专利名称：保护皮肤对抗病原微生物的方法和手段的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物，其能够刺激固有皮肤^l生物菌群的生长，而不刺 激暂居病原微生物菌群的生长。本发明也涉及包含此类微生物的组合物，例如化妆品的或药物的组合物，而且涉及此类^:生物在化妆品、预防或治 疗应用中的用途。
背景技术：
人皮肤上定居着大量多样的微生物，其主要在相对稳定的组合物中作 为共生体在皮肤表面生存(Roth和James， 1988)。此类正常的皮肤菌群被称 为"固有皮肤菌群"。人皮肤的主要功能是保护其下面的组织对抗环境影响 (Feingold， 1985)。此类正常的皮肤菌群特别保护皮肤对抗可能的病原微生物入侵(Bisno， 1984)。某些微生物在固有菌群中占优势，大于卯％的固有 微生物菌群为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)(凝固酶阴性)、某种微球菌(Micrococcus spec.) 、 类白喉菌(Diphteroids)和丙酸杆菌propionibacteria) (Leyden等人，1987)。因此，天然皮肤菌群的稳定支持皮 肤的保护作用和预防病原入侵。增强皮肤的健康。在一些临床研究中已描 述了天然皮肤菌群的重要性。已显示在嬰儿出生后最初几天，这类皮肤菌 群还未发展，因此金黄色葡萄球菌感染的危险非常高。随着菌群的渐增发 展，皮肤可防御病原微生物的定居(Hurst， 1959)。在另一个关于嬰儿的研 究中，观察到用抗生素羟氨节青霉素处理以后，固有菌群被严重抑制(约 50%)。这导致致病酵母白色念珠菌(Candida albican)产生大于14倍的增 加。抗生素处理的终止会导致固有菌群恢复和白色念珠菌阻遏(Brook， 2000)。固有皮肤菌群的微生物通过竟争皮肤表面的附着位点和必需营养来防御病原微生物的定居(Sullivan等人2001)。病原微生物能够通过特异结合 蛋白质附着于表皮结构。在本发明中已知不同的机制。例如已知来自金黄 色葡萄球菌的特异黏附素。这些允许病原微生物附着于纤连蛋白结构。病 原体通常具有附着于宿主的较高可能性。这说明了这些微生物的毒性 (Gibbons和Houte， 1975)的。
当皮肤表面有微小损伤或其它损坏时，特别当正常皮肤菌群被抗生素 或过度洗涤而损害时，病原微生物定居的危险就会急剧增加(Elek, 1956)。 然而，关于营养利用的方面，固有皮肤菌群能更好地适应于皮肤。这是固 有皮肤菌群的优势(Larson,2001)。除此之外，固有皮肤菌群的有机体能够 产生抵抗病原微生物的抗菌物质。这也是固有微生物关于营养和能量来源 方面的优势(Sehvyn和Ellis， 1972; Milyani和Selwyn, 1978)。
而且，皮肤分泌的物质，如复合脂(甘油三酯)，被降解为抑制病原微 生物的不饱和脂肪酸，其中病原微生物是例如致热链球菌(Streptococcus pyrogenes)或革兰氏阴性细菌和真菌(AIy等人，1972)。
微生物皮肤菌群影响几个化妆品相关的皮肤因素。包括皮肤的pH值、 屏障功能和脂类含量。表皮葡萄球菌能够通过降低pH值(约4-6)而对抗病 原微生物。在降低的pH值条件下病原体不能生长(Korting等人，19卯; Lukas， 1990; Korting， 1992; Yosipovitch和Maibach， 1996; Gfatter等人， 1997)。
皮肤的水屏障功能和脂类含量依赖于角质层的神经酰胺含量 (Imokawa等人，1986)。神经酰胺含量降低会引起皮肤干燥和开裂。对皮肤 具有这些表现的遗传过敏性皮炎(atopical dermatitis)患者的研究显示微生 物皮肤菌群戏剧性地改变为金黄色葡萄球菌。此类病原体的特征是有非常 高的神经酰胺酶活性，而正常的固有皮肤菌群共生体则不具有此类活性。 在皮肤中产生释放神经酰胺的鞘磷脂酶活性在遗传过敏性皮炎患者的固有 和病原菌群中是相似的(Ohnishi等人，1999)。
因此，需要保护皮肤(特别是人皮肤)对抗病原微生物的手段和方法。
发明内容
本发明阐述这种需要，并且提供保护皮肤对抗病原微生物定居的微生 物和方法。特別提供在权利要求中被表征的实施方案。
因此，本发明的第 一方面涉及能够刺激一种或多种固有皮肤微生物菌 群生长的微生物，其不刺激暂居病原微生物菌群生长。
发明人令人惊讶地发现，可以通过将上述微生物或其无活性形式向皮 肤给药来实现皮肤对抗病原微生物定居的有效保护。发明者首次鉴定了相 应的微生物和提供了它们的鉴定方法。这些微生物由于特异性刺激固有皮 肤微生物菌群的生长，因而能够再生和稳定天然皮肤菌群。这样使病原微 生物的生长受到抑制。此外，可以防护病原微生物进入皮肤菌群。当在皮肤较上层的微生物通过洗涤被除去时，本发明的孩i生物允许例如刺激在皮 肤更深的角质层的固有菌群。在皮肤上存在着许多不同的微生物。 一些属 于皮肤正常(固有)菌群，是无害共生体，而一些是可能的病原体。
基本上，皮肤上的有机体可以分为两类1.固有有机体固有有机体 永久定居于皮肤上，其定居在皮肤表面、角质层和表皮外层及皮肤和毛嚢 的深缝中。这些固有皮肤菌群的微生物能够在皮肤上生长和繁殖，不侵入 或破坏皮肤组织。较深皮肤区域中的这些有机体并不能通过洗涤轻易除去。 固有微生物是无害共生体。
2.暂居有机体暂居有机体是置于皮肤上、但是不在那里繁殖的微生 物，或者在皮肤上繁殖和短期存在的污染物。它们不能永久存在于健康皮 肤上，健康皮肤的微环境主要由固有菌群所决定。暂居有机体是可能的病 原体。
因此，术语"固有皮肤菌群"指能够在健康皮肤上发现的微生物，优选 人皮肤，并且其组成多数的皮肤上发现的微生物。
具体地，术语"固有皮肤菌群"指永久定居在皮肤表面、角质层和表皮 外层及皮肤和毛嚢的深缝中的微生物。这些微生物的特征在于它们能在皮 肤上生长和繁殖，不侵入或破坏皮肤组织。这些孩i生物的一个特征是在较深皮肤区域中不能通过洗涤轻易除去。固有皮肤菌群的微生物是无害共生 体。
术语"固有皮肤菌群"优选指在皮肤上(优选人皮肤)发现的需氧和厌氧 微生物菌群。更优选地，其指由表皮葡萄球菌(凝固酶阴性)、某种微球菌、 类白喉菌和丙酸杆菌组成的微生物菌群。通常，约卯％的需氧固有皮肤菌群由表皮葡萄球菌组成。剩余的约10%主要由某种微球菌(80 %藤黄微球 菌(ikficwcoccws /wte附))和类白喉菌(13 %)组成。术语"类白喉菌"指广范围 的属于才奉杆菌(0 fy"e6ffcteW"附)属的细菌。出于方4更，表皮类白喉菌分为 如下4组亲脂或非亲脂的类白喉菌；厌氧的类白喉菌；产卟啉的类白喉 菌。厌氧皮肤菌群的主要代表(90%)是丙酸杆菌；特别疮疱丙酸杆菌 (Propionibacterium acnes)、茅贞沭立丙酸杆菌(P. granulosum)和贪婪丙酸杆菌 (P. avidum)可以从皮肤中分离出来。厌氧菌群占整个固有皮肤菌群的大约 4%。
更优选地，大于卯％的微生物菌群属于表皮葡萄球菌、某种微球菌、 类白喉菌和丙酸杆菌。甚至更优选地，固有皮肤菌群的特征在于其主要成 分是表皮葡萄球菌。
微生物皮肤菌群的成分和组分可以通过例如用苏格兰胶带剥离上层皮 肤来定量和定性地确定。固有皮肤菌群的微生物可以通过例如用苏格兰胶 带剥离的IO层以内上层皮肤来鉴定。可作为范例的，将6个2cir^的苏格 兰胶带分别按在皮肤的确定区域(优选在前臂上)来分离这些微生物，然后 每个胶带的剥离物从皮肤转移到用于革兰氏阳性(例如BHI， Difco Inc.)或 者革兰氏阴性细菌的选择性琼脂培养平板上(例如麦康基琼脂，DifcoInc.)， 或者转移到酵母和真菌的选择性琼脂培养基上(例如平板计数琼脂，Difco Inc.)。之后从皮肤转移到琼脂培养平板上的微生物在30。C和37。C、需氧和 厌氧条件下培养约24小时。通过形态学和生物化学方法进行定性分析和定 量计数来确定菌落形成单位。确定相对的组合物和总细胞计数。本领域技 术人员能够通过本领域内已知的方法确定如上所述分离的固有皮肤微生物 菌群的属和/或种。例如，本领域内技术人员可以通过代谢足迹法、脂肪酸
组合物和细胞壁组成等等来鉴定所述微生物。
术语"皮肤"指身体的外罩，其为本领域技术人员公知的。优选地，该术语指三层表皮、真皮和皮下脂肪组织。表皮是皮肤的最外层。其通常 在身体外表面形成防水的防护层，且由具有下基底膜的复层扁平上皮构成。 其通常不含有血管，且通过从真皮扩散而获得营养。组成表皮的主要细胞 类型是角质形成细胞，也存在黑色素细胞和朗氏细胞。表皮被分为几层， 其中细胞通过最内层的有丝分裂而形成。它们向上层移动，在分化时改变 形状和组成，且变为充满角蛋白。它们最后到达被称为角质层的最上层， 并且开始脱落或脱皮。表皮的最外层由25到30层死细胞组成。 一般而言， 表皮分为5个亚层或层(从表面到深入)角质层、透明层、颗粒层、棘层 和生发层或基底层。通常，表皮和真皮的接触面是不规则的，由连续乳头 或指状突起组成，其在皮肤薄的地方最小，而在掌和足底皮肤中最长。通 常，掌和足底的乳头与表皮的高度相关联，其产生脊。皮下脂肪组织是皮 肤的最深层。此层的特征在于其由结締组织、血管和脂肪细胞组成。通常， 此层连接皮肤与下层结构，使身体隔绝寒冷，并以脂肪的形式储存能量。 一般而言皮肤在深层组织上形成对抗物理、化学和细菌物质的防护屏障。 这意味着例如口腔或阴道区域或粘膜组织不属于皮肤。在优选实施方案中， 术语"皮肤"指身体覆盖物的最外层，即表皮。在更优选的实施方案中，术 语"皮肤"指表皮的角质层。在甚至更优选的实施方案中，术语皮肤指表皮 最外面的25到30层死细胞。在最优选的实施方案中，术语"皮肤，，指表皮 最外面的IO层死细胞。
术语"刺激"与固有皮肤菌群微生物菌群的生长相关联，指当与根据本 发明的孩i生物接触时， 一种或多种固有皮肤菌群微生物菌群的生长加速。 生长加速优选指增殖增加，即单位时间内细胞分裂增加。可选择地，术语"刺 激"也指个体细胞大小的增加。细菌细胞大小可以通过用染料SYBR Green I (分子探针，美国)染色后用流式细胞计量法(例如Becton-Dickinson FACSort流式细胞仪，San Jose, CA)来估算。细菌细胞大小用偏角光散射 (SSC)模式估算。
因此生长加速指单位时间内生物量产量的增加。
优选在体外观察固有皮肤菌群微生物菌群的生长刺激，更优选用一种 测定方法，其中根据本发明的微生物与一种或多种固有皮肤菌群的微生物 接触，并且测定这个(这些)固有皮肤菌群的微生物的生长。可以通过在培 养的不同时间间隔进行细胞/菌落计数来测定生长，并将其与不包含根据本 发明的孩i生物的对照相比较，以此来确定生长是否加速。
在实施例中描述了测定生长刺激的体外测定方法，其包含所谓的"体外
孔平板测定"。简言之，此类测定包含如下步骤
-培养至少一种固有皮肤菌群的微生物，将其均匀涂布到预备好的包含适
于各微生物生长(且优选检测)的适当琼脂培养基的琼脂平板上；
-在接种的琼脂平板提供孔；
-用预培养的根据本发明的微生物细胞填充孔；
-琼脂平板在允许固有皮肤菌群微生物菌群生长的条件下培养适当的时 间；和
-检测在含有根据本发明的微生物的孔周围固有皮肤菌群微生物菌群的生 长，且将其与不含根据本发明的微生物的孔周围微生物的生长相比较。
可获得的测定细胞和/或菌落数的手段和方法可以影响最后一步中生 长的测定，例如用适当的染料染色和/或光学手段例如光密度法、和在显微 镜下细胞/菌落计数。
甚至更优选地，固有皮肤微生物菌群的生长刺激也可以在原位皮肤测 定中观察。此测定方法在实施例中描述，其简要包括如下步骤 -培养至少一种固有皮肤微生物菌群，将其均匀涂布于测试个体的皮肤区
域；
-将根据本发明的微生物的一部分准确涂布于固有皮肤微生物菌群涂布的
区域之内；
-培育足够时间以允许固有皮肤微生物菌群的生长；
-将上层皮肤层，包括其中包含的微生物，转移到含有适当生长培养基的
琼脂平板上；
-琼脂平板在允许固有皮肤微生物菌群生长的条件下培养一段时间；
-测定根据本发明的微生物涂布区域周围的固有皮肤微生物菌群的生长， 并将其与没有涂布本发明微生物的对照中微生物的生长相比较。
此测定所使用的皮肤区域可能是个体的任何合适皮肤区域，优选人个 体。在优选的实施方案中，其为人个体前臂的皮肤区域。区域的大小不是 决定性的，优选约为l-40cm2,更优选5-20cm2,甚至更优选5-10 cm2， 例3口约5、 6、 7、 8、 9或10cm2。
将固有皮肤微生物菌群的微生物平均涂布于此区域，优选密度约为102 cfu/cm2 - 103 cfu/cm2。涂布于皮肤的微生物在空气中干燥，并将整分试样 的根据本发明的微生物准确涂布于该区域内。这可以通过本领域内技术人 员所公知的手段来实现。例如，将根据本发明的微生物离心(15分钟, 4000xg)。细胞沉淀用K/Na-緩冲液洗两次(每次1 ml)。在200 pl K/Na緩 沖液中重悬细胞，并将IO nl准备好的微生物用微量移液器准确应用于预 接种的皮肤区域。
皮肤优选在室温培育例如2小时。例如在粘性胶带剥离的帮助下可以 转移上层皮肤，包括其中包含的微生物。上层皮肤转移到琼脂平板中，该 琼脂平板在允许所测试的微生物或固有皮肤菌群生长的温度下培养，并且 使用已知支持此类微生物生长的生长培养基。通常培养约24小时。通过本 领域内技术人员所公知的方法检测微生物的生长。优选通过光密度法或计 数在涂布整分试样的本发明微生物的点附近形成的菌落来测定。细菌细胞 大小可以通过用染料SYBR Green I (分子探针，USA)染色后用流式细胞计 量法(例如Becton-Dickinson FACSort流式细胞仪，San Jose， CA)来估算。 细菌细胞大小用偏角光散射(SSC)模式估算。
如果在体外孔平板测定中，微生物能导致至少一种这类固有皮肤微生 物菌群生长加速，使其与未加微生物的对照相比至少增加5%,优选至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或70%，更优选至少75%,和甚至 更优选至少80%，和最优选至少85%，则此类微生物被认为是刺激一种或 多种固有皮肤微生物菌群的生长。更优选地，如果在原位皮肤测定中，微
生物能导致至少一种固有皮肤微生物菌群生长加速至少5%，优选至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或70%，更优选至少75%，甚至更 优选至少80%,和最优选至少85%，则此类微生物被认为是刺激一种或多 种固有皮肤微生物菌群的生长。
在优选实施方案中，根据本发明的微生物刺激固有皮肤菌群的主要代 表性微生物，即表皮葡萄球菌的生长。词语"刺激生长"的含义如上所述， 并优选指体外刺激，更优选在上文所描述的体外孔平板测定中。甚至更优 选地，其含意为在上文所描述的原位皮肤测定中的刺激。最优选指体外以 及原位测定方法中的刺激。体外孔平板测定和原位皮肤测定优选如实施例 中所述执行。在优选的实施方案中，本发明的微生物也刺激某种微球菌的 生长，优选藤黄微球菌。在更优选的实施方案中，也刺激类白喉菌的生长， 优选属于棒杆菌属的细菌。
在特别优选的实施方案中，根据本发明的微生物刺激固有皮肤微生物 菌群的所有微生物的生长。
根据本发明的微生物的特征也在于其不能刺激暂居病原微生物菌群的 生长。术语"暂居病原菌群"指位于皮肤上但不能繁殖的微生物，或指能在 皮肤上繁殖并短期存在的污染物。具体地，如果一种微生物应用于皮肤上， 不能在健康皮肤提供的环境条件下生长和复制，并且不能永久定居于此器
官(或其区域)上，那么这种孩吏生物祐:认为属于暂居病原菌群。某些细菌、 酵母和真菌可以暂时从人皮肤分离，但是如下微生物由于它们频繁出现，
明显被分类为暂居菌群金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌0^/^tococc附 /;"gew^)、革兰氏阴性杆菌(例如乙酸钓不动杆菌(Jd"eto6flctef cfl/omceric肌))、白色念珠菌(CVi"rf/Ja fl/6/ca"力和津泉糸匕马拉色菌(Afa/fl5^"'" /"r/wr)。暂居菌群的微生物通常具有致病因子，其允许细菌附着于病症皮 肤区域。其能够附着于例如胶原结构或角蛋白结构。
暂居病原-微生物菌群的测定可以通过例如代谢足迹法、脂肪酸组分和 细胞壁组分评估、16S核糖体RNA测序或编码特异致病因子的特异DNA 探针的检测。
12术语"不刺激暂居病原微生物菌群的微生物生长"指本发明的微生物不能刺激至少一种、优选多于一种、优选多于两种、更优选多于5种和特别 优选任何一种暂居病原微生物菌群的生长。
如果一种微生物不能在接触暂居病原微生物菌群时导致其生长加速， 则此种^:生物被认为不刺激暂居病原微生物的生长。是否有生长刺激可以 如上所述在体外或原位测试，与本发明的微生物刺激至少一种固有皮肤菌 群微生物菌群生长的性质相关联。确定刺激与否的测试最优选通过如上所 述的体外孔平板测定和/或原位皮肤测定进行，更优选如实施例中所述进行。如果一种微生物在接触暂居病原微生物菌群时，后者的生长没有加速 或仅有微小的加速，则此种微生物被认为不刺激暂居病原微生物菌群的生 长。"微小的加速"指与对照相比，生长的加速不超过5%,更优选不超过 2%。术语"没有加速，，指与不存在本发明微生物的对照相比，接触本发明微 生物的暂居病原孩i:生物菌群的生长没有发现统计学相关的差异。在优选实 施例中，术语"没有加速"也包括那些微生物实际上导致暂居病原微生物菌 群生长减慢的情况，即抑制此种微生物生长的情况。
在另一个优选的实施方案中，本发明的微生物对暂居病原微生物菌群 的生长没有负面影响。术语"没有负面影响"指当与不存在本发明微生物的 对照相比，与本发明的微生物接触时没有发现暂居病原微生物菌群的生长 被抑制。
在更优选的实施方案中，本发明的微生物不能刺激暂居病原菌群的主 要代表物(即金黄色葡萄球菌)的生长。确定微生物是否刺激金黄色葡萄球 菌生长的测试优选上文所描述的体外和/或原位测试，更优选如实施例中所 描述的测试。
在特别优选的实施方案中，本发明的微生物是属于乳酸菌族的微生物。 术语"属于乳酸菌族的微生物"包括属于细菌，特别是属于革兰氏阳性发酵 真细菌，更特别是属于包括乳酸菌的乳杆菌科的微生物。从分类学角度乳 酸菌被分为链球菌(Str印tococcus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌 (Pediococcus)和乳杆菌(Lactobacillus)几个亚类。本发明的微生物优选为乳杆菌种。乳酸菌族的成员通常缺少卟啉和细胞色素，不能进行电子转移磷 酸化，因此只能通过底物水平磷酸化来获得能量。即在乳酸菌中通过碳水
化合物发酵来合成ATP。所有的乳酸菌都是厌氧生长的，然而，与许多厌 氧菌不同，多数乳酸菌对氧都不敏感，因此其在氧存在和不存在的条件下 都能生长。因此，本发明的细菌优选为耐氧的厌氧乳酸菌，优选属于乳杆 菌属。
本发明的乳酸菌优选为杆状或球状，具有从长细到短弯杆状的不同形 状，且更优选不能运动的和/或不产孢子的，并且其发酵代谢产生的主要或 唯一产物是乳酸。在优选实施方案中本发明的微生物所属的乳杆菌属根据 如下特性被分为三个主要亚类，由此可预料本发明的乳杆菌种可以属于三 个主要亚类之一
(a) 同型发酵乳杆菌
(i) 产生乳酸，优选通过糖酵解途径从葡萄糖产生至少85%量的L-、 D-或DL-同分异构体乳酸；
(ii) 在45。C而不是15。C生长；
(iii) 形状为长杆状；和
(iv) 细胞壁中含有甘油磷壁酸；
(b) 同型发酵乳杆菌
(i) 产生乳酸，优选通过糖酵解途径产生L-或DL-同分异构体乳酸；
(ii) 在15。C生长，在45。C显示可变的生长；
(iii) 形状为短杆状或棒状；和
(iv) 在其细胞壁中含有核糖醇和/或甘油磷壁酸；
(c) 异型发酵乳杆菌
(i) 产生乳酸,优选通过戊糖磷酸途径从葡萄糖产生至少50%量的DL-同分异构体乳酸；
(ii) 产生二氧化碳和乙醇；
(iii) 在15。C或45。C显示可变的生长；
(iv) 形状为长或短杆状；和
(V)其细胞壁中含有甘油磷壁酸。
基于上述特性，本发明的微生物被分类为属于乳酸菌族，具体为乳杆菌属。通过使用经典分类学，例如参考"系统细菌学Bergey手册"(Williams & Wilkins Co., 1984)中相关描述，可以确定本发明的微生物属于乳杆菌属。 可选择地，根据本领域公知的方法，例如根据它们的代谢指紋，即本发明 的微生物糖代谢能力的可比较的概况，或根据其它方法，例如在Schldfer 等人，System. Appl. Microb" 18 (1995)， 461-467或Ludwig等人，System. Appl. Microb.， 15 (1992)， 487-501中所描述的方法将本发明的微生物分类 为属于乳杆菌属。本发明的微生物能代谢糖源，其对于属于乳杆菌属的微 生物是本领域典型且公知的。
也可以使用其它本领域公知的方法对本发明的微生物归入乳杆菌属进 行表征，例如使用SDS-PAGE凝胶电泳测定物种的总蛋白质，并将它们与 公知的和已经表征的乳杆菌属菌林进行比较。制备上述总蛋白质谱的技术 和此类镨的数值分析是本领域内技术人员所熟知的。然而，只有其过程的 各阶段充分标准化，结果才是可信的。当确定微生物系乳杆菌属时，面对 精确的要求，由其作者例如Pot等人在1994年9月12日到16日在比利时 Ghent大学由欧盟组织的"研讨会"中提出(细菌分类和鉴定的指故技术，全 细胞蛋白质的SDS-PAGE),有规律的制订公众可获得的标准化操作。分析 SDS-PAGE电泳凝胶的技术中所使用的软件是极为重要的，因为种间的相 关度依赖于此软件所用的参数和算法。不需进入理论细节，优选通过 Pearson相关系数将经光密度计测量和计算机标准化的条带定量比较。由 此所获得的类似矩阵可以在UPGMA (使用平均连接的不加权配对组方法) 算法的帮助下組织在一起，该算法不仅能够将最近似镨组合在一起，而且 負b构建树形图(见Kersters， Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow. A. G. O'Donnell编辑，John Wiley和Sons Ltd, 1985)。
可选择地，也可以才艮据所谓的Riboprinter.RTM.中关于核糖体RNA
的特征将所述本发明的微生物归入乳杆菌属。更优选地，通过将本发明细菌的16S核糖体RNA的核苷酸序列，或其编码16S核糖体RNA的基因 组DNA的核苷酸序列，与其它迄今为止已知的乳酸菌属和种相比较，而 将本发明新鉴定的种归入乳酸菌属。另一个优选的确定本发明新鉴定的种 属于乳酸菌属的选择是使用靶向16S-23S rRNA间隔区域的种特异性PCR 引物。另一个优选的选择是RAPD-PCR (Mqatu等人in Antonie van Leenwenhoek(79)，l-6，2001)，由于其产生菌林特异性DNA模式，允许确 定与本发明一致的鉴定微生物系乳酸菌属。另外的确定本发明的微生物系 乳酸菌属所使用的技术是限制性内切酶片段长度多态性(RFLP) (Giraffa 等人.Int. J. Food Microbiol. 82 (2003)， 163-172)、重复元素指紋法(Gevers 等人.FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36)或细菌细胞的脂肪酸曱基酯 (FAME)模式分析(Heyrman等人.FEMS Microbiol. Lett. 181 (1991)， 55-62)。可选择地，可以通过凝集素分型(Annuk等人.J. Med. Microbiol. 50 (2001)， 1069-1074)或分析它们的细胞壁蛋白质(Gatti等人.Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997)， 345-348.)来确定乳杆菌。
在本申请的优选实施方案中，微生物是益生乳杆菌种。在本发明中术 语"益生，，指如果孩史生物局部应用于皮肤，其具有对健康有益的作用。优选 地，"益生"微生物是活的微生物，当其局部应用于皮肤时，对此组织的健 康有益。最优选其意味着该微生物对皮肤孩i生物菌群具有正面的作用。
在优选实施方案中，本发明的微生物属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、 短乳軒菌(Lactobacillus brevis)或发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)种。然而，乳杆菌种并不限于这些。
在本发明特别优选的实施方案中，本发明的微生物选自以登录号为DSM 17248 (副干酪乳杆菌副干酪亚种Lactobacillus paracasei ssp. paracasei LB-OB-H2)、 DSM 17247 (短乳杆菌LB-OB-H 1)、 DSM 17250 (短 乳杆菌LB-OB-H4)和DSM 17249 (发酵乳杆菌LB-OB- H3)保藏于DSMZ 的副千酪乳杆菌、短乳杆菌或发酵乳杆菌组成的组。本发明也涉及上述保 藏的乳杆菌菌种的突变体或衍生物，其中所述突变体或衍生物保持了它们刺激固有皮肤微生物菌群的至少一种微生物生长的能力和它们不刺激暂居
病原;微生物菌群的^:生物生长的特性。
术语"以登录号保藏于DSMZ的副干酪乳杆菌、短乳杆菌或发酵乳杆 菌"指属于副千酪乳杆菌、短乳杆菌或发酵乳杆菌物种的微生物的细胞于 2005年4月18日保藏在德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) (DSMZ),保藏号为DSM 17248 (副干 酪乳杆菌LB-OB-H02)、 DSM 17247 (短乳杆菌LB-OB-HOl)、 DSM 17250 (短乳杆菌LB- OB-H04)和DSM 17249 (发酵乳杆菌LB-OB-H03)。 DSMZ 位于马舍尔欧德路(Mascheroderweg) lb， D-38124不伦瑞克 (Braunschweig),德国。上述保藏物依照国际承认的用于专利程序目的的微 生物保藏的布达佩斯条约来保藏。
在特别优选的实施方案中，本发明的微生物是"分离的"或"纯化的"。 术语"分离的"指材料从其原始环境中移出，例如天然环境(如果其天然存 在)，或培养基(如果其为培养的)。例如，天然存在的微生物(优选乳杆菌种) 从天然系统中某些或所有共存的材料中分离出来，则其为分离的。此类微 生物可以是组合物的部分，并且只要该组合物不是其天然环境的部分，则 此类微生物可仍然被视作是分离的。
术语"纯化的"不需要绝对纯化；而是意为相对确定的。从库中获得的 具体微生物已经按常规纯化为微生物学同质，即当用本领域公知的方法在 琼脂平板上划线时，它们作为单个菌落生长。优选地，为此目的使用的琼 脂平板是乳杆菌物种选择性的。此类选择性琼脂平板是本领域内公知的。
本发明的另 一方面涉及本发明微生物的无活性形式，其为例如热灭活 的或冻干的，但是其保留了刺激固有皮肤微生物菌群生长和不刺激暂居病 原皮肤樣吏生物菌群生长的特性。
根据本发明，术语"本发明微生物的无活性形式"包括本发明微生物(优 选此处公开的乳杆菌种)的死细胞或无活性细胞，其在对于乳杆菌属微生物 的特异平板上不能形成单菌落。所述死细胞或无活性细胞可以具有完整的 或破坏的细胞膜。杀死或灭活本发明微生物的细胞的方法是本领域公知的。El國Nezami等人.J. Food Prot. 61 (1998), 466-468描述了用紫外线照射灭 活乳杆菌种的方法。优选地，本发明微生物的细胞是热灭活或冻干的。本 发明细胞冻干的优势在于它们容易保藏和操作，而保留它们刺激固有皮肤 微生物菌群生长而不刺激暂居病原微生物菌群生长的特性。而且，当冻干 的细胞以本领域公知的条件应用于适当液体或固体培养基时，能够重新生 长。以本领域公知的方法进行冻干。优选在室温，即在16。C到25。C之间的 任意温度进行至少2小时。而且，本发明微生物的冻干细胞在4。C可以稳 定至少4周，仍然保留它们的上述特性。可以通过将本发明微生物的细胞 在170 。C培养至少2小时而实现热灭活。然而，优选通过将所述细胞在121 。C 饱和蒸汽存在下以2巴大气压进行高压灭菌至少20分钟来实现热灭活。 可选择将所述细胞在-20。C冷冻至少4周、3周、2周、l周、12小时、6 小时、2小时或1小时来获取本发明微生物的热灭活的细胞。优选至少70%、 75%或80%,更优选85%、卯％或95%，和特别优选至少97%、 98%、 99%和更特别优选99.1%、 99.2%、 99.3%、 99.4%、 99.5%、 99.6%、 99.7%、 99.8%或99.9%,和最特别优选100%的本发明孩1生物无活性形式的细胞是 死的或无活性的，然而，它们仍然具有刺激固有皮肤微生物菌群生长但不 刺激暂居病原微生物菌群生长的能力。本发明微生物的无活性形式是否的 确是死的或无活性的，可以通过本领域公知的方法来测试，例如通过活力 测试。
术语"本发明微生物的无活性形式"也包含本发明微生物的溶菌产物或 部分，优选此处^Hf的乳杆菌种，其中所述溶菌产物或部分优选刺激固有 皮肤微生物菌群生长而不刺激暂居病原微生物菌群(特别是此处所述的金 黄色葡萄球菌)生长。此种刺激的测试如此处所述，特别如所附实施例中所 述。此种情况，本发明微生物的溶菌产物或部分可能刺激暂居病原微生物 菌群生长，然后^支术人员能够例如通过本领域^^知的方法进一步纯化所述 溶菌产物或部分，以便除去可能刺激暂居病原微生物菌群生长的物质，这 些方法在下面举例列出。然后本领域技术人员可以再次测试所述溶菌产物 或部分是否刺激固有皮肤微生物菌群生长而不刺激暂居病原微生物菌群生 长。
根据本发明的术语"溶菌产物"指被破坏的本发明微生物的细胞在水介 质中的溶液或悬浮液或提取物。然而，不应该以任何受限制的方式来解释
该术语。细胞溶菌产物包含例如大分子，如DNA、 RNA、蛋白质、肽、 碳水化合物、脂类等等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂酸等等，或其部 分。另外，所述溶菌产物包含细胞碎片，其可以为平滑或颗粒结构。制备 微生物的细胞溶菌产物的方法是本领域内公知的，例如使用弗氏细胞压碎 器，使用玻璃或4失珠研磨细胞或酶促裂解等。此外，裂解细胞涉及用本领 域公知的多种打开/破坏细胞的方法。裂解细胞的方法并不重要，可以使用 任何能够使本发明微生物的细胞裂解的方法。本领域技术人员可以选择一 种适当的方法，例如通过酶促、化学或物理的方法打开/破坏细胞。酶和多 酶混合物的非限制性实例是蛋白酶，如蛋白酶K、脂酶或糖苷酶；化学方 法的非限制性实例是离子载体、去污剂如十二烷^^L酸钠、酸或碱；和物 理方法的非限制性实例是高压如弗氏高压、重量摩尔渗透压浓度、温度如 热和冷。另外，除了蛋白水解酶、酸、碱等等，也使用合适的酶组合物的 方法。例如用冷冻和融解来裂解本发明;微生物的细胞，更优选在低于-7(TC 的温度冷冻和高于3(TC的温度融解，特别优选在低于-75。C冷冻和高于 35。C融解，和最优选在低于-8(TC冷冻和高于37。C融解。也优选重复所述 冷冻/融解至少l次，更优选至少2次，甚至更优选至少3次，特别优选至 少4次和最优选至少5次。
因此，那些本领域的技术人员可以通过参考上述概括说明来制备所需 的溶菌产物，并且如果需要，将那些方法适当地修饰或改变。优选地，所 述溶菌产物所用的水介质是水、生理盐水或緩冲液。细菌细胞溶菌产物的 优点是能够容易地生产和保藏，由于需要较少的技术设备所以成本低。
根据本发明，溶菌产物也可以是来自上述溶菌产物的分子部分的制品。 这些部分可以通过本领域那些技术人员所公知的方法获得，例如层析(包括 例如亲和层析、离子交换层析、大小排阻层析、反向层析和用其它层析材 料柱层析)，或分4比处理法，其它分级方法例如过滤法，例如超滤、透析、
用大小排阻透析和浓缩离心，梯度密度离心或分步介质离心、沉淀(例如亲 和沉淀)、盐溶或盐析(硫酸铵沉淀)、醇沉淀，或其它蛋白质化学、分子生 物学、生物化学、免疫学、化学或物理学方法分离上述溶菌产物的组分。 在优选的实施方案中，优选那些比其它部分更具免疫原性的部分。那些本 领域的技术人员能够选择合适的方法，并参考实施例中上述常规说明和特 殊说明来确定其可能的免疫原性，如果需要可以将那些方法适当地修饰或 改变。
相应地，术语"本发明微生物的无活性形式，，也包含本发明微生物的滤 出液，优选此处公开的乳杆菌，其中所述滤出液优选抑制暂居病原微生物 菌群的一种或多种微生物(优选金黄色葡萄球菌)的生长，并且不抑制健康 正常的固有皮肤孩史生物菌群的微生物生长。此种抑制可以按本文所描述来 测试，具体按所附实施例中的描述。万一本发明微生物的滤出液可能不抑 制或者刺激暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长，然后技术人员能够 例如通过本领域7>知的方法进一步纯化所述滤出液，以便除去刺激暂居病 原皮肤孩i生物菌群的微生物生长的物质。然后本领域技术人员可以重新测 试所述滤出液是否抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长，而不抑 制固有皮肤微生物菌群的微生物的生长。
术语"滤出液"指本发明微生物的无细胞溶液或悬浮液，其通过将本发 明的微生物在本领域技术人员公知的适当液体、培养基或緩冲液中培养， 离心取上清液而获得。然而，不应该以任何受限制的方式来解释该术语。滤出液包含例如大分子，如DNA、 RNA、蛋白质、肽、碳水化合物、酯类等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂酸等，或其部分。制备微生物滤出 液的方法是本领域内公知的。另外，"滤出液"涉及本领域内公知的多种方 法。制备滤出液的方法并不重要，可以使用任何能够使本发明微生物的细胞滤出的方法。
术语"本发明;微生物的无活性形式"包含本发明微生物细胞的任何部 分。优选地，所述无活性形式是通过膜制备获得的膜部分。属于乳杆菌属 的微生物的膜制备可以通过本领域公知的方法获得，例如通过使用如Rollan等人.Int. J. Food Microbiol. 70 (2001)， 303-307、 Matsuquchi等人. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003)， 259-266或Stentz等人，Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000)， 4272-4278或 Varmanen等人.J. Bacteriology 182 (2000)， 146-154中描述的方法。可选择地，也可以利用全 细胞制品。
本发明的另 一方面涉及组合物，其包含根据本发明的微生物或如上所 述此类孩支生物的突变体、衍生物或无活性形式。在优选实施方案中，所述 组合物包含上述^:生物，其量为每毫克组合物的固体形式中含有102-1012 个细胞，优选103-108个细胞。组合物为液体形式的情况，微生物的量为每 毫升102-1013个细胞。在更优选的实施方案中，所述组合物是以软膏形式 或孩i:胶囊形式的乳浊液的形式，例如水包油乳剂或油包水乳剂。对于乳浊 液、软膏或微胶嚢的情况，组合物包含的所述微生物的量为每毫升102-1013 个细胞。然而，对于特定组合物，微生物的量可能与此处所述不同。
在另一方面，本发明提供生产保护皮肤对抗病原微生物的组合物的方 法，其包括以化妆品的或药物的可接受的载体或赋形剂配制根据本发明的 ;微生物或上述此种孩支生物的突变体、衍生物或无活性形式的步骤。
根据本发明使用的术语"组合物"涉及包含至少一种本发明的微生物或 上述所述微生物的突变体、衍生物或无活性形式的组合物。此处描述的本 发明组合物包含任意组合的上述成分。任选地，其还可能包含至少一种适合于保护皮肤对抗病原;微生物的成分。相应地，其任选地包含下述更多成分的任意组合。术语"适合于保护皮肤对抗病原微生物的成分"包含降低pH值的化合物或组合物和/或其组合。
组合物可能是固体、液体或气体形式，特别可能是粉末、溶液、气溶 胶、悬浮液、乳状液、液体、酏剂、提取物、酊剂或流体提取物，或特别 适合局部施用的形式。适合局部施用的形式包括例如糊剂、软膏、洗剂、 乳膏、凝胶或透皮贴剂。
优选地，本发明的组合物是化妆品组合物，还包含化妆品的可接受的 载体或赋形剂。更优选地，所述化妆品组合物是糊剂、软膏、洗剂、乳膏或凝胶。
本发明的化妆品组合物包含本发明的微生物，上述其突变体、衍生物 或无活性形式，连同本发明的组合物和另外的化妆品可接受的载体。优选 本发明的化妆品组合物用于局部施用。
此处所用的术语"化妆品可接受的载体"指适当的媒介物，使用其可将 本发明组合物以安全有效的方式应用于皮肤。此类媒介物可能包括例如乳 浊液的物质，例如水包油乳剂或油包水的乳剂、软膏或微胶嚢。将活性成
分以胶嚢形式，例如纤维素胶嚢，以明胶，用聚酰胺、类脂嚢泡(niosomes)、 腊模、环糊精或脂质体包裹来施用也是有利的。此处所用术语"安全有效量" 指刺激固有皮肤微生物菌群的至少一种微生物生长的足够量。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的微生物、或上述 其衍生物或突变体或无活性形式，还包含药物的可接受的载体或赋形剂。 药物组合物优选以适合于局部施用的形式。
另外，本发明涉及将本发明的微生物或上述其衍生物或突变体或无活 性形式用于制备组合物的用途，该组合物优选药物或化妆品组合物。
药物组合物包含治疗有效量的本发明微生物或本发明衍生物或突变体 或上述本发明」微生物的无活性形式，并且可以以多种形式配制，例如以固 体、液体、粉末、水溶液、冻干的形式。
如此处所述，可以使用药物的可接受的载体向患者施用药物组合物。 在具体实施方案中，术语"药物的可接受的"指由管理机构或其它普遍公认 的药典i人可〗吏用于动物，特别是用于人。
术语"载体"指用于实施治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类 载体是药物的可接受的，即其在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒。其 优选为等渗、低渗或微弱高渗的，并且具有相对低的离子强度，例如由蔗 糖溶液提供。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括那些来自 石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻 油等等。盐溶液和葡萄糖水和甘油溶液也可以作为液态载体使用。合适的 药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酰酯、滑石、钠离子、脱脂奶粉、甘油、丙烯、 乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，组合物也可以含有少量湿润剂或乳化剂，或pH緩冲剂。这些组合物的形式可以是例如溶液、悬浮液、乳剂、 粉末、持续释放制剂等等。合适的药物载体的实例在E.W. Martin的 "Remington Pharmaceutical Sciences"中描述。可用作药物载体的物质的 一些其它实例为糖，例如葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀 粉；纤维素和其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸 西旨；粉末状tragancanth;麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钾； 碳酸钓；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可 油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；藻 酸；无致热原水；等渗盐；蔓越橘提取物和磷酸盐緩沖液；脱脂奶粉；以 及其它用于药物制剂的无毒相容物质，例如维生素C、雌激素和echinacea。 也可以存在湿润剂和润滑剂例如月桂硫酸钠、和着色剂、调味剂、润滑剂、 赋形剂、压片剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。将活性成分以胶嚢形式施 用，例如纤维素胶嚢，以明胶，用聚酰胺、类脂嚢泡、腊模、环糊精或脂 质体包裹也是有利的。
通常，成分是例如作为干燥的冻干粉末或脱水浓缩物，在熔封容器如 安瓿或标示活性物质的量的小袋中被分开或混合在一起，以单位剂型提供。本发明的药物组合物可以以中性或盐形式配制。药物的可接受的盐包 括与阴离子形成的那些，例如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生 的盐，和与阳离子形成的那些，例如从钠、钾、铵、钧、氩氧化铁、异丙 胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。
可以任选地^f吏用体外或原位测定方法，例如实施例中描述的那些方法， 来帮助鉴定理想剂量范围。制剂所使用的精确剂量也依赖于给药途径，和 疾病或病症的严重性，并且应该根据医生诊断和每个患者的情况来确定。 优选局部给药途径。可以由体外或(动物)模型测试系统衍生的剂量效应曲 线来推测有效剂量。优选地，药物组合物是直接施用或与佐剂结合施用。 佐剂可能选自氯会，质子极性化合物，例如丙二醇、聚乙二醇、甘油、乙
醇、l-曱基-(左旋)-2吡咯烷酮或它们的衍生物，或非质子极性化合物，例 如二甲基亚砜(DMSO) 、 二乙基亚砜、二-(正)丙基亚砜 (di-n-propylsulfoxide)、 二甲砜、环丁砜、二甲基甲酰胺、二曱基乙酰胺、 四甲基脲、乙腈、或其衍生物。在pH限定条件下加入这些化合物。可以 向脊推动物施用本发明的组合物。此处所用"脊推动物"意指与本领域普通 技术人员通常所理解的含义一致。具体地，"脊推动物，，包括哺乳动物，特 别是人。
术语"施用"指上述组合物以治疗有效剂量施用。以"治疗有效剂量，，指 施用后产生效应的剂量，优选此效应保护皮肤对抗病原微生物。精确的剂 量依赖于治疗目的，而且将通过本领域技术人员使用已知技术来确定。正 如本领域公知和前面所描述的，需要根据全身或局部的递送、年龄、体重、 大致健康水平、性别、々大食、给药时间、药物相互作用和情况严重性进行 调整，并且通过本领域那些技术人员用例行实验来确定。
本方法适用于人治疗和兽医应用。此处描述的具有预期治疗活性的化 合物可能如此处所述以生理学上可接受的载体向患者施用。依赖于施用方 式，化合物可能以如下讨论的多种方式配制。制剂中治疗上有活性化合物 的浓度可以从约0.01-100%的重量百分比变化。该物质可以单独施用或与 其它治疗组合施用。
可以通过多种方式施用药物组合物。优选的施用途径是局部途径。
剂量方案由主治医师和临床因素决定。正如医学领域内所熟知的，对 于任一个患者的剂量依赖于许多因素，包括患者的尺寸、体表面积、年龄、 具体施用的化合物、性别、给药时间和途径、大致健康水平、和其它同时 施用的药物。通常剂量可以在例如0.001-1000 ng范围内；然而，特别是考 虑到上述因素时，也可以使用低于或高于此范例范围的剂量。
优选该剂量每周施用一次，更优选每周2次、3次、4次、5次或6次， 和最优选每天一次，甚至更优选每天2次或更多。特别优选每当固有皮肤 菌群发生紊乱(例如通过清洗)之后给药。然而，在治疗进展过程中，可以 以更长的时间间隔给药和按需要以更短的时间间隔给药，例如一天几次。
在优选的情况下，用此处所述方法和本领域那些技术人员公知的其它方法 来监测免疫应答，并优化给药剂量，例如时间、量和/或组分。通过定期评 估来监测逸艮。药物组合物也可以应用于共治疗途径，即与其它药物或药 品同时施用，例如其它保护皮肤对抗病原微生物的药品。
当所希望的治疗涉及局部施用所容易接近的区域或器官时，本发明的 化妆品的或药物的组合物的局部施用是有用的。对于皮肤的局部应用，药 物组合物优选以合适的糊剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶或透皮贴剂配制。 依赖于使用的区域，化妆品的或药物的制剂也可以是喷雾(泵喷雾或气溶 胶)、泡沫、凝胶喷雾、摩丝、悬浮液或粉末的形式。
合适的糊剂包含悬浮于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于) 石油、软白石蜡、黄色石油冻和甘油。
化妆品的或药物的组合物也可能以合适的软膏配制，该软膏包含悬浮 或溶解于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于)一种或多种甘油、 矿物油、液体油、液体石油、白色石油、黄色石油冻、丙二醇、乙醇、甘 油三酯、脂肪酸酯例如鲸蜡酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、蜡例如白蜡或 黄色蜂蜡、脂肪酸醇例如鲸蜡醇、硬酯酰醇和鲸蜡基硬脂酰醇、脂肪酸例 如硬酯酸、鯨蜡基硬酯酸盐、羊毛脂、氢氧化镁、高岭土和水。可选择地， 化妆品的或药物的组合物也可能以合适的洗剂或乳膏配制，其包含悬浮或 溶解于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于)一种或多种矿物油 例如石蜡、植物油例如蓖麻油、蓖麻籽油和氢化蓖麻油、失水山梨糖醇单 硬脂酸酯、聚山梨酸酯、脂肪酸酯例如鲸蜡酯、蜡、脂肪酸醇例如鲸蜡醇、硬脂酰醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、乙醇、甘油三酯和水。
可选择地，化妆品的或药物的组合物也可以用合适的凝胶配制，其包 含悬浮或溶解于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于)一种或多 种水、甘油、丙二醇、液状石蜡、聚乙烯、脂肪油、纤维素衍生物、皂土 和胶态二氧化硅。
根据本发明的气溶胶的合适推进剂是常规的推进剂，例如丙烷、丁烷、 戊烷和其它。
根据本发明的制剂通常包含更多的此类制剂通常使用的辅助剂，例如 防腐剂、芳香剂、消泡剂、染料、色素、增稠剂、表面活性物质、乳化剂、 润滑剂、修饰剂、脂肪、油脂、蜡类或其它对于化妆品或皮肤病制剂的常 用组分，例如酒精、多元醇、聚合物、泡沫稳定剂、可溶促进剂、电解质、 有机酸、有机溶剂、或硅氧烷衍生物。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物可能包含润滑剂。润滑剂以有效防止或减緩解干燥的量使用。有用的润滑剂包括(但不限于)烃油和蜡； 硅酮油；甘油三酯；乙酰甘油酯；乙氧基甘油酯；烷基酯；链烯基酯；脂 肪酸；脂肪醇；脂肪醇醚；醚酯；羊毛脂和衍生物；多羟基醇(多元醇)和 聚醚衍生物；多羟基醇(多元醇)酯；蜡酯；蜂蜡衍生物；植物蜡；磷脂； 固醇；和酖胺。
因此，例如通常的润滑剂包括矿物油，特别是具有50-500 SUS粘性的 矿物油，羊毛脂油，貂油，椰子油，可可脂，橄榄油，杏仁油，澳大利亚 坚果油(macadamia nut oil)，,荟提取物，霍霍巴油，红花油，玉米油， 液体羊毛脂，棉花子油，花生油，purcellin油，全氢化角篁烯(角篁烯)， 荒麻油，聚丁烯，无味矿物精，甜杏仁油，垮梨油，calophyllum油，蓖 麻毒蛋白油，维生素E，橄榄油，矿物精，鲸蜡硬脂醇(主要由鲸蜡醇和硬 脂醇组成的脂肪醇混合物)，亚麻醇，油醇，辛基十二醇，谷物种子油例如 小麦胚油，鯨蜡硬脂醇辛酸酯(鲸蜡硬脂醇和2-乙基己酸酯)，鲸蜡基棕榈 酸酯，二异丙基己二酸酯，棕榈酸异丙酯，棕榈酸辛酯，肉豆蔻酸异丙酯， 肉豆蔻酸丁酯，^J旨酸甘油酯，十六烷基硬脂酸酯，异鲸蜡基硬脂酸酯， 硬脂酸辛酯，辛基羟基硬脂酸酯，丙二醇硬脂酸酯，硬脂酸丁酯，油酸癸 酯，油酸甘油酯，乙酖基甘油酯，(C12-C15)醇的辛酸酯和苯甲酸酯，辛酸 和癸酸的乙酯和多元醇酯例如它们的乙二醇酯和甘油酯，和蓖麻油酸的乙 酯和多元醇酯例如异丙基己二醇酯，月桂酸己酯，十二烷酸辛酯，聚二曱 基硅氧烷共聚醇，聚二甲基硅氧烷醇，羊毛脂，羊毛脂醇，羊毛脂蜡，氢 化羊毛脂，羟基羊毛脂，乙酰羊毛脂，凡士林，羊毛脂酸异丙酯，肉豆蔻 酸鲸蜡醇酯，肉豆蔻酸甘油酯，肉豆蔻酸肉豆蔻酯，肉豆蔻基乳酸酯，鲸蜡醇，异硬脂醇，硬脂醇，和异鲸蜡基羊毛脂等等。
而且，根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含乳化剂。乳 化剂(即乳化物质)优选以有效提供组合物成分均匀混合的量使用。有用的 乳化剂包括(i)阴离子例如脂肪酸盐，例如硬脂酸钾，硬脂酸钠，硬脂酸胺，
和硬脂酸三乙醇胺；含脂肪酸盐的多元醇脂肪酸单酯，例如包含钾或钠盐 的单硬脂酸甘油酯；硫酸酯(钠盐)，例如月桂基5硫酸钠(sodium lauryl 5 sulfate),鲸蜡基硫酸钠；和含硫酸酯的多元醇脂肪酸单酯，例如含月桂基 石克酸钠的单硬脂酸甘油酯；(ii)阳离子氯化物例如N (Stearoyl Colamino Formylmethyl) /y;W必M附；N-大豆-N-乙基吗啉乙^^L酸盐；烷基二甲基节 基氯化銨；diisobutylphenoxytheoxyethyl 二甲基爷基氯化铵；和cetyl pyridium chloride;和(iii)非离子表面活性剂例如聚氧乙烯脂肪醇醚，例如 单硬脂酸酯；聚氧乙烯月桂醇；聚氧丙烯脂肪醇醚，例如丙氧基油醇；聚 氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸 酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单硬脂酸酯；失水山梨糖醇脂肪酸酯，例 如失水山梨糖醇；聚乙二醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇单硬脂酸酯；和多元 醇脂肪酸酯，例如单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯；和乙氧基羊毛脂 衍生物，例如乙氧基羊毛脂，乙氧基羊毛脂醇和乙氧基胆固醇。乳化剂的 选捧在Schrader， Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hi3thig Buch Verlag, Heidelberg,第二版，1989,第三部分举例描述。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包括表面活性剂。合适 的表面活性剂包括例如那些通常的清洁剂、乳化剂、增泡剂、助水溶物、 增溶剂、悬浮剂和非表面活性剂(利于固体在液体中分^L)。
表面活性剂通常分为两性、阴离子、阳离子、和非离子型表面活性剂。 两性表面活性剂包括酰基氨基酸和衍生物和N-烃基氨基酸。阴离子表面活 性剂包括酰基氨基酸和盐，例如酰基谷氨酸、酰基肽、酰基肌氨酸盐和 酰基牛磺酸盐；羧酸和盐，例如链烷酸、羧酸酯和羧酸醚；磺酸和盐，例 如酰基羟乙基磺酸盐、烷基酰基磺酸盐、烷基磺酸盐和磺基丁二酸盐；硫 酸酯，例如烷基醚石克酸酯和烷基硫酸酯。阳离子表面活性剂包括烷基胺、烷基咪唑啉、乙氧基胺和四元盐(例如烷基苯二甲基铵盐、烷基甜菜碱、杂
环铵盐和四烷基胺盐)。非离子型表面活性剂包括醇，例如包含8-18个 碳原子的伯醇；烷醇胺，例如烷醇胺衍生的酰胺和乙氧基酰胺；氧化胺； 酯，例如乙氧基羧酸、乙氧基甘油酯、乙二醇酯和衍生物、甘油一酯、多 聚甘油酯、多元醇酯和醚、失水山梨糖醇/山梨糖醇酯、和磷酸三酯；和醚， 例如乙氧基乙醇、乙氧基羊毛脂、乙氧基聚硅氧烷和丙氧基聚氧乙烯醚。
此外，根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含成膜物。与 本发明一致使用的合适成膜物使组合物光滑和平坦，且包括(不限于)丙 烯酰胺/丙烯酸钠共聚物；丙烯酸铵共聚物；秘鲁香脂；纤维素胶；乙烯/ 马来酸酐共聚物；羟乙基纤维素；羟丙基纤维素；聚丙烯酰胺；聚乙烯； 聚乙烯醇；pvm/MA共聚物(聚乙烯曱基醚/马来酸酐)；PVP(聚乙烯吡咯烷 酮)；马来酸酐共聚物，例如从Gulf科学与技术获得的PA-18; PVP/十六 碳烯共聚物，例如从GAF公司获得的Ganex V-216; acryliclacrylate共聚 物；等等。
通常，成膜物可能以总组合物重量的约0.1%到约10%的量使用，优 选约1%到约8%，最优选约0.1 DEG/O到约5%。也使用有效量的湿润剂， 包括果糖；葡萄糖；glulamic acid;甘油；蜂蜜；麦芽糖醇；甲基葡萄 糖苷醚-10;曱基葡萄糖苷醚-20;丙二醇；乳酸钠；蔗糖；等等。
当然，本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含防腐剂。根据本 发明的确定组合物的防腐剂包括(不限于)对羟基苯甲酸丁酯；对羟基苯 甲酸乙酯；咪唑烷脲；对羟基苯甲酸曱酯；O-苯基苯酚；对羟基苯曱酸丙 酯；季铵盐-14;季铵盐-15;脱氢醋酸钠；吡咬硫酮锌；等等。
防腐剂以防止或延緩孩i:生物生长的有效量使用。通常，防腐剂以组合 物总重量的约0.1°/ 到约1%的量使用，优选约1%到约0.8%，最优选约 0.1%到约0.5%。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含芳香剂。本领域那 些技术人员熟知的芳香剂(芳香组分)和色素(着色剂)可能以赋予本发明组 合物所希望的香味和颜色的有效量使用。
此外，本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含蜡。与本发明一致使用的合适的蜡包括动物蜡，例如蜂蜡、鲸蜡或羊毛蜡(羊毛脂)；植 物蜡，例如巴西棕榈蜡或小烛树蜡；矿物蜡，例如褐煤蜡或地蜡(ozokerite); 和石油蜡，例如石蜡和微晶蜡(高分子量的石油蜡)。动物、植物和一些矿 物蜡主要是高分子量脂肪醇和高分子量脂肪酸形成的酯。例如，三十烷醇 的棕榈酸酯是通常的蜂蜡的主要成分。
根据本发明的其它合适的蜡包括合成蜡，其包括聚乙烯聚氧乙烯和由 一氧化碳和氢衍生的烃基蜡。
典型的蜡也包括地蜡(cerosin);鲸蜡酯；氢化霍霍巴油；氬化霍霍 巴蜡；氢化米糠蜡；日本蜡；霍霍巴乳脂；霍霍巴油；霍霍巴蜡；mmik 蜡；褐煤酸蜡；小冠巴西棕蜡；米糠蜡；虫胶蜡；硫化霍霍巴油；合成蜂 蜡；合成霍霍巴油；三羟基硬脂精；鲸蜡醇；硬脂醇；可可脂；羊毛脂脂 肪酸；在25。C为固体的单-、双-、和25甘油三酯，例如glyceyl tribehenate (二十二烷酸和甘油的三酯)和Clg-C36酸甘油三酯(Clg-C36羧酸和甘油的 三酯混合物)，其可从Croda， Inc., New York, N.Y.分别以商业名 Syncrowax HRC和Syncrowax HGL-C获得；在25 。C为固体的脂肪酯； 硅氧烷蜡例如甲基十八烷氧聚硅氧烷和多聚(二曱基硅氧烷基)硬脂氧硅氧 烷；硬脂酰单-和二乙醇胺；松香和其衍生物，例如乙二醇和甘油的松香酸 酯；25。C为固体的氢化油；和蔗糖甘油酯。可以以水系统中的有效量使用 增稠剂(粘性控制剂)，其包括藻胶；卡波姆例如卡波姆934、 934P、 940 和941;纤维素胶；鲸蜡硬脂醇、椰子酸二乙醇酰胺DEA、糊精；明胶； 羟乙基纤维素；幾丙基纤维素；羟丙基甲基纤维素；硅酸镁铝；肉豆蔻醇； 燕麦粉；油酰胺DEA;油醇；PEG-7M; PEG-14M; PEG-90M;硬脂酰 胺DEA;硬脂酰胺MEA;硬脂醇；黄蓍胶；小麦淀粉；黄原胶；等等。 上述列出的增稠剂中，DEA是二乙醇胺，MEA是乙醇胺。增稠剂(粘性控 制剂)可能以非水系统中的有效量使用，其包括硬脂酸铝；蜂蜡；小烛树蜡; 棕榈蜡；地蜡(ceresin);鲸蜡硬脂醇；鲸蜡醇；胆固醇；水合二氧化硅； 氢化蓖麻油；氢化棉花子油；氢化豆油；氢化牛油脂酸甘油酯；氢化植物油；羟丙基纤维素；羊毛脂醇；肉豆蔻醇；辛基十二醇硬脂酰硫酸酯；油 醇；地蜡(ozokerite);微晶蜡；石蜡、季戊四醇四辛酸酯；聚丙烯酰胺； 聚丁烯；聚乙烯；丙二醇二辛酸酯；丙二醇二壬酸酯；stearalkonium hectorite;硬脂醇；硬脂酰硬脂酸酯；合成蜂蜡；三羟基硬脂酸甘油酯； 三亚油酸甘油酯；三硬脂酸甘油酯；硬脂酸锌；等等。
制剂中常见的天然和合成增稠剂或成胶物是交叉连接的聚丙烯酸和其 衍生物，多糖例如黄原胶或藻酸盐、羧甲基纤维素或羟基羧曱基纤维素， 水胶体例如阿拉伯胶，或蒙脱石矿例如皂土或脂肪醇，聚乙烯醇和聚乙烯 p比咯烷酮。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物中可以添加或使用的其它成分 以它们预期使用的有效量使用，包括提高性能或消费需求的生物学添加 剂，例如氨基酸、蛋白质、香草、芦荟提取物、生物黄酮素等等；緩冲剂、 螯合剂，例如EDTA;乳化稳定剂；pH调节剂；不透明剂；和推进剂， 例如丁烷二氧化碳、乙烷、氢氯氟碳化合物22和142b、氢氟烃152a、异 丁烷、异戊烷、氮、 一氧化二氮、戊烷、丙烷等等。
此夕卜，为了补充或促进其作用，根据本发明的制剂也可能包含抗氧化、 自由基清除、增加皮肤水分或保湿、抗红斑、抗炎或抗过敏的化合物。具 体地，这些化合物可以选自维生素、植物提取物、a和p羟基酸、神经酰 胺、抗炎剂、抗菌剂或紫外过滤物质、及其衍生物和混合物。有利地，根 据本发明的制剂也可能包含吸收UV-B和/或UV-A区域紫外辐射的物质。 有利的脂相选自矿物油、矿物蜡、分枝和/或非分枝烃和烃蜡、饱和和/或 不饱和、分枝和/或非分枝<:8-<:24-烷羧酸的甘油三酯；它们也可选自合成、 半合成或天然油脂，例如橄榄油、棕榈油、杏仁油或混合物；油、脂肪或
蜡、饱和和/或不饱和、分枝和/或非分枝C3-C3。-烷羧酸与饱和和/或不饱和、
分枝和/或非分枝CVC3(r醇的酯，芳香族羧酸和饱和和/或不饱和、分枝和/ 或非分枝C3-C3。-醇，例如肉豆蔻酸异丙酯、异丙基硬脂酸酯、己癸基硬脂 酸酯、油酸油酯；也有此类酯的合成、半合成和天然混合物，例如霍霍巴 油、烷基苯甲酸酯或硅酮油，例如环曱基硅氧烷、二甲基聚硅氧烷、二乙
基聚硅氧烷、八甲基环四硅氧烷和其混合物或二烷基醚。
根据本发明的活性成分可能例如用于清洁皮肤的化妆品组合物，例如 块状皂、香皂、乳白肥皂、透明皂、豪华皂、脱臭皂、膏状皂、嬰儿皂、 护肤皂、磨砂皂、合成洗涤剂、液体皂、糊状皂、软皂、洗涤糊剂、洗涤 液、淋浴和沐浴制品例如洗涤剂、淋浴制品、淋浴凝胶剂、泡沫浴用剂、
膏状泡沫浴用剂、油浴剂、沐浴精华液、擦洗制品、原位产品(in-situ product)、剃须泡沫、刮脸洗剂、剃毛霜。另外，适合皮肤化妆品制剂的 还有例如油包水或水包油的皮肤和身体乳膏、日霜和晚霜、防晒组合物、 晒后产品、护手产品、面霜、多重乳剂、啫喱、微乳剂、脂质体制品、类 脂嚢泡制品、防皱霜、面油、脂质体凝胶、运动凝胶剂(sportgel)、增湿霜、 增白霜、维生素霜、皮肤洗剂、护理洗剂、安瓿、剃须后洗剂、剃须前洗 剂(preshaves)、保湿洗剂、晒黑洗剂、脂肪霜、除色素组合物、按摩制品、 身体粉末、面部滋补剂、除臭剂、止汗剂、鼻贴、抗痤疮组合物、驱虫剂 和其它。
在优选的实施方案中，化妆品组合物包含日用护理水包油制剂，其可 能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％): A
1.7鲸蜡硬脂醇聚醚-6,硬脂醇
0.7鲸蜡硬脂醇聚醚-25
2.0 二乙胺羟基苯甲跣基苯甲酸己酯
2.0PEG-14 二曱基硅油
3.6鲸蜡硬脂醇
6.0乙基己基甲猛肉桂酸酯
2.0 二丁基己二酸酯
B
5.0甘油
0.2 EDTA 二钠
1.0泛醇
适量防腐剂
67.8软化水(aqua dem.) C
4.0辛/癸酸甘油三酯(caprylic/caprictriglyceride)、丙烯酸钠共聚物 D
0.2磷酸抗坏血酸钠 1.0醋酸维生素E 0.2红没药醇
1.0辛/癸酸甘油三酯、抗坏血酸钠、维生素E、维生素A
1.0某种乳杆菌
E
适量氢氧化钠
将A相和B相分别加热到约80。C。随后将B相搅入A相并混匀。将 C相搅入A相和B相的组合物中并混匀。混合物在搅拌下冷却到约40°C; 然后加入D相并用E相调节pH值到约6.5。随后将溶液混匀并冷却到室 温。
在更优选的实施方案中，化妆品组合物包含防护日霜水包油制剂，其 可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％): A
1.7鲸蜡硬脂醇聚醚-6，硬脂醇
0.7鲸蜡硬脂醇聚醚-25
2.0 二乙胺鞋基苯甲酰基苯甲酸己酯
2.0 PEG-14二甲基珪油
3.6鲸蜡硬脂醇
6.0乙基己基甲氧基肉桂酸酯
2.0 二丁基己二酸酯
B
5.0甘油
0.2 EDTA 二钠
1.0泛醇
适量防腐剂
68.6软化水
C
4.0辛/癸酸甘油三酯、丙烯酸钠共聚物
D
1.0磷酸抗坏血酸钠
1.0醋酸维生素E
0.2红没药醇 1.0某种乳杆菌
E
适量氢氧化钠
A相和B相分别加热到约80℃。随后将B相搅入A相并混匀。将C 相引入A相和B相混合物中并混勻。混合物在搅拌下冷却到约40℃;加 入D相并用E相调节pH值到约6.5。随后将溶液混匀并冷却到室温。
在更优选的实施方案中，化妆品组合物包含皮肤清洁水包油制剂，其 可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
10.0鲸蜡石更脂基乙基己酸酯(cetearyl ethylhexanoate)
10.0辛/癸酸甘油三酯
1.5环戊娃氧坑(cyclopentasiloxane)、 环己娃氧烷(cyclohexasilosane)
2.0PEG-40氩化蓖麻油
B
3.5辛/癸酸甘油三酯、丙烯酸钠共聚物
C
1.0醋酸维生素E
0.2红没药醇
适量防腐剂
适量芳香油
D
3.0聚季铵盐-44
0.5椰油三甲基琉酸曱酯铵盐(cocotrimonium methosulfate)
0.5鲸蜡硬脂醇聚醚-25
2.0泛醇、丙二醇
4.0丙二醇
0.1 EDTA 二钠
1.0某种乳杆菌
60.7软化水
首先将A相溶解，随后将B相搅入A相。然后将C相引入A相和B 相混合物中。下一步，将D相溶解并搅入A、 B和C相组合物中。将混合 物混匀并搅拌15分钟。
在更优选的实施方案中，化妆品组合物包含日间身体护理喷雾制剂， 其可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
3.0乙基己基甲氧基肉桂酸酯
2.0 二乙胺羟基苯曱酰基苯甲酸己酯
1.0聚季铵盐-44
3.0丙二醇
2.0泛醇、丙二醇
1.0环戊硅氧烷，环己硅氧烷
10.0辛基十二醇
0.5 PVP
10.0辛/癸酸甘油三酯
3.0 C12-15烷苯甲酸酯
3.0甘油
1.0醋酸维生素E
0.3红没药醇
1.0某种乳杆菌
59.2乙醇
称出A相的组分并溶解至澄清。在更优选的实施方案中，化妆品组合 物包含皮肤凝胶，其可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下 成分(％):
A
3.6 PEG-40氬化蓖麻油
15.0乙醇
0.1红没药醇
0.5醋酸维生素E
适量芳香油
B
3.0泛醇
0.6卡波姆
1.0某种乳杆菌
75.4软化水
C
0.8三乙醇胺
首先将A相溶解至澄清。将B相浸软并且随后以C相中和。下一步， 将A相搅入混匀的B相中，并将混合物混匀。
在仍然更优选的实施方案中，化妆品组合物包含剃须后洗剂，其可能 含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
10.0鲸蜡硬基乙基己酸酯
5.0醋酸维生素E
1.0红没药醇0.1芳香油
0.3丙烯酸酯/C 10-30烷基丙烯酸酯交叉共聚物 B
15.0乙醇 1.0泛醇 3.0甘油 1.0某种乳杆菌 0.1三乙醇胺 63.5软化水
将A相的成分混合。下一步，将B相溶解并搅入A相中，随后混匀。
本发明也涉及根据本发明的微生物或如上所述其衍生物、突变体或无
活性形式用于制备预防或治疗皮炎，优选遗传过敏性皮炎、牛皮痺、毒葛
皮炎、疱渗性湿渗、脓痺或齊疮的药物组合物的用途。
本发明的另 一方面涉及生产组合物的方法，包含以化妆品的和/或药物
的步骤。
此外本发明涉及预防或治疗皮炎的方法，优选遗传过敏性皮炎、牛皮 裤、毒葛皮炎、疱瘆性湿渗、脓癣或疥疮，其包含将根据本发明的组合物 按其预防上或治疗上的有效剂量施用于患者的步骤。
应该理解本发明并不限于此处所述的特定方法、方案、细菌、媒介和 试剂等等，因为这些可能会改变。也应该理解此处所用术语只用于描述特 殊实施方案的目的，而非意在限制本发明的范围，该范围仅受附加权利要 求的限制。除非另外定义，所有此处所用的技术和科学术语与本领域普通 技术人员通常理解的意义一致。
优选地，此处所用术语如"生物^t术术语多语言字典(IUPAC推荐)" Leuenberqer. H.G.W， Naqel. B.和K61bl. H.编辑(1995)， Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland中的描述来定义。在本说明书和随后的 权利要求中，除非正文另外需要，术语"包含"应该理解为包括所声明的整体或步骤、或整体或步骤的组，但不排除任何其它的整体或步骤、或整体 或步骤的组。
本说明书中引用了一些文件。不论上文或下文，本文引用的每个文件 (包括所有专利、专利申请、科学出版物、厂家说明书、说明书等等)都以 其整体引入作为参考。由于先发明，这不应解释为承认本发明不享有对在 先的这类公开的权利。
必须注意的是，除非文中另外清楚说明，此处和附加权利要求中所使 用的单数形式也包括复数。因此，例如参考"试剂，，包括一种或多种此类不 同试剂，参考"方法"包括等同于本领域那些普通技术人员所公知的步骤和 方法，这些步骤和方法可以被修改或取代用于此处所述方法。
本发明的第二方面涉及能够抑制一种或多种暂居病原皮肤微生物菌群 生长的孩i生物，其不抑制健康正常的固有皮肤微生物菌群的微生物生长。
发明者惊奇地发现可以通过向皮肤施用上述微生物或其无活性形式来 实现皮肤对抗病原微生物定居的有效保护。发明者首次鉴定了相应微生物， 并提供了鉴定它们的方法。这些微生物能够差别地抑制皮肤上微生物的生 长，即它们有选择地抑制病原微生物生长，但是不影响健康共生菌群的生 长。因此这些微生物能够再生和稳定天然皮肤菌群。
在皮肤上存在许多不同的微生物。 一些属于皮肤的正常(固有)菌群， 是无害共生体，而一些是可能的病原体。
基本上，皮肤上的有机体可分为两类
1. 固有有机体固有有机体永久定居于皮肤上，其定居在皮肤表面、 角质层和表皮外层及皮肤和毛嚢的深缝中。这些固有皮肤菌群的微生物能 够在皮肤上生长和繁殖，而不侵入或破坏皮肤组织。较深皮肤区域中的这 些有机体并不能通过洗涤轻易除去。固有微生物是无害共生体。
2. 暂居有机体暂居有机体是置于皮肤上但是不在那里繁殖的微生 物，或者在皮肤上繁殖和短期存在的污染物。它们不能永久存在于健康皮 肤上，1建康皮肤的微环境主要由固有菌群所决定。暂居有机体是可能的病 原体。
因此，术语"暂居病原皮肤菌群"指置于皮肤上但是不在那里繁殖的微 生物，或者短期在皮肤上繁殖和存在的污染物。具体地，如果微生物应用 于皮肤上，不能在健康皮肤提供的环境条件下生长和复制，并且不能永久 定居于此器官(或其区域)上，那么这种微生物被认为属于暂居病原皮肤菌 群。
一些细菌、酵母和真菌可以暂时从人皮肤分离，但是特别是如下微生
物由于它们频繁出现，可以被分类为暂居菌群金黄色葡萄球菌、酿脓链 球菌、革兰氏阴性杆菌(例如乙酸钙不动杆菌)、白色念珠菌和糠秕马拉色 菌。暂居菌群的孩i生物通常具有致病因子，其允许细菌附着于病症皮肤区 域。其能够附着于例如胶原结构或角蛋白结构。
微生物皮肤菌群的成分和组分可以通过例如用苏格兰胶带剥离上层皮 肤来定量和定性地确定。皮肤菌群的微生物可以通过例如用苏格兰胶带剥 离的IO层以内上层皮肤来鉴定。可作为范例的，用6个2ci^的苏格兰胶 带分别用力按在皮肤的确定区域来分离这些微生物，优选在前臂上，然后 每个胶带的剥离物从皮肤转移到选择性琼脂培养平板上，平板或者是革兰 氏阳性(例如BHI， Difco Inc.)或者是革兰氏阴性细菌(例如麦康基琼脂， Difco Inc.),或者转移到酵母和真菌的选择性琼脂培养基上(例如平板计数 琼脂，Difco Inc.)。然后从皮肤转移到琼脂培养平板上的微生物在30。C和 37°C,需氧和厌氧条件下培养约24小时。通过形态学和生物化学方法进行 定性分析，以及定量计数来确定菌落形成单位。确定相对组合物和总细胞 计数。本领域技术人员能够通过本领域内已知的方法确定如上所述分离的 皮肤菌群微生物菌群的属和/或种。
暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的测定可以通过例如代谢足迹法、 脂肪酸组分和细l包壁组分评估、16S核糖体RNA测序或编码特异致病因子 的特异DNA探针检测。
如果一种微生物在接触暂居病原微生物菌群时导致其生长减慢，则此 种微生物被认为抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长。术语"抑制 暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长"指本发明的微生物减慢至少一 种、优选多于一种、优选多于两种、更优选多于5种和特别优选任何的暂
居病原菌群的微生物的生长。在更优选的实施方案中，本发明的孩i生物抑 制暂居病原皮肤菌群的主要代表性微生物(即金黄色葡萄球菌)的生长。在 更优选的实施方案中，本发明的微生物特异性抑制金黄色葡萄球菌的生长。 "特异性"优选指其抑制金黄色葡萄球菌的生长，但是不显著或仅有微弱程 度地抑制其它微生物的生长，特别是那些属于固有皮肤菌群的微生物。更 优选地，术语"特异性"指抑制葡萄球菌的程度远高于抑制其它微生物的程 度，特别是固有皮肤微生物菌群的微生物。术语"特异性"特別优选指在本 领域技术人员公知的合适生长测定中，在存在本发明微生物时，金黄色葡 萄球菌的增殖最多为另 一微生物(特别是其它固有皮肤微生物菌群的另一微生物)增殖的50%。优选地，在存在本发明微生物时，金黄色葡萄球菌 的增殖是另一微生物(特别是其它固有皮肤菌群微生物菌群的另一微生物) 增殖的40%、 30%、 20%、 10%，更优选为5%和最优选为0%。对金黄 色葡萄球菌的特异性抑制在实施例lO和ll中给出，其例证说明了在体外 液体测定中，根据本发明的微生物不抑制藤黄微球菌和大肠杆菌。在优选 的实施方案中，本发明的微生物抑制金黄色葡萄球菌的生长，但是不抑制 籐黄孩乏球菌和/或大肠杆菌的生长。
在特别优选的实施方案中，当使用包含甘油的培养条件时，可以检测到 对金黄色葡萄球菌的特异性抑制。
生长减慢优选指增殖减慢，即每单位的细胞分裂减慢。可选择地，术 语"抑制"也指单个细胞大小的减小。细菌细胞的大小可以在用SYBR Green I (分子探针，USA)染料染色后通过流式细胞计量法(例如 Becton-Dickinson FACSort流式细胞仪，San Jose， CA)来评估。细菌细胞大 小用偏角光散射(SSC)模式估算。
因此生长减'隄指单位时间内产生的生物量的降低。
优选在体外观察暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长抑制，更优 选用一种测定方法，其中根据本发明的微生物与一种或多种暂居病原皮肤 菌群的孩i生物接触，并且测定这个(这些)暂居病原皮肤微生物菌群的微生 物的生长。可以通过在培养的不同时间间隔之后进行细胞/菌落计数来测定生长，并将其与不包含根据本发明微生物的对照相比较，以此来确定生长 是否加速或减慢。
在实施例中描述了测定生长抑制的体外测定，其包含所谓的"体外孔平
板测定"。简言之，此类测定包含如下步骤
-培养至少一种暂居病原皮肤菌群的微生物，将其均匀涂布到预备好 的包含适于各微生物生长(且优选检测)的适当琼脂培养基的琼脂平板上；
-在接种的琼脂平板提供孔；
-用预培养的根据本发明的微生物细胞填充孔；
-琼脂平板在允许暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长的条件下培 养适当的时间；和
-在含有根据本发明的微生物的孔周围检测暂居病原皮肤菌群的微生 物的生长，且将其与不含根据本发明的微生物的孔周围微生物的生长相比 较。
可以用可获得的测定细胞和/或菌落数的手段和方法来影响最后一步 中生长的测定，例如用适当的染料染色和/或光学手段例如光密度法、和在 显微镜下计数细胞/菌落。在优选的实施方案中，用孔附近出现的透明区域 的直径来确定抑制面积。
更优选地，用"体外液体测定"来确定对暂居病原皮肤微生物菌群的微 生物的生长抑制。此测定方法在实施例中描述，且简要包括如下步骤
-在液体培养基中培养至少一种暂居病原皮肤微生物菌群的微生物；
-将根据本发明的微生物的整分试样的液体培养物和暂居病原皮肤微 生物菌群的微生物的整分试样的液体培养物接种于允许暂居病原皮肤微生 物菌群的微生物生长的培养基中；
-将根据本发明的微生物和暂居病原皮肤微生物菌群的微生物在液体 培养基中共培养；
-将共培养的液体培养物的整分试样转移到琼脂平板上，该平板包含 适当的生长培养基；
-琼脂平板在允许暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长的条件下培
养一段时间；通过菌落形成单位定量来测定暂居病原皮肤微生物菌群的凝: 生物的生长，并将其与不应用本发明微生物的对照中微生物的生长进行比 较。
甚至更优选地，也在"原位皮肤测定方法"中观测暂居病原皮肤微生物 菌群的4敖生物的生长抑制。此测定方法在实施例中描述，其筒要包含如下 步骤
-培养至少一种暂居病原皮肤微生物菌群的微生物，将其均匀涂布于 测试个体的皮肤区域；
-将根据本发明的微生物的整分试样准确涂布于暂居病原皮肤微生物 菌群的孩i生物涂布的区域内；
-培育足够时间以允许暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长；
-将上层皮肤，包括其中包含的微生物，转移到包含适当生长培养基 的琼脂平板上；
-琼脂平板在允许暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长的条件下培 养一段时间；
-测定根据本发明的微生物涂布区域周围的暂居病原皮肤微生物菌群 的微生物的生长，并将其与没有本发明的微生物涂布的对照中微生物的生 长相比较。
此测定所使用的皮肤区域可能是个体的任何合适皮肤区域，优选人个 体。在优选的实施方案中，其为人个体前臂的皮肤区域。区域的大小不是 决定性的，优选约为1-40 cm2，更优选5-20cm2，甚至更优选5-10 cm2， 例如约5、 6、 7、 8、 9或10cm2。
将暂居病原皮肤微生物菌群的微生物平均涂布于此区域，优选密度约 为102 cfu/cm2 - 103 cfu/cm2。涂布于皮肤的^:生物在空气中干燥，并且将 根据本发明的微生物的整分试样以准确的方式涂布于该区域。这可以通过 本领域内技术人员所公知的手段来实现。例如，将根据本发明的微生物离 心(15分钟，4000xg)。细胞沉淀用K/Na-緩冲液洗两次(每次1 ml)。在200 jil K/Na緩冲液中重悬细胞，用微量移液器将10 nl准备好的微生物准确涂布
于预接种的皮肤区域。
皮肤优选在室温培育例如2小时。例如在粘性胶带剥离物的帮助下可 以转移上层皮肤，包括其中包含的微生物。上层皮肤转移到琼脂平板中， 该琼脂平板在允许所测试的暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长的温度 下培养，并且使用已知支持此类微生物生长的生长培养基。通常培养约24 小时。通过本领域内技术人员所公知的方法检测微生物的生长。优选通过 光密度法或将涂布本发明微生物的点附近形成的菌落计数来测定。细菌细 胞大小可以通过用染料SYBR Green I (分子探针，USA)染色后用流式细胞 计量法(例如Becton-Dickinson FACSort流式细月包4义，San Jose， CA)来估 算。细菌细胞大小用偏角光散射(SSC)模式估算。
如果在"体外孔平板测定"中，微生物能导致至少一种暂居病原微生物 菌群的微生物的生长与未加微生物的对照相比至少降低5%，优选至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或70%、 80%，更优选至少卯％， 和甚至更优选至少95%,和最优选至少99%,则此类孩史生物被认为是抑制 一种或多种暂居病原;敞生物菌群的生长。
更优选地，如果在"体外液体测定"中，微生物能导致至少一种暂居病 原微生物菌群的微生物的生长与未加微生物的对照相比降低至少5%，优 选至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或70%、 80%,更优选至少 90%,和甚至更优选至少95%，和最优选至少99%，则此类孩史生物祐:认为 是抑制一种或多种暂居病原^:生物菌群的生长。
最优选地，如果在原位皮肤测定中，；敞生物能导致至少一种暂居病原 微生物菌群的微生物的生长减慢至少5%，优选至少10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%或70%、 80%,更优选至少卯％，和甚至更优选至少 95%,和最优选至少99%，则此类孩支生物祐:认为是抑制一种或多种暂居病 原微生物菌群的生长。
确定微生物是否抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物(例如金黄色 葡萄球菌)生长的测试优选如上所的述体外和/或原位测试，更优选如实施 例中所描述的测试。
在优选的实施方案中，根据本发明的微生物导致一种或多种暂居病原 皮肤微生物菌群的微生物(优选金黄色葡萄球菌)的生长抑制，其与至少一 种此类微生物在使用抗生素后的生长抑制是可比较的。术语"可比较的，，指 特定量才艮据本发明的微生物的抑制活性与抗生素的活性在相同的范围内。
具体地，优选通过使用1.0xl08和3.0xl09个之间的细胞来实现此种作用， 更优选2.0xl08和1.0xl09个细胞之间，甚至更优选3.0xl()8和5.0xl08个 细胞之间和最优选3.4xl08个细胞，并且由此种量的细胞所达到的抑制活 性优选相应于5到15单位的抗生素。术语"抗生素"指具有抑制微生物生长 或杀死孩i生物能力的化学物质。此类物质是本领域技术人员所公知的。优 选地，此术语指p-内酰胺化合物，如青霉素类、头孢菌素类或碳青霉烯类； 大环内酯类；四环素类；氟会诺酮类；磺胺类；氨基糖苷类；咪唑类；肽-抗生素和林可胺类抗生素。更优选地，此术语指杆菌肽和红霉素。在优选 的实施方案中，术语"可比较的"指本发明的微生物约3.4xl()8个细胞的抑 制活性相应于约150 jig的杆菌肽或约2.5 jig的红霉素。最优选地，如在实 施例12中说明的，术语"可比较的，，指以金黄色葡萄球菌作为指示菌抹，本 发明的孩走生物约3.4xl08个细胞的抑制活性相应于约150 jig的杆菌肽或约 2.5 ng的红霉素。
此处描述了术语"暂居病原微生物菌群的微生物"。优选地，此术语指 金黄色葡萄球菌。可以优选在体外观测来比较暂居病原皮肤微生物菌群的 孩丈生物的生长抑制程度与使用抗生素后至少 一种此类微生物的生长抑制， 更优选用 一种测定方法，其中将根据本发明的^L生物与 一种或多种暂居病 原皮肤菌群的微生物接触，并且测定此类暂居病原皮肤微生物菌群的微生 物的生长。最优选地，用实施例中所描述和前面所提及的"体外孔平板测定" 来确定生长抑制的比较。简言之，"体外孔平板测定，，的此类比较包含如下 步骤
-培养至少一种暂居病原皮肤微生物菌群的微生物，将其均匀涂布到 预备好的包含适于各微生物生长(且优选检测)的琼脂培养基的琼脂平板 上；
-在接种的琼脂平板提供孔；
-一些孔用预培养的根据本发明的微生物细胞填充，且一些孔用不同 浓度的抗生素填充；
-琼脂平板在允许暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长的条件下培 养适当的时间；
-在含有根据本发明的微生物的孔周围检测暂居病原皮肤微生物菌群 的微生物的生长，且将其与含不同浓度抗生素的孔周围微生物的生长相比 较；
-测量孔的抑制圏的直径，并计算抑制面积；和 制相关联。
在优选的实施方案中，术语"抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生 长"指由于释放(防御性)抗菌物质而使暂居病原皮肤微生物菌群的微生物 的生长减慢。术语"抗菌物质"指能介导暂居病原皮肤微生物菌群的微生物 生长的选择性抑制的物质。优选的物质是对蛋白酶消化作用不敏感的物质。 术语"不敏感"指该物质不受或仅部分地受蛋白酶活性的影响。术语"蛋白 酶"指催化蛋白质内部肽键断裂的任何酶，其为本领域技术人员所公知。在 优选的实施方案中，该术语指蛋白酶K、灰色链霉菌(Streptomyces griseus) 蛋白酶、胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶。术语"蛋白酶消化"指在本领域技术人 员公知的条件下的蛋白酶反应。在优选的实施方案中，该术语指在37。C下 例如培育1小时。
在更优选的实施方案中，术语"抗菌物质"指该物质的特征在于在高或 低pH值下其特性不会,皮扰乱。术语"不扰乱"指该物质稳定，并且有生物 学活性。术语"高pH值"和"低pH值"是本领域技术人员所公知的。优选 地，在pH 3到pH 11之间，其特性不被扰乱。
根据本发明的微生物的特征也在于其不抑制健康正常的固有皮肤微生物物菌群的生长。因此，术语"固有皮肤微生物菌群，，和"健康正常的固有皮肤 微生物菌群"指能够正常地在健康皮肤上发现的微生物，优选人皮肤，并且
其组成皮肤上发现的主要微生物。具体地，术语"固有皮肤微生物菌群"指 永久定居在皮肤表面、角质层和表皮外层及皮肤和毛嚢的深缝中的微生物。 这些微生物的特征在于它们能在皮肤上生长和繁殖，而不侵入或破坏皮肤 组织。这些微生物的 一个特征是在较深皮肤区域中不能通过洗涤轻易除去 它们。固有皮肤微生物菌群的微生物是无害共生体。
术语"固有皮肤微生物菌群"优选指在皮肤上发现的需氧和厌氧微生物 菌群，优选人皮肤。更优选地，其指由表皮葡萄球菌(凝固酶阴性)、某种
微球菌、类白喉菌和丙酸杆菌组成的微生物菌群。通常，约90%的需氧固 有皮肤微生物菌群由表皮葡萄球菌组成。剩余的约10%主要由某种微球菌 (80 %藤黄微球菌)和类白喉菌(13 %)组成。术语"类白喉菌"指广范围的属 于棒杆菌属的细菌。出于方便，表皮类白喉菌分为如下4組亲脂或非亲 脂类白喉菌；厌氧类白喉菌；产卟啉类白喉菌。厌氧皮肤菌群的主要代表 (卯％)是丙酸杆菌；特别是疮疱丙酸杆菌、颗粒丙酸杆菌和贪婪丙酸杆菌 可以从皮肤中分离出来。厌氧菌群占整个固有皮肤菌群的大约4%。
更优选地，大于90%的微生物菌群属于表皮葡萄球菌、某种微球菌、 类白喉菌和丙酸杆菌。甚至更优选地，固有皮肤微生物菌群的特征在于其 主要成分是表皮葡萄球菌。
术语"皮肤"指身体的外罩，其为本领域技术人员公知的。优选地，该 术语指三层表皮、真皮和皮下脂肪组织。表皮是皮肤的最外层。其通常 在身体外表面形成防水的保护层,且由具有下基底膜的复层扁平上皮构成。 其通常不含血管，并且通过从真皮扩散而获得营养。组成表皮的主要细胞 类型是角质形成细胞，也存在黑色素细胞和朗氏细胞。表皮被分为几层， 其中细月包通过最内层的有丝分裂而形成。它们向上层移动，在分化时改变 形状和组成，且变为充满角蛋白。它们最后到达被称为角质层的最上层， 并且开始脱落或脱皮。表皮的最外层包含25到30层死细胞。 一般而言， 表皮分为5个亚层或层(从表面到深入)角质层、透明层、颗粒层、棘层 和生发层或基底层。通常，表皮和真皮的接触面是不规则的，由连续乳头 或指状突起组成，其在皮肤薄的地方最小，而在掌和足底皮肤中最长。通常，掌和足底的乳头与表皮的高度相关联，其产生脊。皮下脂肪组织是皮 肤的最深层。此层的特征在于其由结締组织、血管和脂肪细胞组成。通常， 此层连接皮肤与下层结构，使身体隔绝寒冷，并以脂肪的形式保藏能量。 一般而言皮肤在深层组织上形成对抗物理、化学和细菌因素的防护屏障。 这意味着例如口腔或阴道区域或粘膜组织不属于皮肤。在优选实施方案中， 术语"皮肤"指身体覆盖物的最外层，即表皮。在更优选的实施方案中，术 语"皮肤"指表皮的角质层。在甚至更优选的实施方案中，术语皮肤指表皮最外面的25到30层死细胞。在最优选的实施方案中，术语"皮肤，，指表皮 最外面的IO层死细胞。
术语"不抑制"关于固有皮肤微生物菌群的微生物的生长指当与根据本 发明的微生物接触时，至少一种、优选多于一种、优选多于两种、更优选 多于5种和特别优选任何固有皮肤微生物菌群的微生物的生长不被改变。 生长不改变优选指增殖没有变化，即每单位时间细胞的分裂不变。如果微 生物不能在接触固有皮肤微生物菌群的微生物时导致其生长减慢，则此种 微生物被认为不改变固有皮肤微生物菌群的微生物的生长。可以如上所述 在体外或原位测试是否有生长抑制，所述抑制与本发明的微生物抑制至少 一种暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长的特性有关。最优选的确定抑 制与否的测试通过如下所述的固有皮肤微生物菌群的微生物的"体外孔平 板测定"和/或"体外液体测定"和/或"原位皮肤测定"进行，更优选如实施例 中所述进行。
简言之，固有皮肤微生物菌群的微生物的"体外孔平板测定，，包含如下 步骤
-培养至少一种固有皮肤微生物菌群的微生物，将其均匀涂布到预备 好的包含适于各微生物生长(且优选检测)的适当琼脂培养基的琼脂平板 上；
-在接种的琼脂平板提供孔；
-用预培养的根据本发明的微生物细胞填充孔；
-琼脂平板在允许固有皮趺微生物菌群的微生物生长的条件下培养适当的时间；和
-在含有根据本发明微生物的孔周围检测固有皮肤微生物菌群的微生 物的生长，且将其与不含根据本发明的微生物的孔周围微生物的生长相比较。
可以用可获得的测定细胞和/或菌落数的手段和方法来影响最后 一 步 中生长的测定，例如用适当的染料染色和/或光学手段例如光密度法、和在 显微镜下计数细胞/菌落。在优选的实施方案中，使用孔周围出现的透明圏 的直径以确定抑制面积。
固有皮肤微生物菌群的微生物的"体外液体测定"在实施例中描述，其 简要包括如下步骤
-在液体培养基中培养至少一种固有皮肤微生物菌群的微生物；
-将根据本发明的微生物的整分试样液体培养物和固有皮肤微生物菌 群的微生物的整分试样液体培养物接种于允许固有皮肤微生物菌群的微生 物生长的培养基中；
-根据本发明的微生物和固有皮肤微生物菌群的微生物在液体培养基 中共培养；
-将共培养的液体培养物的整分试样转移到琼脂平板上，该平板包含 适当的生长培养基；
-琼脂平板在允许固有皮肤微生物菌群的微生物生长的条件下培养一 段时间；
-通过菌落形成单位定量来测定固有皮肤微生物菌群的微生物的生 长，并将其与不应用本发明微生物的对照中微生物的生长进行比较。
简言之，固有皮肤微生物菌群的微生物的"原位皮肤测定"包含如下步
骤
-培养至少一种固有皮肤微生物菌群的微生物，将其均匀涂布于测试 个体的皮肤区域；
-将根据本发明的微生物的整分试样准确涂布于固有皮肤微生物菌群 的微生物涂布的区域内；
-将皮肤培育足够时间以允许固有皮肤微生物菌群的微生物的生长； -将上层皮肤，包括其中包含的微生物，转移到包含适当生长培养基 的琼脂平板上；
-琼脂平板在允许固有皮肤微生物菌群的微生物生长的条件下培养一 段时间；
-测定根据本发明的微生物涂布区域周围的固有皮肤微生物菌群的微 生物的生长，并将其与没有本发明的微生物涂布的对照中微生物的生长相 比较。
如果一种微生物在接触固有皮肤微生物菌群的微生物时，后者的生长 没有减慢或仅有孩i小的减慢，则此种微生物被认为不改变固有皮肤微生物 菌群的微生物的生长。"微小的减慢"指与对照相比，生长减慢不超过5%， 更优选不超过2%。术语"没有减慢"指与不存在本发明微生物的对照相比， 接触本发明微生物的固有皮肤微生物菌群的微生物的生长没有发现统计学 相关的差异。在优选实施例中，术语"没有减慢"也包括那些微生物实际上 导致固有皮肤^f敖生物菌群的^:生物生长加速的情况，即刺激此种微生物生 长的情况。
在另一个优选的实施方案中，本发明的微生物对固有皮肤微生物菌群 的微生物的生长没有负面影响。术语"没有负面影响"指与不存在本发明微 生物的对照相比，与本发明的微生物接触时没有发现固有皮肤微生物菌群 的微生物的生长邱支抑制。
在特别优选的实施方案中，本发明的微生物是属于乳酸菌族的微生物。 术语"属于乳酸菌族的微生物"包括属于细菌，特别是属于革兰氏阳性发酵 真细菌，更特别是属于包括乳酸菌的乳杆菌科的微生物。从分类学角度乳 酸菌被分为链球菌、明串珠菌、片球菌和乳杆菌几个亚类。本发明的微生 物优选为乳杆菌种。乳酸菌族的成员通常缺少卟啉和细胞色素，不能进行 电子转移磚酸化，因此只能通过底物水平磷酸化来获得能量。即在乳酸菌 中通过碳7K化合物发酵来合成ATP。所有的乳酸菌都是厌氧生长的，然而， 与许多厌氧菌不同，多数乳酸菌对氧都不敏感，因此其在氧存在和不存在的条件下都能生长。相应地，本发明的细菌优选为耐氧的厌氧乳酸菌，优 选属于乳杆菌属。
本发明的乳酸菌优选为杆状或球状，具有从长细到短弯杆状的不同形 状，此外优选固定的和/或不产孢子的，并且其发酵代谢产生的主要或唯一 产物是乳酸。在优选的实施方案中，本发明的微生物所属的乳杆菌属根据 如下特性被分为三个主要亚类，本发明的乳杆菌种可以属于三个主要亚类之一
(a) 同型发酵乳杆菌
(i) 产生乳酸，优选通过糖酵解途径从葡萄糖产生至少85%量的L-、 D-或DL-同分异构体的乳酸；
(ii) 在45'C而不是15。C生长；
(iii) 形状为长杆状；和
(iv) 细胞壁中含有甘油磷壁酸；
(b) 同型发酵乳杆菌
(i) 产生乳酸，优选通过糖酵解途径产生L-或DL-同分异构体的乳酸;
(ii) 在1S。C生长，在"。C显示可变的生长；
(iii) 形状为短杆状或棒状；和
(iv) 在其细胞壁中含有核糖醇和/或甘油磷壁酸；
(c) 异型发酵乳杆菌
(i) 产生乳酸，优选通过戊糖磷酸途径从葡萄糖产生至少50%量的DL-同分异构体的乳酸；
(ii) 产生二氧化碳和乙醇；
(iii) 在15。C或45。C显示可变的生长；
(iv) 形状为长或短杆状；和
(v) 其细胞壁中含有甘油磷壁酸。
基于上迷特性，本发明的微生物被分类为属于乳酸菌族，具体为乳杆 菌属。通过使用经典分类学，例如参考"细菌分类学Bergey手册"(Williams & Wilkins Co., 1984)中的相关描述，可以确定本发明的微生物属于乳杆菌属。可选择地，根据本领域公知的方法将本发明的微生物分类为属于乳杆 菌属，例如根据它们的代谢指紋，即本发明的微生物糖代谢能力的可比较
的概况，或根据其它方法，例如在Schleifer等人，System. Appl. Microb.， 18 (1995)， 461-467或Ludwig等人，System. Appl. Microb.， 15 (1992)， 487-501
中所描述的方法。本发明的微生物能代谢糖源，所述糖源对于属于乳杆菌 属的微生物是本领域典型且公知的。
也可以使用其它本领域公知的方法对本发明的微生物归入乳杆菌属进 行表征，例如使用SDS-PAGE凝胶电泳测定物种的总蛋白质，并将它们与 公知的和已经表征的乳杆菌属菌林进行比较。制备上述总蛋白质镨的技术 和此类镨的数值分析是本领域内技术人员所熟知的。然而，只有其过程的 各阶段充分标准化，结果才是可信的。当确定微生物系乳杆菌属时，面对 精确的要求，由其作者例如Pot等人在1994年9月12日到16曰在比利时 Ghent大学由欧盟组织的"研讨会"中提出(细菌分类和鉴定的指紋技术，全 细胞蛋白质的SDS-PAGE)，有规律的制订公众可获得的标准化操作。分析 SDS-PAGE电泳凝胶的技术中所使用的软件是极为重要的，因为种间的相 关度依赖于此软件所用的参数和算法。不需进入理论细节，优选通过 Pearson相关系数将经光密度计测量和计算机标准化的条带定量比较。由 此所获得的类似矩阵可以在UPGMA (使用平均连接的不加权配对组方法) 算法的帮助下组织在一起，该算法不仅能够将最近似谱组合在一起，而且 能构建树形图(见Kersters， Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368， M. Goodfellow. A. G. O'Donnell编辑,John Wiley和Sons Ltd, 1985)。
可选择地，也可以根据所谓的Riboprinter.RTM.中关于核糖体RNA 的特征将所述本发明的微生物归入乳杆菌属。更优选地，通过将本发明细 菌的16S核糖体RNA的核苷酸序列，或其编码16S核糖体RNA的基因 组DNA的核苷酸序列，与其它迄今为止已知的乳酸菌属和种相比较，而 将本发明新鉴定的种归入乳酸菌属。另一个优选的确定本发明新鉴定的种
属于乳酸菌属的选择是使用靶向16S-23S rRNA间隔区域的种特异性PCR 引物。另一个优选的选择是RAPD-PCR (Niqatu等人.于Antonie van Leenwenhoek(79)，l-6，2001)，由于其产生菌抹特异性DNA模式，允许确 定与本发明一致的鉴定微生物系乳酸菌属。另外的确定本发明的微生物系 乳酸菌属所使用的技术是限制性内切酶片段长度多态性(RFLP) (Giraffa 等人.Int. J. Food Microbiol. 82 (2003)， 163-172)、重复元素指紋法(Gevers 等人.FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36)或细菌细胞的脂肪酸甲基酯 (FAME)模式分析(Heyrman等人.FEMS Microbiol. Lett. 181 (1991)， 55-62)。可选择地，可以通过凝集素分型(Annuk等人.J. Med. Microbiol. 50 (2001)， 1O矽-i074)或分析它们的细胞壁蛋白质(Gatti等人.Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997)， 345-348.)来确定乳杆菌。
在本申请的优选实施方案中，微生物是益生乳杆菌种。在本发明中术 语"益生，，指如果微生物局部应用于皮肤，其具有对健康有益的作用。优选 地，"益生"微生物是活的微生物，当其局部应用于皮肤时，对此组织的健 康有益。最优选其意味着该微生物对皮肤微生物菌群具有正面的作用。
在优选实施方案中，本发明的微生物属于布氏乳杆菌(Lactobacillus delbrvckii) OB-LB-Sa3〕或德氏豸1 杆菌(Lactobacillus delbrvckii) OB-LB-Sa3)种。然而，豸L杆菌种并不 限于这些。
在本发明特别优选的实施方案中，本发明的微生物选自以登录号为 DSM 18007 (布氏乳杆菌OB-LB-Sal6)和DSM 18006 (德氏乳杆菌德氏亚 种(Lactobacillus delbrvckii) OB-LB-Sa3)寸呆藏于DSMZ的布 氏乳杆菌或德氏乳杆菌组成的组。本发明也涉及上述保藏的乳杆菌菌种的 突变体或衍生物，其中所述突变体或衍生物保持了它们刺激固有皮肤微生物菌群的至少一种生物生长的能力和它们不刺激暂居病原;敝生物菌群的 微生物生长的特性。
术语"以登录号保藏于DSMZ的布氏乳杆菌或德氏乳杆菌，，指属于布 氏乳杆菌或德氏乳杆菌物种的微生物的细胞于2006年2月24日保藏在德 意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen) (DSMZ),保藏号为DSM 18007 (布氏乳杆菌OB-LB-Sal6) 和DSM 18006 (德氏乳杆菌德氏亚种OB-LB-Sa3)。DSMZ位于马舍尔欧德 路(Mascheroderweg) lb， D画38124不伦瑞克(Braunschweig)，德国。上述保 藏物依照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约来保
在特别优选的实施方案中，本发明的微生物是"分离的"或"纯化的"。 术语"分离的"指材料从其原始环境，例如天然环境(如果其天然存在)，或 培养基(如果其为培养的)中移出。例如，天然存在的微生物(优选乳杆菌属) 从天然系统中某些或所有共存的材料中分离出来，则其为分离的。此类微 生物可以是组合物的部分，并且只要该组合物不是其天然环境的部分，则 此类微生物仍然可被视作是分离的。
术语"纯化的"不需要绝对纯化；而是意为相对确定的。从库中获得的 具体微生物已经按常规纯化为微生物学同质，即当用本领域公知的方法在 琼脂平板上划线时，它们作为单个菌落生长。优选地，为此目的使用的琼 脂平板是乳杆菌物种选择性的。此类选择性琼脂平板是本领域内公知的。
本发明的另一方面涉及本发明微生物的无活性形式，其为例如热灭活 的或冻干的，但是其保留了抑制暂居病原皮肤微生物菌群的一种或多种微 生物生长和不抑制健康固有皮肤微生物菌群的微生物生长的特性。
根据本发明，术语"本发明微生物的无活性形式"包括本发明微生物(优 选此处/>开的乳杆菌种)的死细胞或无活性细胞，其在对于乳杆菌属微生物 的特异平板上不能形成单菌落。所述死细胞或无活性细胞可以具有完整的 或破坏的细胞膜。杀死或灭活本发明微生物的细胞的方法是本领域公知的。 El國Nezami等人.J. Food Prot. 61 (1998)， 466-468描述了用紫外线照射灭
活乳杆菌种的方法。优选地，本发明;微生物的细胞是热灭活或冻干的。本 发明细胞冻干的优势在于它们容易保藏和操作，而保留它们抑制暂居病原 皮肤微生物菌群的一种或多种微生物生长和不抑制健康固有皮肤微生物菌 群的微生物生长的特性。而且，当以本领域公知的条件应用于适当液体或 固体培养基时，冻千的细胞能够重新生长。以本领域公知的方法进行冻干。优选在室温，即在16℃到25℃之间的任意温度进行至少2小时。而且，本 发明微生物的冻干细胞在4℃可以稳定至少4周，仍然保留它们的上述特 性。可以通过将本发明微生物的细胞在170。C培养至少2小时而实现热灭 活。然而，优选通过将所述细胞在12rC饱和蒸汽存在下以2巴大气压进 行高压灭菌至少20分钟来实现热灭活。可选择将所述细胞在-20℃冷冻至 少4周、3周、2周、l周、12小时、6小时、2小时或1小时来获取本发 明;敞生物的热灭活的细胞。优选至少70%、 75%或80%,更优选85%、 90%或95%,和特别优选至少97%、 98%、 99%和更特别优选99.1%、 99.2%、 99.3%、 99.4%、 99.5％、 99.6%、 99.7%、 99.8%或99.9%，和最 特别优选100%的本发明」微生物无活性形式的细胞是死的或无活性的，然 而，它们仍然具有抑制暂居病原皮肤微生物菌群的一种或多种微生物生长 和不抑制健康固有皮肤微生物菌群的微生物生长的能力。本发明微生物的 无活性形式是否的确是死的或无活性的，可以通过本领域公知的方法来测 试，例如通过活力测试。
术语"本发明微生物的无活性形式"也包含本发明微生物的溶菌产物或 部分，优选此处公开的乳杆菌种，其中所述溶菌产物或部分优选抑制暂居 病原皮肤微生物菌群的一种或多种微生物(优选金黄色葡萄球菌)的生长和 不抑制健康固有皮肤微生物菌群的微生物生长。此种抑制可以如此处所述， 特别是如所附实施例中所述进行测试。在此种情况，本发明微生物的溶菌 产物或部分可能不抑制或刺激暂居病原微生物菌群的微生物生长，然后技 术人员能够例如通过本领域公知的方法(其在下文中示例性给出)进一步纯 化所述溶菌产物或部分，以^更除去可能刺激暂居病原孩i生物菌群的;f敫生物 生长的物质。然后本领域4支术人员可以再次测试所述溶菌产物或部分是否 抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长而不抑制固有皮肤微生物菌 群的微生物生长。
根据本发明的术语"溶菌产物"指被破坏的本发明微生物的细胞在水介 质中的溶液或悬浮液或提取物。然而，不应该以任何受限制的方式来解释 该术语。细胞溶菌产物包含例如大分子，如DNA、 RNA、蛋白质、肽、碳7jC化合物、脂类等等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂酸等等，或其部 分。另外，所述溶菌产物包含细胞碎片，其可以为平滑或颗粒结构。制备 微生物的细胞溶菌产物的方法是本领域内公知的，例如使用弗氏细胞压碎 器，使用玻璃或铁珠研磨细胞或酶促裂解等。此外，裂解细胞涉及用本领 域/>知的多种打开/破坏细胞的方法。裂解细胞的方法并不重要，可以使用 任何能够使本发明微生物的细胞裂解的方法。本领域技术人员可以选择一 种适当的方法，例如通过酶促、化学或物理的方法打开/石皮坏细胞。酶和多
酶混合物的非限制性实例是蛋白酶，如蛋白酶K、脂酶或糖苷酶；化学方 法的非限制性实例是离子载体、去污剂如十二烷基硫酸钠、酸或碱；和物 理方法的非限制性实例是高压如弗氏高压、重量摩尔渗透压浓度、温度如 热和冷。另外，除了蛋白水解酶、酸、碱等等，也使用合适的酶组合物的 方法。例如用冷冻和融解来裂解本发明微生物的细胞，更优选在低于-7(TC 的温度冷冻和高于30'C的温度融解，特别优选在低于-75。C冷冻和高于 35。C融解，和最优选在低于-80。C冷冻和高于37。C融解。也优选重复所述 冷冻/融解至少l次，更优选至少2次，甚至更优选至少3次，特别优选至 少4次和最优选至少5次。
因此，那些本领域的技术人员可以通过参考上述概括说明来制备所需 的溶菌产物，并且如果需要，将那些方法适当地修饰或改变。优选地，所 述溶菌产物所用的水介质是水、生理盐水或緩冲液。细菌细胞溶菌产物的 优点是能够容易地生产和保藏，由于需要较少的技术设备所以成本低。
根据本发明，溶菌产物也可以是来自上述溶菌产物的分子部分的制品。 这些部分可以通过本领域那些技术人员所公知的方法获得，例如层析(包括 例如亲和层析、离子交换层析、大小排阻层析、反向层析和用其它层析材 料柱层析)，或分批处理法，其它分级方法例如过滤法，例如超滤、透析、 用大小排阻透析和浓缩离心，梯度密度离心或分步介质离心、沉淀(例如亲 和沉淀)、盐溶或盐析(石克酸铵沉淀)、醇沉淀，或其它蛋白质化学、分子生 物学、生物化学、免疫学、化学或物理学方法分离上述溶菌产物的组分。 在优选的实施方案中，优选那些比其它部分更具免疫原性的部分。那些本领域的技术人员能够选择合适的方法，并参考实施例中上述常规说明和特 殊说明来确定其可能的免疫原性，如果需要可以将那些方法适当地修饰或 改变。
因此，术语"本发明微生物的无活性形式"也包含本发明微生物的滤出 液，优选此处公开的乳杆菌，其中所述滤出液优选抑制暂居病原皮肤微生 物菌群的一种或多种微生物(优选金黄色葡萄球菌)的生长，并且不抑制健 康正常的固有皮肤微生物菌群的微生物生长。此种抑制可以按本文所描述 来测试，特别是按所附实施例中的描述。万一，本发明微生物的滤出液可 能不抑制或者刺激暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长，技术人员能 够例如通过本领域>^知的方法进一步纯化所述滤出液，以便除去刺激暂居 病原皮肤微生物菌群的微生物生长的物质。然后本领域技术人员可以重新 测试所述滤出液是否抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物的生长，而不抑制固有皮肤^L生物菌群的微生物的生长。
术语"滤出液"指本发明微生物的无细胞溶液或悬浮液，其通过将本发 明的微生物在本领域技术人员公知的适当液体、培养基或緩冲液中培养， 离心取上清液而获得。然而，不应该以任何受限制的方式来解释该术语。 滤出液包含例如大分子，如DNA、 RNA、蛋白质、肽、碳水化合物、月旨 类等，和/或小分子，如氨基酸、糖、脂酸等，或其部分。制备微生物滤出 液的方法是本领域内公知的。另外，"滤出液"涉及本领域内公知的多种方 法。制备滤出液的方法并不重要，可以使用任何能够使本发明微生物的细 月包滤出的方法。
术语"本发明微生物的无活性形式"包含本发明微生物细胞的任何部 分。优选地，所述无活性形式是通过膜制备获得的膜部分。属于乳杆菌属 的微生物的膜制备可以通过本领域公知的方法获得，例如通过使用如 Rollan等人.Int. J. Food Microbiol. 70 (2001)， 303-307、 Matsuquchi等人. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003)， 259-266或Stentz等人，Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278或 Varmanen等人.J. Bacteriology 182 (2000)， 146-154中描述的方法。可选择地，也可以利用全细胞制品。
本发明的另 一方面涉及组合物，其包含根据本发明的微生物或如上所
述此类孩i生物的突变体、；时生物或无活性形式。在优选实施方案中，所述 组合物包含上述微生物，其量为每毫克组合物的固体形式中含有102-1012 个细胞，优选103-108个细胞。组合物为液体形式的情况，微生物的量为每 毫升102-1013个细胞。在更优选的实施方案中，所述组合物是以软膏形式 或孩史胶嚢形式的乳浊液的形式，例如水包油乳剂或油包水乳剂。对于乳浊 液、软膏或孩先胶嚢的情况，组合物包含的所述微生物的量为每毫升102-1013 个细胞。然而，对于特定组合物，微生物的量可能与此处所述不同。
在另一方面，本发明提供生产保护皮肤对抗病原微生物的组合物的方 法，其包括以化妆品的或药物的可接受的载体或赋形剂配制根据本发明的 孩吏生物或上述此种艰吏生物的突变体、衍生物或无活性形式的步骤。
根据本发明使用的术语"组合物"涉及包含至少一种本发明的微生物或 上述所述^f敫生物的突变体、衍生物或无活性形式的组合物。下文描述的本 发明组合物包舍任意组合的上述成分。任选地，其还可能包含至少一种适 合于保护皮肤对抗病原微生物的成分。相应地，其任选地包含下述更多成
分的任意組合。术语"适合于保护皮肤对抗病原微生物的成分"包含降低pH
值的化合物或组合物和/或其组合。
组合物可能是固体、液体或气体形式，尤其可能是粉末、溶液、气溶 胶、悬浮液、乳状液、液体、酏剂、提取物、酊剂或流体提取物，或特别 适合局部施用的形式。适合局部施用的形式包括例如糊剂、软膏、洗剂、 乳膏、凝胶或透皮贴剂。
优选地，本发明的组合物是化妆品组合物，还包含化妆品的可接受的 载体或赋形剂。更优选地，所述化妆品组合物是糊剂、软膏、洗剂、乳膏 或凝胶。
本发明的化妆品组合物包含本发明的微生物，上述其突变体、衍生物 或无活性形式，连同本发明的组合物和另外的化妆品可接受的载体。优选 本发明的化妆品组合物用于局部施用。
此处所用的术语"化妆品可接受的载体"指适当的媒介物，使用其可将 本发明组合物以安全有效的方式应用于皮肤。此类媒介物可能包括例如乳 浊液的物质，例如水包油乳剂或油包水的乳剂、软膏或微胶嚢。将活性成 分以胶嚢形式，例如纤维素胶嚢，以明胶，用聚酰胺、类脂嚢泡、腊模、 环糊精或脂质体包裹来施用也是有利的。此处所用术语"安全有效量"指抑 制暂居病原皮肤孩史生物菌群的一种或多种微生物生长的足够量。
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含本发明的微生物或上述其 -时生物或突变体或无活性形式，还包含药物的可接受的载体或赋形剂。药 物组合物优选以适合于局部施用的形式。
另外，本发明涉及本发明的微生物或上述其衍生物或突变体或无活性 形式用于制备组合物的用途，该组合物优选药物或化妆品组合物。
药物组合物包含治疗有效量的本发明微生物或本发明的衍生物或突变 体或所述本发明-敝生物的无活性形式，并且可以以多种形式配制，例如以 固体、液体、粉末、水、冻干的形式。
如此处所述，药物组合物可以使用药物的可接受的载体向患者施用。 在具体实施方案中，术语"药物的可接受的"指由管理机构或其它普遍公认 的药典认可使用于动物，特别是用于人。
术语"载体"指用于实施治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类 载体是药物的可接受的，即其在所使用的剂量和浓度下对接受者无毒。其 优选为等渗、低渗或微弱高渗的，并且具有相对低的离子强度，例如由蔗 糖溶液提供。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括那些来自
石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、 油等等。盐溶液和葡萄糖水和甘油溶液也可以作为液态载体使用。合适的 药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅 胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酰酯、滑石、钠离子、脱脂奶粉、甘油、丙烯、 乙二醇、水、乙醇等等。如果需要，组合物也可以含有少量湿润剂或乳化 剂，或pH緩冲剂。这些组合物的形式可以是例如溶液、悬浮液、乳剂、
粉末、持续释放制剂等等。合适的药物载体的实例在E.W. Martin的
"Remington Pharmaceutical Sciences"中描述。可用作药物载体的物质的 一些其它实例为糖，例如葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀 粉；纤维素和其^f生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸 酯；粉末状tragancanth;麦芽；明胶；滑石；硬脂酸；硬脂酸镁；硫酸钓； 碳酸钩；植物油，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可 油；多元醇，例如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；琼脂；藻 酸；无致热原水；等渗盐；蔓越橘提取物和磷酸盐緩冲液；脱脂奶粉；以 及其它用于药物制剂的无毒相容物质，例如维生素C、雌激素和echinacea. 也可以存在湿润剂和润滑剂例如月桂硫酸钠、和着色剂、调味剂、润滑剂、 赋形剂、压片剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂。将活性成分以胶嚢形式施 用，例如纤维素胶囊，以明胶，用聚酰胺、类脂嚢泡、腊模、环糊精或脂 质体包裹也是有利的。
通常，成分是例如作为干燥的冻干粉末或脱水浓缩物，在熔封容器如 安瓿或标示活性物质的量的小袋中被分开或混合在一起，以单位剂型提供。
本发明的药物组合物可以以中性或盐形式配制。药物的可接受的盐包 括与阴离子形成的那些，例如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生 的盐，和与阳离子形成的那些，例如从钠、钾、铵、钩、氢氧化铁、异丙 胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。
可以任选地使用体外或原位测定方法，例如实施例中描述的那些方法， 来帮助鉴定理想剂量范围。制剂所使用的精确剂量也依赖于给药途径，和 疾病或病症的严重性，并且应该根据医生诊断和每个患者的情况来确定。 优选局部给药途径。可以由体外或(动物)模型测试系统衍生的剂量效应曲 线来推测有效剂量。优选地，药物组合物是直接施用或与佐剂结合施用。 佐剂可能选自氯喹，质子极性化合物，例如丙二醇、聚乙二醇、甘油、乙 醇、l-甲基-(左^:)-2吡咯烷酮或它们的衍生物，或非质子极性化合物，例 如二甲基亚砜(DMSO)、 二乙基亚砜、二-(正)丙基亚砜、二甲砜、环丁砜、 二甲基曱酰胺、二甲基乙酰胺、四甲基脲、乙腈、或其衍生物。在pH限 定条件下加入这些化合物。可以向脊推动物施用本发明的组合物。此处所
用"脊推动物"意指与本领域普通技术人员通常所理解的含义一致。具体地， "脊推动物"包括哺乳动物，特别是人。
术语"施用"指上述组合物以治疗有效剂量施用。以"治疗有效剂量”指施用后产生效应的剂量，优选此效应保护皮肤对抗病原微生物。精确的剂 量依赖于治疗目的，而且将通过本领域技术人员使用已知技术来确定。正 如本领域公知和前面所描述的，需要根据全身或局部的递送、年龄、体重、 大致健康水平、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和情况严重性进行 调整，并且通过本领域那些技术人员用例行实验来确定。
本方法适用于人治疗和兽医应用。此处描述的具有预期治疗活性的化 合物可能如此处所述以生理学上可接受的载体向患者施用。依赖于施用方 式，化合物可能以如下讨论的多种方式配制。制剂中治疗上有活性化合物的浓度可以从约0.01-100%的重量百分比变化。该物质可以单独施用或与其它治疗组合施用。
可以通过多种方式施用药物组合物。优选的施用途径是局部途径。
剂量方案由主治医师和临床因素决定。正如医学领域内所熟知的，对 于任一个患者的剂量依赖于许多因素，包括患者的尺寸、体表面积、年龄、 具体施用的化合物、性别、给药时间和途径、大致健康水平、和其它同时施用的药物。通常剂量可以在例如0.001-1000ug范围内；然而，特别是考 虑到上述因素时，也可以使用低于或高于此范例范围的剂量。
优选该剂量每周施用一次，更优选每周2次、3次、4次、5次或6次， 和最优选每天一次，甚至更优选每天2次或更多。特别优选每当固有皮肤 菌群发生紊乱(例如通过清洗)之后给药。然而，在治疗进展过程中，可以 以更长的时间间隔给药和按需要以更短的时间间隔给药，例如一天几次。 在优选的情况下，用此处所述方法和本领域那些技术人员公知的其它方法 来监测免疫应答，并优化给药剂量，例如时间、量和/或组分。通过定期评 估来监测逸艮。药物组合物也可以应用于共治疗途径，即与其它药物或药 品同时施用，例如其它保护皮肤对抗病原微生物的药品。
当所希望的治疗涉及局部施用所容易接近的区域或器官时，本发明的化妆品的或药物的组合物的局部施用是有用的。对于皮肤的局部应用，药 物组合物优选以合适的糊剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶或透皮贴剂配制。 依赖于使用的区域，化妆品或药物制剂也可以是喷雾(泵喷雾或气溶胶)、 泡沫、凝胶喷雾、摩丝、悬浮液或粉末的形式。
合适的糊剂包含悬浮于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于) 石油、软白石蜡、黄色石油冻和甘油。
化妆品的或药物的组合物也可能以合适的软膏配制，该软膏包含悬浮 或溶解于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于)一种或多种甘油、 矿物油、液体油、液体石油、白色石油、黄色石油冻、丙二醇、乙醇、甘 油三酯、脂肪酸酯例如鲸蜡酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯化合物、蜡例如白蜡或 黄色蜂蜡、脂肪酸醇例如鲸蜡醇、硬酯酰醇和鲸蜡基硬脂酰醇、脂肪酸例 如硬酯酸、鲸蜡^^更酯酸盐、羊毛脂、氩氧化镁、高岭土和水。可选择地， 化妆品的或药物的组合物也可能以合适的洗剂或乳膏配制，其包含悬浮或 溶解于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于)一种或多种矿物油 例如石蜡、植物油例如蓖麻油、蓖麻籽油和氢化蓖麻油、失水山梨糖醇单 硬脂酸酯、聚山梨酸酯、脂肪酸酯例如鲸蜡酯、蜡、脂肪酸醇例如鲸蜡醇、^J旨酰醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、乙醇、甘油三酯和水。
可选择地，化妆品的或药物的组合物也可以以合适的凝胶配制，其包 含悬浮或溶解于载体中的活性成分。此类载体包括(但是不限于)一种或多 种水、甘油、丙二醇、液状石蜡、聚乙烯、脂肪油、纤维素衍生物、皂土 和胶态二氧化珪。
根据本发明的气溶胶的合适推进剂是常规的推进剂，例如丙烷、丁烷、 戊烷和其它。
根据本发明的制剂通常包含更多的此类制剂通常使用的附加物，例如 防腐剂、芳香剂、消泡剂、染料、色素、增稠剂、表面活性物质、乳化剂、 润滑剂、修饰剂、脂肪、油脂、蜡类或其它常用组分，对于化妆品或皮肤 病制剂，例如酒精、多元醇、聚合物、泡沫稳定剂、可溶促进剂、电解质、 有机酸、有机溶剂、或硅氧烷衍生物。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物可能包含润滑剂。润滑剂以有
效防止或减緩解干燥的量使用。有用的润滑剂包括(但不限于)烃油和蜡； 硅酮油；甘油三酯；乙酰甘油酯；乙氧基甘油酯；烷基酯；链烯基酯；脂 肪酸；脂肪醇；脂肪醇醚；醚酯；羊毛脂和衍生物；多羟基醇(多元醇)和 聚醚衍生物；多元醇酯；蜡酯；蜂蜡衍生物；植物蜡；磷脂；固醇；和酰 胺。
因此，例如通常的润滑剂包括矿物油，特别是具有50-500 SUS粘性范 围的矿物油，羊毛脂油，貂油，椰子油，可可脂，橄榄油，杏仁油，澳大 利亚坚果油，,荟抽提物，霍霍巴油，红花油，玉米油，液体羊毛脂，棉 花子油，花生油，purcellin油，全氢化角簠烯(角鲨烯)，蓖麻油，聚丁烯， 无p木矿物精，甜杏仁油，鲟梨油，calophyllum油，茺麻毒蛋白油，维生 素E，橄榄油，矿物精，鲸蜡硬脂醇(主要由鲸蜡醇和硬脂醇组成的脂肪醇 混合物)，亚麻醇，油醇，辛基十二醇，谷物种子油例如小麦胚油(鲸蜡硬 脂醇和2-乙基己酸酯)，鲸蜡基棕榈酸酯，二异丙基己二酸酯，棕榈酸异丙 酯，棕榈酸辛酯，肉豆蔻酸异丙酯，肉豆蔻酸丁酯，丙三1^更脂酸盐，硬 脂酸甘油酯，十六烷基硬脂酸酯，异鲸蜡基硬脂酸酯，硬脂酸辛酯，辛基 羟硬脂酸酯，丙二醇硬脂酸酯，硬脂酸丁酯，油酸癸酯，油酸甘油酯，乙 酰基甘油酯，(C12-C15)醇辛酸酯和苯甲酸酯，辛酸和癸酸的乙酯和多元醇 酯例如它们的乙二醇酯和甘油酯，和蓖麻毒蛋白油酸乙酯和多元醇酯例如 异丙基己二酸醇酯，月桂酸己醇酯，十二烷酸辛酯，聚二甲基硅氧烷共聚 醇，聚二甲基硅氧烷醇，羊毛脂，羊毛脂醇，羊毛脂蜡，氢化羊毛脂，羟 基羊毛脂，乙酰羊毛脂，凡士林，羊毛脂酸异丙酯，肉豆蔻酸鲸蜡醇酯， 肉豆蔻酸甘油酯，肉豆蔻酸肉豆蔻酯，肉豆蔻基乳酸酯，鲸蜡醇，异硬脂 醇，硬脂醇，和异鲸蜡基羊毛脂等等。
而且，根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含乳化剂。乳 化剂(即乳化试剂)优选以有效提供组合物成分均勻混合的量使用。有用的 乳化剂包括(i)阴离子例如脂肪酸盐，例如硬脂酸钾，硬脂酸钠，硬脂酸胺， 和硬脂酸三乙醇胺；含脂肪酸盐的多元醇脂肪酸单酯，例如包含钾或钠盐的单硬脂酸甘油酯；硫酸酯(钠盐)，例如月桂基5硫酸钠，鲸蜡基疏酸钠； 和含硫酸酯的多元醇脂肪酸单酯，例如含月桂基硫酸钠的单硬脂酸甘油酯； (ii) P曰离子IU匕物例:i口 N (Stearoyl Colamino Formylmethyl) pyridium; N画 大豆-N-乙基吗啉乙基硫酸盐；烷基二曱基节基氯化铵； diisobutylphenoxytheoxyethyl 二甲基节基氯化铵；和 cetyl pyridium chloride;和(iii)非离子表面活性剂例如聚氧乙烯脂肪醇醚，例如单硬脂酸 酯；聚氧乙烯月桂醇；聚氧丙烯脂肪醇醚，例如丙氧基油醇；聚氧乙烯脂 肪酸酯，例如聚氧乙烯硬脂酸酯；聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如 聚氧乙烯失水山梨糖醇单硬脂酸酯；失水山梨糖醇脂肪酸酯，例如失水山 梨糖醇；聚乙二醇脂肪酸酯，例如聚乙二醇单硬脂酸酯；和多元醇脂肪酸 酯，例如单硬脂酸甘油酯和丙二醇单硬脂酸酯；和乙氧基羊毛脂衍生物， 例如乙氧基羊毛脂，乙氧基羊毛脂醇和乙氧基胆固醇。乳化剂的选择在 Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Hi3thig Buch Verlag， Heidelberg,第二版，1989,第三部分举例描述。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包括表面活性剂。合适 的表面活性剂包括例如那些通常的清洁剂、乳化剂、增泡剂、助水溶物、 增溶剂、悬浮剂和非表面活性剂(利于固体在液体中^:)。
表面活性剂通常分为两性、阴离子、阳离子和非离子型表面活性剂。 两性表面活性剂包括酰基氨基酸和衍生物和N-烃基氨基酸。阴离子表面活 性剂包括酰基氛基酸和盐，例如酰基谷氨酸、酰基肽、酰基肌氨酸盐和 酰基牛磺酸盐；羧酸和盐，例如链烷酸、羧酸酯和羧酸醚；磺酸和盐，例 如酰基羟乙基磺酸盐、烷基酰基磺酸盐、烷基磺酸盐和磺基丁二酸盐；硫 酸酯，例如烷基醚;f克酸酯和烷基硫酸酯。阳离子表面活性剂包括烷基胺、 烷基咪唑啉、乙氧基胺和四元盐(例如烷基苯二甲基铵盐、烷基甜菜碱、杂 环铵盐和四烷基胺盐)。非离子型表面活性剂包括醇，例如包含8-18个 碳原子的伯醇；烷醇胺，例如烷醇胺衍生的酰胺和乙氧基酰胺；氧化胺； 酯，例如乙氧基羧酸、乙氧基甘油酯、乙二醇酯和衍生物、甘油一酯、多 聚甘油酯、多元醇酯和醚、失水山梨糖醇/山梨糖醇酯、和磷酸三酯；和醚,例如乙氧基乙醇、乙氧基羊毛脂、乙氧基聚硅氧烷和丙氧基聚氧乙烯醚。
此外，根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含成膜物。与本发明一致使用的合适成膜物使组合物光滑和平坦，且包括(不限于)丙 烯酰胺/丙烯酸钠共聚物；丙烯酸铵共聚物；秘鲁香脂；纤维素胶；乙烯/ 马来酸酐共聚物；羟乙基纤维素；羟丙基纤维素；聚丙烯酰胺；聚乙烯； 聚乙烯醇；pvm/MA共聚物(聚乙烯甲基醚/马来酸酐)；PVP(聚乙烯吡咯烷 酮)；马来酸酐共聚物，例如从Gulf科学与技术获得的PA-18; PVP/十六 碳烯共聚物，例如从GAF公司获得的GanexV-216; Acryliclacrylate共聚 物；等等。
通常，成膜物可能以总组合物重量的约0.1%到约10%的量使用，优 选约1%到约8%，最优选约0.1%到约5%。也使用有效量的湿润剂，包 括果糖；葡萄糖；glulamic acid;甘油；蜂蜜；麦芽糖醇；甲基葡萄糖 苷醚-10;曱基葡萄糖苷醚-20;丙二醇；乳酸钠；蔗糖；等等。
当然，本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含防腐剂。根据本 发明的确定组合物的防腐剂包括(不限于)对羟基苯曱酸丁酯；对羟基苯 甲酸乙酯；咪唑烷脲；对羟基苯甲酸甲酯；O-苯基苯酚；对羟基苯曱酸丙 酯；季铵盐-14;季铵盐-15;脱氢醋酸钠；吡咬硫酮锌等。
防腐剂以防止或延緩微生物生长的有效量使用。通常，防腐剂以总组 合物重量的约0.1%到约1%的量使用，优选约1%到约0.8%,最优选约 0.1%到约0.5%。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含芳香剂。本领域那 些技术人员熟知的芳香剂(芳香组分)和色素(着色剂)可能以赋予本发明的 组合物希望的香味和颜色的有效量使用。
此外，本发明的化妆品的或药物的组合物也可能包含蜡。与本发明一 致使用的合适的蜡包括动物蜡，例如蜂蜡、鲸蜡或羊毛蜡(羊毛脂)；植 物蜡，例如巴西棕榈蜡或小烛树蜡；矿物蜡，例如褐煤蜡或地蜡；和石油 蜡，例如石蜡和^:晶蜡(高分子量的石油蜡)。动物、植物和一些矿物蜡主 要是高分子量脂肪醇和高分子量脂肪酸形成的酯。例如，三十烷醇的棕榈酸酯是通常的蜂蜡的主要成分。根据本发明的其它合适的蜡包括合成蜡， 其包括聚乙烯聚氧乙烯和由一 氧化碳和氩衍生的烃基蜡。
典型的蜡也包括地蜡；鲸蜡酯；氢化霍霍巴油；氩化霍霍巴蜡；氢 化米糠蜡；日^if;霍霍巴乳脂；霍霍巴油；霍霍巴蜡；munk蜡；褐煤 酸蜡；小冠巴西棕蜡；米糠蜡；虫胶蜡；硫化霍霍巴油；合成蜂蜡；合成 霍霍巴油；三羟基硬脂精；鲸蜡醇；硬脂醇；可可脂；羊毛脂脂肪酸；在 25。C为固体的单-、二、和25甘油三酯，例如glyceyl tribehenate(二十二 烷酸和甘油的三酯)和Clg-C36酸甘油三酯(Clg-C36羧酸和甘油的三酯混 合物)，其可从Croda，Inc.，NewYork，N.Y.分别以商业名SyncrowaxHRC 和SyncrowaxHGL-C获得；在25 。C为固体的脂肪酯；硅氧烷蜡例如曱基 十八烷氧聚硅氧烷和多聚(二曱基硅氧烷基)硬脂氧硅氧烷；硬脂酰单-和二 乙醇胺；松香和其衍生物，例如乙二醇和甘油的松香酸酯；25。C为固体的 氢化油；和蔗糖甘油酯。增稠剂(粘性控制剂)可能以水系统中的有效量使 用，其包括藻胶；卡波姆例如卡波姆934、 934P、 940和941;纤维素胶； 鯨蜡硬脂醇、椰子酸二乙醇酰胺DEA、糊精；明胶；羟乙基纤维素；羟 丙基纤维素；羟丙基曱基纤维素；硅酸镁铝；肉豆蔻醇；燕麦粉；油酰胺 DEA;油醇；PEG-7M; PEG-14M; PEG-90M;硬脂酰胺DEA;硬脂酰 胺MEA;硬脂醇；黄蓍胶；小麦淀粉；黄原胶；等等。上述列出的增稠 剂中，DEA是二乙醇胺，MEA是乙醇胺。增稠剂(粘性控制剂)可能以非 水系统中的有效量使用，其包括硬脂酸铝；蜂蜡；小烛树蜡；棕榈蜡；地 蜡；鲸蜡硬脂醇；鲸蜡醇；胆固醇；？K合二氧化硅；氢化蓖麻油；氢化棉 花子油；氢化豆油；氢化牛油脂酸甘油酯；氢化植物油；羟丙基纤维素； 羊毛脂醇；肉豆蔻醇；辛基十二醇硬脂酰硫酸酯；油醇；地蜡；微晶蜡； 石蜡、季戊四醇四辛酸酯；聚丙烯酰胺；聚丁烯；聚乙烯；丙二醇二辛酸 酯；丙二醇二壬酸酯；stearalkonium hectorite;硬脂醇；硬脂酰硬脂酸酯； 合成蜂蜡；三羟^^更脂酸甘油酯；三亚油酸甘油酯；三硬脂酸甘油酯；硬 脂酸锌；等等。制剂中常见的天然和合成增稠剂或成胶物是交叉连接的聚 丙烯酸和其衍生物，多糖例如黄原胶或藻酸盐、羧曱基纤维素或羟基羧曱
基纤维素，水胶体例如阿拉伯胶，或蒙脱石矿例如皂土或脂肪醇，聚乙烯 醇和聚乙烯吡咯烷酮。
根据本发明的化妆品的或药物的组合物中可以添加或使用的其它成分
以它们预期使用的有效量使用，包括提高性能或消费需求的生物学添加 剂，例如氨基酸、蛋白质、香草、芦荟提取物、生物黄酮素等等；緩冲剂、 螯合剂，例如EDTA;乳化稳定剂；pH调节剂；不透明剂；和推进剂， 例如丁烷二氧化碳、乙烷、氢氯氟碳化合物22和142b、氢氟烃152a、异 丁烷、异戊烷、氮、 一氧化二氮、戊烷、丙烷等等。
此外，为了补充或促进其作用，根据本发明的制剂也可能包含抗氧化、 自由基清除、增加皮肤水分或保湿、抗红斑、抗炎或抗过敏的化合物。具 体地，这些化合物可以选自维生素、植物提取物、a和卩羟基酸、神经酰 胺、抗炎剂、抗菌剂或紫外过滤物质、及其衍生物和混合物。有利地，根 据本发明的制剂也可能包含吸收UV-B和/或UV-A区域紫外辐射的物质。 有利地，脂相选自矿物油、矿物蜡、分枝和/或非分枝烃和烃蜡、饱和和/ 或不饱和、分枝和/或非分枝<:8-<:24-烷羧酸的甘油三酯；它们也可选自合 成、半合成或天然油脂，例如橄榄油、棕榈油、杏仁油或混合物；油、脂肪或蜡、饱和和/或不饱和酯、分枝和/或非分枝C3-C30-烷羧酸、和饱和和/ 或不饱和、分枝和/或非分枝C3-C30-醇，芳香族羧酸和饱和和/或不饱和、 分枝和/或非分枝C3-C30醇，例如肉豆蔻酸异丙酯、异丙基硬脂酸酯、己 癸基硬脂酸酯、油酸油酯；也有此类酯的合成、半合成和天然混合物，例 如霍霍巴油、烷基苯曱酸酯或硅酮油，例如环曱基硅氧烷、二曱基聚硅氧 烷、二乙基聚硅氧烷、八曱基环四硅氧烷和其混合物或二烷基醚。
根据本发明的活性成分可能例如用于清洁皮肤的化妆品组合物，例如 块状皂、香皂、乳白肥皂、透明皂、豪华皂、脱臭皂、膏状皂、婴儿皂、 护肤皂、磨砂皂、合成洗涤剂、液体皂、糊状皂、软皂、洗涤糊剂、洗涤 液、淋浴和沐浴制品例如洗涤剂、淋浴制品、淋浴凝胶剂、泡沫浴用剂、 膏状泡沫浴用剂、油浴剂、沐浴精华液、擦洗制品、原位产品、剃须泡沫、 刮脸洗剂、剃毛霜。另外，适合皮肤化妆品制剂的还有例如油包水或水包油皮肤和身体乳膏、日霜和晚霜、防晒组合物、晒后产品、护手产品、面 霜、多重乳剂、啫喱、微乳剂、脂质体制品、类脂嚢泡制品、防皱霜、面 油、脂质体凝胶、运动凝胶剂、增湿霜、增白霜、维生素霜、皮肤洗剂、
护理洗剂、安瓿、剃须后洗剂、剃须前洗剂preshaves、保湿洗剂、晒黑洗 剂、脂肪霜、除色素组合物、按摩制品、身体粉末、面部滋补剂、除臭剂、 止汗剂、鼻贴、抗痤疮组合物、驱虫剂和其它。
在优选的实施方案中，化妆品组合物包含日用护理的水包油制剂，其 可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
1.7鲸蜡硬脂醇聚醚-6,硬脂醇
0.7鲸蜡硬脂醇聚醚-25
2.0 二乙胺羟基苯甲酰基苯曱酸己酯
2.0 PEG-14二甲基珪油
3.6鲸蜡硬脂醇
6.0乙基己基曱氧基肉桂酸酯
2.0 二丁基己二酸酯
B
5.0甘油
0.2 EDTA 二钠
1.0泛醇
适量防腐剂
67.8软化水 C
4.0辛/癸酸甘油三酯，丙烯酸钠共聚物 D
0.2磷酸抗坏血酸钠 1.0醋酸维生素E 0.2红没药醇
1.0辛/癸酸甘油三酯，抗坏血酸钠，维生素E,维生素A
1.0乳杆菌
E
适量氢氧化钠
A相和B相分别加热到约80°C 。随后将B相搅入A相并混匀。将C 相搅入A相和B相混合物中并混匀。混合物在搅拌下冷却到40°C;然后 加入D相并用E相调节pH值到约6.5。随后将溶液混勻并冷却到室温。
在更优选的实施方案中，化妆品组合物包含防护日霜水包油制剂，其 可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
1.7鲸蜡硬脂醇聚醚-6，硬脂醇
0.7鲸蜡硬脂醇聚醚-25
2.0 二乙胺羟基苯曱酰基苯甲酸己酯
2.0 PEG-14二甲基珪油
3.6鲸蜡硬脂醇
6.0乙基己基甲氧基肉桂酸酯
2.0 二丁基己二酸酯
B
5.0甘油
0.2 EDTA 二钠
1.0泛醇
适量防腐剂
68.6软化水
C
4.0辛/癸酸甘油三酯，丙烯酸钠共聚物 D
1.0磷酸抗坏血酸钠 1.0醋酸维生素E
0.2红没药醇
1.0乳杆菌
E
适量氢氧化钠
A相和B相分别加热到约80℃。随后将B相搅入A相并混勻。将C 相引入A相和B相混合物中并混匀。混合物在搅拌下冷却到约40℃;加 入D相并用E相调节pH值到约6.5。随后将溶液混匀并冷却到室温。
在更优选的实施方案中，化妆品组合物包含皮肤清洁水包油制剂，其 可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
10.0鯨蜡硬脂基乙基己酸酯
10.0辛/癸酸甘油三酯
1.5环戊硅氧烷，环己硅氧烷
2.0 PEG-40氬化蓖麻油
B
3.5辛/癸酸甘油三酯，丙烯酸钠共聚物
C
1.0醋酸维生素E
0.2红没药醇
适量防腐剂
适量芳香油
D
3.0聚季铵盐-44
0.5椰油三甲基琉酸甲酯铵盐
0.5鲸蜡硬脂醇聚醚-25
2.0泛醇，丙二醇
4.0丙二醇
0.1 EDTA 二钠1.0乳杆菌 60.7软化水
首先将A相溶解，随后将B相搅入A相。然后将C相引入A相和B 相混合物中。下一步，将D相溶解并搅入A、 B和C相组合物中。将混合 物混匀并搅拌15分钟。
在更优选的实施方案中，化妆品组合物包含日间身体护理喷雾制剂， 其可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
3.0乙基己基甲氧基肉桂酸酯
2.0 二乙胺羟基苯曱酰基苯甲酸己酯
1.0聚季铵盐-44
3.0丙二醇
2.0泛醇，丙二醇
1.0环戊硅氧烷，环己硅氧烷
10.0辛基十二醇
0.5 PVP
10.0辛/癸酸甘油三酯 3.0 C12-15烷苯甲酸酯 3.0甘油
1.0醋酸维生素E 0.3红没药醇 1.0乳杆菌 59.2乙醇
称出A相的组分并溶解至澄清。在更优选的实施方案中，化妆品组合 物包含皮肤凝胶，其可能含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下 成分(％):
A
3.6PEG-40氬化蓖麻油15.0乙醇 0.1红没药醇 0.5醋酸维生素E 适量芳香油 B
3.0泛醇 0.6卡波姆 1.0乳杆菌 75.4软化水 C
0.8三乙醇胺
首先将A相溶解至澄清。将B相浸软并且随后用C相中和。下一步， 将A相搅入混匀的B相中，并将混合物混匀。
在仍然更优选的实施方案中，化妆品组合物包含剃须后洗剂，其可能 含有例如根据国际化妆品成分命名INCI的如下成分(％):
A
10.0鲸蜡硬脂基乙基己酸酯cetearylethylhexanoate 5.0醋酸维生素E 1.0红没药醇 0.1芳香油
0.3丙烯酸酯/C 10-30烷基丙烯酸酯交叉共聚物 B
15.0乙醇 1.0泛醇 3.0甘油 1.0乳杆菌 0.1三乙醇胺 63.5软化水
将A相的成分混合。下一步，将B相溶解并搅入A相中，随后混匀。
本发明也涉及根据本发明的微生物或如上所述其衍生物、突变体或无
活性形式用于制备预防或治疗皮炎的药物组合物的用途，优选遗传过敏性
皮炎、牛皮痺、毒葛皮炎、疱渗性湿渗、脓癣或齊疮。
本发明的另 一方面涉及生产组合物的方法，包含以化妆品的和/或药物
的步骤。
此外本发明涉及预防或治疗皮炎的方法，优选遗传过敏性皮炎、牛皮 癣、毒葛皮炎、疱疹性湿渗、脓癣或济疮，其包含将根据本发明的组合物 :矛姿其预防上或治疗上的有效剂量施用于患者的步骤。
应该理解本发明并不限于此处所述的特定方法、方案、细菌、媒介和 试剂等等，因为这些可能会改变。也应该理解此处所用术语只用于描述特 殊实施方案的目的，而非意在限制本发明的范围，该范围仅受附加权利要 求的限制。除非另外定义，所有此处所用的技术和科学术语与本领域普通 技术人员通常理解的意义一致。
优选地，此处所用术语如"生物技术术语多语言字典(IUPAC推荐)" Leuenberqer. H.G.W， Naqel. B.和K61bl. H.编辑(1995)， Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland中的描述来定义。在本说明书和随后的 权利要求中，除非正文另外需要，术语"包含，，应该理解为包括所声明的整 体或步骤、或整体或步骤的组，但不排除任何其它的整体或步骤、或整体 或步骤的组。
本说明书中引用了一些文件。不论上文或下文，本文引用的每个文件 (包括所有专利、专利申请、科学出版物、厂家说明书、说明书等等)都以 其整体引入作为参考。由于先发明，这不应解释为承认本发明不享有对在 先的这类公开的权利。
必须注意的是，除非文中另外清楚说明，此处和附加权利要求中所使 用的单数形式也包括复数。因此，例如参考"试剂，，包括一种或多种此类不 同试剂，参考"方法"包括等同于本领域那些普通技术人员所公知的步骤和方法，这些步骤和方法可以被修改或取代用于此处所述方法。
本发明的第一方面由如下描述的图l到图4说明
图1显示在体外孔平板测定中表皮葡萄球菌的生长刺激(实施例1)。 孔周围形成的黑色菌环表明指示菌林表皮葡萄球菌的生长刺激。在显微镜 下观察菌落增加的数量。
图2显示乳杆菌对皮肤上表皮葡萄球菌的刺激作用。图中显示了含有 共同应用于皮肤的指示菌抹表皮葡萄球菌和乳杆菌的琼脂平板。上层皮肤 用粘性胶带转移到琼脂平板上。通过此种方法将指示菌抹转移到琼脂平板 上。对照平板不含有乳杆菌菌林。
图3显示乳杆菌缺乏对皮肤上金黄色葡萄球菌的刺激。图中显示了含 有共同应用于皮肤的指示菌林金黄色葡萄球菌和乳杆菌的琼脂平板。上层 皮肤用粘性胶带转移到琼脂平板上。通过此种方法将指示菌林转移到琼脂 平板上。对照平板不含有乳杆菌菌林。
图4显示在体外孔平板测定中缺乏金黄色葡萄球菌的生长刺激(实施 例4)。观察到孔周围没有形成细胞密度增加的黑色菌环。这表明指示菌株 没有被乳杆菌刺激。
本发明的第二方面由如下描述的图5到图ll说明
图5显示在体外孔平板测定中金黄色葡萄球菌的生长抑制(实施例5)。 孔周围形成的透明环表明指示对菌抹金黄色葡萄球菌的生长抑制。
图6显示在体外液体测定中金黄色葡萄球菌的生长抑制(实施例6)。 图中显示与不含乳酸菌的对照相比，通过计数指示菌林金黄色葡萄球菌的 菌落形成单位来定量的抑制程度。
图7显示在体外液体测定中缺乏对表皮葡萄球菌的生长抑制(实施例 7)。图中显示与不含乳酸菌的对照相比，通过计数指示菌林表皮葡萄球菌 的菌落形成单位来定量的抑制程度。
图8显示在体外液体测定中缺乏对藤黄微球菌的生长抑制(实施例10)。图中显示与不含乳酸菌的对照相比，通过计数指示菌林藤黄微球菌的
菌落形成单位定量的抑制程度。
图9显示在体外液体测定中缺乏对大肠杆菌的生长抑制(实施例11)。 图中显示与不含乳酸菌的对照相比，通过计数指示菌林大肠杆菌的菌落形 成单位定量的抑制程度。
图10显示在体外孔平板测定中，与杆菌肽和红霉素相比，对金黄色 葡萄球菌生长抑制的程度(实施例12)。以不同浓度的杆菌肽和红霉素填充 预先打好的孔，观察金黄色葡萄球菌的生长。在图IOA中显示对应的校准 曲线。在图10B中显示确定数量的预培养乳杆菌细胞(DSM 18006)对金黄 色葡萄球菌的生长抑制。
图11显示乳杆菌抑制物的蛋白酶稳定性(实施例13)。乳杆菌DSM 18006的抗菌活性通过蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和灰色链霉菌 蛋白酶的降解稳定性来表征。
实施例
本发明的第一方面由如下的实施例1到4说明
实施例1 ' 体外孔平板测定中表皮葡萄球菌的生长刺激
在体外孔平板测定中已经鉴定特定乳酸菌能够刺激琼脂平板上表皮葡 萄球菌的生长。此处描述这些乳酸菌。为了测试此种作用，用预培养的乳 酸菌填充预先打好的孔，并观察指示菌林表皮葡萄球菌的生长刺激。为提 高生长刺激的可视效果，使用亚碲酸盐。亚碲酸盐特异性地染色葡萄球菌。 灌入乳酸菌的孔周围形成黑色菌环并且菌落数增加即定义为刺激。数据在 图1中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌从-80。C冻存的含lmlMRS培养液的微量离心管中取出培养。 管子是封闭的并且在37。C培育2天。将10 jil此预培养液转移到Falcon塑 料管中含7mlMRS培养液的主培养液中。培养2天。培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗2次(每次1 ml)。 在200 ul K/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌株的培养和制备
指示菌抹是表皮葡萄球菌(DSM20044)。用15 ul预培养24小时的培养 液接种含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37℃培 养24小时。以BHI培养液将整分试样稀释到光密度OD595nm为0.025 - 0.05， 取800 ul涂布于指示平板上(BHI/亚碲酸盐)。用木塞打孔器在琼脂上打孔。 用预培养的乳酸菌填充这些孔。
培养基和緩冲液:
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
BHI-培养基 Difco
BHI/亚碲酸盐 与BHI-琼脂类似，在冷却到50℃以后，将1 ml 无菌过滤的1 %亚碲酸钾溶液转移到100 ml BHI-培养基中；每板20ml
MRS-培养液 Difco， 150 ul/孔
K/Na-缓冲液Ki3ster Thiel， pH 7.0，高压灭菌 -0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例2
原位皮肤测定中表皮葡萄球菌的生长刺激 经鉴定益生乳酸菌能直接在皮肤上刺激表皮葡萄球菌的生长。 将表皮葡萄球菌的培养液稀释，直接应用于皮肤上，并在空气中干燥。 然后将乳酸菌的整分试样精确应用于此皮肤区域。乳酸菌能直接在皮肤上 刺激指示菌抹表皮葡萄球菌。培育之后，使用粘性胶带将葡萄球菌从皮肤 转移到琼脂平板上。将琼脂平板在37℃培养。菌落计数的增加表明皮肤上 指示菌林的生长剌激(图2)。本发明的乳杆菌菌林，特别是那些保藏于 DSMZ的乳杆菌菌抹，展现对此处所述指示菌抹的生长刺激。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌从-80℃冻存的含lml MRS培养液的微量离心管中取出培养。 管子封闭的在37℃培育2天。10 ul此预培养液转移到含7 ml MRS培养 液的福尔肯管中的主培养液中。培养2天。培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗2次(每次1 ml)。在200jil K/Na 緩冲液中重悬细胞。
指示菌林的培养和制备
指示菌林是表皮葡萄球菌(DSM20044)。用15 pl预培养24小时的培养 液接种含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37℃培 养24小时。以BHI培养液将整分试样稀释到光密度OD外5nm为0.025 - 0.05。 再一次稀释此溶液(l :100)。
培养基和緩冲液
BHI-琼脂 1.8%Difco 琼脂； 每板20 ml
BHI-培养基 Difco
MRS-培养液 Difco, 150ul/孔
K/Na-緩冲液 Kvster Thiel, pH 7.0, 高压灭菌 －0.066 M Na2HP04 x 2H2O 61.2 ml -0.066 M KH2PO4 38.8 ml
在前臂上应用表皮葡萄球菌
取制备好的指示菌林表皮葡萄球菌的1 :100的稀释液400 均匀涂 布于确定皮肤区域(10cmx3cm),并且在空气中干燥。
在表皮葡萄球菌接种的皮肤区域应用乳杆菌
将10 ul制备好的乳杆菌准确应用于预先接种表皮葡萄球菌的皮肤区域。在正常环境中在手臂上培育2小时。
将微生物从皮肤上重新分离
2小时后，使用粘性胶带将4层上层皮肤转移到BHI-琼脂平板上。通 过此过禾呈，将分离的皮肤细菌转移到琼脂平板上。琼脂平板在37℃培养24 小时。
实施例3
原位皮肤测定中金黄色葡萄球菌没有生长刺激
使用此测定可以检验能够刺激防护性固有皮肤微生物菌群细菌的乳杆 菌是否并不刺激不需要的暂居病原菌群的细菌。为此目的，指示菌林金黄 色葡萄球菌被高度稀释，并以与表皮葡萄球菌一样的方式应用于皮肤上(见 实施例2)。再测试乳酸菌的刺激活性。并没有观察到所述乳酸菌对金黄色 葡萄球菌的剌激。本发明的乳杆菌菌林，特别是那些保藏于DSMZ的乳杆 菌菌林，不显示对金黄色葡萄球菌的刺激。数据在图3中给出。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌从-80℃冻存的含lml MRS培养液的微量离心管中取出培养。 管子封闭的在37℃培育2天。将10 ul此预培养液转移到Falcon塑料管中 含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。培养后通过离心(15分钟， 4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗2次(每次1 ml)。在200jil K/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌抹的培养和制备
指示菌林是金黄色葡萄球菌(DSM346)。用15ul预培养24小时的培养 液接种在含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37°C 培养24小时。以BHI培养液将整分试样稀释到光密度OD595nm为0.025-0.05。再一次稀释此溶液(l :100)。培养基和緩冲液:
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
Bffl-培养基 Difco
MRS-培养液 Difco， 150 μl/孔
K/Na-緩冲液 Ki3ster Thiel， pH 7.0，高压灭菌 -0.066 M Na2HP04x2H2O61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
在前臂上应用金黄色葡萄球菌
取制备好的指示菌林金黄色葡萄球菌的1 :100稀释液400 jil，均匀涂 布于确定皮肤区域(10cmx3cm),并且在空气中干燥。
在金黄色葡萄球菌接种的皮肤区域应用乳杆菌
将10 μl 制备好的乳杆菌准确应用于预先接种金黄色葡萄球菌的皮肤 区域。在正常环境中在手臂上培育2小时。
将微生物从皮肤上重新分离
2小时后，4吏用粘性胶带将4层上层皮肤转移到BHI-琼脂平板上。通 过此过程，分离出来的皮肤细菌被转移到琼脂平板上。琼脂平板在37。C培 养24小时。数据在图3中显示。
实施例4
在体外孔平板测定中金黄色葡萄球菌没有生长刺激
经鉴定特定乳酸菌在体外孔平板测定中能够在琼脂平板上刺激表皮葡 萄球菌的生长,但是不能刺激暂居皮肤菌群的代表金黄色葡萄球菌的生长。 为测试此种作用，用预培养的能够刺激表皮葡萄球菌的乳酸菌填充到预先 打好的孔中，并没有观察到指示菌抹金黄色葡萄球菌的生长刺激。为提高 生长刺激的可视效果，使用亚碲酸盐。亚碲酸盐特异性地将葡萄球菌染色。 含有乳酸菌的孔周围形成黑色菌环并且菌落数增加即定义为刺激。本发明的乳杆菌菌林，特别是那些保藏于DSMZ的乳杆菌菌林，不显示对金黄色 葡萄球菌的刺激。数据在图4中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌从-80'C冻存的含lmlMRS培养液的微量离心管中取出培养。 管子封闭的在37。C培育2天。将10 jil此预培养液转移到Falcon塑料管中 含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。培养后通过离心(15分钟， 4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗2次(每次1 ml)。在200^1 K/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌林的培养和制备
指示菌抹是金黄色葡萄球菌(DSM346)。 15 jil预培养24小时的培养液 接种于含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37'C培 养24小时。以BHI培养液稀释整分试样到光密度OD595nm为0.025 - 0.05， 取800 jd涂布于指示平板上(BHI/亚碲酸盐)。用木塞打孔器在琼脂上打孔。 用预培养的乳酸菌填充这些孔。
培养基和緩冲液
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
BHI-培养基 Difco
BHI/亚碲酸盐 与BHI-琼脂类似，在冷却到5(TC以后，将1 ml
MRS-培养液 K/Na-緩冲液
无菌过滤的1 %亚碲酸钾溶液转移到100 ml BHI-培养基中；每板20ml Difco， 150 jil/孔
Ki3ster Thiel， pH 7.0，高压灭菌 -0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml
0.066 M KH2P04 38.8 ml
78
本发明的第二方面由如下的实施例5到13说明
实施例5
体外孔平板测定中金黄色葡萄球菌的生长抑制
已经鉴定特定乳酸菌能够在体外孔平板测定中特异性抑制琼脂平板上 金黄色葡萄球菌的生长。为了测试此作用，用预培养的乳酸菌填充预先打 好的孔，并观察指示菌抹金黄色葡萄球菌的生长抑制。数据在图5中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80。C冻存的含lml MRS培养液的 微量离心管中取出培养。管子封闭的在37。C培育2天。将10 jil此预培养 液转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。 培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K7Na-緩冲液清 洗2次(每次lml)。在200 nlK/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌林的培养和制备
指示菌林是金黄色葡萄球菌(DSM346)。用15 jil预培养24小时的培养 液接种含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶。指示菌林在37。C培养 24小时。以BHI培养液稀释整分试样到光密度ODs95鹏为0.025-0.05，取 800 jil涂布于指示平板上(BHI)。用木塞打孔器在琼脂上打孔。用5 jil或 10 jil预培养的乳酸菌填充这些孔。
培养基和緩冲液 BHI-琼脂 BHI國培养基 MRS-培养液 薩a-緩沖液
1.8% Difco琼脂；每板20 ml Difco Difco
根据Klister Thiel， pH 7.0，高压灭菌 誦0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例6
体外液体测定中金黄色葡萄球菌的生长抑制
在体外液体测定中已经鉴定特定乳酸菌能够抑制液体培养基中金黄色 葡萄球菌的生长。为了测试此种作用，将预培养的乳酸菌与指示菌林金黄 色葡萄球菌在对葡萄球菌生长最佳的液体培养基中共培养。通过计数指示 菌林菌落形成单位并与没有乳酸菌的对照相比较来定量抑制的程度。数据 在图6中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80。C冻存的含lml MRS培养液的 微量离心管中取出培养。管子封闭的在37。C培育2天。10 pl此预培养液 转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。培 养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗 2次(每次lml)。在含250mM甘油的200jUK/Na緩冲液中重悬细胞，并 培养17小时。
指示菌抹的培养和制备
指示菌林是金黄色葡萄球菌(DSM346)。 15 jil预培养24小时的培养液 接种于含有10 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。培养物用新鲜BHI 培养液稀释到细胞密度为2.5 x 108个细胞/ml。
液体抑制测定
对于液体测定，将5 jil新鲜配制的乳酸菌(从200 jil)和10 nl预培养的 指示菌林金黄色葡萄球菌接种在10 ml的BHI培养液中共培养。培养7小 时。然后将100 fil的1 :10000的稀释液涂布在BHI琼脂平板上，用于定量 菌落形成单位。平板培养24小时，并计数菌落形成单位。
培养基和緩冲液BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
BHI-培养基 Difco MRS-培养液 Difco
K/Na-緩冲液 根据Ki3sterThiel，pH7.0，高压灭菌
-0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例7
体外液体测定中表皮葡萄球菌没有生长抑制
使用此测定可以检验在体外液体测定中，所选能够抑制病原微生物金 黄色葡萄球菌生长的乳酸菌是否并不抑制皮肤共生微生物菌群主要成员表 皮葡萄球菌的生长。
为测试此作用，将预培养的乳酸菌与指示菌林在液体培养基中共培养。 通过计数指示菌林菌落形成单位并与没有乳酸菌的对照相比较来定量抑制 的程度。数据在图7中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80。C冻存的含1ml MRS培养液的 微量离心管中取出培养。管子封闭的在37'C培育2天。10 nl此预培养液 转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。培 养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗 2次(每次lml)。在含250mM甘油的200 jilK/Na緩冲液中重悬细胞，并 培养17小时。
指示菌抹的培养和制备
指示菌林是表皮葡萄球菌(DSM20044)。 15μl预培养24小时的培养液 接种于含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。
液体抑制测定
对于液体测定，将5μl新鲜配制的乳酸菌(从200μl)和10μl预培养的 指示菌林表皮葡萄球菌在10mlBHI培养基中共培养。培养7小时。然后 将100μl的1 :10000的稀释液涂布在BHI琼脂平板上，用于定量菌落形成 单位。平板培养24小时，并计数菌落形成单位。
培养基和緩冲液:
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂;每板20 ml
BHI-培养基 Difco
MRS-培养液 Difco
K/Na-緩冲液 根据Küster Thiel， pH 7.0，高压灭菌 -0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例8
原位皮肤测定中金黄色葡萄球菌的生长抑制
经鉴定乳酸菌能直接在皮肤上抑制金黄色葡萄球菌的生长。
为测试此作用，将金黄色葡萄球菌的培养液稀释，直接应用于皮肤上， 并在空气中干燥。然后将乳酸菌的整分试样应用于此皮肤区域。这样在皮 肤上乳酸菌能直接抑制指示菌抹金黄色葡萄球菌。培育之后，使用粘性胶 带将葡萄球菌从皮肤转移到琼脂平板上。将琼脂平板在37。C培养。与没有 乳酸菌的对照相比，菌落计数的减少表明皮肤上指示菌株的生长抑制。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80℃冻存的含lml MRS培养液的 微量离心管中取出培养。管子封闭的在37℃培育2天。10μl此预培养液 转移到Falcon塑料管中含7mlMRS培养液的主培养液中。培养2天。培 养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩沖液清洗 2次(每次lml)。在200μlK/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌林的培养和制备
指示菌林是金黄色葡萄球菌(DSM346)。 15 pl预培养24小时的培养液 接种于含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37'C培 养24小时。
培养基和緩冲液 BHI-琼脂 BHI-培养基 MRS-培养液 K/Na-緩冲液
在前臂上应用金黄色葡萄球菌
取预制备的指示菌株金黄色葡萄球菌的l:100的稀释液400 nl，均匀 涂布于确定皮肤区域(10cmx3cm)，并且在空气中干燥。
在金黄色葡萄球菌接种的皮肤区域应用乳杆菌 将10nl制备好的乳杆菌应用于预先接种金黄色葡萄球菌的皮肤区域。 在正常环境中在手臂上培育6小时。
将微生物从皮肤上重新分离
6小时后，使用粘性胶带将4层上层皮肤转移到BHI-琼脂平板上。这 样，分离出来的皮肤细菌被转移到琼脂平板上。琼脂平板在37'C培养24 小时。
实施例9
原位皮肤测试中表皮葡萄球菌没有生长抑制
经鉴定乳酸菌能抑制金黄色葡萄球菌的生长而不直接影响皮肤上的表 皮葡萄球菌的生长。
使用此测定可以检验能够抑制金黄色葡萄球菌的乳杆菌是否并不抑制 健康正常皮肤菌群的共生微生物表皮葡萄球菌。
因此以与金黄色葡萄球菌一样的方式将指示菌林表皮葡萄球菌高度稀 释并应用于皮肤。再测试乳酸菌的抑制活性。没有观察到所述乳酸菌对表 皮葡萄球菌的抑制。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80。C冻存的含lml MRS培养液的 微量离心管中取出培养。管子封闭的在37。C培育2天。将10 nl此预培养 液转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。 培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清 洗2次(每次lml)。在200jUK/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌林的培养和制备
指示菌林是表皮葡萄球菌(DSM20044)。 15fil预培养24小时的培养液 接种于含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌株在37。C培 养24小时。
培养基和緩冲液
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
BHI-培养基 Difco MRS-培养液 Difco
K/Na-緩冲液 Ki3sterThiel，pH7.0,高压灭菌
-0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
在前臂上应用表皮葡萄球菌
取制备好的指示菌林表皮葡萄球菌的1 :100的稀释液400 pi,均匀涂 布于确定皮肤区域(10cmx3cm)，并且在空气中干燥。
在接种表皮葡萄球菌的皮肤区域应用乳杆菌
将10 μl制备好的乳杆菌应用于预先接种表皮葡萄球菌的皮肤区域。 在正常环境中在手臂上培育6小时。
将微生物从皮肤上重新分离
6小时后，使用粘性胶带将4层上层皮肤转移到BHI-琼脂平板上。这 样，分离出来的皮肤细菌被转移到琼脂平板上。琼脂平板在37℃培养24 小时。
实施例10
体外液体测定中藤黄微球菌没有生长抑制
在体外液体测定中，所选能够抑制病原微生物金黄色葡萄球菌生长的 乳酸菌并不抑制皮肤共生微生物菌群相关成员藤黄微球菌的生长。为测试 此种作用，将预培养的乳酸菌与指示菌抹在液体培养基中共培养。通过计 数指示菌林菌落形成单位并与没有乳酸菌的对照比较来定量抑制的程度。 数据在图8中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006和OB-LB-Sal6; DSM 18007)从-80。C 冻存的含lml MRS培养液的微量离心管中取出培养。管子封闭的在37℃培育2天。10 jil此预培养液转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养液 的主培养液中。培养2天。培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。 细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗2次(每次1 ml)。在含250 mM甘油的200 jil K/Na緩冲液中重悬细胞，并培养17小时。
指示菌林的培养和制备
指示菌林是藤黄微球菌。用15 μL冷冻培养物接种于含有20 ml BHI 培养液的振摇的玻璃培养瓶中预培养24小时。
液体抑制测定
对于液体测定，将5 jil新鲜配制的乳酸菌(从200 nl)和10 jil预培养的 指示菌林藤黄微球菌在10mlBHI培养基中共培养。培养7小时。然后将 100 fil的1 :1000的稀释液涂布在BHI琼脂平板上，用于定量菌落形成单 位。平板培养24小时，并计数菌落形成单位。
培养基和緩冲液
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
BHI-培养基 Difco MRS-培养液 Difco
K/Na-緩冲液 根据Ki3sterThiel,pH7.0，高压灭菌
-0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml
-0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例11
体外液体测定中大肠杆菌没有生长抑制
在体外液体测定中，所选能够抑制病原微生物金黄色葡萄球菌生长的 乳酸菌并不抑制其它人相关微生物如大肠杆菌。
为测试此作用，将预培养的乳酸菌与指示菌抹在液体培养基中共培养。 通过计数指示菌林菌落形成单位并与没有乳酸菌的对照相比较来定量抑制 的程度。数据在图9中显示。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006和OB-LB-Sal6; DSM 18007)从-80。C 冻存的含lml MRS培养液的微量离心管中取出培养。管子封闭的在37。C 培育2天。将10 pi此预培养液转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养 液的主培养液中。培养2天。培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。 细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗2次(每次1 ml)。在含250 mM甘油的200 jilK/Na緩沖液中重悬细胞，并培养17小时。
指示菌林的培养和制备
指示菌祙是大肠杆菌。用15 jil冷冻培养物接种于含有20 ml BHI培 养液的振摇的玻璃培养瓶中预培养24小时。
液体抑制测定
对于液体测定，将5 jil新鲜配制的乳酸菌(从200 jil)和10 ftl预培养的 指示菌抹大肠杆菌接种在10mlBHI培养基中共培养。培养7小时。然后 将100 jd的1 :1000的稀释液涂布在BHI琼脂平板上，用于菌落形成单位 定量。平板培养24小时，并计数菌落形成单位。
培养基和緩冲液:
BHI-琼脂
BHI-培养基
MRS-培养液
K/Na-緩冲液
1.8% Difco琼脂；每板20 ml
Difco
Difco
根据Ki3ster Thiel， pH 7.0，高压灭菌 -0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例12
在体外孔平板测定中，与杆菌肽和红霉素相比，对金黄色葡萄球菌的 生长抑制程度
在体外孔平板测定中已经鉴定特定乳酸菌能够特异性地抑制琼脂平板 上金黄色葡萄J求菌的生长。将这种作用与杆菌肽和红霉素的商业抗生素乳 膏制剂相比较。为比较这种作用，将不同浓度的两种抗生素填充到预先打 好的孔中，观察到对指示菌株金黄色葡萄球菌的生长抑制(图10A中给出 校准曲线)。测量抑制区的直径，并计算其抑制面积。然后通过确定数目的 预培养的乳杆菌菌林OB-LB-Sa3 (DSM 18006)细胞，将此面积与金黄色葡
萄球菌的生长抑制相关联(见图IOB)。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80。C冻存的含lml MRS培养液的 微量离心管中取出培养。管子封闭的在37。C培育2天。将10 jil此预培养 液转移到Falcon塑料管中含7 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。 培养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清 洗2次(每次lml)。在200nlK/Na緩冲液中重悬细胞。
指示菌林的培养和制备
指示菌抹是金黄色葡萄球菌(DSM346)。 15 nl预培养24小时的培养液 接种于含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37。C培 养24小时。以BHI培养液稀释整分试样到光密度OD595nm为0.025 - 0.05， 取800 ul涂布于指示平板上(BHI)。用木塞打孔器在琼脂上打孔。用5 fil 或10 nl预培养的乳酸菌或相应体积的商业抗生素制剂填充这些孔。
培养基和緩冲液
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂；每板20 ml
BHI-培养基 Difco MRS-培养液 Difco
K/Na-緩沖液 根据KDsterThiel，pH7.0，高压灭菌
-0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml -0.066 M KH2P04 38.8 ml
实施例13
乳杆菌抑制物的蛋白酶稳定性
在体外孔平板测定中已经鉴定特定乳酸菌能够特异性地抑制琼脂平板 上的金黄色葡萄球菌的生长。所选乳杆菌的抗菌活性通过蛋白酶K、灰色 链霉菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的消化性能来表征。制备乳杆菌上清液的无细胞制剂，并在不同蛋白酶中于37'C孵育1小时。然后测试这些制剂4中制指示菌林金黄色葡萄球菌生长的能力。测量抑制区的直径，并 计算其抑制面积(见图11)。
乳杆菌的培养和制备
乳酸菌(OB-LB-Sa3; DSM 18006)从-80。C冻存的含7 ml MRS培养液 的Falcon塑料管中取出培养。管子封闭的在37。C培育2天。将7 ml此预 培养液转移到培养瓶中含40 ml MRS培养液的主培养液中。培养2天。培 养后通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞。细胞沉淀用K/Na-緩冲液清洗 2次(每次2ml)。在10 mlBHI培养基中重悬细胞，在37。C培养6小时。 通过离心(15分钟，4000xg)收集细胞，上清液用于蛋白酶孵育。具体地， 150 fil上清液与15 nl的10 mg/ml蛋白酶溶液在37。C赙育。
指示菌抹的培养和制备
指示菌林是金黄色葡萄球菌(DSM346)。 15jil预培养24小时的培养液 接种于含有20 ml BHI培养液的振摇的玻璃培养瓶中。指示菌林在37。C培 养24小时。以BHI培养液稀释整分试样到光密度OD595nm为0.025 - 0.05， 取800 pl涂布于指示平板上(BHI)。用木塞打孔器在琼脂上打孔。用5 nl 或10 jil预培养的细胞填充这些孔，并与15 jil的10 mg/ml蛋白酶溶液在 37'C孵育1小时。然后使用5 jil或10 fil的蛋白酶处理的乳杆菌上清液进 行抑制测定。
培养基和緩冲液:
BHI-琼脂 1.8% Difco琼脂BHI-培养基 MRS-培养液 K/Na-緩冲液
BHI-培养基 Difco
MRS-培养液 Difco
MRS-培养液 Difco
K/Na-緩冲液 才艮据KiisterThiel，pH7.0，高压灭菌 -0.066 M Na2HP04x2H20 61.2 ml-0.066 M KH2P04 38.8 ml
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Yosipovitch, G" Maibach, HI. (1996): Skin surface pH: A protective acid mantle in Cosmetics Toiletries magazine 111 (12): 10权利要求
1.微生物，其能够刺激一种或多种固有皮肤微生物菌群的微生物生长，而不刺激暂居病原微生物菌群的微生物生长。
2. 权利要求i的微生物，其能够刺激表皮葡萄球菌的生长。
3. 权利要求2的微生物，其能够在体外刺激表皮葡萄球菌的生长。
4. 权利要求2或3的微生物，其能够在原位皮肤测定中刺激表皮葡 萄球菌的生长。
5. 权利要求1到4的任一项的微生物，其不刺激金黄色葡萄球菌的 生长。
6. 权利要求1到5的任一项的微生物，其为属于乳杆菌属的微生物。
7. 权利要求6的微生物，其中所述乳杆菌是副干酪乳杆菌、短乳杆 菌或发酵乳杆菌。
8. 权利要求7的微生物，其中副干酪乳杆菌是副干酪乳杆菌副干酪 亚种的副干酪乳杆菌。
9. 权利要求7或8的微生物，其选自具有DSMZ登录号DSM 17248、 登录号DSM 17247、登录号DSM 17250和登录号DSM 17249的 副干酪乳杆菌、短乳杆菌或发酵乳杆菌，或其突变体或衍生物组 成的组，其中所述突变体或衍生物保留刺激至少 一种固有皮肤微 生物菌群的微生物生长而不刺激暂居病原微生物菌群的微生物生 长的能力。
10. 权利要求1到9中任一项的微生物的无活性形式，其能够刺激一 种或多种固有皮肤微生物菌群的微生物生长，但不刺激暂居病原 微生物菌群的微生物生长。
11. 权利要求10的无活性形式，其为热灭活或冻干的。
12. 组合物，其包含权利要求1到9中任一项的微生物或权利要求10 或11的无活性形式。
13. 权利要求12的组合物，其为化妆品组合物，任选地包含化妆品的可接受的栽体或赋形剂。
14. 权利要求12的组合物，其为药物组合物，任选地包含药物的可接 受的载体或赋形剂。
15. 权利要求1到9中任一项的微生物的用途或权利要求10或11的 无活性形式的用途，所述用途为制备用于保护皮肤对抗病原菌的 化妆品的或药物的组合物。
16. 权利要求1到9中任一项的微生物的用途或权利要求10或11的 无活性形式的用途，所述用途为制备预防或治疗皮炎的药物组合 物。
17. 权利要求16的用途，其中皮炎是遗传过敏性皮炎、牛皮癣、毒葛 皮炎、疱渗性湿渗、脓癣或齊疳。
18. 生产组合物的方法，其包括用化妆品的或药物的可接受的载体或 赋形剂配制根据权利要求1到9中任一项的微生物或权利要求10 或ll的无活性形式的步骤。
19. 微生物，其能够抑制一种或多种暂居病原皮肤微生物菌群的微生 物生长，而不抑制健康正常的固有皮肤^:生物菌群的^:生物生长。
20. 权利要求19的微生物，其能够抑制金黄色葡萄球菌的生长。
21. 权利要求20的微生物，其能够在体外抑制金黄色葡萄球菌的生长。
22. 权利要求21的微生物，其能够在体外液体测定中抑制金黄色葡萄 球菌的生长。
23. 权利要求20到22中任一项的微生物，其能够在原位皮肤测定中 抑制金黄色葡萄球菌的生长。
24. 权利要求19到23中任一项的微生物，其不抑制表皮葡萄球菌的 生长。
25. 权利要求19到24中任一项的微生物，其为属于乳杆菌属的微生 物。
26. 权利要求25的微生物，其中所述乳杆菌是布氏乳杆菌或德氏乳杆 菌。
27. 权利要求26的微生物，其中所述德氏乳杆菌是德氏乳杆菌德氏亚 种。
28. 权利要求26或27的微生物，其选自具有DSMZ登录号DSM 18007 和登录号DSM 18006的布氏乳杆菌和德氏乳杆菌德氏亚种，或其 突变体或衍生物组成的组，其中所述突变体或衍生物保留抑制一 种或多种暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长并且不抑制健康 正常的固有皮肤微生物菌群的微生物生长的能力。
29. 权利要求19到28中任一项的微生物的无活性形式，其能够抑制 一种或多种暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长，而不抑制健 康正常的固有皮肤微生物菌群的微生物生长。
30. 权利要求29的无活性形式，其为热灭活或冻干的。
31. 组合物，其包含权利要求19到28中任一项的微生物或权利要求 29或30的无活性形式。
32. 权利要求31的组合物，其为化妆品组合物，任选地包含化妆品的 可接受的载体或赋形剂。
33. 权利要求31的组合物，其为药物组合物，任选地包含药物的可接 受的载体或赋形剂。
34. 权利要求19到28中任一项的微生物的用途或权利要求29或30 的无活性形式的用途，所述用途为制备用于保护皮肤对抗病原菌 的化妆品的或药物的组合物。
35. 权利要求19到28中任一项的微生物的用途或权利要求29或30 的无活性形式的用途，所述用途为制备预防或治疗皮炎的药物组 合物。
36. 权利要求35的用途，其中该皮炎是遗传过敏性皮炎、牛皮癣、毒 葛皮炎、疱渗性湿療、脓癣或齊痴。
37. 生产组合物的方法，其包括用化妆品的或药物的可接受的载体或 赋形剂配制根据权利要求19到28中任一项的微生物或权利要求 29或30的无活性形式的步骤。
全文摘要
本发明涉及微生物，在第一方面，其能够刺激固有皮肤微生物菌群的微生物生长，而不刺激暂居病原微生物菌群的微生物生长。在第二方面，本发明涉及的微生物能够抑制暂居病原皮肤微生物菌群的微生物生长，而不抑制固有皮肤微生物菌群的微生物生长。本发明还涉及包含此类微生物的组合物，以及此类微生物在化妆品、预防或治疗应用中的用途。
文档编号C12N1/20GK101203600SQ200680022460
公开日2008年6月18日 申请日期2006年6月22日 优先权日2005年6月22日
发明者A·海尔曼, A·赖因德, C·朗, E·布德, M·波特纳, M·维恩, R·克内尔 申请人:有机金属平衡有限公司