改变对外源和内源免疫原(包括同系和非同系细胞、组织或器官)的免疫应答的材料和方法

专利名称：改变对外源和内源免疫原(包括同系和非同系细胞、组织或器官)的免疫应答的材料和方法
技术领域：
本发明；肥、组织或器 例如，本发明可以调 节对外源或内源免疫原(包括非同系或同系细胞、组织或器官)的不利 的免疫应答或炎症反应，以及改善自身免疫状况。
背景技术：
在过去几年中已经对异种移植进行了大量的研究，来克服器官的缺乏D然而，宿主免疫应答是种间移植的一个难以逾越的障碍。天然抗体引起这些不相容移植物的直接排斥，而内皮细胞(EC)损 伤和移植物血管内层EC的活化在启动慢性移植物排斥中起关键作 用。内皮层的完整性的破坏在许多病症中无疑是重要的，这些病症 包括同系和非同系组织移植以及感染、胂瘤、炎症和心血管疾病。迄今为止，免疫调节和移植物接受性需要依赖于全身施用的免 疫抑制剂。这些药物允许一定程度的移植物接受，但是只有有限的 成功，并且也许更重要的是，患者的免疫系统由于这些药物而完全 受损。因此，仍然需要可以实现免疫调节而对患者免疫系统没有毒 性和不利影响的治疗性材料和治疗方案。类似地，外源免疫原或刺激引起临床挑战。这些也可以导致需 要治疗的不利的免疫事件或炎症反应。迄今为止，这些不利事件的 临床处理几乎只依赖于应用非特异性抑制免疫系统的药物进行治 疗。自身免疫病和其他类似的疾病是升高的炎症反应或不利的免疫 应答的另一个临床表现。迄今为止，成功控制这些疾病对于医生来说还是一个困难。本发明的 一 个目的是提供不依赖于可损害患者免疫系统的化学 试剂或药物而用于实现免疫调节的组织工程方案。这种组织工程方 案可以用来以临床上实施的方式改变对外源和内源免疫原(包括非 同系以及同系细胞、组织或器官相关免疫原)的免疫应答。本发明 的另 一个目的是促进患者对非同系以及同系细胞、组织或器官的接 受性。本发明的另一个目的是使用这种组织工程方案调节炎症反应 如与损伤有关的炎症反应和各种疾病。另一个目的是使用本发明的 材^)"和方法控制自身免疫性和有关疾病。发明内容本发明利用了以下的发现锚定于和/或包埋在生物相容性基 质、优选具有三维结构的生物相容性基质内的细胞，能够调节对任任何同系或非同系的免疫原，包括细胞、组织或器官相关的免疫 原，以及损伤、疾病和环境刺激。一方面，本发明提供一种降低免疫应答或炎症反应的方法。根 据该方法，给接受者提供含有生物相容性基质和锚定和/或包埋的内 皮细胞、内皮样细胞或其类似物的可植入材料。以足以降低接受者 的免疫应答或炎症反应的量给接受者提供可植入材料。根据本发明，所述提供步骤可以在给接受者施用一个或多个剂 量的来自同系或非同系供体的细胞、组织或器官之前、同时或之后 进行。根据另一实施方案，所述提供步骤在发生免疫应答或炎症反 应之前、同时或之后进行。根据另一实施方案，该方法通过调节免 疫记忆来降j氏免疫应答或炎症反应。在一个有关方面，本发明提供一种在患者中诱导免疫接受性的 方法。根据该方法，在以有效诱导患者接受性的量移植自体移植、 异种移植或同种异体移植细胞、组织或器官之前、同时或之后，给 患者提供含有生物相容性基质和锚定和/或包埋的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物的可植入材料。另外，本发明涉及一种降低供体抗原免疫原性的方法。根据该 方法，在以有效降低供体抗原免疫原性的量向接受者内导入供体抗 原之前、同时或之后，递送含有生物相容性基质和锚定和/或包埋的 内皮细胞、内皮样细胞或其类似物的可植入材料。才艮据另一实施方 案，供体和接受者是相同的。根据另一实施方案，接受者患有自身 免疫病。根据再另一实施方案，供体抗原含有非内皮细胞抗原。根据各种其他实施方案，所述提供步骤在给接受者施用免疫抑 制剂之前、同时或之后进行。所述免疫抑制剂可以存在于可植入材 料中。此外，本发明还涉及一种给接受者移植同系或非同系细胞、组 织或器官移植物的方法。根据该方法，在移植之前、同时或之后给 接受者提供含有生物相容性基质和锚定和/或包埋的内皮细胞、内皮 样细胞或其类似物的可植入材料，致使移植的同系或非同系细胞、 组织或器官不被接受者排斥。根据该方法的一个实施方案，移植的 细胞、组织或器官包括非内皮细胞。在另 一方面，本发明涉及一种含有生物相容性基质和锚定于其 上和/或包埋在其中的细胞的可植入材料。根据一个当前优选的实施 方案，所述细胞是内皮细胞、内皮样细胞或其任一种的类似物。在细胞。根据另一实施方案，可植入材料的细胞是上述任一细胞类型 的自体、同种异体、异种或遗传修饰的变体。根据一个进一步优选 的实施方案，可植入材料的细胞是血管内皮细胞。根据一个实施方 案，可植入材料是固体或非固体。根据另一实施方案，通过植入、 注射或输注给接受者提供可植入材料。本发明还涉及用于降低对同系或非同系细胞、组织或器官的免 疫应答的可植入材料。根据本发明的该方面，可植入材料包括生物 相容性基质和锚定在其上和/或包埋在其中的内皮细胞、内皮样细胞 或其类似物。根据本发明的该方面，有效量的可植入材料降低接受者对同系或非同系细胞、组织或器官的免疫应答。根据本发明该方 面的一个实施方案，细胞、组织或器官是患有自身免疫病的接受者 的细胞、组织或器官。本发明还涉及上述可植入材料的变形，其可用于降低对非同系 细胞、组织或器官的免疫应答，其中所述可植入材料包括锚定和/或 包埋在生物相容性基质中的细胞、组织或器官或其片段。有效量的 这种可植入材料降低接受者对非同系细胞、组织或器官的免疫应 答。非同系细胞、组织或器官是患有自身免疫病的接受者的细胞、 组织或器官。在另一方面，本发明提供适合用于此处所述任一发明的可植入 材料的细胞。根据一个实施方案，内皮样细胞或其类似物是非内皮 细胞。根据另一实施方案，该类似物是非天然的。根据另一实施方 案。当细胞锚定和/或包埋在生物相容性基质中时，降低接受者对同 系或非同系供体细胞、组织或器官的体液或细胞免疫应答。根据另 一 实施方案，当细胞锚定和/或包埋在生物相容性基质中 时，显示降低的免疫原性。根据一个实施方案，当锚定和/或包埋在生物相容性基质中时，细胞通过显示降低的MHC表达或降低的结 合、活化或促进先天免疫细胞的成熟的能力显示降低的免疫原性， 其中所述先天免疫细胞选自NK细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬 细月包。根据另 一实施方案，当细胞锚定和/或包埋在生物相容性基质中 时，显示降低的共刺激分子或粘附分子表达。根据另一实施方案，抑制所述树突细胞表达HLA-DR、 IL12、 Toll-样受体或CD83;促进所述树突细胞摄取葡聚糖；或者阻断树突细胞诱导的淋巴细胞增 殖；或者当与获得性免疫细胞共培养时，抑制所述细胞的增殖、活 化或分化，其中获得性免疫细胞选自B淋巴细胞和T淋巴细胞。在另 一 方面，本发明提供包含此处所述的任一 细胞的细胞库。 在另一方面，本发明提供包含此处所述的任一可植入材料的库。在另一方面，本发明提供一种降低由暴露于外源免疫原引起的 免疫应答或炎症反应的方法。根据该方法，给接受者提供一种包含 生物相容性基质和锚定和/或包埋的内皮细胞、内皮样细胞或其类似 物的可植入材料。以足以降低接受者中由暴露于外源免疫原引起的 免疫应答或炎症反应的量给接受者提供可植入材料。根据该方法的一个实施方案，所述提供步骤在发生免疫应答或 炎症反应之前、同时或之后进行。根据另一实施方案，外源免疫原 是天然存在的。根据另一实施方案，外源免疫原选自药剂、毒素、 手术植入物、传染物和化学药品。根据另一实施方案，外源免疫原 是选自环境应激、损伤和暴露的外来刺激。


图1A、 1B和1C显示根据本发明说明性实施方案的循环PAE 特异性抗体的水平。图2显示根据本发明说明性实施方案的脾细胞的裂解活性。图3A显示根据本发明说明性实施方案的细胞因子产生细胞的频率。图3B显示根据本发明说明性实施方案的代表性ELISPOT孔。图3C显示根据本发明说明性实施方案的T细胞的频率。图4A和4B为根据本发明说明性实施方案的效应细胞水平的图。图5A、 5B和5C显示根据本发明说明性实施方案的抗体水平。 图6显示根据本发明说明性实施方案的脾细胞的水平。 图7A和7B显示根据本发明说明性实施方案的抗体水平。 图8A和8B显示根据本发明说明性实施方案的细胞因子产生细 月包的频率。图9A和9B显示根据本发明说明性实施方案的效应细胞的水平。图IOA和10B显示根据本发明说明性实施方案的Th2-细胞因子产生脾细胞的频率和T细胞分化为效应细胞的程度之间的相关性。 图11显示根据本发明说明性实施方案对内皮细胞的损伤程度。图中提到的"包埋"、"基质包埋"的PAE、 HAE或EC是指基质 锚定的和/或包埋的PAE、 HAE、 EC。发明详述组织工程是一种有前景的方法，其利用内皮细胞、内皮样细胞胞治疗。例如，某些疾病，例如但不限于血管疾病，引起不利的免 疫应答和/或炎症反应。本发明基于以下发现锚定和/或包埋在三维 基质中的细胞如内皮细胞分泌必需的调节因子，该调节因子可改善 或以其他方式调节不利的免疫应答。本发明的可植入材料根据组织工程的原理开发，代表了解决此 处所述临床需要的新方法。本发明的可植入材料的独特之处在于锚 定和/或包埋在生物相容性基质内的活细胞能够在生理反馈控制下按 生理比例向施用部位提供多种基于细胞的产物。如本文其他部分所 述，适合用于可植入材料的细胞是内皮细胞、内皮样细胞或上述每 一种的类似物。这些细胞局部递送多种化合物以及生理学动态给药 提供了对负责调节免疫应答的过程的更有效的调节。本发明的可植 入材料可以提供模拟支持性生理学并且有助于调节免疫应答的环 境。这是一个意外的发现，因为内皮细胞在不利的同种异体和异种 免疫应答的启动中可能起关4建作用。而且，内皮细胞可以通过抗原 介导的过程活化T细胞，而T细胞活化可以改变关键的内皮细胞功 能，包括通过细胞因子激活的抗原递呈，由此引起不利的免疫应 答。而且，内皮细胞组成型表达I类主要组织相容性复合物 (MHC)分子，并且IFN-Y可以诱导内皮细胞表达H类MHC分子， 该分子使它们能够通过直接途径给CD8+和CD4+ T-细胞提供抗原依 赖性信号。内皮细胞也可以主要给T细胞提供共刺激。另外，通过粘附分子的内皮表达捕获T细胞的能力允许形成接触区，该接触区 增强了炎症形式的不利的免疫应答。此外，自身免疫性可以加重血 管疾病，特别是抗内皮细胞抗体形式。与糖尿病、高血压和其他疾 病状态有关的心血管疾病的死亡率的升高反映了这些抗体的存在和 效价的升高。相反，如此处所述，基质锚定的和/或包埋的内皮细胞当植入宿 主中时，作为有力的免疫系统调节剂起作用，预期的全身免疫应答 和/或局部炎症的显著降低证明了这一点。如本文举例说明的，通过 在幼稚小鼠以及内皮细胞免疫反应性升高的小鼠中比较对于游离的 和基质锚定和/或包埋的内皮细胞的免疫应答，已经证明了这些细胞 改善或调节免疫应答的能力。如此处所述的基质结合的内皮细胞在多个水平上提供免疫保护；已经证明当人和猪内皮细胞如此处公开 的那样基质锚定和/或包埋时，精细MHC类分子、共刺激分子以及 粘附分子明显减少。如本文所举例说明的，内皮细胞的基质锚定和/或包埋也可以影 响免疫记忆的形成。再植入单独的游离的、盐水悬浮的内皮细胞沉 淀物或者与空基质相邻的沉淀物引起明显提高的体液和细胞异种应 答，而用基质锚定的和/或包埋的内皮细胞激发小鼠导致脾细胞的裂 解能力降低，而不提高体液免疫应答。而且，Thl/Th2平衡向前者的 适当转移在接受基质锚定的和/或包埋的异种内皮细胞的小鼠中是明 显的。因此，导入与空基质相邻的游离内皮细胞不能降低宿主免疫应 答，表明基质锚定和/或包埋的重要性。锚定的和/或包埋的内皮细胞 在刺激后不能表达MHC II、共刺激和粘附分子说明了响应于植入的 基质锚定的和/或包埋的异种内皮细胞，效应细胞中的T细胞的分化 减弱。如此处所述，当小鼠脾细胞暴露于基质锚定的和/或包埋的异 种内皮细胞时，其活化以依赖于MHC II类的方式减弱。总之，内皮细胞的各向同性对这种独特的免疫调节形式做出贡 献，其中锚定和/或包埋在适当基质中的细胞通过分离或掩蔽关键性抗原而提供了免疫保护，众所周知，体内内皮细胞功能是依赖于锚定和密度的。以前的研究已经证明内皮基膜(EBM)控制细胞粘附、扩散、迁移、收缩性、分化、增殖、蛋白质合成和分泌等方面。此外，EBM在从糖尿病到肾小球病到动脉粥样硬化症的许多体 内疾病状态中改变。内皮细胞的功能障碍与在内皮细胞附着程度积 累的基膜组成的改变有关，基膜锚定的质量对于内皮细胞免疫起作用。本发明基于以下意外的发现在适当的生物相容性基质(例如但 不限于基于胶原的三维基质)中锚定和/或包埋的内皮细胞可以将异种 内皮细胞转化为免疫学上非攻击性的(non-offending)细胞表型。这 一发现现在可以由技术人员按照本文提供的指导进行，作为诱导对 同系或非同系治疗的耐受性的方法，该治疗例如但不限于本文举例 说明的同种异体移植或异种移植。例如，在本发明的优选实施方案 中，临床医生可以通过在移植同种异体或异种移植物组织或器官之 前植入基质锚定的和/或包埋的内皮细胞来降低和/或延迟排斥。对于 本发明，血液是一种组织类型。预处理使接受者的免疫系统适应，并且可以导致降低的、减弱 的和/或延迟的对移植物的免疫应答。本发明不需要可植入材料包含 与最终植入接受者中的细胞相同或类似的锚定的和/或包埋的细胞。 所需要的是包含锚定的和/或包埋的细胞的可植入材料当给接受者提 供时具有免疫调节作用。在某些情况中，在移植之前或同时单次施 用可能就足够了。在其他情况下，优选多次或连续施用。本领域技 术人员应当认识这些情况。众所周知，甚至同种异体细胞的移植也通常伴随有免疫应答。 非常感兴趣的一个问题是，这是外来细胞的本质的和不变的性质还 是可以调节的性质。本文所述的实验证明了如果以基质锚定的和/或 包埋的状态植入，则正常锚定于基膜上的细胞的免疫原性可能显著 降低，这种效应在这些相同细胞以游离状态注射时没有乂见察到。本 文所述的其他实验研究了增强的抗内皮细胞免疫的影响，这是多种自身免疫病和内分泌疾病的共同临床特4i。另外，本文概述的一些实验证明了连续注射游离猪主动脉内皮细胞(PAE)诱导循环抗-PAE抗体，升高免疫敏感性。对接下来的 PAE注射的应答甚至高于在第一次暴露时观察到的。相反，当PAE 以基质锚定的和/或包埋的状态植入时，对接下来的暴露的免疫应答 减弱并且随时间显著降低。同样，如下所述，对内皮细胞的初始应 答是IgM-介导的，低于随后的IgG应答，并且在之前为连续注射时 减弱。IgM应答在幼稚动物中比在预先致敏的动物中更明显，并且 在游离PAE暴露后比在暴露于基质锚定的和/或包埋的内皮细胞后需 要更长的时间减弱。用游离PAE悬浮液对小鼠预先致敏类似于在糖尿病、高血压和 自身免疫病中所见的IgGr引起的抗内皮免疫。对游离的和基质锚定 的和/或包埋的细胞的细胞免疫应答遵循体液免疫模式。重复暴露于 抗原导致记忆的形成增强，并且随后导致效应细胞的更剧烈的免疫 反应。因此，异种反应性IL-4-和IL-10-产生脾细胞和效应T细胞 的导入随时间升高，并且在向幼稚和预先致敏的小鼠中植入游离内 皮细胞后可见。在所有小鼠中，细胞因子水平与效应T细胞诱导精 确地线性相关，进一步支持异种反应性中Th2-引导的细胞应答和减 弱基质包埋的内皮细胞的免疫沉默方面以激活适应性免疫机制的观 点。对植入的内皮细胞的损伤与引起的免疫应答程度相关。在游离 PAE预先致敏后最深刻地影响植入的细胞。在接受基质包埋的内皮 细胞的幼稚小鼠中降低的体液和细胞免疫应答诱导导致较低程度的 宿主免疫细胞的损伤。这些实验提供了对内皮细胞激活和损伤的理解，提示对于细胞-基质接触具有关键作用。当前优选的基质Gelfoam的蜂窝样结构允许内皮细胞结合到、或锚定到、或包埋于其三维构型内，并且在某 些实施方案中，以模拟静止血管中汇合内皮外观的方式排列于该基 质的内表面。因此，在某些实施方案中，锚定于和/或包埋于在具有 Gelfoam性质的基质内的内皮细胞类似于完整内皮的生理学三维状态。下面所述的实验证明了基质锚定和/或包埋不仅保护内皮细胞免 于宿主免疫反应，而且改变了宿主内皮细胞免疫原性的理解。因此，在疾病过程中，例如，内皮细胞从完整、基质粘附的内 源状态向游离状态的表型转化对于(例如)血管疾病的启动和持续 可能是关键的。本文的教导表明内皮细胞脱离早于粘附、共刺激和MHC分子的表达，然后是免疫细胞的吸引、持续的内皮活化和细胞 损伤。在这方面，内皮细胞的免疫生物学和免疫反应性质与形态学 和功能相关。来自不同血管床的内皮细胞和差异的基膜连接性证明 了在粘附、共刺激和MHC分子的组成型和诱导型表达中有明显的差 异。进而，越来越多地了解了过渡细胞外基质蛋白质如纤连蛋白和 纤维蛋白原向内皮下基质内的沉积以及内皮细胞从基膜上的分离影 响了内皮细胞内信号发生。本发明设想，可以利用细胞表型、免疫原性和功能的操作来适应为了再生目的在体外发展的组织工程构建体的性质；特别是，本发明的这种应用在临床上是有益的，因为当前的基于细胞的疗法受 限于深刻的宿主免疫反应。例如，本发明特别可用于治疗动脉粥样 硬化病，因为活化的免疫细胞和炎症的存在是关键的病理生理因 素。类似地，已经确定增强的抗内皮免疫是基于内皮细胞的疗法的关4建限速效应，例如但不限于涉及在血管结构内部纟妻种细胞或组织 的疗法。相反，可以利用本发明来控制在血管病理学中发生的内皮 细胞表型转移，例如，通过细胞-基质接触的脱排列 (dearrangement)，然后可以在临床上使用本发明的材料和方法实 施适当的耙向治疗选项。总之，本文提供的教导也证明了基质的特征，例如但不限于生 物相容性、多孔性、三维性，可以支持内皮细胞群体的生长，并且 可以调节这些细胞的免疫原性。锚定和/或包埋在三维基质内的内皮 细胞引起相当低的宿主免疫机制激活，并且经受非常低的宿主免疫 细胞的攻击和损伤。在幼稚小鼠中的发现在具有增强的抗内皮免疫 的宿主中扩大。此处提供的体内研究显示在植入包含锚定的和/或包埋的内皮细胞的基质如Gelfoam的动物中比在注射游离内皮细胞的 动物中Th2-引导的免疫应答显著降低。为了使内皮细胞激活幼稚宿 主T细胞，需要两个信号1)在供体内皮细胞上表达的MHC分子 内的抗原呈递，和2)也在供体内皮细胞表面上表达的共刺激分子提 供的第二信号。因此，不希望受理论约束，所观察到的结果的一种 可能的解释是生物相容性基质和包埋的内皮细胞之间的相互作用导 致供体内皮细胞上关键共刺激、MHC和/或粘附分子的表面表达降 低。实际上，关键粘附、MHC-II和共刺激分子在PAE和HAE (人 主动脉内皮细胞)上表达的体外研究显示基质锚定的和/或包埋的依 赖性分布。与在标准组织培养板上生长的相同内皮细胞相比，在锚 定和/或包埋于Gelfoam基质的内皮细胞中，粘附(E-选择素、P-选 择素、ICAM-1、 VCAM-1和CD58 )、共刺激(CD40 、 CD80、 CD86)和MHC-II分子的表达分布均降低。P-选择素、E-选择素和 VCAM-1与免疫炎症部位的T细胞募集密切相关。因为抗原通过 MHC II类分子向CD4+ T细胞呈递对于非血管化异种植入物情况下 的宿主免疫识别来说是必需的，观察到的在基质锚定的和/或包埋的 内皮细胞上降低的MHC-II表达翻译为宿主脾细胞增殖应答的降低。 此外，相同脾细胞在体外重复暴露于在组织培养板上生长的内皮细 胞引发更强烈的二次应答，而对于预先暴露于基质锚定的和/或包埋 的内皮细胞来说，没有提高的二次应答，因此没有记忆。这些体外 发现与在大鼠和小鼠中在如此处所述植入和用基质锚定的和/或包埋 的内皮细胞激发后观察到的显著减弱的免疫反应相关。类似地，在生物相容性基质(例如但不限于Gelfoam)中培养内 皮细胞影响MHC II类分子的表达、随后影响体外内皮免疫原性的机 制通过研究细胞内信号途径进一步阐明。MHC II类分子的内皮表达 由活化的免疫细胞(例如T细胞)分泌的促炎细胞因子(例如干扰素(IFN) -y)诱导。促炎细胞因子与内皮细胞上的其受体的结合启 动了细胞内信号级联，导致Janus蛋白酪氨酸激酶(例如JAK-1和 2)和信号转导子和转录激活子(例如STAT-1)的磷酸化。JAK和STAT的活化通常在靶细胞内紧密调节。如下所述，详细的体外分析 证明了在组织培养板上生长至汇合的内皮细胞和锚定和/或包埋于 Gelfoam基质中的内皮细胞之间IFN-y诱导的细胞内信号途径具有差 异。Gelfoam包埋的HAE显示较低的STAT-磷酸化速度和关4建的干 扰素-调节因子-1 (IRF-1)的活化，表面IFN-y受体表达没有改变。用 IFN-y刺激Gelfoam中的HAE后也观察到较低的JAK激活速度。在进一步研究后，发现在Gelfoam基质上生长的非-IFN-y刺激的 HAE比在组织培养平板上生长的HAE表达显著较高水平的反作用 抑制分子，细胞因子信号抑制剂(SOCS)-l和3。因此，在Gelfoam-包埋的HAE中减弱的IFN-y诱导的细胞内信号的一种解释是SOCS-1 和3水平提高，导致细胞因子诱导的内皮细胞活化的阈值提高。在一个优选实施方案中，将包含锚定的和/或包埋的内皮细胞的 本发明的可植入材料植入到任何非腔部位。这样，不需要供体细胞 直接暴露于宿主循环。最近的证据表明了可溶性内皮因子CX3CL1 (CXXXC趋化分子)对于免疫细胞(即自然杀伤细胞)吸引的重要 性，和表面表达形式的CXXXC趋化分子对于这些免疫细胞粘附的 重要性。假如只在异种或同种异体基质锚定的和/或包埋的内皮细胞 的植入部位之中和周围观察到适度的细胞浸润，则对HAE上 CXXXC趋化分子的可溶性和表面表达的释》丈进4f定量。如以下所述 的实验所说明的，与在组织培养板上生长的HAE相比，基质锚定的 和/或包埋的内皮细胞显示在细胞因子刺激后CXXXC趋化分子的分 泌减少且表面表达下调。这导致在体外人自然杀伤细胞向基质锚定 的和/或包埋的HAE上的粘附显著较低。总之，与在组织培养板上生长的细胞相比，在基质锚定的和/或 包埋的内皮细胞中细胞内信号改变、SOCS-1和3水平升高(导致 MHC-II分子的表达减弱和随后的T细胞活化)以及CXXXC趋化分 子分泌和表面表达降低，这表明由于基质包埋引起内皮细胞免疫原 性的改变。细月包来源。如此处所述,本发明的可植入材料包括可以为同系、同种异体、异体或自体的细胞。在某些实施方案中，活细胞的 来源可以来自于适当的供体。在另外一些实施方案中，细胞来源可 以来自于尸体或细胞库。在一个优选实施方案中，细胞是内皮细胞。在一个特别优选的 实施方案中这种内皮细胞获自血管组织，特别是但不限于动脉组 织。如下所述，适合使用的一种类型的血管内皮细胞是主动脉内皮 细胞。适合使用的另一种类型的血管内皮细胞是脐静脉内皮细胞。 适合使用的另一种类型的血管内皮细胞是冠状动脉内皮细胞。适合 本发明使用的其他类型的血管内皮细胞包括肺动脉内皮细胞和髏动 月永内皮细月包。在另 一个当前优选的实施方案中，合适的内皮细胞可以从非血 管组织中获得。非血管组织可以从如本文其他部分所述的任何管状 解剖结构中获得，或者可以从任何非血管组织或器官中获得。在另一个实施方案中，内皮细胞可以来自于内皮祖细月包或干细胞；在另一个实施方案中，内皮细胞通常可以来自于祖细胞或干细 胞。在一个优选实施方案中，细胞可以是祖细胞或千细胞。在另外 一些优选实施方案中，细胞可以是来源于血管或非血管组织或器官 的同系、同种异体、异种或自体非内皮细胞。本发明还涉及遗传改 变、修饰或工程化的任何上述细胞。在另外一个实施方案中，两种或多种类型的细胞共培养，以制 备本发明的可植入材料。例如，可以将第一种细胞引入生物相容性 基质内培养，直到汇合。第一细胞型可以包括，例如，平滑肌细 胞、成纤维细胞、干细胞、内皮祖细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞 的组合、任何其他期望的细胞型、或适合产生有助于内皮细胞生长 的环境的期望的细胞型的组合。 一旦第一细胞型达到汇合，则将第 二细胞型接种到在生物相容性基质之中、之上或之内的第一种汇合 的细胞型上面，培养，直到第一细胞型和第二细胞型都达到汇合。 第二细胞型可以包括，例如，内皮细胞或任何其他期望的细胞型或 细胞型的组合。设想第一和第二细胞型可以分步引入，或者作为一种混合物引入。还设想可以调节细胞密度，来改变平滑肌细胞与内 皮细胞的比例。类似地，基质在开始时可以接种适合预期适应症或 临床方案的不同细胞的混合物。本发明的锚定的和/或包埋的细胞需要它们表现一种或多种优选 的表型或功能性质。本发明基于以下发现具有容易鉴定的表型 (如本文其他部分所述)的细胞当与优选的基质结合时可以通过全 身和/或局部效应降低、改善和/或调节免疫应答或炎症反应。对于本发明，本发明细胞典型的一种这样优选的、容易鉴定的 表型是通过本文所述的体外试验测定的改变的免疫原性表型。本发 明细胞典型的另一种容易鉴定的表型是通过本文所述的体外试验测 定的阻断或干扰树突细胞成熟的能力。每种表型在本文中被称为免疫调节表型。免疫调节功能性的评价对于本文所述的本发明,可以检测可 植入材料在植入前的免疫调节功能的指标。例如，评价可植入材料 的样品，以确定它们降低MHC II类分子表达、降低共刺激分子表 达、抑制共培养的树突细胞成熟、以及减少T细胞增殖的能力。在 某些优选实施方案中，当可植入材料能够使MHC II类分子的表达降 低至少约25-80%,优选50-80%、最优选至少约80%;使共刺激分 子的表达降低至少约25-80%、优选50-80%、最优选至少约80%; 将共培养的树突细胞的成熟抑制至少约25-95%、优选50-95%、最 优选至少约95%;和/或使淋巴细胞增殖降低至少约25-90%、优选 50-90%、最优选至少约90%时，可以用于本文所述的目的。MHC II类分子和共刺激分子的表达水平可以用下文详述的常规 流式细胞分析进行定量。淋巴细胞的增殖可以通过在体外共培养 3 [H]-胸苷标记的CD3+-淋巴细胞与可植入组合物经如下详述的闪烁胞共培养并且通过流式细胞术和FACS分析评价树突细胞上各种标 记的表面表达或者通过测定树突细胞对FITC-偶联的葡聚糖的摄取来 定量。上述每种方法都在下文详细描述。在本发明的典型操作实施方案中，细胞不需要显示一种以上的 上述表型。在某些实施方案中，细胞可以显示一种以上的上述表型。尽管上迷表型均代表功能性内皮细胞，例如但不限于血管内皮 细胞，但是对于本发明而言，显示这种表型的非内皮细胞被认为是 内皮样的，因此适合本发明使用。内皮样细胞在本文中也^皮称为内皮细胞的功能性类似物；或内皮细胞的功能性模拟物。因此，仅仅 是作为举例，适合此处公开的材料和方法使用的细胞也包括产生内皮样细胞的干细胞或祖细胞；在来源上是非内皮细胞但是使用此处 所述的参数在功能上类似于内皮细胞的细胞；使用此处所述的参 数，经构建或以其他方式修饰而具有内皮样功能的任何来源的细胞。典型地，本发明的细胞当在汇合、接近汇合或汇合后群体中存 在并且与优选的生物相容性基质如此处所述的那些结合时，显示一 种或多种上述表型。本领域技术人员应当理解，汇合的、接近汇合 的或汇合后的细胞群体可以通过多种技术容易地鉴定，最常用的和 广泛接受的是直接显微镜检查。其他技术包括使用标准细胞计数技 术评价每表面积的细胞数，例如但不限于血细胞计数器或coulter计 数器。另外，对于本发明，内皮样细胞包括但不限于在功能上和表型 上模仿或冲莫拟汇合、接近汇合或汇合后的内皮细胞的细胞，这通过 此处所述的参数来确定。因此，使用以下的详细描述和指导，本领域技术人员应当理解 如何制备、使用、检测和鉴定此处公开的可植入材料的操作性实施 方案。也就是说，此处提供的教导公开了制备和使用本发明的可植 入材料必须的那些信息。进而，此处提供的教导公开了鉴定、制备 和使用操作上等同的含细胞组合物所需的那些信息。实际上，所需答。本领域技术人员应当理解，本发明组合物的等同实施方案可以仅用常规实验以及此处提供的教导来鉴定。在某些优选实施方案中，本发明的可植入材料中使用的内皮细 胞从人尸体供者的主动脉上分离。每一批细胞来源于一个或多个供 体，充分检测内皮细胞纯度、生物学功能、细菌、真菌、已知人类 病原体和其他偶然物质的存在。利用众所周知的技术将细胞冷冻保存并且建库(bank),用于以后在培养中扩增，用于以后在生物相 容性可植入材料中配制。在其他实施方案中，可以从供体或预期可 植入材料的患者中收集活细胞。细胞制品。如上所述，合适的细胞可以从多种组织型和细胞型 中获得。在某些优选实施方案中，在可植入材料中使用的人主动脉 内皮细胞分离自尸体供者的主动脉。在其他实施方案中，通过类似 于用来分离人主动脉内皮细胞的方法，从正常猪主动脉中分离猪主 动脉内皮细胞(Cell Applications, San Diego, CA)。每批细胞来源于一 个或多个供体，充分检测内皮细胞的存活力、纯度、生物学功能、 支原体、细菌、真菌、酵母、已知人类病原体和其他偶然物质的存 在。将细胞进一步扩增，表征，并冷冻保存，利用众所周知的技术 在第3-6代形成工作细胞库，用于以后在培养中扩增，以及用于随 后配制为生物相容性可植入材料。每瓶加入约15 ml内皮细胞生长培养基预处理的T-75瓶中制备人或 猪主动脉内皮细胞。人主动脉内皮细胞在内皮生长培养基(EGM-2， Cambrex Biosciences, East Rutherford, NJ)中制备。EGM画2由添力口有 含2% FBS的EGM-2的内皮细胞基础培养基(EBM-2， Cambrex Biosciences)组成。猪细胞在添加有5% FBS和50 fig/ml庆大霉素的 EBM-2中制备。将培养瓶置于孵箱中，在大约37。C和5% C02/95% 空气、90%湿度下保持最少30分钟。从-160。C至-140。C冷冻箱中取 出一或两小瓶细胞，在大约37。C下融化。将每瓶融化的细胞以大约 3乂103细胞/^113的密度、优选地但不低于1.0xl(^和不大于7.0xl0、々 密度接种到两个T-75瓶中；将含有细胞的培养瓶放回孵箱中。大约8-24小时后，除去消耗的培养基，并更换为新鲜培养基。每2-3天 更换一次培养基，之后，直到细胞达到大约85-100%汇合，优选地 但不低于60%且不高于100%汇合。当可植入材料用于临床应用时， 只有不含抗生素的培养基用于人主动脉内皮细胞的融化后培养和本发明的可植入材料的制备。然后除去内皮细胞生长培养基，用10 ml HEPES緩沖盐溶液 (HEPES)漂洗细胞单层。除去HEPES，加入2 ml胰蛋白酶使细胞脱 离T-75瓶表面。 一旦发生脱壁，即加入3 ml胰蛋白酶中和溶液 (TNS)终止酶反应。加入另外5 ml HEPES，使用血细胞计H器计数 细胞。将细胞悬液离心，并且在人类细胞的情况下，使用不含抗生 素的EGM-2调节至大约1.75x106细胞/ml的密度，或者在猪细胞的 情况下，用补充5% FBS和50 ng/ml庆大霉素的EBM-2调节至大约 1.50x106细月包/ml。生物相容性基质。根据本发明，可植入材料包含生物相容性基 质。该基质允许细胞生长，并且允许细胞锚定和/或包埋于该基质 内。 一种特别优选的基质的特征是以三维构造为特征，使得锚定的 和/或包埋的细胞能够产生并占据多维空间。多孔材料是优选的。基 质可以是固体或非固体。某些非固体基质是可流动的，并且适合通 过注射型或输注型方法施用。在某些实施方案中，基质是柔性的和 适合的。该基质也可以是柔性平面的形式。该基质也可以是凝胶、 泡沫、悬浮液、颗粒、微载体、微胶嚢或纤维结构的形式。在某些 优选实施方案中，细胞锚定于其上和/或细胞包埋于其中的非固体基 质形式在施用时可以注射或输注。当前一种优选的基质是Gelfoam (Pfizer, New York, NY)，它是 一种吸收性明胶海绵(下文称为"Gelfoam基质")。Gelfoam基质是 由特殊处理的、纯化的猪皮明胶溶液制成的多孔和柔性的海绵样基 质。根据另一实施方案，生物相容性基质材料可以是修饰的基质材 料。当细胞与基质结合时，可以选择基质材料的修饰以优化和/或控制细胞的功能，包括本文所述的细胞的表型(例如免疫调节表 型)。根据一个实施方案，基质材料的修饰包括用附着因子或粘附 肽包被基质。附着因子的例子包括，例如，纤连蛋白、纤维蛋白凝 胶和利用标准水性碳二亚胺化学法共价连接的细胞粘附配体(包括，例如RGD)。其他细胞粘附配体包括具有细胞粘附识别序列的 肽，包括但不限于RGDY 、 REDVY 、 GRGDF 、 GPDSGR 、 GRGDY和REDV。根据另一个实施方案，基质是Gelfoam以外的基质。其他基质 材料的例子包括，例如，纤维蛋白凝胶、藻酸盐、聚苯乙烯磺酸钠 微载体、胶原包被的葡聚糖微载体、纤维素、PLA/PGA和 pHEMA/MMA共聚物(对于每个共聚物，共聚比为1-100%)。才艮 据一个优选实施方案，这些其他的基质被修饰，以包括如以上提到 和描述的附着因子。根据另一实施方案，生物相容性基质材料被物理修饰，以改善 细胞向基质上的附着。根据一个实施方案，将基质交联，以增强其 机械性质，并且改善其细胞附着和生长性质。根据一个优选实施方 案，藻酸盐基质首先用硫酸钙交联，然后使用氯化钙和常规方案进 行第二次交联步骤。根据另一实施方案，改变生物相容性基质的孔径。当前一种优 选的基质孔径为大约25 pm至大约100 优选大约25 pm至50lim;更优选大约50 iam至75 iam;更优选大约75 至100 pm。其 他优选的孔径包括低于大约25 pm且高于大约100 jam的孔径。根据 一个实施方案，利用盐浸(salt leaching)技术改变孔径。氯化钠在 基质材料溶液和溶剂中混合，将溶液倒入模具中，使溶剂蒸发。然 后将基质/盐块浸入水中，浸出盐得到多孔结构。选择溶剂使得基质 在溶液中但是盐不在溶液中。 一种示例性的溶液包括PLA和二氯曱 烷。根据一个替代实施方案，将二氧化碳气泡引入非固体形式的基 质中，然后用适当的表面活性剂稳定。然后用真空除去气泡，得到多孔结构。根据另一实施方案，使用冷冻干燥技术控制基质的孔径，使用 冰微粒的冷冻速度形成不同大小的孔。例如，大约0.1-2%猪或牛明 胶的明胶溶液可以倒入模具或器皿中，在多个不同的温度下预冷冻，然后冻干一段时间。然后优选地利用紫外线(254 nm)或者通过加 入戊二醛(曱醛)使材料交联。预冷冻温度(例如-20。C、 -80°C或-180°C)、冻干温度(在大约-50。C冻干)和明胶浓度(0.1%至 2.0%;孔径通常与溶液中的明胶浓度成反比)的变化均可影响获得 的基质材料的孔径，并且可以改变以产生优选的材料。技术人员应 当理解，合适的孔径为促进和保持具有此处所述表型的最佳细胞群 体的孔径。生物相容性基质的细胞接种。下面描述了 一种示例性的生物相 容性基质构造。如其他部分所述，优选的基质是固体或非固体，并 且可以配制用于才直入、注射或输注。合适的生物相容性基质的预切片或一份合适的生物相容性可流 动基质通过加入不含抗生素的EGM-2在大约37°C和5% C02 / 95% 空气下再水合12-24小时。然后从再水合容器中除去可植入材料， 并置于分别的组织培养亚中。生物相容性基质以大约1.5-2.0xl05细 胞(1.25-1.66x105细胞/cm3基质)的优选密度接种，并置于孵箱中在大 约37。C和5% C02 / 95%空气、90%湿度下保持3-4小时，以促进细 胞附着。然后将接种后的基质置于单独的容器(Evergreen， Los Angeles, CA)管中，每一个配有一个帽，含有0.2 |am滤器和EGM-2,并且在大约37。C和5% C02 / 95%空气下孵育。每2-3天更换一 次培养基，之后，直到细胞达到汇合。在一个优选实施方案中，细 胞优选地传代6次，但是也可以使用传代更少或更多的细胞。细月包生长。在第3或4、 6或7、 9或10、 12或13天或前后除 去可植入材料的样品，计数细胞，并评价存活力，构建生长曲线， 进行评价，以估计生长特性，并确定是否达到汇合、接近汇合或汇 合后。通常，本领域技术人员应当理解在早期、中期和晚期时间点可接受的细胞生长的指标，例如在早期时间点(例如，当使用猪主 动脉内皮细胞时，在大约第2-6天)观察到细胞数指数增长，之后是接近汇合期(例如，大约第6-8天)，之后一旦细胞达到汇合即 进入细胞数稳定期(例如大约第8-10天)，当细胞汇合后保持细胞 数(例如，大约第10-14天)。.细胞计数如下实现用0.5 mg/ml胶原酶在1^ ￡8/0&++溶液中 的溶液完全消化可植入材料等份。在测量消化后的可植入材料的体 积后，用0.4%台盼蓝(4:1细胞台盼蓝)稀释已知体积的细胞悬 浮液，并且通过台盼蓝排除法评价存活力。活细胞、非活细胞和总 细胞用血细胞计数器计数。通过将活细胞数对培养天数作图来构建 生长曲线。对于本发明，汇合被定义为，如果为示例性柔性平面形式的可 植入材料(1.0x4.0x0.3 cm)，存在至少约4xl05细胞/cm3,优选地在 可注射或可输注组合物中每份(50-70 mg)存在大约7xl()S至lxl(^个 总细胞。对于这两者，细胞存活力为至少约卯％,优选地不低于 80%。本发明的一个示例性实施方案包括生物相容性基质和适合此处 所述的各种临床适应症或治疗方案之任一种使用的细胞。具体地， 在一个优选实施方案中，可植入材冲牛包含生物相容性基质和内皮细 胞、内皮样细胞或上述任一种的类似物。在一个当前优选的实施方 案中，可植入材料是柔性平面形式，并且包括内皮细胞，优选血管 内皮细胞，例如但不限于人主动脉内皮细胞，和生物相容性基质 Gelfoam⑧明胶海绵(Pfizer, New York, NY，下文称为"Gelfoam基 质")。本发明的可植入材料包括锚定于和/或包埋在生物相容性基质内 的细胞。锚定于和/或包埋在之内的含义是通过细胞-细胞和/或细胞-基质相互作用紧密连接，使得细胞经得起本文公开的制备操作的条 件。如本文所述，可植入材料的一种操作实施方案包括具有优选表 型的接近汇合的、汇合的或汇合后的细胞群体。应当理解，可植入材料的实施方案可能在制备操作过程中释放出细胞，和/或某些细胞 不象其他细胞那样紧密连接。只需要可植入材料包含满足本文所述 功能或表型标准的细胞。本发明的可植入材料基于组织工程的原理开发，并且代表满足 本文所述临床需要的新方法。本发明的可植入材料的独特之处在于 锚定和/或包埋于生物相容性基质内的活细胞能够在生理反馈控制下 按照生理比例向施用部位供应多种基于细胞的产物。如本文所述， 适合可植入材料使用的细胞是内皮、内皮样细胞或上述每一种的类 似物。这些细胞局部递送多种化合物和生理动态给药提供了对负责 调节免疫应答的过程的更有效的调节。本发明的可植入材料可以提功能性的评价。对于本文所述的本发明，在递送给接受者之前 检测可植入材料的功能性的指标。例如，作为适用性的一种测定， 在培养过程中收集条件培养基，以确定培养的内皮细胞产生的硫酸类肝素或转化生长因子-[31 (TGF-pi)或碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)或一氧化氮的水平。在某些优选实施方案中，当细胞总数至少 约为1,优选大约为2,更优选至少约为4xl05细胞/cm3柔性平面形 式时，可植入材料可以用于本文所述的目的；活细胞的百分比至少 约为80-90%,优选》90%,最优选至少约90%;条件培养基中的硫 酸类肝素至少约为0.1-0.5iug/mL/天，优选至少约0.23 iug/mL/天。如 果需要其他指标，则条件培养基中的TGF-(31至少约为200-300 pg/ml/天，优选至少约为300 pg/ml/天；条件培养基中的b-FGF低于 大约200 pg/ml，优选地不超过大约400 pg/ml。硫酸类肝素水平可以利用常规二曱基亚甲基蓝-软骨素酶ABC 消化分光光度测定法进行定量。总硫酸化糖胺聚糖(GAG)水平利 用二曱基亚甲基蓝(DMB)染料结合测定法进行测定，其中将未知 样品与标准曲线进行比较，该标准曲线是使用已知量的在收集介质 中稀释的纯化硫酸软骨素产生的。其他条件培养基样品与软骨素酶 ABC混合，在添加DMB颜色试剂之前消化硫酸软骨素和硫酸皮肤素。所有吸光度都在与GAG标准混合的DMB染料的最大波长吸光 度处测量，通常在515-525 nm附近测量。通过从条件培养基样品中 的总硫酸化糖胺聚糖浓度中减去硫酸软骨素和硫酸皮肤素的浓度， 计算每天硫酸类肝素的浓度。通过;肖化纯化的硫酸软骨素样品证实软骨素酶ABC活性。如果消化少于100%的纯化的硫酸软骨素，则 适当地修正条件培养基样品。硫酸类肝素水平也可以利用使用单克 隆抗体的ELISA试验进行定量。需要时，TGF-(31和b-FGF水平可以利用使用单克隆或多克隆抗 体、优选使用多克隆抗体的ELISA试验进行定量。对照收集介质也 可以利用ELISA试-验进行定量，并对对照介质中存在的TGF-(31和 b-FGF水平适当地修正样品。 一氧化氮(NO)水平可以利用标准 Griess反应试验进行定量。 一氧化氮的不稳定和挥发性质使其不适 合大多数检测方法。然而， 一氧化氮的两种稳定的分解产物，硝酸 盐(N03)和亚硝酸盐(N02)，可以用常^见光度测定法4企测。在硝酸还 原酶的存在下，Griess反应试^r将磷酸盐酶促转化为亚硝酸盐。亚 硝酸盐作为有颜色的偶氮染料产物进行比色检测，在大约540 nm的 范围内吸收可见光。系统中存在的一氧化氮的水平如下测定将所 有硝酸盐转化为亚硝酸盐，测定未知样品中的亚硝酸盐的总浓度， 然后比较得到的亚硝酸盐的浓度和使用已知量的转化为亚硝酸盐的 硝酸盐产生的标准曲线。另外，任何一种或多种上述试验可以单独或者组合使用，作为尽管先前描述的优选的免疫调节表型可以用上述一种或多种任 选的定量硫酸肝素、TGF-(M、 NO和/或b-FGF功能测定来评价，但 也可以如下评价可植入材料中 一种或多种优选免疫调节表型的存 在。对于本发明， 一种这样优选的、容易鉴定的本发明细胞典型的 表型是例如通过下述体外试验测定的改变的免疫原性表型。另外一 种容易鉴定的本发明细胞典型的表型是例如通过下述体外试验测定 的阻断或千扰树突细胞成熟的能力。每种表型在此被称为免疫调节表型，表现这种表型的细胞具有免疫调节功能。免疫调节功能的评价。对于本文所述的本发明,可植入材料的 免疫调节功能可以如下检测。例如，评价可植入材料的样品，以确 定它们减少MHC II类分子表达、减少共刺激分子表达、抑制共培养 的树突细胞成熟、减少T细胞增殖的能力。在某些优选实施方案中，当材料能够使MHC II类分子的表达减少至少约25-80%,优选 50-80%，最优选至少大约80%时；使共刺激分子的表达减少至少约 25-80%，优选50-80%，最优选至少约80%时；将共培养的树突细胞 的成熟抑制至少约25-95%,优选50-95%,最优选至少约95%时； 和/或使淋巴细胞的增殖减少至少约25-卯％,优选50-卯％，最优选 至少约90%时，可才直入材冲牛可以用于本文所述的目的。MHC II类分子和共刺激分子的表达水平可以用以下详述的常头见 流式细胞术和FACS分析进行定量。淋巴细胞的增殖可以通过体外 共培养3[司-胸普标记的〔03+-淋巴细胞与可植入组合物，通过以下 详述的闪烁计数进行定量。树突细胞成熟的抑制可以通过共培养可 植入材料与树突细胞并且通过流式细胞术和FACS分析评价树突细 胞上各种标记的表面表达或者通过流式细胞术测定树突细胞对FITC-偶联的葡聚糖的摄取进行定量。这些方法均在下文详细描述。另外，任一种或多种上述试验可以单独或组合使用，作为鉴定使用方法和临床适应症本发明总的涉及调节对外源免疫原或 刺激以及内源免疫原或刺激的免疫学上不利的应答(包括炎症反 应)的材料和方法。本发明也涉及细胞、组织或器官相关的免疫 原。例如，本发明可以调节对非同系或同系细胞、组织或器官的不 利的免疫应答，和/或改善预先存在的免疫状况，例如但不限于自身 免疫状况。用于适合的临床适应症的可植入材料和方法的这种论述 将参考以下的术语和概念。早期免疫应答依赖于先天免疫。在先天免疫应答过程中，多种 先天免疫机制识别和响应免疫原的存在。先天免疫在任何时间存在于所有个体中，主要区别自身、改变的自身和非自身。例如， 一种类型的先天免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、树突细胞和单核细胞。 先天免疫应答之后为获得性免疫应答，后者由特定淋巴细胞的克隆 选择介导，并且导致更适合的和长期的针对所识另J抗原的免疫应答。应答，包括免疫记忆的发展。获得性免疫应答通过淋巴细胞的克隆 选择产生。获得性免疫应答不同于免疫的先天和非获得性阶段，先的。获得性免疫应答包括细胞介导的免疫和体液免疫。例如，获得 性免疫细胞是B细胞或T淋巴细胞。获得性免疫应答的一个标志是免疫记忆的建立。免疫记忆是免 疫系统更快速、有效地响应以前所遇到的免疫原的能力，并且反映 了克隆扩增的抗原特异性淋巴细胞群体的预先存在。保护性免疫可以是细胞介导的免疫或体液免疫。体液免疫是体 液免疫应答中形成的抗体介导的特异性免疫。细胞介导的免疫描述 了其中抗原特异性T细胞起主要作用的任何获得性免疫应答。自身免疫病由持续的自身抗原特异性的获得性免疫应答介导。 组织损伤的产生是因为抗原是机体的内在成分，因此免疫系统的效 应机制针对于自身组织。另外，由于攻击性的自身抗原不能从身体 中除去，因此免疫应答持续存在，并且不断供应新的自身抗原，从 而扩大了这种应答。尽管某些同系移植物可能是长期接受的，但是甚至同系移植物 对于接受者可能存在问题。实际上，甚至当收获、离体操作自体细 胞并将其返回原供体时，也可一定程度地发生不接受性。 一般地， 在MHC或其他基因座处不同的移植物被接受者的T细胞应答短期 排斥。当供体和接受者在MHC处不同时，例如，免疫应答针对非自 身MHC分子或移植物表达的其他表面分子。移植物的接受或排斥引 起免疫事件如抗原识别、T细胞活化、T辅助细胞募集、以及最终的移植物破坏。炎症反应开始于局部免疫应答。急性炎症是早期的短暂事件，d 而慢性炎症例如在自身免疫应答期间持续存在。炎症反映了细胞因 子对局部血管的作用。细胞因子对血管内皮的粘附性质具有重要作 用，导致循环白细胞附着于血管壁的内皮细胞上，并且穿过血管壁巴细月包。示例性的治疗方法和临床适应症在下面论述。这不是穷尽性的论述。本发明涉及任何适合用本发明治疗的临床适应症，包括以患 者中具有不利临床后果的免疫事件为代表的或与之相关的任何临床适应症。同系和非同系移植物本发明可以用来减少或降低移植物接受 者对细胞、组织和/或器官移植物(无论是同系还是非同系移植物) 的不利应答。本发明也可以用于稳定或保持移植物接受者对细胞、 组织或器官移植物的接受性，而无论是同系还是非同系移植物。如 本文所述，当使用可植入材料作为移植前处理、同时处理或移植后 处理时，发生不利免疫应答的调节。例如，预期预处理可以使接受 者的免疫系统适应，这有利于以后移植物的接受。类似地，同时处 理可以縮短生理事件的时间过程，最终导致接受性，并且改善移植 物引起的任何不利的免疫事件。移植后处理无论是单处理还是多处 理，都可以保持接受状态，并且如果/当这些事件发生时阻止不利免 疫事件。在临床上，适合用本发明的可植入材料治疗的典型适应症 包括但不限于同种异体排斥、异种排斥、与移植组织或器官相关的 缺血-再灌注损伤、和重复治疗过程。重复治疗过程包括，例如，在 不同血管部位复发的动脉粥样硬化，这需要反复干预和反复补充注 射胰岛细胞。对于本发明，血液是一种组织类型，并且由于上述所 有原因，输血接受者可能获益于本发明的治疗。类似地，基于免疫 学的疾病与受益于上述治疗方案的细胞、组织和/或器官移植有关。补体依赖的细胞毒性除了如上所述减少、调节或消除先天免疫应答和/或获得性免疫应答以外，本发明的可植入材料也可以减 少、调节或消除补体级联的严重程度和补体激活的炎症副作用。例 如，使用本发明的可植入材料减弱补体级联减少了移植组织或器官 的补体介导的细胞裂解，由此改善了移植功能障碍并且延长了成功 治疗的持续时间。介入治疗如本文教导的，本发明可以调节已经存在的免疫应 答以及未来由于后来较早暴露于免疫原而引起的应答的严重性或强减少超敏反应的发作来插入可植入材料。记忆应答的抑制可以避免 例如可能危害患者器官健康的进一步的生理损害。在已经存在病症 如自身免疫病的情况下，本发明可以阻止不减弱的免疫攻击对患者 组织或器官的破坏作用。本质上，这些患者持续暴露于攻击性免疫 原，其免疫应答失去控制地放大，导致严重的、通常致命的疾病结 果。尽管自身免疫病可以与攻击性免疫原的连续激发相比，但是可 以类似地考虑其他临床适应症。例如，如上所提示的，同系或非同 系移植物的接受者经历连续激发。移植物的补充，例如随时间推移 恶化的肾胰岛细胞，构成连续激发。继发梗塞或继发血管损伤可以 被视为连续激发。另外一个实例是例如但不限于脉管炎的疾病。使 用本发明的材料和方法可以有效地控制上述任 一'清况。代替的免疫抑制剂如本文其他部分所述，预期应用本发明的 可植入材料至少有效地抑制T细胞活化，使得消除或显著减少了应 用有害免疫抑制剂的需要。然而，也预期某些类别的患者，如易感 高度恶化的免疫应答的患者，可以用可植入材料和免疫抑制剂两者 进行治疗。本发明的可植入材料当在同系或非同系组织移植之前或 同时应用时，可以允许降低免疫抑制剂的剂量，如果是必要的，控 制潜在的移植物排斥应答。给移植物接受者施用强免疫抑制剂，例如，环孢素A、他克莫 司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、吗替麦考酚酯、来氟米特、糖皮质激素、细胞抑制剂、硫唑。票呤和泼尼松，以抑制T细胞活化并且 增加移植物存活的可能性。然而，施用强免疫抑制剂增加了癌症和 感染的危险，并且引起其他副作用的危险，包括高血压、血脂异 常、高血糖症、溃疡病和肝及肾损伤。本发明可以允许更谨慎的和 危险性更低的这些药剂的给药方案。另外， 一般给器官接受者施用 的免疫抑制剂可以在施用本发明的可植入材料之前、同时和/或之后 施用。例如，可植入材料可以扩大免疫抑制剂的有效效果，同时使 这些药剂在其免疫系统被过度刺激或过度致敏的接受者中的危险最 小化，也许缩短实际达到免疫调节的时间。在某些实施方案中，进 一步预期免疫抑制剂的剂量低于在不存在可植入材料时 一 般施用的 剂量，由此使接受者接触较低毒性剂量的免疫抑制剂。改变免疫应答的时程在本发明的一个优选实施方案中，施用 基质锚定的和/或包埋的内皮细胞，以减少或延迟免疫或炎症应答。 不需要认为可植入材料完全消除免疫或炎症应答才是有效的。这些 材料只需要改变应答的时程，例如通过缩短免疫或炎症应答的持续 时间，或者将急性炎症应答减为慢性炎症应答。延迟免疫或炎症应 答允许同时或稍后施用治疗，以在不存在免疫或炎症应答的条件下 有效地治疗接受者，和/或延长移植物接受的持续时间。因此，不利 免疫应答的严重程度的任何延迟或降低在临床上有益于患者。此外，本发明的可植入材料也可以用来控制或减少与导入患者 内的任何外源异物或外来物质或任何形式的外源刺激有关的免疫应 答和炎症反应。本发明涉及天然存在的外源免疫原。本发明也涉及 外源免疫原，包括但不限于药剂、毒素、手术植入物、传染物和化 学药品。对于本发明，外源免疫原可以是外源刺激，例如但不限于激。例如，合成移植材料，如合成PTFE 动静脉移植物，或其他合 成手术材料或假肢器官装置，可以在宿主中诱导异物反应。在植入合成材料之前或同时给患者应用本发明的可植入材料也可以减少或者消除这种类型的免疫或炎症应答。植入后应用也是有效的。减少 宿主中的任何异物反应改善了治疗的总体功能和/或结果。一般性考虑因素。在本发明的某些实施方案中，在施用可植入 材料之前、同时和/或之后施用其他治疗剂。例如，根据需要植入物 的临床适应症，也可以向可植入材料内掺入细胞因子或生长因子， 包括可以减弱免疫相关体液或细胞事件或组织相关的生物化学级联 的试剂。其他类型的治疗剂包括可以促进锚定和/或包埋在可植入材 料内的细胞寿命的那些治疗剂和/或可以延迟易蚀生物相容性基质在 植入后的生物侵蚀的试剂。上述任一种可以局部施用也可以全身施用；如果是局部施用，则某些试剂可以包含于可植入材料内，或者 由细胞本身作用。施用考虑因素。如本文所预期的,本发明的可植入材料可以递 送至或置于任何相容的解剖部位，只要在该部位的状况不导致可植 入材料的机械类型或物理类型的破坏或过早的破裂或者另外地危害 可植入材料的物理完整性或功能性。例如，本发明可以皮下、血管 周或腹膜内定位。 一个优选的部位是皮肤袋。其他优选部位可以是 血管周或非血管周。可植入材料可以定位于邻近或接触器官或管状 解剖结构，该结构可以是血管或非血管结构。本发明可以递送至任 何相容的部位，用于系统调节体液或细胞免疫应答，或局部调节炎 症反应，或此两者。可才直入材料的某些优选实施方案在生物腐蚀之 前可以在植入部位存在至少约56-84天，优选大约至少7天，更优 选大约至少14天，甚至更优选大约至少28天，最优选长于大约28 天。当准备递送至接受者时，示例性的柔性平面形式的可植入材料为 1x4x0.3 cm (1.2 cm3)的无菌片，优选地大约5-8xl05、优选地至少约 4xl05细胞/cm3，至少约卯％活细胞，例如，来源于单个尸体供者的 人主动脉内皮细胞，每立方厘米，在大约45-60 ml、优选大约50 ml 内皮生长培养基(例如，不含酚红和不含抗生素的内皮生长培养基 (EGM-2))中。当使用猪主动脉内皮细胞时，生长培养基也是不含酚红的EBM-2,但是补充了 5% FBS和50 |ag/ml庆大霉素。在本文所述的某些实施方案中，本发明的可植入材料是含有微 粒生物相容性基质的可流动组合物，该基质可以是凝胶、泡沫、悬 浮液、颗粒、微载体、微胶嚢或其他可流动的材料的形式。本文涉 及用于注射型或输注型递送装置的任何非固体可流动组合物。在某 些实施方案中，可流动组合物优选地是保持形状的组合物。本文涉 及的在可流动型微粒基质之中、之上或之内含有细胞的可植入材料 可以配制用于任何注射型递送装置，该装置的内径范围从大约22号 到大约26号，并且能够递送大约50 mg可流动组合物，该组合物含 有在大约1至大约3 ml中优选含有大约1百万个细胞的微粒材料。根据当前优选的 一个实施方案，可流动组合物包含生物相容性 微粒基质，如Gelfoam⑧颗粒、Gelfoam②粉末或粉末化的Gelfoam (Pfizer Inc., New York, NY)(下文称为"Gelfoam颗粒")，这是一种从 猪皮明胶衍生的产物。根据另一实施方案，微粒基质是Cytodex-3 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)农i载体，它是由与交联葡聚糖 基质偶联的变性胶原组成。血管内施用。可流动组合物也可以通过腔内或血管内途径施 用，即使最终沉积部位不在腔内。例如，可以通过任何能够插入血 管内的装置递送组合物。可以利用内窺镜引导系统将递送装置定位 在施用部位，包括，例如，血管内超声(IVUS)、彩色多普勒超声、双路超声、其他常规超声、血管造影术、磁共振血管造影术(MRA)、磁共振成像(MRI)、 CT扫描、焚光透视法，以确定本领域 已知的支架和/或其他内窥镜引导系统的位置。另外，也可以利用触 i貪定位施用部位。在一种情况中，腔内递送装置装备有穿过血管腔壁到达血管非 腔表面的横穿或穿透装置。然后将可流动组合物沉积在非腔表面 上。本文预期非腔(也被称为腔外)表面可以包括任何位于血管外 部的部位或血管的任何血管周表面，或者可以在(例如)血管外 膜、基质或内膜内。对于本发明，非腔或腔外的含义是除腔内表面以外的任何表面。也预期在血管周间隙内的沉积可以通过腔内递送 装置来实现，并且不需要接触所穿过血管的腔外表面。本文涉及的穿透装置可以允许，例如，以所需几何结构排列的 单递送点或多递送点实现可流动组合物向血管非腔表面的递送，而 不^C坏损伤或患病靶部位。多递送点例如可以排列为环形、牛眼形 或线性阵列排列。穿透装置也可以是支架穿孔器形式，例如但不限 于包括多个递送点的嚢形支架。经皮施用。可流动组合物可以通过使用针头、导管或其他合适 的递送装置的经皮途径递送。可流动组合物可以在使用引导方法的 同时经皮递送，以促进向需要治疗的部位的递送。引导步骤是任选 的。可以利用内窥镜引导系统定位腔外施用部位，例如，包括血管内超声(IVUS)、彩色多普勒超声、双路超声、其他常规超声、血管 造影术、磁共振血管造影术(MRA)、磁共振成像(MRI)、 CT扫描荧 光透视法。另外，也可以利用触诊定位施用部位。在进入血管周或 腹膜间隙后，例如，医生可以将可流动组合物沉积在任何非腔表面 上或任何非腔部位。引导或鉴定步骤是任选进行的，不是实施本发 明的方法所必需的。在另一个实施方案中，将可植入的可流动组合 物局部递送至手术暴露的腔外部位。还涉及通过输注施用。输注可以作为大丸剂型剂量或较慢型逐 步剂量实现。熟练技术人员将认识到每一种的优点，并且将了解使 用一种或其他施用模式的情况。所需要的是常规临床输注装置。实验材料与程序材jf斗的准备和评^介。如本文其他部分详细描述的,猪主动脉内 皮细胞和人主动脉内皮细胞单独分离并培养。然后将培养的细胞接 种到三维生物相容性基质如Gelfoam中，并且孵育直到细胞达到汇 合。按照以前所述的方案评价锚定和/或包埋于基质内的内皮细胞的 功能性。在大鼠中内皮细胞谦导的免疫反应。54只Sprague-Dawley大鼠在皮下背间区接受5xl05猪主动脉内皮细胞移植物，其作为 Gelfoam-包埋的细胞、盐水悬浮的细胞沉淀或者作为与空Gelfoam 相邻的沉淀。在切开背部后，以钝刀技术建立小皮下腔，并且仔细 插入Gelfoam-包埋的细胞或注射细胞。空对照Gelfoam基质在植入 之前在完全DMEM中孵育。从0-56天连续收集血清，等分并贮存 于-70。C。在小鼠中内皮细胞诱导的免疫反应。36只B6小鼠在皮下背间 区接受5xl05猪主动脉内皮细胞植入物，其作为Gelfoam-包埋的细 胞、盐水悬浮的细胞沉淀或者作为与空Gelfoam相邻的沉淀。空对 照Gelfoam基质在植入之前在完全DMEM中孵育。为了评^介基质包 埋对免疫记忆的影响，在第100天用相同的处理激发相同组的小 鼠。从每次植入过程后的0-90天连续收集血清，等分并贮存于-70。C。每组4只小鼠分别在第28天和第128天处死进行脾细胞分 离。在连续激发的小鼠中内皮细胞诱导的免疫反应。从Large White 猪主动脉分离的猪主动脉内皮细胞(PAE)如前所述接种于Gelfoam 上，或者在聚苯乙烯板上生长至汇合。B6-小鼠在第0、 21、 35天在 皮下背间区接受注射5xl05 PAE (n=24,预先致敏的小鼠)或盐水 (n=24,幼稚小鼠)。在第42天，每组12只小鼠接受5xl(^基质包埋 的或游离的PAE。在接下来的90天研究宿主免疫反应和内皮细胞的 裂解损伤。从第42-132天连续收集血清，等分，并贮存于-70。C。在 第70天处死每组6只小鼠，其余的在第132天处死进行脾细胞分 离。实验包埋在三维基质中的内皮细胞以三维模式生长。 进行扫描电子显微镜检查来评价在生物相容性基质内生长的内 皮细胞的生长才莫式。包含锚定和/或包埋在Gelfoam基质内的内皮细 胞的可植入材料用PBS漂洗，分成0.5 cm的标本，用3%戊二醛(Sigma Chemicals; St. Louis, MO)固定90分钟，并转移到蒸馏水中。 在1% Os04中孵育后，标本用蒸馏水漂洗，在乙醇系列溶液(30、 50、 75、 80、 85、 90、 95和100%)中以15分钟间隔脱水，并且以 30分钟间隔用六甲基二硅氮烷(Sigma) (50%、 100%)脱水。标本在 100% HMDS中蒸发过夜，之后在血浆包被器(Edwards Coating System, U.K.)中用金包被。在5-kV加速电压下获得扫描电子显微照 片(Stereoscan 240, Cambridge Instruments, U.K.)。扫描电子显微镜检查揭示猪主动脉内皮细胞沿Gelfoam-基质间 隙的3-D生长模式。在2周的培养过程中，细胞存活力保持在 95%。实验数据表明Gelfoam-包埋的细胞的体内免疫接受性是基质中 内皮细胞的三维生长模式的效果，而不是单独生物相容性基质存在 的效果。 一般来说，在组织工程生物材料内组合的植入的细胞或蛋 白质作为抗原免疫刺激的来源。另外，Gelfoam基质是免疫中性的， 并且其本身没有免疫保护效果，因为单独注射与Gelfoam基质相邻 的猪主动脉内皮细胞与注射游离内皮细胞诱发相同的免疫应答。内 皮细胞的性质贡献于用基质包埋的细胞制品观察到的这种免疫调节 的独特形式，特别是，这些细胞具有方向性与基膜相互作用的基 面和与流动的血液和细月包成分相互作用的上表面。tu居冲是示内皮细 胞功能是依赖于锚定和密度的。系统疾病如高血压、脂质和葡萄糖 代谢的改变、或暴露于毒素改变了依赖于锚定的调节和针对内皮的 免疫应答的幅度和性质，完整内皮细胞从基质粘附的到游离的表型 转化导致血管疾病的发病。包括共刺激和粘附分子在内的表面分子的调节体外内皮细胞上共刺激和粘附分子的表达水平通过流式细胞术 定量。使用FITC-和PE-标记的抗体，包括小鼠抗猪P-选择素抗体、 小鼠抗猪CD31 (克隆LCI-4)、抗人CD54 (克隆15.2)、抗人CD62E (克隆1,2B6)、抗人CD58 (克隆1C3)、抗人CD80 (克隆BB1)、抗人 CD86 (克隆2331)、抗人4-lBB-配体(PE-标记的，克隆C65-485)、大鼠抗小鼠IgG!(克隆A85-l)和抗小鼠IgM (克隆R6-60.2)、兔抗大鼠 IgG、兔抗人CD40、山羊抗兔IgG、小鼠抗人CD 106 (克隆 1.G11B1)、小鼠抗人HLA-DP，DQ,DR (克隆CR3/43)、小鼠抗I类 MHC (IgG2a)、大鼠抗小鼠IgG^、小鼠抗人ox40-配体、小鼠抗人程 序性死亡配体1 (PD-L1，克隆MIH1)、抗人PD-L2 (克隆MIH18)和 抗人诱导型共刺激因子配体(ICOS-配体，克隆MIH12)。内皮细胞单层或包埋在Gelfoam中的内皮细胞在完全培养基中 培养后收获(CD31、 CD58、 PD-L2、 ox40-配体、MHC-I)，用100 U/ml TNF画a (CD54、 CD80、 CD86、 CD106、 E-选才奪素、P-选4奪素) 或200 U/ml TNF-a (ICOS-L)刺激24小时，用10 pg/ml LPS刺激24 小时(4-lBB-配体)，1000 U/ml IFN画y (MHC-II、 CD40)或100 U/ml IFN-y和25 ng/ml TNF-a (PD-Ll)刺激48小时。吸出培养基，用PBS 洗涤细胞。单层在1.0 mM PBS/EDTA中孵育5分钟，通过轻轻振摇 破坏。Gelfoam用I型胶原酶消化，显示对表面分子的表达没有影 响。洗涤细胞悬浮液，将3xl05细胞重悬浮在FACS緩冲液(含有 0.1% BSA和0.1%叠氮钠的PBS, Sigma Chemicals; St. Louis, MO) 中。内皮细胞与第一抗体在4。C下孵育30分钟。必要时，将细胞重 悬浮在FACS緩冲液中，用第二抗体在4°C下染色30分钟。然后洗 涤细胞，在1%低聚甲醛中固定，并使用FACScalibur设备和 CellQuest软件(Becton Dickinson, San Diego, CA)通过流式细胞术分析 104细胞。包埋在三维生物相容性基质中的猪主动脉内皮细胞改变了表面 分子的表达。与在组织培养聚苯乙烯板上生长的猪主动脉内皮细胞 的CD58表达相比，包埋于Gelfoam中的猪主动脉内皮细胞中CD58 的组成型表达显著下降(-60.4%, p<0.002)。经FACS分析，与生长 在聚苯乙烯板上的猪主动脉内皮细胞相比，基质包埋的猪主动脉内 皮细胞上的共刺激和粘附分子和MHC II类的上调也有显著降低 (CD80: -64.9%, p<0.002; CD86: -65.40/o, p<0,001; CD40: -53.8%, p〈0.005; ICAM-1: -68.7%, p〈0.001; VCAM-1: -53.9%, p〈0.005; E-选择素-71.8%， pO.0005; P-选4奪素-79.9%, p<0.0002; MHC II: -78.3%， p<0.0002) 。 MHCI类和CD31的表面表达没有显著性差异。类似地，包埋在三维生物相容性基质中的人主动脉内皮细胞改 变了表面分子的表达。在3D基质中生长的人主动脉内皮细胞表现出 显著降低的CD58表达谱，并且显示共刺激和粘附分子的上调明显 缺乏。然而，在包埋在Gelfoam中的人主动脉内皮细胞和在组织培 养聚笨乙烯板上生长的人主动脉内皮细胞之间，ICAM-1、 E-选择 素、MHCI和CD31表达水平没有显著性差异。此外，PD-L2的组成 型表达(100%, p^0.73)和PD-L1的上调(86%， p^0.09)没有显著性差 异。因此，包埋在三维生物相容性基质中的内皮细胞减少了共刺激 和粘附分子。基质包埋的猪主动脉内皮细胞和人主动脉内皮细胞在 活化的内皮细胞上表现出显著较低的共刺激和粘附分子表达水平。也通过共焦显微镜检查在体外植入物中，以及通过免疫组化分 析在大鼠体内，分析了 CD31、 MHC-II、 CD58、 ICAM-1和E-选择 素的表达。将内皮细胞接种于盖玻片上或包埋于Gelfoam基质中。 在用PBS洗涤并用3%低聚曱酪固定20分钟(盖玻片)或过夜(Gelfoam)后，用大鼠血清(Bethyl Laboratories, TX)阻断内皮细胞 30分钟。在用抗体染色之前，将Gelfoam基质切成2 mm厚的薄 片。内皮细胞用适量的抗体染色1小时(盖玻片)或2小时(Gelfoam),并且通过Zeiss LSM510激光扫描共焦显樣i镜分析。 染色强度用Image J寿欠件(National Institute of Health, Bethesda, MD)定 量，并且对CD31表达标准化。共焦显微镜4全查显示在基质包埋的猪主动脉内皮细胞上CD58、 ICAM-1 、 E-选冲奪素和MHC-II的表达水平降低，而CD31表达保持 不变(p0.02)。细胞-基底锚定对MHC-I的表达没有影响，但是显著 减弱了预期的MHC-II分子的上调。包埋在Gelfoam中的猪主动脉内 皮细胞仅引起异种004+ T细胞在体外的适度增殖，这类似于在游离 猪主动脉内皮细胞中阻断MHC-II结合所见的应答。体内免疫应答的调节基质包埋的猪主动脉内皮细胞显示涉及P-和E-选择素的白细胞募集中的起始事件的较低刺激，以及与免疫炎症部位处的T细胞募 集紧密相关的VCAM-1的较低刺激。基质包埋下调全部的普通和种 特异性共刺激分子，包括第一次关于内皮细胞表达和4-lBB-配体抑 制的报道。同时，作为抵销抑制分子起作用的B7家族成员PD-L1 和PD-L2的表达和上调在基质包埋后保持完整。这些体外发现翻译应。也在植入后第28天对每组6只大鼠对植入的细胞应答进行了免 疫组化评价。切割5微米的石蜡切片，通过在0.01 mol/L柠檬酸緩 冲液，pH 6.0中樣吏波炉加热10分钟进4亍抗原一是耳又。白细胞、T和B 淋巴细胞通过亲和素-生物素过氧化物酶复合法鉴定。第一抗体是小 鼠抗大鼠CD45R0,用于鉴定白细胞(Research Diagnostics; 1:50稀 释)，小鼠抗大鼠CD4,用于鉴定CD4+-T细胞(Pharmingen; 1:10稀 释)，和小鼠抗大鼠CD8,用于鉴定CD8+-T细胞(Pharmingen; 1:50 稀释)。大鼠脾脏用作阳性对照，小鼠IgG作为阴性对照。第一抗体 在室温下应用1小时，所有切片都用Mayer苏木精溶液(Sigma)复 染。检查6个不重叠的视野(x600)。将每组的结果平均。与注射的游离PAE或注射的与三维生物相容性基质相邻的PAE免疫应答。包埋在Gelfoam中的猪主动脉内皮细胞显著减少猪主动 脉内皮细胞特异性IgG在体内的形成。在接受游离猪主动脉内皮细 胞和注射与Gelfoam相邻的猪主动脉内皮细胞的大鼠中，血清细胞 因子(MCP-1、 IL-6、 TNF-a)产生，在植入后5天达到峰值。相反， 在应用基质包埋的猪主动脉内皮细胞的动物中，细胞因子水平不提 高到背景以上。免疫组织学研究揭示了在第28天细胞浸润到植入/注射部位之内 和周围的证据。在注射游离猪主动脉内皮细胞和注射与Gelfoam相邻的猪主动脉内皮细胞后，在植入/注射部位富含T细胞，而在移植物周围也发现了大量CD45R0 P曰性白细胞。相反，植入物周围的组 织和Gelfoam-猪主动脉内皮细胞本身比其他细胞植入组浸润少4.5 倍的白细胞和CD4+-T细胞，和少3.3倍的CD8+ T纟田月包。植入的猪主动脉内皮细胞特异性的循环大鼠免疫球蛋白也通过 流式细胞术检测。使用0.25%胰蛋白酶/0.04% EDTA从组织培养聚 苯乙烯板上分离下2xl()S猪主动脉内皮细胞，沉淀，洗涤，重悬浮在 FACS緩冲液中，与来自接受大鼠的血清在4。C下孵育30分钟(在 FACS緩冲液中1:10稀释)。用冷FACS緩冲液洗涤两次后，细胞与 FITC偶联的抗大鼠IgG —起孵育。在暗处4°C將育30分钟后，再 次用冷FACS緩冲液洗涤样品两次，在1%低聚曱醛中固定，使用 FACScalibur设备和CellQuest软件通过流式细胞术分析104细胞。大 鼠IL-6 (R&D Systems, MN，才全测限定为21 pg/ml)、大鼠TNF-a (R&D Systems,检测限定<5 pg/ml)和大鼠MCP-1 (Amersham,检测限 定<5 pg/ml)的血清浓度在植入后第0、 5、 12、 28天通过ELISA定 量。同时通过相同的ELISA进行测量，以避免测定条件的变化。蛋白的水平也通过流式细胞术进行测定。使用0.25%胰蛋白酶/0.04% EDTA从细胞培养板上分离下与植入的细胞来自同一抹的2xl()S猪主 动脉内皮细胞，沉淀，洗涤，重悬浮于FACS緩冲液(PBS， 1% FCS， 0.1%叠氮钠)中。这些细胞然后与来自接受小鼠的血清在4。C下孵育 60分钟(在FACS緩冲液中1:10稀释)。用FACS緩冲液洗涤两次 后，细胞分另'J与FITC偶联的大鼠抗小鼠IgG2a (Southern biotechnology, AL)、 IgGi (克隆A85-l)或IgM (克隆R6-60.2, BD Pharmingen, CA)—起孵育。在暗处4°C孵育30分钟后，再次用冷 FACS緩冲液洗涤样品两次，在0.25 ml 1%低聚曱醛中固定，使用 FACScalibur设备和CellQuest软件通过流式细胞术分析104细胞。与注射游离的PAE和注射与三维生物相容性基质相邻的PAE相 比，包埋在三维生物相容性基质中的内皮细胞降低了小鼠体内Th2-引导的免疫应答。为了表征猪主动脉内皮细胞特异性抗体应答的程度和性质，在作为Gelfoam-包埋的细胞、盐水悬浮的细胞沉淀或作 为与空Gelfoam相邻的沉淀在皮下背间区才直入猪主动脉内皮细胞 后，从小鼠中采集血清。植入后的抗猪主动脉内皮细胞IgG!和IgM 水平在4妻受猪主动脉内皮细胞沉淀或与空Gdfoam相邻的猪主动脉 内皮细胞沉淀的小鼠中类似于以及显著高于包埋在Gelfoam中的猪 主动脉内皮细胞的接受者(图1A和1B)。在小鼠植入基质包埋的猪主 动脉内皮细胞12天后，抗猪主动脉内皮细胞IgG^有短暂的和较少 的升高(p0.005)，这在4妻受沉淀的猪主动脉内皮细胞或空Gelfoam 植入物以及注射沉淀的猪主动脉内皮细胞的小鼠中没有见到(图 1C)。图1A、 1B和1C图示了在皮下注射游离PAE、 Gelfoam生长的 内皮细胞后，或者在伴随注射单独的与Gelfoam相邻的PAE后，通 过流式细胞术测定的小鼠中的循环PAE-特异性IgG。来自所有小鼠 的结果的图示(至植入后第28天每组n=18,第56-100天每组 n=12)证明在基质包埋的PAE植入和其他形式的PAE植入之间 IgG,(图1 A)和IgM (图1B)具有统计学显著性差异。在植入基质包 埋的PAE的12天后，抗PAEIgG2a短暂且少量的升高(图1C)。与在组织培养板上生长的未刺激的HAE相比，基质包埋的 HAE表达显著高水平的细胞因子信号的抑制性信号分子抑制剂 (SOCS)3 (0.007±0.001对0.003土0.0003 RU， p<0.001)。因此，用IFN-y刺激导致在基质包埋的HAE上显著较低的MHC II表达(37土5对 68±4%， p<0.001)。尽管IFN-Y-受体表达水平未变(p4.39),但是基 底粘附减少了 IFN-y4秀导的Janus激酶1和2和转录-1的信号传导剂 和激活剂的磷酸化。然后在基质包埋的HAE中干扰素调节因子-l、 CIITA (0.01士0.004对0.03±0.004 RU， p〈0.005)和HLA-DR (0.17±0.04 对0.27士0.05 RU， p〈0.02)的表达减少。基质包埋的HAE上MHC II 表达的减少导致诱导同种T细胞增殖的能力减弱(4152士255对 19619±327 cpm, p<0.001)。有意思的是，包埋在三维基质内的内皮细胞几乎完全减少了观察到的Th2-引导的免疫应答，减弱了裂解活性，并且减弱了幼稚T细胞向效应细胞的分化。根据以前的结果，这些数据提示细胞的Gelfoam包埋通过在T细胞水平上免疫活化、通过降低MHC II类分 子以及共刺激和粘附分子的表达水平而提供免疫保护。 淋巴细胞增殖和裂解活性的调节。在聚苯乙烯孔中生长的或者包埋在Gelfoam中的猪主动脉内皮 细胞以5xl()4细胞/孔接种于96孔板中，并用40 ng/ml猪INF-y刺激 48小时，随后用丝裂霉素C(Sigma， 50 pg/ml， 30分钟)处理，以防 止背景增加。人CD4+淋巴细胞利用CD4+ T细胞分离试剂盒II (Miltenyi Biotec,德国)按照生产商的说明通过负选才奪纯化，并且以 2xl()5细胞/孔添加。在一些实验中，针对HLA-DP、 DQ、 DR的鼠抗 体阻断通过MHC II类分子的活化。在第6天通过16小时的脉冲(l |aCi/ml, Amersham)测定3[H]-胸苷掺入。丝裂霉素处理的猪主动脉内 皮细胞、培养基或单独的T细胞的胸苷摄取用作阴性对照。为了评价小鼠体内的淋巴细胞裂解活性，进行脾细胞的分离和 评价。植入猪主动脉内皮细胞后第28天，在层流柜中无菌分离每组 4只小鼠的脾脏。将器官切成几片。通过配有19号针头的无菌注射 器抽吸悬浮液几次，以进一步分散团块。之后，使悬浮液通过200 iam尼龙筛网。用RPMI (含有2 mM L-谷氨酰胺，0.1 M HEPES, 200 U/ml青霉素G, 200 (ig/ml链霉素和5%热灭活的小牛血清，Life Technologies)洗涤细胞两次，并且立即使用。为了进一步在小鼠体内评价淋巴细胞裂解活性，进行钙荧光素-AM释放测定。来自与注射的细胞相同抹的猪主动脉内皮细胞以 2xl0V孔的终浓度重悬浮在完全培养基中，并与15 jiiM钙荧光素-AM (Molecular Probes)在37°C和偶尔搅动下孵育40分钟。用完全培养 基洗涤两次后，加入终浓度为5xl0V孔的脾细胞作为效应细胞。最 后20分钟，检测只含完全培养基中的靶细胞的6个重复孔和在培养 基加2% Triton X-100中含有靶细胞的6个孔中的自发和最大释放作为对照。在37°C/5% C02下將育3小时后，使用Fluoroskan Ascent FL双扫描农么量滴定^反荧光计(Thermo Electron Corporation, TX)4全测 样品。数据表示为任何荧光单位(AFU)。特异性裂解按照公式[(检 测释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]x 100计算。殖。分离的人CD4+ T细胞对在组织培养板中生长的或包埋在 Gelfoam中的未处理的和INF-y处理的猪主动脉内皮细胞(40 ng/ml， 48小时)的增殖应答通过胸苷掺入法来测定。当猪主动脉内 皮细胞被基质包埋时，在暴露于用INF-y预处理的猪主动脉内皮细胞 后注意到的强CD4+ T细胞增殖几乎消除(17087.2士3749.75对 5367.8±1976.3 cpm, p<0.01)。 MHC II抗体的存在将'淋巴细胞响应 INF-Y处理的猪主动脉内皮细胞的增殖阻断了 65%,达到与基质包埋 的猪主动脉内皮细胞相当的水平。在6天培养后(61士13 cpm)以及单 独培养分离的CD4+T细胞后(83士27cpm)，丝裂霉素处理的猪主动脉 内皮细胞不显示显著的增殖。类似地，与注射的游离PAE和注射的与三维生物相容性基质相 邻的PAE相比，包埋在三维生物相容性基质中的内皮细胞降低了小 鼠体内的淋巴细胞裂解活性。在猪主动脉内皮细胞植入后28天分离 来自3个不同治疗组的小鼠脾脏的淋巴细胞。供体猪主动脉内皮细 胞用钙焚光素-AM标记，在与淋巴细胞共孵育后通过钙荧光素荧光释 放试验测定内皮细胞裂解。与植入猪主动脉内皮细胞-Gelfoam构建 体后从小鼠中分离的淋巴细胞(22.4±4.2%， p<0.05;图2)相比，注 射纯猪主动脉内皮细胞后(36.8±3.9%)和伴随注射猪主动脉内皮细胞 后(33.9±4.7%)，来自小鼠的淋巴细胞显示最高的裂解活性。图2图示了来自接受游离PAE的小鼠的脾细胞，显示与基质包 埋的PAE相比显著增加的裂解活性。用游离PAE激发小鼠显著提高 了分离的脾细胞的异种裂解活性。Th2细胞因子产生细胞和细胞因子的调节。免疫斑点板(Millipore， Bedford, MA)用5 |ug/ml抗小鼠干扰素(IFN)-y、抗小鼠白介素(IL)-2、抗小鼠IL-4或抗小鼠IL-10 mAb (均 来自BD Pharmingen)在无菌PBS中包被过夜。然后将板用不含酚 红、含有10%加热灭活的小牛血清的完全RPMI培养基封闭2小 时。然后将脾细胞(0.5x106，在100 |Lil完全RPMI培养基中)和用于植 入的猪主动脉内皮细胞的相同抹(0.5x106,在100 pl完全RPMI培养 基中)置于每个孔中，在37°C和5% C02下培养48小时。用去离子 水洗涤然后用含有0.05% Tween的PBS (PBST)洗涤后，分别加入2 |ug/ml的生物素化的抗小鼠IFN-y、抗小鼠IL-2、抗小鼠IL-4或抗小 鼠IL-10 mAb (均来自BD Pharmingen)过夜。然后用PBST洗板三 次，接着与辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素(BD Pharmingen)孵育 1小时。用PBST洗涤4次接着用PBS洗涤后，用3-氨基-9-乙基-口卡 唑(BD Pharmingen)将板显色。得到的斑点在计算4几辅助酶联免疫斑 点图像分析仪(Cellular Technology Ltd., ORT)上计数。从异种应答中 减去单独具有培养基、脾细胞或猪主动脉内皮细胞的孔中的斑点数，说明数据分析中的背景。与注射的游离PAE和注射的与三维生物相容性基质相邻的PAE 相比，包埋在三维生物相容性基质中的内皮细胞减少了小鼠体内的 Th2细胞因子产生细胞。通过ELISPOT试验测定从植入不同形式的 猪主动脉内皮细胞后的动物回收的脾细胞中Thl细胞因子(IFN-y, IL-2)和Th2细胞因子(IL-4， IL-10)产生细胞的频率。在植入后第28天， 与从接受游离猪主动脉内皮细胞或与空Gelfoam相邻的猪主动脉内 皮细胞的小鼠中分离的脾细胞相比，在从接受基质包埋的猪主动脉 内皮细胞的小鼠中分离的脾细胞中，Th2细胞因子产生细胞的频率 显著较低(IL-4: p<0.0001， IL-10: p<0.001;图3A)。相反，从三个组分 离的脾细胞中，Thl细胞因子产生细胞的频率没有显著性差异(图 3B)。图3A图示了在小鼠植入游离PAE、基质包埋的PAE或邻近空 Gelfoam注射PAE后，接受者中异种抗原特异性细胞因子产生细胞 的频率。在第28天在三个组之间异种反应性IFN-y和IL-2产生T细胞的频率没有显著性差异。然而，用基质包埋的PAE激发引起异种 抗原特异性IFN-y和IL-2产生T细胞显著增加。图3B示出了分别在第一次植入和第二次植入28天后每个治疗 组一只小鼠的代表性ELISPOT孑L。检测了响应PAE的IL-4产生。 通过计算机辅助图像分析测定每个孔中的IL-4斑点数。图3C图示了在第28天，游离PAE的接受者比基质包埋的PAE 的接受者显示显著增加的异种反应性IL-4和IL-10产生T细胞的频 率。用游离PAE或邻近空Gelfoam基质注射PAE进行激发在第128 天显著提高了异种抗原特异性IL-4和IL-10产生T细胞的频率。效应细力包的调节将从接受者中回收的脾细胞以2xl06/ml的浓度重悬浮在FACS 緩沖液中。细胞用抗-CD4 FITC (克隆L3T4)、抗CD8 FITC (克隆 Ly-2)、抗-CD44 R-PE (克隆Ly-24)和抗-CD62L别藻蓝蛋白(克隆Ly-22)和同种型对照(均来自BD PharMingen)染色。如前所述列举表达 CD44《和CD62L "的CD4+和CD8+效应细胞。包埋在三维生物相容性基质中的内皮细胞在小鼠体内阻止异种 排斥。为了确定基质包埋对异种反应性CD4+和CD8+ T细胞的产生 和功能的影响，我们测量了在植入基质包埋的猪主动脉内皮细胞、 植入盐水悬浮的细胞沉淀或在植入28天后作为与空Gelfoam相邻的 沉淀后，在处理的小鼠脾脏中发现的CD62L低CD44 *的数目(图4)。 CD4+和8+效应细胞已经被确定地鉴定为CD62L "CD44 *细胞。与接 受基质包埋的猪主动脉内皮细胞的小鼠相比，在游离猪主动脉内皮 细胞接受者和接受与空Gelfoam相邻的猪主动脉内皮细胞的小鼠 中，CD62L低CD44 *细胞的百分比显著增加；在所有组中， CD4+CD62L低CD44 *T细胞的频率高于CD8+效应细胞(比值为1.7-2.3)。图4A图示在接受游离PAE的小鼠中显著增加的CD4+和CD8+ 效应细胞。在第28天和第128天，CD4+效应细胞数量超过CD8+ T-细月包。从小鼠中回收的CD4+脾细胞使用CD62L和CD44作为效应T细胞的标记通过流式细胞术进行分析。来自在植入28天后4妄受游离 (a)、基质包埋的(b)或与Gelfoam相邻的PAE (c)的小鼠的代表性图。图4B图示接受游离PAE的小鼠在激发后其效应细胞的扩充增 加，而基质包埋的PAE则没有。 异种排斥和免疫记忆的调节。包埋在三维生物相容性基质中的内皮细胞在植入非血管化异种 组织后产生免疫记忆。Thl细胞因子通过下调Th2-引导的体液应答 在阻止异种排斥中起重要作用。在这方面，数据证明组织工程内皮 细胞在激发后可以诱发猪主动脉内皮细胞特异性IgG2a抗体的显著增 加和异种反应性Thl产生脾细胞的显著增加。第一次植入100天后，每组中其余的小鼠用与第一次遇到的相 同的猪主动脉内皮细胞激发。接受盐水悬浮的细胞沉淀或与空 Gelfoam相邻的沉淀的小鼠显示显著的IgGr引导的猪主动脉内皮细 胞特异性抗体应答，超过了在第一次植入过程后观察到的应答(图 5A)。仅观察到微弱的IgM-抗体释放(图5B)。明显不同的是，接受 基质包埋的猪主动脉内皮细胞的小鼠不显示猪主动脉内皮细胞特异 性抗-IgG,和IgM水平增加，而是显示猪主动脉内皮细胞特异性 IgG2a抗体显著释放，这在其他两个小鼠组中不存在(图5C)。图5A、 5B和5C图示了与使用基质包埋的PAE激发相比，用 游离PAE或与Gelfoam相邻的PAE激发小鼠(到植入后第128天每 组n=12，到第156-190天每组n^6)显著增加了 PAE-特异性IgG广抗 体的形成(图5A)。激发对PAE-特异性IgM的形成没有影响(图 5B),在三组之间PAE特异性IgG2a-抗体没有显著性差异(图5C)。与这些结果 一 致，从接受游离猪主动脉内皮细胞或相邻空 Gelfoam注射猪主动脉内皮细胞的小鼠中分离的脾细胞在激发28天 后显示显著提高的裂解猪主动脉内皮细胞的能力，而来自接受第二 次植入基质包埋的猪主动脉内皮细胞的小鼠的脾细胞的裂解能力显 著弱于第一次植入后(图6)。小鼠在再植入猪主动脉内皮细胞后，异种反应性IL-4和IL-10产生T细胞的频率显著增加，Th2产生脾 细胞的频率在用基质包埋的猪主动脉内皮细胞激发后不变。然而， 用基质包埋的猪主动脉内皮细胞激发比第 一植入过程诱导更高频率 的异种反应性INF-y和IL-2产生脾细胞。图6图示了基质包埋或MHC II阻断使暴露于PAE的小鼠脾细 胞的增殖恢复到未剌激的水平。小鼠脾细胞响应INF-y刺激的PAE 增殖。基质包埋的内皮细胞或MHC II抗体的存在将脾细胞响应 INF-y处理的PAE的增殖阻断了大约79%。每个数值表示为平均值 土SD。此外，激发28天后，CD4+效应细胞的百分比在接受游离猪主动 脉内皮细胞的小鼠中进一步增加，在接受与空Gelfoam植入物相邻 的猪主动脉内皮细胞的小鼠中显著增加，但是在接受基质包埋的猪 主动脉内皮细胞的小鼠中保持不变。对于CD8+效应T细胞，相同的 模式是明显的。当与INF-y刺激的基质包埋的内皮细胞孵育时，在体外用PAE 刺激幼稚小鼠脾细胞显示了比游离内皮细胞显著减弱的脾细胞增殖 应答。MHC II抗体的存在使脾细胞响应INF-y处理的PAE的增殖阻 断了 79%,达到与基质包埋的PAE相当的水平。总之，在研究期结束时，接受基质包埋的猪主动脉内皮细胞的 小鼠的脾大小看起来小于其他组(62.9±9.6， 112.7±16.9， 102.5±18.8 mm3; p<0.05 )。因此，在幼稚T细胞和静息内皮细胞之间的同源相互作用可以 在体外和体内导致耐受。这些数据证明在植入非血管化的异种组织后形成免疫记忆。免疫记忆的特征在于抗原特异性IgG,和IgM水 平、脾细胞裂解活性和向效应T细胞分化增加的趋势显著增加。相 反，用内皮细胞基质包埋激发小鼠导致脾细胞裂解能力降低，效应 CD4+和CD8+ T细胞的频率不变。用基质包埋的猪主动脉内皮细胞 激发对于抗-PAE IgG,和IgM的产生没有影响，而IgG2a水平显著提 高。cxxxc趋化分子表达的调节趋化因子和粘附分子在向血管壁补充循环免疫细胞中是关键的。cxxxc趋化分子具有化学趋化和粘附功能，与动脉粥样硬化、心脏同种异体移植物排斥、肾小球肾炎和类风湿性关节炎的发病机理有关。我们通过RT-PCR、 Western印迹法、流式细胞术和ELISA 比较了游离和基质包埋的人主动脉内皮细胞(HAE)之间CXXXC趋化 分子的表达和分泌。用细胞因子刺激的HAE和51Cr标记的自然杀伤 (NK)细胞进行粘附试验。HAE用100 U的TNFa/ml (Sigma)和100 U的IFN國y/ml (Roche) 在37°C下在含有5% C02的潮湿空气中刺激，证明该条件在培养的 内皮细胞中导致最大CXXXC趋化分子水平。流式细胞术内皮细胞单层或在Gelfoam中基质包埋的内皮细 胞在用TNFa和IFN-y刺激指定时间后收获。吸出培养基，用PBS洗 涤细胞。单层在1 mM PBS/EDTA中孵育5分钟，通过轻轻振摇破 坏。Gelfoam生长的细胞用I型胶原酶(Worthington Biochemical, NJ) 消化，其显示对CX3CL1表达没有影响。洗涤细胞悬浮液，3xl0"田 胞在4%低聚甲醛中固定10分钟。在两个洗涤步骤后，将细胞重悬 浮于皂苷緩沖液(0.1%皂苷，0.05% NaN3,在Hanks平衡盐溶液)中， 离心，弃去上清液。然后将HAE与FITC-偶联的小鼠抗人CX3CL1 (IgGl,克隆51637, R&D Systems, Minneapolis, MN)或匹配的同种型 对照(克隆MOPC-31C, Pharmingen)在4°C下孵育45分钟。然后 洗涤细胞，使用FACScalibur设备和CellQuest软件通过流式细胞术 分析104细胞。Western印迹分析通过胶原酶处理从Gelfoam基质上消化细胞 单层或细胞，用PBS緩沖液洗涤，通过与裂解緩冲液(20 mM Tris， 150 mM NaCl, pH 7.5, 1% Triton X-100, 1%脱氧胆酸盐，0.1% SDS和 蛋白酶抑制剂；Roche)孵育制备细胞裂解液。将样品在4-20% Ready Tris-HCl凝月交(BioRad Laboratories, Hercules, CA )上分离。 使用用于CXXXC趋化分子检测的阳性对照，其由缺乏羧基端57个氨基酸的85-到90-kDa形式的重组人CXXXC趋化分子组成(R&D Systems)。然后利用甘氨酸-Tris转移緩冲液将蛋白质转移到PVDF 膜(Millipore， Billerica， MA)上。印迹膜在Starting Block封闭緩沖 液(Pierce, Rockford， IL)中封闭1小时。对于CXXXC趋化分子检 测，封闭的膜与在封闭緩冲液中1:200稀释的山羊抗人CXXXC趋化 分子多克隆抗体(R&D Systems)在4°C下孵育过夜。然后在室温下用 由含有0.05% Tween 20的PBS组成的洗涤缓冲液洗膜三次，然后与 第二抗体在室温下孵育2小时，该第二抗体是在封闭緩冲液中 1:3000稀释的偶联到辣根过氧化物酶上的兔抗山羊IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA ),然后更换洗涤緩沖液5次进行洗 涤。为了检测CXXXC趋化分子带，按照生产商的说明将印迹与化 学发光底物(Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus试剂 盒，Perkin-Elmer, Boston, MA) —起孵育，随后暴露于X-光胶片(Kodak X-Omat Blue XB-1 )。ELISA:在细胞因子刺激后来自内皮细胞单层或包埋在Gelfoam 中的内皮细胞的条件培养基在指定时间期限内收获。分泌的CXXXC 趋化分子用可作为商品获得的酶联免疫吸附测定(ELISA)检测试 剂盒(R&D Systems)来检测。简要地说，96孑L Immulon板(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA )用100 |ul溶于PBS中的4 pg/ml小鼠抗人 CXXXC趋化分子捕获抗体在室温下包被过夜。用洗涤缓冲液(PBS-0.05% Tween-20)洗涤三次后，将板在含1%牛血清白蛋白-5%蔗糖的PBS中封闭3小时。加入100 pi标准(使用在稀释緩沖液 中2倍系列稀释的420 ng/ml重组人CXXXC趋化分子(试剂盒提 供))或条件培养基，然后在室温下孵育过夜。经三次洗涤步骤 后，将板与100 |ul溶于PBS中的500 ng/ml小鼠抗人CXXXC趋化 分子检测抗体在室温下孵育2小时，然后与100 pi偶联到辣根过氧 化物上的链霉亲和素在室温下孵育30分钟。然后加入100 jul与四曱 基联苯胺(R&D Systems)混合的过氧化氢溶液显色。在450 nm波长 下读取光密度。NK细胞-内皮细胞结合试验HAE在6孔板中生长到汇合 (6xl05细胞/孔)或包埋在Gelfoam基质中，并在含有5% C02的潮 湿空气环境下用100 U TNFoc/ml和100 U IFN-y/ml在37。C下活化 20小时，用PBS洗涤一次。用I型胶原酶消化Gelfoam基质，进行 细胞计数，并以6xl05细胞/孔的浓度接种在6孔々反上1小时，以佳_ 之粘附。分离的NK细胞与10 fiCi 51Cr/106NK细胞孵育，在PBS中 洗涤，然后以20 pg/ml重悬浮(5xl0V孔)在400 pl单独的培养基或 含抗CX3CR1抗体的培养基中20分钟。在轻轻摇动(10圏/分钟) 的条件下，将NK细胞悬浮液加到内皮单层上。30分钟后弃去培养 基，轻轻洗孔。通过用PBS中的1% Triton处理来裂解粘附细月包。 使用y计数仪检测每分钟各孔结合的计数来确定总结合。该分析显示 了至少三个独立实验的代表。基质包埋抑制了 CXXXC趋化分子mRNA的诱导。在组织培养 聚苯乙烯板上或三维基质内生长的静止内皮细胞不表达CXXXC趋 化分子，而用TNFoc和IFN-Y刺激在组织培养聚苯乙烯板上生长的 HAE诱导CXXXC趋化分子mRNA以依赖时间的方式表达。在组 织培养聚苯乙烯板上生长的HAE中的CXXXC趋化分子mRNA表 达在12小时刺激时达到峰值，在刺激24小时后细胞仍然表达显著 量的mRNA。相反，在研究的所有时间点，在基质包埋的内皮细胞 中CXXXC趋化分子mRNA表达的诱导显著降低。在12小时细胞 因子刺激后也达到最大值，但是在组织培养聚苯乙烯板上生长至汇 合的内皮细胞中只有约10%的表达水平(p<0.0001 )。基质包埋抑制了 HAE中的CXXXC趋化分子蛋白质表达。 Western印迹分析显示与在组织培养聚苯乙烯板上生长的内皮细胞相 比，在包埋在Gelfoam基质内的HAE中的CXXXC趋化分子蛋白质 表达水平较低。在未受刺激的内皮细胞和刺激4小时的内皮细胞中 无法检测到CXXXC趋化分子-特异性蛋白质带。在组织培养聚苯乙 烯板上生长的内皮细胞在刺激8小时后表达CXXXC趋化分子，并 且在用TNFot和IFN-y刺激16-24小时时显示最大表达。基质包埋的HAE中的蛋白质表达后来(12小时)可以检测到，在细胞因子刺激 24小时内4交弱并且消失。类似于Western印迹结果，流式细胞分析揭示在组织培养聚苯 乙烯板上生长的HAE中有显著较高的CXXXC趋化分子蛋白表达水 平。基质包埋的内皮细胞在细胞因子刺激16小时后达到最大表达 (22.8±5.7%)，在组织培养聚苯乙烯板上生长的内皮细胞在TNFoc和 IFN-y刺激20小时后达到最大和显著纟是高的CXXXC趋化分子表达 (76.5±8.6%;p<0.0001)。实验数据表明细胞因子刺激的基质包埋的内皮细胞分泌CXXXC 趋化分子减少。CXXXC趋化分子水平也通过ELISA纟企测为释》文到 内皮培养上清液中的可溶性CXXXC趋化分子的累积水平。可溶性 CXXXC趋化分子的水平平行于Western印迹法和流式细胞分析中的 结果由组织培养聚苯乙烯板上生长的HAE分泌的CXXXC趋化分 子显著超过由基质包埋的HAE分泌的水平(32.2±2.4对13.8±1.7 pg/ml,在培养24小时后；p<0.0002)。实验数据表明，NK细胞与基质包埋的内皮细胞的粘附降低。为 了研究我们的发现的功能相关性，接下来使用在组织培养聚苯乙烯 板上生长或基质包埋的51Cr标记的NK细胞和细胞因子刺激的HAE 进行粘附试验。通过Y-计数揭示，与包埋于Gelfoam内相比，显著更 多的NK细胞粘附于在组织培养聚苯乙烯板上生长的异种HAE (6335±420对1735±135 cpm; p<0.0002;图5)。 CXXXC趋化分子表 达对于NK细胞粘附于活化内皮细胞的重要性可以通过以下证明 加入20 jug/ml抗-CX3CLl使NK细胞与细胞因子刺激的HAE的粘附 显著增强了大约74% (p<0.005,与不含抗-CX3CLl相比)。NK细胞 不附着于组织培养聚苯乙烯板或单独的Gelfoam。免疫反应性增强的小鼠中免疫应答的调节。内皮细胞注射在小鼠中诱导抗体形成。在幼稚B6小鼠中，与盐 水注射(136±39对49±14 MFI; p<0.02)相比，三次连续皮下注射 5xl05 PAE产生循环内皮细胞特异性IgGl (2210±341对53±12平均荧光强度(MFI); pO.0001)和IgM抗体。在第一次注射PAE后42天 在任一小鼠组的血清中没有检测到PAE-特异性IgGh抗体(数据未 示出)。基质包埋的内皮细胞阻止体液免疫反应性。与游离细胞植入明 显不同，基质包埋的异种内皮细胞的植入在幼稚小鼠中不能诱导显 著的体液免疫应答(d 42， IgG!: 210士102对735±327 MFI; p < 0.001; IgM: 60±11对299±51 MFI; p < 0.001;图7A和7B)。在预先致敏的 连续激发的小鼠中注射游离PAE导致体液免疫应答升高，以及IgG! 抗体水平明显增加(3795±448 MFI; p<0.0002,相对于幼稚小鼠)， 以及PAE-特异性IgM略微增加(164士28 MFI)。明显相反，在预先致 敏的连续激发的小鼠中植入基质包埋的PAE不增加PAE-特异性抗 体而且，注射的PAE特异性的抗体水平随时间緩慢降低(IgG1: 1578±334 MFI; p<0.0005，对比游离PAE; IgM: 69±5 MFI; p<0.01, 对比游离PAE;图7A和7B)。在4个治疗组中PAE特异性IgG^-抗 体没有增加(数据未示出)，这支持以前关于在异种移植中Th2应 答占优势的报道。图7A和7B图示了在皮下植入非包埋的或基质包埋的PAE后， 幼稚的和预先致敏的连续激发的小鼠中的循环PAE-特异性IgG,(图 7A)和IgM (图7B)。所有小鼠的结果的图示(n二12/组，到植入后第 70天，11=6/组，第71-132天)都证明基质包埋的和游离PAE植入 之间具有显著性差异。植入基质包埋的PAE后的抗体水平緩慢降 低。数据表示为平均值iSD。基质包埋的内皮细胞是较差的细胞免疫诱导剂。ELISPOT分析 显示在植入游离PAE后90天在幼稚的和预先致敏的连续激发的小 鼠中具有高频率的产生异种T辅助细胞(Th)2-细胞因子(IL-4， IL-10) 的脾细胞，但是在植入基质包埋的PAE后没有。在预先致敏的连续 激发的小鼠中异种反应性脾细胞的频率超过接受游离PAE的幼稚小 鼠中的异种反应性脾细胞活化和分化(IL-4: 907±59对680±129; p<0.02; IL-10: 1096±94对888±151斑点数；p<0.02;图8A和8B)。另外，与在幼稚小鼠中植入基质包埋的PAE相比，在预先致敏的连续 激发的小鼠中植入基质包埋的PAE仅引起IL-4轻微增加(322士75对 199±99斑点数；pO.05;与游离PAE相比p〈0.0005;图8A)，但是 产生IL-10的异种反应性脾细月包没有增加(403士142对451±135斑点 数；p-0.27;与游离PAE相比pO.001;图8B)。与才妻受游离PAE的 幼稚小鼠相比，在接受基质包埋的PAE的预先致敏的连续激发的小 鼠中存在显著较少的Th2-细胞因子产生脾细胞(pO.OOl)。产生 Thl-细胞因子(IFN-y和IL-2)的脾细胞的频率在4个治疗组之间没 有显著不同，这再次支持了 Th2在异种反应性中的主要作用(数据 未示出)。图8A和8B图示了在向幼稚和预先致敏的连续激发的小鼠中植 入游离PAE或基质包埋的PAE之后，接受者中产生异种反应性细胞 因子的细胞的频率。数据表示为平均值iSD。与基质包埋的PAE的 接受者相比，幼稚和预先致敏的连续激发的游离PAE接受者表现出 显著增高的产生IL-4(图8A)和IL-10(图8B)的脾细胞的频率。在接受非包埋的PAE的小鼠中，产生细胞因子的脾细胞的增加 平行于CD4+和CD8+效应T细胞随时间的增加(CD4+: 44±2幼稚小 鼠，54±4%预先纟丈每文的小鼠，p<0.05; CD8+: 20±2; 21+2%;图9A禾口 9B)。因此，在暴露于基质包埋的PAE的幼稚和预先致敏的连续激 发的小鼠中，T细胞向CD44 "CD62L *T细胞的分化显著减弱 (CD4+: 22±2幼稚小鼠，21±3%预先致敏的小鼠；与游离PAE相比 p〈0.01; CD8+: 12±2; 14±3%;与游离PAE相比pO.02;图9A和9B)。 在所有治疗组中，CD4+数超过CD8+效应T细胞1.7-2.6。在第132 天在所有治疗组中，在Th2-细胞因子产生脾细胞的频率和T细胞分 化为CD4+CD44高/CD62L低(IL-4: r=0.81; p<0.0001; IL-10 r=0.88; p〈0.0001;图IO)和CD8+CD44高/CD62L低效应细胞(IL-4: r二0.79; p〈0.0001; IL-10 r=0.86; p<0.0001 )的程度之间注意到强烈相关性。图9A和9B图示了在接受游离PAE的小鼠中显著增加的CD4+ (图9A)和CD8+ (图9B)效应细胞。使用CD62L和CD44作为效应T细胞的标记，通过流式细胞术分析从小鼠中回收的脾细胞。当内皮 细胞被基质包埋时，在幼稚和预先致敏的连续激发的小鼠之间没有 差异。数据表示为平均值士SD。图IOA和IOB显示了 Th2-细胞因子产生脾细胞的频率和T细胞 分化为效应细胞的程度之间的Spearman相关性。图10A图示了 IL-2 细胞因子的频率。图10B图示了 IL-10细胞因子的频率。该相关性 提示细胞因子水平与效应T细胞诱导线性相关。密度椭圆面积代表 95%置信区间。基质包埋的内皮细胞被阻止裂解损伤。在第70天和第132天表 征宿主淋巴细胞损伤异种内皮细胞的能力。钙荧光素释放在效靶 比为25:1时达到稳定。对于该比例，当在第70天接受非包埋的 PAE代替基质包埋的PAE时，内皮细胞损伤在幼稚小鼠中高1.6 倍，在预先致敏的连续激发的小鼠中高1.7倍(p<0.001)。这些比例 在132天后分别提高到1.9和2.3 (pO.0005;图11)。注意到，与 接受游离PAE的幼稚小鼠相比，在接受基质包埋的PAE的预先致敏 的小鼠中，内皮损伤程度显著较低(20.9±2.3对37.1±3.4% AFU; pO.001;图11 )。在第70天和第132天表征宿主淋巴细胞损伤异种内皮细胞的能 力。图11图示了当内皮细胞是游离的或被基质包埋时，在幼稚和预 先致敏的小鼠中损伤内皮细胞的程度。与游离PAE相比，在接受基 质包埋的PAE的幼稚和预先致敏的小鼠中，通过裂解的内皮损伤显 著降低。2xl04 PAE用钓荧光素标记，并且与分别在70天和132天 后分离的5xl()S脾细胞孵育。钙荧光素释放在效靶比为25:1时达到稳定。对于该比例，当 在第70天接受非包埋的PAE代替基质包埋的PAE时，内皮细胞损 伤在幼稚小鼠中高1.6倍，在预先致敏的连续激发的小鼠中高1.7倍 (p<0.001)。这些比例在132天后分别才是高到1.9和2.3 (pO.0005; 图11)。注意到，与接受游离PAE的幼稚小鼠相比，在接受基质包 埋的PAE的预先致敏的小鼠中，内皮损伤程度显著较低(20.9±2.3对37.1±3.4% AFU;pO.001;图11)。树突细胞成熟的调节树突细胞是抗原呈递细胞，具有启动和调节免疫应答的独特能 力。成熟树突细胞促进T细胞分化为效应细胞和记忆细胞，而不成 熟的树突细胞以耐受原方式呈递(自身)抗原。树突细胞与多种内 皮介导的疾病有关，活化的内皮细胞诱导其成熟。因为树突细胞在 免疫反应性中非常关键，因此内皮细胞引导的树突细胞成熟依赖于 内皮细胞-基质接触。树突细胞的制备、培养和成熟从健康志愿者中采集外周血， 在Ficoll-Paque (Sigma Chemicals, St. Louis, MO)上通过标准方法分 离。为了衍生树突细胞，总外周血单核细胞(PBMC)在组织培养瓶中 以2xl(^细胞/ml的密度在完全培养基(RPMI1640， 10%热灭活的小牛 血清，0.1 mM丙酮酸钠(Life Technologies))中培养1.5小时。孵育 后，用lxHBSS溶液(Life Technologies)充分洗涤除去未附着的细 胞。然后将剩余的附着细胞在含有20 ng/ml白介素(IL)-4和20 ng/ml GM-CSF (Peprotech, Rocky Hill, NJ)的完全培养基中在C02孵箱中 37。C培养5天。得到的细胞是半附着到非附着的，是MHC II低 /CD14-m/CD83-(数据未显示)。为了进一步成熟，收获附着和非附着的树突细胞，充分洗涤， 计数，并用细胞因子混合物(10 ng/ml IL-1J3, 1000 U/ml IL-6, 20 ng/ml IL-4, GM-CSF，和TNF-a;均来自Preprotech)、 1.5xl05 HAE 或1.5xl05 PAE刺激5xl()S个树突细胞48小时。内皮细胞在组织培 养板上生长至汇合后作为悬浮液，或者表面附着包埋于Gelfoam基 质中。每次试验重复至少4次。成熟后，使用磁珠标记的CDla抗 体(Miltenyi, Bergisch-Gladbach，德国)从任何掺杂的内皮细胞中分离 树突细胞。流式细胞分析显示分离的树突细胞的纯度为98%(数据 未示出)。实时PCR:使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen， Valencia, CA)按照 生产商的说明从分离的树突细胞和剩余的内皮细胞中提取总RN A 。互补DNA4吏用来自Applied Biosystems (Foster City, CA)的TaqMan 反转录试剂合成。用Opticon实时PCR 4义(MJ Research, Waltham， MA)，使用SYBR Green PCR主混合物(AppliedBiosystems)和选择的 引物进行实时PCR分析。收集反应数据，通过互补Opticon计算机 软件进行分析。应用标准曲线计算基因表达的相对量，并对GAPDH 标准化。流式细胞术洗涤树突细胞或内皮细胞悬浮液，将3xl()S个细胞 重悬浮于FACS緩冲液(含有0.1% BSA和0.1%叠氮钠的PBS; Sigma Chemicals)中。标准流式细胞分析评价各种标记的表面表 达。在单色流式细胞分析中使用直接与藻红蛋白(PE)或异硫氰酸荧 光素(FITC)偶联的下列单克隆抗体PE-CDla (克隆HI149, IgG)、 FITC-CD3 (克隆UCHTl, IgGJ、 PE-CD14 (克隆TUK4, IgG2a)、 PE國 CD31 (克隆WM59, IgG!)、 FITC-CD40 (克隆5C3， IgGJ、 FITC-CD54 (克隆15.2, IgG!)、 FITC-CD80 (克隆BB1, IgM)、 FITC-CD83 (克隆 HB15e, IgG,)、 FITC-CD86 (克隆2331， IgG0、 FITC-CD106 (克隆51-10C9, IgG,)、 FITC-HLA-DP、 DQ、 DR(克隆CR3/43, IgG!)、 FITC-Toll-样受体(TLR)2 (克隆TL2.3, IgG^)和FITC-TLR4 (克隆HTA125， IgG2a)。分别使用适当的同种型对照抗体(小鼠PE-IgG,， PE-IgG2a, FITC画IgG!， FITC-IgG2a， FITC画IgM)。 抗体购自 DakoCytomation (Carpinteria， CA)、 Serotec (Raleigh, NC)或PharMingen (San Diego, CA)。染色后，洗涤细胞，并在1%低聚甲醛中固定，然后利用 FACScalibur设备和CellQuest软件(Becton Dickinson, Mountain View, CA)分析。胞吞活性如前所述通过FITC-偶联的葡聚糖(MW 40,000; Molecular Probes, Eugene, OR)的摄取测定树突细胞的胞吞活性。简 言之，各个成熟状态的树突细胞在完全培养基中与1 mg/ml FITC-偶 联的葡聚糖37。C孵育1小时，测定特异性摄取，或者在4。C孵育， 测定非特异性结合。然后充分洗涤细胞，并且如上所述通过流式细 胞术进行分析。混合淋巴细胞反应试验按照生产商说明(Dynal Biotech, Lake Success, NY), 4吏用抗体排除和f兹珠，通过负选择，由总PBMC制备 来自无关供体的CD3+T-细胞。通过流式细胞术评1^介，非》兹部分含有 大于95%的CD3+ T-细胞。将2xl05 CD3+ T-纟田胞/孔接种在96孔圓 底板中。对纯化的细胞因子或内皮细胞成熟的树突细胞进行y-照射 (3000 rad,来自137Cs源)，并且以lx104、 4xl03或2xl03细胞/孔 的密度添加到T-细胞中，得到1:20、 1:50或1:100 DC:T-细胞的最终 比例。在第5天，向每孔加入1 pCi 3H画胸苷(Perkin-Elmer， Boston, MA)。 18小时后收集细胞，使用Packard TopCount y-计数器(GMI, Ramsey MI)对311-胸普摄取进行定量。Western印迹法与树突细胞分离后，用PBS緩沖液洗涤内皮细 胞，通过与裂解緩沖液(20 mM Tris, 150 mM NaCl， pH 7.5， 1% Triton X-100, 1%脱氧胆酸盐，0.1% SDS和蛋白酶抑制剂；Roche, Indianapolis, IN)孵育制备细胞裂解液。在4-20% Ready Tris-HCl凝胶 (BioRad Laboratories, Hercules, CA)上分离样品。然后Y吏用甘氨酸-Tris转移緩沖液将蛋白质转移到PVDF膜(Millipore, Billerica， MA) 上。Jurkat (TLR2)或HL-60全细胞裂解液(TLR4，均来自Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA)作为对照。将膜在Starting Block封 闭緩沖液(Pierce, Rockford, IL)中封闭1小时。封闭的膜与兔抗人 TLR2 (在封闭緩沖液中1:250稀释)或TLR4抗体(1:200稀释，均来自 Santa Cruz Biotechnologies)于4。C孵育过夜。然后在室温下用由含有 0.05% Tween 20的PBS组成的洗涤緩冲液洗膜三次，然后与在封闭 緩沖液中1:1000稀释的第二抗体一与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗 兔IgG(Santa Cmz Biotechnology, Santa Cruz, CA)—室温孵育2小 时，然后洗涤，其中更换5次洗涤緩冲液。为了检测TLR带，按照 生产商的说明，将印迹与化学发光底物(Western Lightning Chemiluminescence Reagent Plus^式剂盒；Perkin-Elmer)—起卵孚育,f逭 后在FluorChem SP (Alpha Innotech， San Leandro， CA)上暴露并且分非附着的内皮细胞引导单核细胞衍生的树突细胞的成熟。与以前的观察一致，单核细胞在GM-CSF和IL-4中培养5天后分化为不 成熟的树突细胞(数据未示出)。用IL-ip、 TNF-a和IL-6长时间细 胞因子刺激48小时上调共刺激分子(CD40: 2.3倍，与未成熟树突细 胞相比，CD80: 1.9倍，CD86: 1.6倍)和HLA-DR分子(1.5倍)，以及 CD83的表达(2.2倍)，其作为确认的树突细胞成熟标记。在组织培 养板中生长至汇合后暴露于同种异体和异种内皮细胞的盐水悬浮液 诱导单核细胞衍生的树突细胞完全成熟，其程度类似于用细胞因子混合物长时间处理。单独的HAE或PAE诱导树突细胞共刺激分子 表达，CD40 (HAE: 2.1倍，PAE: 2.5倍，与未成熟的树突细胞相 比)、CD80(2.1倍，2.3倍；p〈0.05,与细胞因子刺激相比)、CD86(1.6 4咅，1.7倍)、HLA-DR (1.7倍，2.2 <咅；p<0.05 ，与HAE相比， p<0.002，与细胞因子刺激相比)和CD83 (2.6倍；p0.05，与细胞因子 刺激相比，3.2倍；p<0.02，与HAE相比，p<0.001,与细月包因子刺激 冲目比)增力口。以类似的方式，在暴露于HAE的盐水悬浮液后，树突细胞 TLR2和4表达上调(分别为1.5和2.5倍)，其程度类似于或高于 细胞因子刺激(与未成熟的树突细胞相比，两种TLR均为1.5 倍)。在树突细胞与非附着的异种PAE共孵育后，这种效应甚至更 强(TLR2: 2.4倍；p<0.05，与细胞因子刺激和HAE刺激相比， IXR4: 3.0 4咅；p<0.05，与HAE相比，p<0.001，与纟田月包因子刺激相 比)。对于mRNA转录物水平可以获得类似的结果。另外，用细胞 因子成熟的树突细胞或非附着的内皮细胞显示IL12 p40 mRNA显著 上调(未成熟的0.03±0.02相对单位(RU),细"包因子刺激的 0,23±0.03 RU, p<0.002， HAE—刺;敫的0.31±0.05 RU， pO.OOl, PAE-刺 ;敫的0.28士0.03, p<0.002)。与底物附着的内皮细胞一起孵育导致不完全的树突细胞成熟， 并且保持胞吞活性。明显不同于与非附着内皮细胞的共培养，树突 细胞与基底附着的HAE和包埋于三维基质内的PAE的共培养限制了树突细胞的成熟这些树突细胞只表现CD40(基底附着的HAE: 与未成熟DC相比为1.5倍，p<0.02,与非粘附的HAE相比，基底附 着的PAE: 1.3倍，p<0.002,与非附着的PAE相比)、CD80 (基底附 着的HAE和PAE: 1.3倍，p<0.005,与非附着的EC相比)、CD86 (基底附着的HAE: 1.1倍，PAE: 1.2倍，均为p<0.005，与非附着的 EC相比)、CD83 (基底附着的HAE: 1.5倍，pO.OOl,与非附着的 HAE相比，PAE: 1.4倍，p<0.0002,与非附着的PAE相比)和TLR4 (基底附着的HAE: 1.5倍，PAE: 1.3倍，均为p<0.005，与非附着的 内皮细胞相比)的弱上调。与基底附着的内皮细胞共孵育根本不能诱 导树突细胞上的HLA-DR和TLR2表达(p0.005)。与单独的空(数据未示出)。实时PCR分析揭示当树突细胞暴露于基底附着的 同种异体和异种内皮细胞时具有相同的不完全成熟模式。当用基底 附着的内皮细胞成熟树突细胞时，IL12 p40的诱导类似地显著较弱(HAE刺；敫的0.06±0.01， p<0.005 ， PAE刺；敫的，0.07士0.02， p<0.02)。未成熟的树突细胞有效捕获抗原并且显示高水平的胞吞作用。 当单核细胞在GM-CSF和IL-4中培养3天和5天时，FITC-偶联的 葡聚糖摄取提高(423.3士121.8平均焚光强度(MFI)， 239.8±42.8 MFI， p<0.0001)。成熟典型地同时伴随着抗原呈递功能的增强和通过胞吞 活性的抗原捕获能力的降低。葡聚糖摄取一般随持续的细胞因子刺 激(89.7士14.7 MFI， pO,OOOl，对比d5)、与非附着HAE (92士20.3 MFI) 或PAE (82.4±16.5 MFI)共孵育而降低。明显不同的是，当内皮细胞 以基底附着的三维状态呈现时，树突细胞保持其胞吞活性，并且葡 聚糖摄取明显增加(基底附着的HAE: 203.2±11.3 MFI，p<0.05,对比 d5, pO.0001,对比非附着的HAE;基底附着的PAE: 254.3±32 MFI, p<0.0001,对比非附着的PAE)。树突细胞在与基底附着的内皮细胞培养后显示T细胞增殖活性 降低。促进T细胞分化为效应和记忆细胞的能力是树突细胞成熟程度的重要功能标记。细胞因子处理的和非附着内皮细胞暴露的树突细胞在检测的全谱树突细胞T-细胞比例上诱导T细胞增殖 (74789±1777， HAE: 97522±1630，和PAE: 101616±4302 cpm),而在 与基底附着的HAE (18320±1000 cpm, p〈0.002)和PAE (20080±683 cpm, p0.0001)共孵育的树突细胞中该能力显著减弱。基底附着的内皮细胞当与树突细胞共培养时其活化降低。实时 PC、流式细胞术和Western印迹分析揭示在与树突细胞共培养2天 后HAE和PAE的活化降低。在基于磁珠分离树突细胞后，对于内 皮细胞特异性标记CD31而言，剩余的细胞的纯度大于95%(数据 未示出)。实时PCR分析证明基底附着的HAE上粘附分子、 CD58、 HLA-DR和TLR-分子的mRNA表达水平比它们的非附着对 应物降低。mRNA表达水平降低翻if为表面和细胞内表达降低，与 非附着HAE相比，在基底附着的HAE上ICAM-1的表达低3.6倍 (PAE降低1.3倍)，对于HAE， VCAM-1降低4.9倍(PAE: 2.7 倍)，对于HAE， HLA-DR降低16倍(PAE:降低23倍)。Western印 迹的光密度分析揭示，在与树突细胞共孵育48小时后，在非附着内 皮细胞中比在基底附着的内皮细胞中TLR2 (HAE:提高1.5倍，PAE: 提高1.6倍；p<0.05)和TLR4表达增强(HAE:提高2.3倍，PAE:提 高2倍；p0.01)。因此，非附着内皮细胞诱导单核细胞衍生的树突细胞成熟，其 程度类似于细胞因子混合物所见的程度，与基底附着的内皮细胞共 孵育只诱导mRNA转录物和树突细胞上粘附、共刺激和HLA-DR 分子的蛋白质水平的少量上调。与基底附着的内皮细胞共孵育的树 突细胞也缺乏作为直接成熟标记的IL12 mRNA和CD83表达的上 调。与基底附着的内皮细胞共培养后树突细胞的这种不成熟状态通 过持续的摄取葡聚糖的能力反映出来。在功能上，暴露于非附着内 皮细胞的树突细胞在混合淋巴细胞反应中表现出增强的T细胞刺激 活性，而在暴露于基底附着的内皮细胞成熟的树突细胞后，T细胞 增殖显著较弱。进一步的实验对免疫应答的效果移植排斥的治疗确定正常(非缺乏免疫力的)器官移植接受 者群体。该群体分为三组， 一组在接受植物器官之前接受有效量的 本发明的可植入材料。第二组在接受移植器官的同时接受有效量的 本发明的可植入材料。第三组不接受本发明的可植入材料，但是将 接受移植器官。通过评价血清样品中T-淋巴细胞和B-淋巴细胞的增 殖以及通过监测移植器官接受的持续时间，随时间监测免疫应答和/ 或炎症应答的减少和/或改善。预期接受有效量的本发明可植入材料 的候选者将表现为淋巴细胞增殖减少和/或移植器官接受的持续时间 延长。自身免疫病的治疗确定诊断为自身免疫病的患者群体。该群 体分为两组， 一组接受有效量的本发明的可植入材料。通过评价血 清样品中T-淋巴细胞和B-淋巴细胞的增殖以及通过监测与自身免疫 病有关的症状的强度和持续时间，随时间监测自身免疫应答和/或炎 症反应的减少和/或改善。预期接受有效量的本发明可植入材料的候 选者将表现为淋巴细胞增殖减少和/或症状的频率和/或强度降低。
权利要求
1.一种降低免疫应答或炎症反应的方法，包括以下步骤给接受者提供可植入材料，该可植入材料包含生物相容性基质；和锚定的或包埋的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物，其中以足以降低所述接受者中的免疫应答或炎症反应的量给所述接受者提供所述可植入材料。
2. 权利要求1的方法，其中所述提供步骤在给所述接受者施用 一个或多个剂量的来自同系或非同系供体的细胞、组织或器官之 前、同时或之后。
3. 权利要求1的方法，其中所述提供步骤在发生免疫应答或炎 症反应之前、同时或之后。
4. 一种诱导患者中接受性的方法，包括以下步骤 在所述患者移植自体移植、异种移植或同种异体移植细胞、组织或器官之前、同时或之后，以有效诱导所述患者中的接受性的量 提供包含生物相容性基质和锚定的或包埋的内皮细胞、内皮样细胞 或其类似物的可植入材料。
5. —种降低供体抗原免疫原性的方法，包括以下步骤 在向接受者中导入所述供体抗原之前、同时或之后，以有效降低供体抗原免疫原性的量提供包含生物相容性基质和锚定的或包埋 的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物的可植入材料。
6. 权利要求1、 4或5的方法，其中所迷提供步骤在给所述接 受者施用免疫抑制剂之前、同时或之后进行。
7. 权利要求6的方法，其中在同时施用过程中，所述免疫抑制 剂存在于所述可植入材料中。
8. 权利要求5的方法，其中所述供体和接受者是相同的。
9. 权利要求1、 4、 5或8的方法，其中所述接受者患有自身免 疫病。
10. 适合权利要求l-9任一项使用的可植入材料。
11. 权利要求10的可植入材料，其中内皮样细胞或类似物是非 内皮细胞。
12. 权利要求10的可植入材料，其中细胞是前述任一种细胞的 自体的、同种异体的、异种的或遗传修饰的变体。
13. 权利要求10的可植入材料，其中细胞是血管内皮细胞。
14. 一种给接受者移植同系或非同系细胞、组织或器官移植物 的方法，包括以下步骤在移植之前、同时或之后给所述接受者提供包含生物相容性基 质和锚定的或包埋的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物的可植入材 料，使得所述移植的同系或非同系细胞、组织或器官不被所述接受 者排斥。
15. 权利要求4或14的方法，其中所述移植的细胞、组织或器 官包含非内皮细胞。
16. 权利要求5的方法，其中所述供体抗原包含非内皮细胞抗原。
17. 权利要求14的方法，其进一步包括在移植之前、同时或之 后施用免疫抑制剂的步骤。
18. 适合权利要求l-17任一项的可植入材料使用的细胞。
19. 权利要求18的细胞，其中所述内皮样细胞或其类似物是非 内皮细月包。
20. 权利要求18的细胞，其中所述类似物是非天然的。
21. 权利要求18的细胞，其中所述细胞当锚定于或包埋在生物 相容性基质内时降低接受者对非同系供体细胞、组织或器官的体液 或细胞免疫应答。
22. 权利要求18的细胞，其中所述细胞当锚定于或包埋在生物 相容性基质内时显示降低的免疫原性。
23. 权利要求22的细胞，其中所述降低的免疫原性是当锚定于 或包埋在生物相容性基质内时降低的MHC表达或降低的结合、活化或促进先天免疫细胞成熟的能力，其中所述先天免疫细胞选自NK细月包、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。
24. 权利要求18的细胞，其中所述细胞当锚定于或包埋在生物 相容性基质内时显示降低的MHC、共刺激分子或粘附分子的表达。
25. 权利要求18的细胞，其中所述细胞当锚定于或包埋在生物 相容性基质内并与树突细胞共培养时，抑制所述树突细胞表达HLA-DR、 IL12、 Toll-样受体或CD83;促进所述树突细胞4聂取葡聚糖； 或阻断树突细胞诱导的淋巴细胞增殖；或当与获得性免疫细胞共培 养时，抑制所述细胞的增殖、活化或分化，其中所述获得性免疫细 胞选自B-淋巴细胞和T-淋巴细胞。
26. —种可植入材料，包含生物相容性基质和锚定的或包埋的 权利要求22的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物。
27. —种可植入材料，包含生物相容性基质和锚定的或包埋的 权利要求24的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物。
28， 一种可植入材料，包含生物相容性基质和锚定的或包埋的 权利要求25的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物。
29. —种细胞库，包含权利要求18或权利要求23-25任一的细胞。
30. —种可植入材料库，包含权利要求10的可植入材料。
31. —种可植入材料库，其中所述可植入材料包含生物相容性 基质和锚定的或包埋的权利要求22的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物。
32. —种可植入材料库，其中所述可植入材料包含生物相容性 基质和锚定的或包埋的权利要求24的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物。
33. —种可植入材料库，其中所述可植入材料包含生物相容性 基质和锚定的或包埋的权利要求25的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物。
34. 权利要求10的可植入材料，其中所述可植入材料是固体或非固体。
35. 权利要求10的可植入材料，其中通过植入、注射或输注给 接受者提供所述可植入材料。
36. —种用于降低对非同系细胞、组织或器官的免疫应答的可 植入材料，其中所述可植入材料包含生物相容性基质；和锚定于其上或包埋于其中的内皮细胞、内皮样细胞或其类似 物；或组织或器官或其片段；其中有效量的所述可植入材料降低接受者对所述非同系细胞、 组织或器官的免疫应答。
37. 权利要求36的可植入材料，其中所述非同系细胞、组织或 器官是患有自身免疫病的接受者的细胞、组织或器官。的方法，包括以下步骤给接受者提供一种可植入材料，该可植入材料包含 生物相容性基质；和锚定的或包埋的内皮细胞、内皮样细胞或其类似物， 其中以足以降低所述接受者中由暴露于所述外源免疫原引起的 免疫应答或炎症反应的量给所述接受者提供所述可植入材料。
38. 权利要求38的方法，其中所述提供步骤在发生免疫应答或 炎症反应之前、同时或之后。
39. 权利要求38的方法，其中所述外源免疫原是天然存在的。
40. 权利要求38的方法，其中所述外源免疫原选自药剂、毒 素、手术植入物、传染物和化学药品。
41. 权利要求38的方法，其中所述外源免疫原是选自环境应 激、损伤和暴露的外源刺激。
全文摘要
本文公开了调节对外源或内源免疫原(包括细胞、组织或器官相关的免疫原)的免疫学不利的应答的材料和方法。包含细胞(例如但不限于锚定或包埋在生物相容性基质中的内皮细胞)的可植入材料可以调节对外源或内源免疫原的不利的免疫或炎症反应，包括对非同系或同系细胞、组织或器官、外源免疫原或刺激的应答，以及改善自身免疫状况。可植入材料可以在发生免疫应答或炎症反应之前、同时或之后提供。可植入材料可以诱导移植患者中的免疫学接受性、减少移植物排斥和降低供体抗原免疫原性。
文档编号C12N5/071GK101268183SQ200680022447
公开日2008年9月17日 申请日期2006年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者埃拉泽尔·R·埃德尔曼, 海伦·玛丽·纽金特, 海科·梅特 申请人:麻省理工学院;渗透治疗有限公司