程中发生并且可以就如此利用而无需进一步干扰有性繁殖过程。图1和2示意性地图解说明了正常减数分裂事件(随后是DH的形成)和SDR事件的不同。在这两个图中描绘了4个染色体对，并且同系物以浅色或黑色棒状结构显示，其中棒状物上的黑色圆圏表示着丝粒。该图仅用于举例说明本发明的原理。对于本领域技术人员来说显而易见的是，实际上所涉及的染色体对的数目取决于所涉及的物种。此外，交换(crossing-over)点相关于它们的数目/染色体和它们在染色体上的位置是可变的。图1描述了正常的减数分裂和两次减数分裂都发生后染色体的加倍(其可以是自发的或诱导的)。在这种情形中，交换导致了每组中有两个亲本和两个重组染色体产生。此外，由于每对的两个同源染色体的独立分配，显然可以形成许多遗传上不同的孢子/配子。在图1中，仅描述了该过程的三种任意的结果。在从这些孢子再生植物后，可以获得DH。DH的产生在当前的植物育种中是极其重要的并且作为一种已确立的技术应用于大多数作物。从二倍体孢子再生的植物将进一步被称为DH-O，即作为初级再生体的双单倍体，所述初级再生体来自自发的或诱导的源自正常减数分裂事件的二倍体化孢子。术语"SDR-O"用于来自缺少第二次减数分裂的细胞或孢子的初级再生体。DH-0植物当自花传粉时将产生在所有等位基因中在遗传上100%相同并且完全固定的子代(DH-1)植物。因而，尽管在DH-O植物上形成的孢子(配子)再次进行减数分裂和重组，但是不能发生基因重排。因此，这意味着这种所谓的"纯系"是永久的，因为不能发生分离。然而当生长在不同条件下，例如低或高温，或例如在不同气候带中时，这种纯系可以在表型上显示不同的表现。然而，所述可以观察到的差异对于所述品系的所有"成员"均是有效的，换而言之将不会有"品系内"变异。然而，在不同纯系(DH-1)之间可以存在差异，这称为"品系间"变异。图2描述了SDR事件。与其中自发的或诱导的染色体加倍在减数分裂完成后发生的图l相反，二倍体孢子的发生是由于不存在第二次减数分裂而引起。DH和二倍体SDR植物之间的根本性不同由下列事实来举例说明在SDR植物中于不同染色体上存在杂合区段，而DH是完全纯合的。应该进一步注意，在SDR植物中所有染色体对相关于它们的着丝粒区是纯合的。如杲存在杂合性，则其存在于远侧的染色体末端。这与称为笫一次分裂重建(FirstDivisionRestitution)或FDR的另一种异常的减数分裂事件不同，所述FDR的特征在于不存在第一次减数分裂并且其导致所有染色体对在着丝粒区处的杂合性。在图2所示的理论情形中，分别用于产生DH和SDR的起始植物(供体植物)含有完全杂合的同源染色体。这表示由那些染色体携带的基因的所有等位基因是多态性的。然而，实际上，这是相当不可能的，因而这种情形举例说明了最极端的杂合情形。从图2中还可以清楚地看出，对于SDR事件每个染色体对的交换点决定了纯合基因座和杂合基因座之间的比率。对于它们的交换位置平均更靠近端粒的那些SDR-事件这种比率增加，而当所述交换位置平均更靠近着丝粒时该比率降低。如果可利用足够的分子标记，对于每个SDR事件可容易地测定这些交换点。每个染色体臂的交换程度被着丝粒的位置所限制。应该进一步注意，如果残留的杂合性相对较低，则SDR事件类似于发生RIL，s和BIL，s,只是是以杂合的形式。SDR仅仅是更广泛的一类导致未减数孢子/配子形成的现象的一种形式(Veilleux，PlantBreedingReviews3，253-288(1985)，其描述了形成未减数配子的机制并提供了在作物植物中未减数配子发生的列表)。那时，主要公认两种不同类别的未减数配子，即SDR和FDR。最近，已经公开了第三类未减数配子，称为不定减数分裂重建(IndeterminateMeioticRestitution,IMR)(Lim等人,(2001)Theor.Appl.Genet.103:219-230)。对于本发明的目的来说，仅SDR是相关的。SDR在多种作物中自然发生，如由Veilleux(同上)以及其他独立的研究(LimK等人，(2004)BreedingScience54:13-18)所提出的列表所证明。有趣的是，在辣椒中发现，通过将植物暴露于ll'C下48小时，SDR2n配子(花粉)的频率从少于1%增加至10.5。/。(平均)(ZhangX等人，(2002)JournalofHorticulturalScience&Biotechnology78:(1)84-88)。据测量，SDR发生的最大频率为81.3%。因而，通过外部刺激来增加SDR事件数目是可能的。2n孢子或配子的发生不限于雄配子体，而是还存在证据表明这也在雌配子体的7jc平上发生。例如ZagorchevaL(GeneticsandPlantBreeding9(5)，386-399(1976))报道了在黄瓜中出现大孢子发生和大配子发生的偏离。近反向育种利用由SDR而引起的未减数孢子的发生以便很大程度地重构杂合起始植物材料的遗传组成。基本上，为了重构原始的杂种植物，可开始选择每条染色体着丝粒区互补的那些SDR-0植物。这可以通过使用多态性分子标记对每条染色体的着丝粒区进行基因分型来完成。由于SDR-O再生体对于每条染色体在着丝粒区处是纯合的，因而完全(或部分)互补的植物可以以这种方式容易地鉴定。当选取1个随机的SDR-0植物时发现互补的SDR-0植物(基于着丝粒互补性，并且不考虑任何残留的杂合性)的概率是(l/2)x,其中x是染色体的数目。如果要重构原始的亲本品系，发现一个亲本的概率是(l/2广1，而对于另一亲本该概率是(l/2广。如先前说明的，"近亲本(nearparental)"品系也可以^人为是回交近交系(Back-crossInbredLines,BIL，s)，借此对于两个亲本都产生了渐渗区段。这些互补的植物随后可以进行杂交以便重构原始杂种植物的基因型。然而，既然由于减数分裂重组，SDR-0植物的染色体臂的远端区域将是杂合的(在每个染色体臂发生单次交换的情形中)，那么分离将在重构的杂种中发生，这导致一定水平的非均一性。当位于互补SDR-G事件的远端区域中的遗传信息，由于重組在相对较远的染色体位置处发生并因而基因含量低，或者由于等位基因变异对表型变异没有显著贡献，而对表型变异没有显著贡献时，重构的杂种将是相对均一的。在本发明的一个优选实施方案中，产生了其中减数分裂重组只在染色体的最远端的端粒区发生的SDR-0事件。在这样的事件中，染色体在物理上重组而不是在遗传上重组。为了获得遗传上完全均质的重构的杂种植物，从每个互补的SDR-O事件产生DH。在图3中示意性地图解说明的这种原理描述了在从来自图2的SDR-0事件3再生的植物上发生的孢子/配子的形成。所形成的孢子可以再生，并且在染色体加倍后可以产生DH。通过使用分子标记，可以选择在遗传上与任一种亲本品系十分相似的那些DH。这在图4中通过已经加倍的染色体组来图解说明。由于分离，这些双单倍体植物的染色体的远侧末端(从重组断裂点至端粒)将平均含有每个亲本的50%的遗传信息。当两个随机选取的源于互补的SDR-0事件的双单倍体植物通过杂交进行组合时，在重构的杂种植物中近侧臂区将会是100%杂合的，而远侧臂区将会是50%杂合的。由于假设SDR-0事件平均是60%纯合的(Carputo，D.等人，(2003)Genetics163，287-294)，具有互补事件的重构将导致平均80%的杂合性(100%x60%+50%x40%)和20%的纯合性。近端和远端交换点之间的纯合性将偏向于对于该区域来说是纯合的SDR-0再生体的基因型，而对于远端交换点来说为远端的，纯合性将对于两个亲本基因型来说是相等的。对本领域技术人员来说显然的是，涉及杂合性百分比的上述图形代表极端的值，即从100%杂合的植物开始，这意味着染色体上携带的基因的所有等位基因都是多态性的。实际上，这是十分不可能的，因而杂合性的百分比平均来说将会更低。本发明进一步涉及用于产生杂种的方法，所述方法包括将根据本发明产生的第一种纯合生物体与第一种纯合生物体杂交。根据本发明，有可能重构原始杂种的遗传构成，然而，此外，可以获得接近所述原始杂种的遗传构成的变体。在第一个实施方案中，第二种纯合生物体与第一种纯合生物体至少部分互补，从而所得的杂种与杂合的起始生物体相似。合适地，与杂合的起始生物体相似包括具有起始生物体的至少50%的杂合性的杂种。优选地，杂合性中的相似是50%和100%之间的任何百分比，更特别地，杂合性中的相似是50%和60%之间，优选60%和70°/。之间，更优选70%和80%之间，更加优选80%和90%之间，以及最优选90%和100%之间的任何百分比。短语"任何百分比"旨在覆盖所述范围内的每个和所有百分比，即使特定的百分比没有明确地提到。备选地，选择第二种纯合生物体而使得得到的杂种胜过原始杂合起始生物体。"原始的杂合起始生物体"是在权利要求1的步骤a)中使用的生物体。于每个亲本的每条染色体臂内的交换点。、通it使用分子标记:、在杂交后导致具有相对较低的杂合性水平的Fl杂种的SDR-0事件以及源于其的DH都可以得以选择。在这个实施方案中，对于SDR-O事件，应该选择平均具有更多远端交换的那些，而对于DH,应该选择最互补的那些。然而，在另一方面，可以期望选择在近端和远端交换点之间具有相对较大距离的那些事件，以在可以偏向于任一亲本的Fl杂种中引入纯合性。从上面看可以清楚，近反向育种使得植物育种者能在很大程度上重构杂种植物，但是由于纯合的等位基因的不同水平和来源所引起的显著变异也可以在试验性F1杂种之间获得，这可能导致原始(起始)杂种植物的性能的改良。此外，有可能产生仅对于给定的染色体亚组来说是互补的杂种。这可以通过选择那些SDR-0事件来完成，所述SDR-0事件在它们的着丝粒基因型基础上对于所期望的染色体对是互补的，并且对于其他染色体对是相同的。从所谓的近替代系(near-substitutionline)产生的这种杂种对于非互补染色体对将是大部分纯合的，与互补染色体对相比较而言在染色体的远端区具有相似的杂合性水平。在其最极端的形式中，可以杂交完全非互补的双单倍体，这导致产生了具有局限于染色体远端部分的杂合性的杂种植物。为了将SDR用于近反向育种技术，可以利用SDR事件的自然发生或可以通过例如遗传工程来诱导SDR事件。本发明的另一实施方案涉及回交。回交是本领域技术人员所述熟知的一个植物育种术语，并且其指其中将特定性状渐渗入至具有所期望的遗传构成(所谓的遗传背景)的植物品系中的过程。这一过程的理想结果是遗传上与起始植物品系几乎相同而仅负责所述期望性状的遗传因子通过重组而被加入至其中的植物品系。为了完成这个目标，将携带所期望的遗传背景和所期望的性状的植物杂交，并从后代中选择携带所述性状以及尽可能地具有所述遗传背景的植物。由于每个回交循环所期望的遗传背景的增加平均减半，所以实际上要进行4-5个育种循环来完成回交过程。近反向育种使得能加速回交，因为达到纯合性的该过程仅需要两步。第一个步骤与传统的回交过程相同，即将携带所期望的遗传背景和所期望的性状的植物杂交。将得到的杂种用于产生SDR-0事件，其可就所期望的性状和所期望的遗传背景进行选择，所述所期望的性状可基于表型或辅助的标记，和所述所期望的遗传背景基于对于所述遗传背景特异的着丝粒标记。第二个步骤涉及DH的产生，使用分子标记就最大量的遗传背景来选择所述DH。近反向育种加快了获得纯合性的过程，但采用了两个选择步骤。当可利用足够的遗传标记时，与传统过程相比较而言可以有效得多地获得所期望的回交产物，因为可以显著减少耗时的育种循环的次数。使用本发明的近反向育种方法，可将CMS以十分有效的方式渐渗入所期望的背景中。为了将近反向育种应用于CMS转移，CMS供体品系优选对于大量的核遗传标记来说在遗传上与必需转化为雄性不育的品系不相似，这样可以更容易地测定CMS的染色体和可育供体的染色体之间的差异。为了将纯系或所期望的近交系(纯合的或近乎纯合的)转化为相似的但具有CMS背景的品系，通过用所期望品系的花粉对所述CMS进行授粉来进行第一次杂交。得到的Fl子代含有CMS和所期望品系的50%的染色体。通过用化学药品(例如一氧化二氮)或胁迫条件(例如低温)处理来诱导Fl子代植物以在雌核发育过程中进行SDR-减数分裂。SDR也可以在雌核发育过程中自然发生。如果应用孤雄发育，则必须利用恢复系基因，其可以抑制雄性不育诱导性细胞质的效果。将得到的SDR-O植物用对于Fl杂种的着丝粒区来说是多态的DNA标记进行遗传分析。选择只含有必须转化为CMS的品系的着丝粒区的SDR-G植物。如果可以利用大量的覆盖基因组的区别性标记，那么可以选择在染色体上平均具有最近端交换位置的那些SDR-O事件。这在单个步骤中将所选的品系大大地转化为CMS。如果需要，可以重复该回交循环。SDR事件的自然发生可以通过特定的非生物胁迫条件例如热或冷休克来增强。这些胁迫条件已知能增强未减数二倍体孢子的形成(ZhangX等人，(2002)JournalofHorticulturalScience&Biotechnology78:(1)84-88)。此外，有可能通过施用一氧化二氮(N20)气体来诱导2n花粉的形成(0kazaki，K.等人，(2005)Euphytica，143，101-114)。当二倍体孢子通过雄性减数分裂产生时，还有可能通过流式细胞术和荧光激活细胞分选术来富集这些细胞。这样的技术本身是本领域技术人员所熟知的，并且过去已经应用于小孢子(DeslauriersC等人，(1991)FlowcytometriccharacterisationandsortingofculturedBrassicanapusmicrospores.Biochem.Biophys.Acta:1091，165-172)。此外，已知二倍体孢子或花粉在大小上比它们的单倍体同等物要大(LernmiG和NegriV.(1994)Researchon2npollenproductioninLotustenuisanLM.G.V.ofPerugiaUniversity.LotusnewsletterVol;25,pp24-27)。令人惊讶地，二倍体孢子在物理上不同于单倍体孢子这一仅有的事实使得有可能通过流式细胞术和荧光激活细胞分选术来特异地富集二倍体孢子。此外，导致二倍体孢子形成的环境条件的优化可以使用不同的分选技术来容易地完成。发育、雌核发育或经针刺授粉(pricklepollination)的孤雌生殖来进行。当应用经针刺授粉的孤雌生殖时，使用二倍体花粉，特别是关于对于胚乳中母本对父本基因组的比率的改变具有低耐受力的那些物种来说，可能是有利的。如果不是全部作物的话，对于大多数作物，一旦从二倍体孢子再生出植物，分子标记可用于确定染色体对的着丝粒区是纯合的还是杂合的，这分别对于SDR或FDR事件来说是特征性的。以这种方式，可以容易地选择SDR事件。使得能够干扰参与减数分裂的第二次细胞分裂的基因功能的不同遗传方法对本领域技术人员来说是已知的。这样的干扰可以通过诱变或基因转移(transgenesis)来进行。转基因方法旨在稳定或瞬时引入DM片段，其修饰减数分裂的第二次分裂从而导致SDR类型的二倍体孢子。这种修饰可以通过干扰参与减数分裂过程的遗传因子，特别是参与第二次细胞分裂的那些遗传因子来进行。所述干扰可以基于转录后基因沉默(PTGS)通过特异地下调基因表达来建立。PTGS可以通过RNA-干扰(RNAi)或病毒诱导的基因沉默(VIGS)来完成。在另外一个方法中，所述干扰可以通过过表达对于减数分裂的第二次分裂施加显性负影响的蛋白质来建立，从而导致SDR。无论釆用什么方法，均需要在分子水平上知道靶标基因。已经描述了导致SDR-类型的减数分裂的马铃薯的许多隐性突变体(pcpc、osos、fcfc)(Carputo，D.等人，(2003)Genetics163，287-294)。此外，对于玉米，elongatel突变导致了第二次减数分裂的缺失(Barell，PJ和Grossniklaus，U.(2005)PlantJ.43，309-320)。尽管在这些特定实例中已经突变的基因还没有在分子水平上被鉴定，但是技术人员将能够这样做，并因而这些基因和其他仍未知的基因是使用分子抑制技术在靶物种中获得SDR的极好的候选者。本发明涉及近反向育种的一般原理，并且不是所有可能的在起始生物体中诱导SDR的实施方案已经得以描述这一事实对于本发明来说是无关的。上面描述的基因的备选方案可以在基因如DUET(VenkataReddy等人，(2003)Development130，5975-5987)和CYC1;2(Wang等人，(2004)PlantPhysiology136，4127-4135)中找到，所述基因已经对于拟南芥(^i"W/^;^/、Ma//a/7a)进行了描述，并且所述基因在突变后导致异常形式的减数分裂。在这些突变体中的二倍体减数分裂产物是SDR样的，并因而DUET和CYC1;2以及它们在其他植物物种中的功能同系物是获得SDR类型的减数分裂的候选靶基因。另外一个候选耙基因是TETRASPORE/STUD(Yang等人，(2003)PlantJ.34，229-240),其在敲除后导致减数分裂后细胞分裂的缺失。tetraspore/stud突变体的小孢子的二倍体再生体可以是SDR样的。一旦已经获得SDR-O植物，可以进一步在分子上进一步对它们进行表征。最初，可以测定着丝粒区的单倍型，这提供了对于SDR-O植物之间同源染色体的互补性水平的了解。依靠该应用，可以选择完全或部分互补的SDR-O植物。随后，可将所述SDR-O植物用于产生更密集的单倍型图语。这可以用本领域技术人员所熟知的分子分型技术来完成。实例是RFLP(限制性片段长度多态性(Beckmann，J.S.和Soller，M(1983)Theor.andA卯i.Genet.67，35-43))、RAPD(随机扩增多态DNA(Welsh,J.和McClelland,M.(1990)NucleicAcidsRes.19，961-866))、AFLP(扩增片段长度多态性)Vos，P.等人(1995)NucleicAcidsRes.23，4407-4414))或SFP(单特征多态性(Borovitz，J.等人,(2003)GenomeResearch13,513-523)。可以使用这些技术而无需预先知道DNA多态性的性质。如果将DM多态性表征为例如SNP，则可以利用许多SNP检测技术(Kwok，P丄和Chen，X(2003)Curr.IssuesMol.Biol.5，43-60)。单倍型图语可用于选择植物以用于DH生产。关于在SDR-O起始植物中是杂合的区域，所获得的DH可被鉴定为单倍型。这种分析提供了可用于操控F1杂种中杂合性/纯合性比率的遗传信息，并且其提供了选择Fl杂种基因组纯合区的任一亲本起源的这一可能性。发现两个纯合生物体的至少一种互补组合(杂交后可以'再合成，起始生物体的组合)的概率是给定物种的单倍染色体数目x和从杂合起始生物体产生的纯合生物体数目k的函数。当给定的作物物种的单倍染色体数目表示为x时，仅考虑接近交换点的染色体区域并因而包括着丝粒区，从那种作物物种的植物获得的SDR-0基因型的最大数目是2'。从该群体随机选取的一对SDR-0植物或源于其的DH植物在杂交后，导致形成具有与产生所述SDR-O事件的基因型(原始基因型)近乎相等的基因型的Fl杂种的概率是(2x-1)/2X。如果产生了总数为k的SDR-O植物，那么2个遗传上截然不同的可以杂交的SDR-0植物或源于其的DH植物存在l/2k(k-l)种组合。任意随机选取的2个SDR-0植物或源于其的DH植物的组合为互补的概率是1//。因而，任何随机选取的2个SDR-O植物或源于其的DH植物的组合不是互补的概率是I-1//-(2X-1)/2X。如果有k个SDR-0或源于其的DH,则可以得到!/2k(k-l)种组合，并因而在该SDR-0群体或源于其的DH内不能发现互补的植物的概率是((2M)/20('^—m。该分析的结果显示于下面表1中。表l:使用近反向育种技术发现两个互补的SDR-O或源于其的DH的至少一种组合的概率，该概率作为单倍染色体数目x和可利用的随机产生的SDR-0植物数目k的函数<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>该分析显示，根据本发明，使用单倍染色体数目为7的植物物种如黄瓜的48个SDR-O植物或源于其的DH，单倍染色体数目为9的植物物种如花椰菜的128个SDR-0植物或源于其的DH，以及单倍染色体数目为12的植物物种如番茄、甜瓜和甜椒的256个SDR-O植物或源于其的DH，可以以高的概率极大地再合成原始的基因型为Fl杂种。这些数字说明了这样一个事实对于这些作物物种应用近反向育种所需的SDR-0植物的数目是相对较低的，并因而这些数目的产生是高度可行的，尤其是在工业环境中。对本领域技术人员来说显而易见的是，对任何已知了单倍染色体数目的植物物种都可以这样计算。本申请中使用的"SDR-0植物或细胞"旨在涉及从未减数配子产生的植物和细胞。这样的未减数配子可以反过来是第二次分裂重建(SDR)事件的结果，但是也可以是导致形成二倍体的异常形式减数分裂的产物。本发明因而提供了使用从SDR或SDR样未减数配子再生的生物体(特别是植物)以及它们的子代的手段，例如用于基因型重构目的、用于产生近互补亲本品系、用于产生近染色体置换品系以及用于通过引入纯合和杂合的基因组区段来优化F1杂种。本发明将进一步在随后的非限制性实施例中进行阐迷，所述实施例涉及以下附图图5显示了黄瓜的典型F2植物的AFLP模式。每条水平线代表1个单独的植林。每一竖栏表示一连锁群。浅灰色部分表示杂合区域，黑色和暗色区域表示各自的纯合区域。图6显示了黄瓜的典型DH系的AFLP分析。每条水平线代表l个单独的植林。每一竖栏表示一连锁群。正如在DH中所预期的，仅存在黑色和暗色区域，而不存在浅灰色部分。图7显示了黄瓜中典型SDR-O植物的AFLP分析。每条水平线代表l个单独的植抹。每一竖栏表示一连锁群。浅灰色部分表示杂合区域，黑色和暗色区域表示各自的纯合区域。图8显示了从用低温处理的辣椒植物收集的花粉。图A表示通过光学显微镜观察到的经冷处理的植物的花粉，而图B代表对照植物的花粉。实施例实施例1在通过雌核发育获得的黄瓜(&^迈"ya"'^^L.)植物中发生相对较低水平的杂合性的证明通过根据EP-374755在黄瓜中产生单倍体和双单倍体，通过使用AFLP分析(根据EP-534858进行)发现，在所预期的双单倍体中，某这在图5、6和7中得到了很好的证明，所述附图显示，最初假定的双单倍体(图6)仍然含有杂合部分，根据定义这不可能在真正的双单倍体中。该实施例表明，通过黄瓜中的雌核发育可以获得DH,但是另外获得了显示出一些杂合性区域的植物。与F2代相比较，这种杂合性水平大大降低了，并因而极有可能是由SDR样的机制引起的。实施例2甜沐权(Ca;s/c咖a/m"咖L.)中未减数孢子/配子形成的增强为了增加未减数孢子/配子形成的频率，应用冷胁迫作为诱导剂。为此，根据Zhang等人，(2002)JournalofHorticulturalScienc6&Biotechnology78，84-88，将含有成熟前的花芽并在23。C下生长的有花甜椒植林暴露于ll'C下5天。这种冷击后，采集花芽并且通过用解剖镊和解剖刀打开花药来提取花粉。随后将花粉转移至显微镜栽玻片上，并用一滴乙酸洋红就生存力进行染色。将盖玻片放在悬浮液上面，并用光学显微镜观察所述悬浮液。作为对照，从在23。C下生长的甜椒植株收集花粉。图8显示了从冷处理的植物(8A)相对于从对照植物(8B)收集的花粉的形态学的代表性实例。可以看出，对于经冷处理的植物，具有增加的大小(表明来源于未减数孢子)的花粉的数目大大增加。在这个特定的实例中，据估计，由于冷处理，未减数孢子的％升高至25。因此，显示出，通过温度胁迫来增强未减数孢子的形成是十分可行的。实施例3通过流式细胞术来富集在甘蓝(^"a^icsWe/^ceaL.)中自然发生的二倍体孢子对于甘蓝(以及其他植物种)，已知二倍体孢子比单倍体孢子大。为了确定使用流式细胞术来富集二倍体孢子是否可行，制备从二倍体和四倍体植物获得的孢子的不同混合物。通过下列方式来分离花粉在援沖溶液(8.2g/LNaCl,1,9g/LNa2HP04.2H20，0.3g/LNaH2PO,2H20，pH=7.4)中研磨花芽(大小为3-4mm),随后经过110)im过滤器进行过滤。将细胞用提取緩冲液洗涤两次并计数。以下单倍体对二倍体细胞比例制备下列混合物i:i、io:l和100:1。分选基于粒度、生存力和大小这些参数来进行。对于所有比率并基于所述三个参数中的每一个，获得对二倍体细胞的富集。在接下来的试验中，基于上述参数对天然的单倍体小孢子群体进行分选。发现，可以分选出二倍体小孢子，据估计所述二倍体小孢子在所述小孢子群体中以0.7%的频率存在。图9显示了与正常的单倍体小孢子相比较，在该试验中获得的经纯化的二倍体小孢子(较低的行)，该试验通过光学显微镜观察。照片蒙Ing.N.Vennik;TN0Leiden(TheNetherlands)允许而获得。实施例4可用于下调候选靶基因Tetraspore的RNA干扰载体的构建为了下调特定植物物种中候选靶基因的活性，可以利用RNA干扰。为此，将拟南齐的Tetraspore的DNA片段插入至pKANNIBAL(Wesley等人，(2001)ThePlantJournal27，581—590)中，这样一旦在植物中表达后就形成RNA分子，该RNA分子可以自身折回，因而形成发夹结构，其引发了同源RNA的特异性降解。载体pKANNIBAL含有一个位于CaMV35S启动子下游的内含子，并在上游形成章鱼碱合酶多腺苷酸化信号。在该内含子的任一侧放置了一个多克隆位点，其使得能够方便地以相互倒转的方向插入对应于RNA干扰耙的DNA的左臂和右臂。一旦转录后，该内含子通过剪接而除去，并且所述左臂和右臂相互折回而形成双链RNA。分离两个cDNA片段，其对应所述基因的5，-末端(588bp,正向引物5，-ACCTCCGAGAACTCCGTTAAG-3，;反向引物:5,-TGCCTGCTTTCTACCACTTC-3，)和所述基因的中间部分(679bp,正向引物5，-TTCTCAAGTGGCAAGGTGTC-3，;反向引物:5，-ATCCCTCTTTGGTGGAGTAG-3，)。在每个片段的两侧都产生限制性内切酶识别位点，其使得能够将所述cDNA片段作为反向重复插入pKANNIBAL中。两个片段的左臂都被改造成XhoI-KpnI片段，而两个片段的右臂都被改造成HindII-XbaI片段。在最后一个步骤，将完成的发夹盒(含有所述两个Tetraspore序列作为反向重复)分开插入称为pART27的二元载体的T-DNA中，所述二元载体含有新霉素磷酸转移酶II基因作为用于植物转化的选择标记。T-DNA的完整性通过序列分析来确认。将得到的二元载体(关于5，-片段被命名为pRZ226，以及关于3，-片段^皮命名为pRZ219)用三亲交配过程(triparentalmatingprocedure)转移至根瘤土壤杆菌(^ro6a"er/咖f咖e尸ac/e/7s)中。当克隆的候选靶基因的片段和需要通过RNA干扰进行下调的特定基因之间的序列相似性太低时，上面描述的方法可用于制备类似构建体，其含有与需要下调的基因足够同源的DM片段。实施例5用pRZ226和pRZ219转化拟南芥将含有所述植物转化载体pRZ226和pRZ219的根瘤土壤杆菌C58菌林于29。C下在LB培养基中生长过夜，所述LB培养基含有链霉素(100mg/L)和壮观霉素(300mg/L)以选择所述栽体，以及含有利福平(40mg/L)和庆大霉素(25mg/L)以选择所述根瘤土壤杆菌C58的背景。为了产生转基因植物，大部分如Desfeux等人，(2000)PlantPhysiology123，895-904所述，使用拟南芥花浸渍(floraldip)法。将所述细菌细胞重悬浮于花浸渍溶液(每升milliQ中有50g蔗糖+500silwettL-77表面活性剂)中。将含有多个花芽的抽莒植物浸没于含有0D在1.0和1.5之间的土壤杆菌细胞的浸渍溶液中5-10秒，同时轻轻搅动。孵育后，将植物装在塑料容器中以在低光照条件下保持高湿度1天，随后让种子在所述植物上生长。通过让经表面消毒的种子在铺于半强度MS平板上的0.1%琼脂糖中发芽来选择转化体，所述MS平板含有50mg/L卡那霉素。将卡那霉素抗性的幼苗转移至温室中的土壤中。实施例6甘蓝中自然发生的SDR事件就二倍体植物的发生对通过远源杂交在携带Ogura细胞质雄性不育性(CMC)的红球甘蓝(^rfl^/cso/eraces)上产生的杂种进行筛选，所述二倍体植物在表型上与原始红球甘蓝CMS植物近乎相同，并且因而是体内雌核发育的结果。可基于它们的表型容易地与真正的杂种植物相区分的这些植物确实经鉴定具有低的频率。这些植物通过孤雌生殖而源于自发加倍的减数配子，或源于未减数配子。为了区分这些可能性，使用AFLP(根据EP-534858进行)来分析源于这些植物的DM。该分析证明了存在相对较低频率的杂合基因座，这表明这种植物源于未减数配子。该实施例显示出，通过甘蓝中的体内雌核发育，可获得具有相对较低水平的杂合性的植物，所述杂合性可能是由SDR样的机制引起的。图IO显示了来源于未减数配子的甘蓝植物的AFLP指紋图谱。灰色线条表示来自一个亲本的纯合标记召唤(call)，暗灰色来自另一亲本。浅灰色表示杂种标记基因座。实施例7玉米中的近反向育种将核酸整合入玉米的基因组中是本领域已知的常规方法，并且已经描述了如何完成该过程的方法(EP-801134;US-5,489，520;EP-97.114654.3)。使用在这些专利申请中描述的转化方法中的任何一种，引入核酸序列，其对参与第二次减数分裂的基因，特别是elongatel(Barell，PJ和Grossniklaus，U.(2005)PlantJ.43，309-320)产生特异抑制效果，并因而导致SDR类型的异常减数分裂事件发生。由于转基因核酸序列整合的不同基因组位点，所获得的SDR-事件的频率有时候在独立的转化体之间不同。在另一试验中，通过用低温处理玉米植抹，或通过如Kato，A和Birchier，JA(2006)J.Hered.1，39-44所述，施加一氧化氮气体来增加SDR孢子的频率。由于所述抑制性核酸的活性或者应用了低温或一氧化氮处理，产生了许多SDR类型的小孢子或大孢子。基于SDR小孢子在大小上与正常单倍体小孢子相比较而言较大这样一个事实，通过使用流式细胞术或焚光激活细胞分选术来富集如此产生的细胞群体中存在的SDR-0小孢子。由于SM-事件而产生的小孢子或大孢子含有一套二倍染色体。这些二倍体小孢子或大孢子是用于产生SDR-0再生体的起始材料。物。在这种情形中，获得了含有单倍体胚的种子，参见例如RotarencoV(2002)Productionofmatroclinousmaizehaploidsfollowingnaturalandartificialpollinationwithahaploidinducer.MaizeGeneticsCooperationNewsLetter76:16。上述的用于产生DH玉米植物的方案也应用于从SDR-Q细胞产生SDR-0玉米胚，所述了在SDR-0谷粒的胚乳中的母本和父本基因组之间获得正确的平衡，还利用四倍体诱导品系。在其中应用基因转移来诱导SDR的特定试验中，含有单个拷贝的转基因的转化体是优选的。在获得含有极大地抑制第二次减数分裂的核酸构建体的转基因品系后，将该品系用于杂交以避免反复的转化事件。在那种情况中，含有单倍体配子的正常花粉的频率低但仍足以用于杂交。在一个进一步的试验中，使用了由启动子控制的抑制性核酸构建体，所述启动子可通过例如地塞米松来化学请导(Bohner，S.等人，(1999)PlantJ.19，87-95)。然后按常规从小孢子获得玉米中的单倍体(PescitelliS和PetolinoJ(1988)PlantCellReports7:441-444;Co謹nsM等人，(1989)PlantCellReports7:618-621;PescitelliS等人，(1989)PlantCellReports7:673-676;ButerB(1997)Invitrohaploidproductioninmaize.In:InVitroHaploidProductioninHigherplants,vol4，37-71.KluwerAcademicPublishers.Eds.;SJain,S10Sopory&RVeilleux)。获得(RotarencoV(2002)MaizeGeneticsCooperationNewsLetter76:16)。在这种情形中，获得了含有单倍体胚的种子。将上述用于产生DH玉米植物的方案应用于从SDR-0细胞产生SDR-0玉米胚，所述SDR-0细胞的形成是通过基因转移或通过本实施例中详细说明的其他处理方法来诱导。关于每条染色体的着丝粒区，用分子标记来对所述SDR-0玉米植物进行遗传表征，所述分子标记对于在原始的起始植物中的这些区域来说是多态性的。为了检测所述多态性，使用了选自CAPS、dCAPS、Invader、pyrosequencing、taqman的不同技术。因而，鉴定了就着丝粒区的标记得分而言对于所有染色体对来说互补的SDR-0玉米植物对。然后将这样的SDR-0玉米植物对用于产生每抹SDR-0互补植物的双单倍体植物。将从每林互补SDR-0植物获得的单独的DH成对杂交，即用于产生玉米Fl杂种的两个DH源于互补SDR-0事件中的任一个。互易地进行这种杂交。将如此产生的Fl杂种在田间试验中评估农学性能，其中起始Fl杂种用作对照。据发现，通过本发明的近反向育种获得的杂种的农学性能与原始杂种的性能相似。实施例8黄瓜中的近反向育种对于黄瓜来说雌核发育是一种完全确立的技术，并根据EPQ374755中描述的方法来进行。当根据EP0374755进行应用时在雌核发育过程中发生的自发性SDR事件导致形成具有一些残留杂合性的二倍体再生体。这些SDR-0黄瓜植物用AFLP分析来鉴定，所述AFLP分析根据EP534858中提供的方法进行。关于每条染色体的着丝粒区，用分子标记来对如此获得的SDR-O黄瓜植物进行遗传表征，所述分子标记对于在原始的起始植物中的这些区域来说是多态性的。为了检测所述多态性，使用了选自CAPS、dCAPS、Invader、pyrosequencing、taqman的已知技术。这导致了SDR-0黄瓜植物对的鉴定，所述黄瓜植物对就着丝粒区的标记得分而言对于所有染色体对来说是互补的。随后根据EPG374755中描述的方法，将这样的SDR-O黄瓜植物对用于产生每林SDR-O互补植物的DH植物。丢弃自发发生的SDR事件，并仅将真正的双单倍体植物用于进一步的步骤中。如果获得了单倍体植物，就将染色体数目加倍，例如通过应用秋水仙素。所迷的染色体加倍也可以自发发生。随后，将从每林互补SDR-0植物获得的单独的DH植物成对杂交，即用于产生黄瓜Fl杂种的两个DH源于互补SDR-0事件中的任一个。互易地进行这种杂交。将如此产生的Fl杂种在试验中评估农学性能，其中起始F1杂种用作对照。据发现，通过本发明的近反向育种获得的杂种的农学性能与原始Fl杂种的性能相似。权利要求1.用于从杂合非人生物体产生纯合非人生物体的方法，所述纯合生物体可以进行杂交而获得杂种，所述方法包括a)提供杂合起始生物体；b)让所述生物体产生源于第二次分裂重建的SDR-0细胞；c)从所述SDR-0细胞再生SDR-0生物体；和d)从如此获得的SDR-0生物体产生纯合生物体。2.权利要求l的方法，其中产生SDR-0细胞而不干扰起始生物体。3.权利要求1的方法，其中产生所述SDR-0细胞的生物体经选择而显示出高于平均的第二次分裂重建。4.权利要求1的方法，其中产生所述SDR-0细胞的生物体经遗传修饰而显示出高于平均的第二次分裂重建。5.权利要求5的方法，其中所述遗传修饰是暂时的。6.权利要求5的方法，其中所述遗传修饰是通过将增加生物体中第二次分裂重建事件数目的遗传元件稳定地整合入基因组中。7.权利要求1的方法，其中产生所述SDR-0细胞的生物体受到环境胁迫而显示出高于平均的第二次分裂重建。8.权利要求7的方法，其中所述环境胁迫选自温度胁迫、N02、一氧化二氮N20或它们的组合。9.权利要求l的方法，其中所述纯合生物体通过双单倍体技术、近交、第二次分裂重建或其组合来制备。10.用于产生杂种的方法，所述方法包括将根据权利要求l-9中任一项产生的第一种纯合生物体与第二种纯合生物体杂交。11.权利要求10的方法，其中第二种纯合生物体与第一种纯合生物体至少部分互补，这样得到的杂种与所述杂合起始生物体类似。12.权利要求11的方法，其中与所述杂合起始生物体的类似包括具有至少50%的起始生物体的杂合性的杂种。13.权利要求11或12的方法，其中所述杂合性的类似是50%-100%之中的任何百分数。14.权利要求11、12或13的方法，其中所述杂合性的类似是50%-60%之中，优选60%-70%之中，更优选70%-80°/。之中，更加优选80%-90%之中，以及最优选90%-100°/。之中的任何百分数。15.权利要求10的方法，其中选择第二种纯合生物体，从而使得得到的杂种优于所述杂合起始生物体。16.权利要求10的方法，其中选择第二种纯合生物体，从而使得仅一亚群的其染色体与第一种纯合生物体的对应染色体互补。17.权利要求16的方法，其中剩下的染色体在第一种和第二种纯合生物体之间是相同的。18.用于在具有所期望的遗传背景的生物体中渐渗入性状的方法，所述方法包括下述步骤a)将具有所期望的遗传背景的第一种生物体与具有所期望的性状的第二种生物体杂交以获得杂合起始生物体；b)让所述生物体产生源于第二次分裂重建的SDR-0细胞；c)从所述SDR-0细胞再生SDR-0生物体；d)选择具有所期望的性状和所期望的背景的SDR-O生物体；和e)从所选择的SDR-0生物体产生纯合生物体。19.权利要求18的方法，其中所述SDR-0细胞是如权利要求2-8中所定义的而获得的。20.权利要求18或19的方法，其中所述纯合生物体通过双单倍体技术、近交、第二次分裂重建或其组合来制备。21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述选择是基于目视检查或借助于分子标记来进行。22.权利要求1-21中任一项的方法，其中所述生物体是植物。23.可通过权利要求1-9中任一项的方法而获得的纯合非人生物体。24.可通过权利要求10-21中任一项的方法而获得的杂种非人生物体。25.权利要求23或24的非人生物体，其中所述生物体是植物。26.来自权利要求23、24或25的生物体的子代。27.来自权利要求23、24或25的生物体或者权利要求26的子代的细胞。28.来自权利要求23、24或25的生物体或者权利要求26的子代的組织。全文摘要本发明涉及用于从杂合非人生物体产生纯合非人生物体的方法，所述纯合生物体可以进行杂交而获得杂种，所述方法包括提供杂合起始生物体；让所述生物体通过减数分裂产生SDR-0细胞，所述细胞源于第二次分裂重建；从所述SDR-0细胞再生SDR-0生物体；以及从如此获得的SDR-0生物体产生纯合生物体。本发明进一步涉及用于产生杂种的方法，所述方法包括将根据上面的方法产生的第一种纯合生物体与第二种纯合生物体杂交。此外，本发明提供了通过这些方法可获得的纯合非人生物体和杂种非人生物体。本发明特别涉及植物。文档编号C12N15/82GK101160404SQ200680012445公开日2008年4月9日申请日期2006年3月2日优先权日2005年3月3日发明者C·M·P·梵邓恩,R·H·G·迪克斯申请人:瑞克斯旺种苗集团公司