用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗的制作方法

专利名称：用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗的制作方法
用于治疗阿尔茨海默病的具有较高安全性的经鼻腔内给药基因疫苗 技术领域0001本发明是有关一种基于负链RNA病毒载体的用于阿尔茨海默病的治疗 性基因疫苗。 技术背景0002随着日本急速步入老龄化社会，老年性痴呆症及其护理问题日渐成为 巨大的社会问题。据报道，在日本，65岁以上的老人中有10%患有老年性 痴呆症。阿尔茨海默病是导致老年性痴呆症的两大原因之一，约占老年性 痴呆症患者的50%,但目前尚未推出有效的治疗方法。0003阿尔茨海默病的病理学改变有以下3点特征即神经元细胞的萎缩/ 脱落；由|3淀粉样蛋白(amyloid)(以下简称为A|3 )凝集和沉淀所引起的老 年斑的形成；由异常tau蛋白质引起的神经元纤维性病变。阿尔茨海默病患 者脑内生成的(3淀粉样蛋白质主要是由(3及Y分泌酶裂解P淀粉样前体蛋白 后产生的40-43个氨基酸组成的。老年斑的中央为P淀粉样蛋白，在其周 围含有胶质细胞，纤维型星形胶质细胞，及营养不良的神经突起构成的凝 集体。目前， 一种较有力的阿尔茨海默病发病机制"淀粉样蛋白级联假说" 认为，p淀粉样蛋白的凝集及沉淀是形成老年斑的主要原因。0004基于该假说，阿尔茨海默病的新型疗法-免疫疗法尤为受到关注。该 疫苗疗法旨在利用免疫学手法来清除脑内卩淀粉样蛋白。ELan公司的 Schenk等将前凝集Ap42与佐剂同时给药到PDAPP-转基因小鼠的肌肉内， 确认到了其脑内淀粉样沉淀的减少(专利文献1以及非专利文献1 )。在Elan 公司和Wyeth公司等的临床试验中，将合成A|342肽(AN-1792)和佐剂(QS21) 同时进行肌肉内给药后，在被试验者的血清中发现了可识别P折叠结构的 抗A[3抗体(非专利文献2)。并且报道了脑的高级功能也有改善(非专利文献3)。然而很遗憾，在11期临床试验中有6% (298名中18名)的患者 出现了脑脊髓膜炎的副作用，并有1例死亡报告。顾而中断了上述的临床 试验。对死亡患者的脑组织进行病理分析时发现，在新皮质中没有老年斑 的存在，而显示了疫苗的有效性。在老年斑消失的区域内，确认到了对A(3 分解物的小胶质细胞的吞噬作用。该结果表明结合于A(3的抗体通过Fc受 体介导，被小神经胶质细胞吞食。0005上述抗A卩抗体对神经元，神经胶质细胞，淀粉样前体蛋白(APP)及 细胞内A(3不发生反应。由此很难判断，上述副作用是由抗体引起的脑部炎 症。给药AN-1792疫苗时需要一种佐剂。这种佐剂具有很强的免疫赋活作 用，还可诱导T淋巴细胞性细胞免疫。由此判断，上述副作用有可能是由 于佐剂诱导的细胞免疫，使反应于A卩或APP的TH1型CD4+T细胞浸润大 脑后导致的，类似于实验性过^t性脑脊髓炎的脑脊髓膜炎。(非专利文献4)0006通过AN-1792疫苗试验确认了使用Ap肽疫苗疗法的病理学有效性。然 而为了使疫苗适用于临床应用，必须减低脑脊髓膜炎等的副作用。由该观 点构思了 2种新的治疗方案。一种是结合有载体蛋白的Ap肽N末端片段与 Th2佐剂并用的免疫疗法(专利文献2)。其中所述载体蛋白可被T细胞识别。 还有一种是包含有腺病毒载体的经改良的疫苗接种法(专利文献3)。其中 所述腺病毒载体包含有编码由A(3肽和霍乱毒素B亚单位组成的融合蛋白质 的核酸。进而，本发明者们还开发出了一种安全性更高的口服疫苗-腺相 关病毒载体，该载体包含有编码诱导体液免疫的Ap肽的肽片断的DNA(专 利文献4)。由于上述腺相关病毒载体疫苗利用TH2细胞易于被诱导的肠道 粘膜免疫系统，则无需任何佐剂；并且，通过对APP转基因小鼠的一次给 药表现出如下的优秀特性，在肠道内具有可长达6个月的抗原呈递作用； 呈现出减低脑内淀粉样沉淀及老年斑形成的效果；且未在其他脏器发现任 何可被观察到的炎症。然而为了使阿尔茨海默病的疫苗疗法实用化，还需 要发明更加安全有效，更为先进的疫苗。000特許文献1WO 99/2794特許文献2WO 02/096350特許文献3WO 2004/0508特許文献4WO 2004/111250特許文献5WO 00/70070特許文献6特开2000-2538特許文献7WO 2001/072340非特許文献1SchenkD. et al, Nature 400: 173-177, 1999非特許文献2Hock C. et al" Nat Med. 8: 1270-1275, 200非特許文献3Hock C. et al., Neuron 38, 547-554, 200非特許文献4临床和研究82(3): 439-444,2005[发明的公开]0008鉴于上述情况完成了本发明。本发明的目的为针对阿尔茨海默病提供 更加安全有效的疫苗疗法。0009为此，本发明者们经过不懈努力，尝试开发了针对阿尔茨海默病的新 型疫苗疗法。本发明者们具有利用仙台病毒进行既可以用于基因导入，又 可以用于基因治疗的载体的开发经验。仙台病毒是负链RNA病毒。该病毒 只在宿主细胞的细胞质内增殖，因其生活周期中不具有DNA期，所以不会 整合入染色体内。因此，在作为基因导入载体使用时，可确保高度的遗传 安全性。本发明者们在开发以仙台病毒为基础的基因导入载体时，从仙台 病毒基因组中敲除了其基因，以提高安全性，提供更适合靶疾患的载体。 通过从基因组中敲除与侵入宿主细胞有关的膜融合蛋白(F蛋白质)的基因， 来提高其安全性，在既可以成功地改良使其不会引发二次感染的同时，也 可以有效的重构病毒载体(WO 00/70070)。进而，利用仙台病毒载体的流感 疫苗(特开2000 - 253876)及AIDS疫苗的开发也获得成功。0010IL-10等TH2细胞因子，在与活体内免疫应答密切相关的TH1/TH2 平衡中，发挥着重要的作用。TH1细胞产生IFN-y,使细月包免疫亢进。由 TH1细胞产生的IFN - y,可抑制TH2细胞的IL-10产生。同时，TH2细胞 产生IL-IO，使体液免疫亢进。由TH2细胞产生的IL-IO，可抑制TH1细胞 产生IFN - y等。本发明者们尝试了将编码A(3和TH2细胞因子的基因同时导入上述仙台病毒载体，来开发可抑制细胞免疫引起的脑脊髓膜炎等副作用的针对阿尔茨海默病的疫苗。于是本发明者们构筑了编码Api-43和IL-10 的仙台病毒载体，并检测了它的效果。首先，将该载体对24- 25个月龄的 APP转基因小鼠进行鼻腔内给药，并测定了给药4周及8周后的血清中抗 AJ342抗体的水平。对照组的小鼠中只测出了较低水平的抗A卩抗体，并且 随着时间的推移，其抗体量也逐渐升高。反之，在施用本发明载体的小鼠 血中，则测到了较高水平的抗A(3抗体，8周后的抗体水平比4周后的抗体 水平稍有下降。病理组织学检查显示施用本发明载体后，在前脑叶，头顶 叶及海马中的老年斑明显减少。进而，对脑组织中的A卩量通过ELISA法 也进行了测定。其结果显示，脑组织中的AP量明显减少。同时使用CD3 和Iba-1作为指标进一步探讨了施用本发明载体是否会引起中枢神经系统内 的淋巴细胞浸润。结果表明，均未产生淋巴细胞浸润及小神经胶质细胞的 病理性G及端)活化。 0011为优秀的特性。第一，该载体在极为高龄的阿尔茨海默病小鼠模型中，具 有使AJ3明显减少的效果。在上述试验中使用的是接近寿终的24-25个月龄 的Tg2576小鼠。而以往阿尔茨海默病疗法研究中所使用的小鼠的最大月龄 为18个月。像在这样高龄的小鼠模型中取得治疗效果实为首创。这些高龄 小鼠的脑内沉淀有大量的A(3。因此，本发明的载体对阿尔茨海默病病情进 展较多的患者也可能发挥较高的治疗效果。第二，本发明的载体与以往的 疫苗疗法相比，在较低的使用量和较少次数的给药情况下，也具有治疗效 果。例如，在使用以往的A(3肽和佐剂并用的给药方法时， 一般需要多次给 药才可确立其免疫效果。如AN-1792临床试验中，实际的给药次数为数次 到十几次。与之相比，本发明的载体一次给药后就表现出显著的有效性。 进而，在腺相关病毒载体的疫苗疗法(WO2004/11125099)中，疫苗接种如本 说明书实施例所述方法施行了一次给药，给药量为5xl0"基因组/个体。反 之，本说明书所记载的实施例的施用量为5xl06CIU(Cell Infectious Unit)/个 体(换算为基因组复制数则约5xl(^基因组/个体)。这两个载体的给用量约差 104。第三，实施例中载体的给药并未引起小鼠的脑脊髓膜炎。有报告表明， AN-1792的临床试验中所观察到的脑脊髓膜炎在小鼠模型中也被观察过(M.Shoji, et al., 4她Annual Meeting of Japanese Society of Neurology, May 15-17, 2003)。也有对正常的非模型小鼠(C57B6鼠)施用A|3肽和佐剂免疫后也出 玉见过脑脊骨4月^炎的净艮道。(Furlan R, et al., Vaccination with amyloid-beta peptide induces autoimmune encephalomyelitis in C57/BL6 mice, Brain 126: 285-291， 2003)。本说明书所述结果显示本发明的载体对人体给药时也具有 安全性。0012如上所述，本发明的载体在用量少给药次数少的条件下具有较高的A卩 清除效果。在基于仙台病毒载体的AIDS病疫苗中，确认了其效果部分由于 细胞免疫所致(WO 2001/072340)。实施例中使用的载体，为了防止产生副作 用，与细胞免疫相比，刻意的做了依赖于体液免疫的设计，本说明书所描 述的优异的疫苗效果在阿尔茨海默病治疗疫苗中也显示出体液免疫的重要 性。通过使用Th2细胞因子或Th2佐剂来使体液免疫占优势，可以减低副 作用。顾本发明提供编码A卩的负链RNA病毒载体及其应用,特别是提供如 下发明0013(1) 一种负链RNA病毒载体，该载体含有编码p淀粉样蛋白的核酸。(2) (1)的负链RNA病毒载体，还包含编码Th2细胞因子或其部分 肽的核酸。(3) (2)的负链RNA病毒载体，其中所述Th2细胞因子或其部分 肽是IL-10或其部分肽。(4) (1) - (3)中的任一载体，其中所述负链RNA病毒是副粘病毒载体。(5) (4)中的载体，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。(6) (1) - (5)中的任一载体，其中所述(3淀粉样蛋白是AP43或其部分肽。(7) (1) - (6)中的任一载体，其中所述(3淀粉样蛋白来源于人。(8) (3) - (7)中的任一载体，其中所述IL-10源于小鼠或人。(9) (1) - (8)中的任一载体，其中所述卩淀粉样蛋白是序列号为1 的核苷酸序列所编码的多肽或其一部分。(10) (3) - (9)中的任一载体，其中所迷IL-10是序列号为2或3的核普酸序列所编码的多肽。(11) (1) - (10)中的任一负链RNA病毒载体，包含序列号为5的核酸。(12) —种組合物，所述组合物包含(l) - (11)中任一项所述的载 体及药理学上可容许的承运体。(13) (12)中的组合物，包含(i)以可表达样式编码Th2细胞因子 或其部分肽的核酸，(ii) Th2细胞因子或其部分肽，或(m)Th2佐剂。(14) (13)中的组合物，包含Th2细胞因子、其部分肽或Th2佐剂。(15 ) ( 13 )中的组合物，包含以可表达样式编码Th2细胞因子或其部 分肽的核酸。(16) (15)中的组合物，其中所述Th2细胞因子是由含有编码(3淀粉 样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体所编码的。(17) (15)中的组合物，其中所述Th2细胞因子是由含有编码p淀粉 样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体以外的载体所编码的。(18) (12) - (17)中的任一组合物，该组合物是药学组合物。(19) 用于治疗和预防阿尔茨海默病的药学组合物，包含(l) - (18) 中的任一项所述的载体。(20 )(19)中的组合物，还包含(i)以可表达样式编码Th2细胞因子 或其部分肽的核酸，(ii) Th2细胞因子或其部分肽，或(iii) Th2佐剂。(21) (18)或(20)中的药学组合物，是用于鼻腔内给药的药学组合物。(22) 是一种使(3淀粉样蛋白沉淀减退的方法。所述方法包含给药(1) - (11)中任一项所述的载体，或者包含该载体的组合物的步骤。(23) —种阿尔茨海默病的治疗或预防方法，包括给药(1) - (11) 中任一项所述的载体或者包含该载体的组合物的步骤。(24) (22)或(23)的方法，所述给药为鼻腔内给药。 (25 ) (22)或(23)的方法，所述给药为肌肉内给药。(26) (22) - (25 )中的任一方法，还包含给药Th2细胞因子、其部 分肽、Th2佐剂或编码Th2细胞因子及其部分肽的载体的步骤。(27) (26)的方法，为施用Th2细胞因子、其部分肽、或Th2佐剂的方法。(28)(26)的组合物，其中给药编码Th2细胞因子或其部分肽的载体。0014本发明提供了在给药量少及给药次数少的情况下，可以有效降低p淀 粉样蛋白沉淀的一种新型负链RNA病毒载体。本实施例所述载体不会诱导 中枢神经系统的炎症，且与以往疫苗给药相比引起脑脊髓膜炎的可能性低。 本发明的载体是治疗阿尔茨海默病的极为有效的手段。0015本发明涉及到负链RNA病毒载体。该载体包含编码(3淀粉样蛋白的核酸。0016本发明中的基因，是指编码遗传物质或转录单位的核酸。基因可以是 RNA或DNA。本发明中，编码蛋白的核酸叫做该蛋白质的基因。基因也可 以不编码蛋白质。例如，基因也可以编码核酶或反义RNA等功能性RNA。 基因可以是天然产生或是人工设计的序列。本说明书中的"DNA"包括单链 DNA和双链DNA。术语"编码蛋白，，是指为便于在适当的条件下表达蛋白， 多核苷酸以正义或反义方向包含编码蛋白质氨基酸序列的ORF。0017负链RNA病毒是以负链RNA(与编码病毒蛋白的有义链互补的反义链) 为基因组的病毒。负链RNA病毒也可称为负链。本发明中所使用的负链 RNA病毒优选单链负链RNA病毒(也可称非分节型(non-segmented)负链 RNA病毒)。所谓单链负链RNA病毒指的是以一条负链RNA为基因组的 病毒。包括以下病毒科的病毒副粘病毒一牛(Paramyxoviridae)(包含副粘病毒 属(Paramyxovirus)、麻渗病毒属(MorbilHvims)、及忍&,炎病毒属(Rubulavirus)、 及肺炎病毒属(Pneumovims)等属)、弹状病毒(Rhabdoviridae)科(包含水泡性 病毒属(Vesiculovirus)、狂犬病毒属(Lyssavirus)、及热病毒属(Ephemerovims) 等)、纤丝病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(流感病毒属 (Influenza virus)A、 B、 C、及索戈托样病毒属(Thogoto-like virus)等包括在内)、 布尼亚病毒f牛(Bunyaviridae)(包含布尼亚病毒属(Bunyavims)、汉坦病毒属 (Hantavirus)、内罗病毒属(Nairovims)、及白蛉病毒属(Phlebovirus)等)、以及 沙粒病毒科(Arenaviridae)等。0018本发明中尤其优选的负链RNA病毒的具体例子为，包括例如属于副粘 病毒牙牛的仙台病毒(6^Mcte'v/n 9, 4斤i成疫病毒^7VewC(3W/ev/n^), 炎病毒("Mwmps v/n ^，麻渗病毒(iWecw/^ w'nwj， RS病毒(呼吸道^^^4毒 (K邵/rator少，c,'a/ Wms"，牛痙病毒fhWerp&st vz>—，疸热病毒(必fe附/ er v/ras」，浙吳副流感病毒(SV5) (7WowA:ey para/w/7Me"za Wrws fSK5」j ，人副；克感病 毒1, 2， 3型(7zwmaw/ flraz'"7 we"za (y/ e 7, 2, 3 vr'n^es」,属于副净占病毒牙牛 fPflraw_y;rov/n-(iae /a/w7_y); 属于正粘病毒牙牛fOw/zomjyxoW〃'(iae yh/m7;^的;^感 病毒(/w/7wew加vz'n^);属于弹状病毒-牛(7 /za6(iowW(iae 72wn7y」的水泡性口炎 病毒(1^s7'cw/flrv/r—及狂犬病毒(Ka6/es vz>—。0019本发明优选使用副粘病毒。副粘病毒是指属于副粘病毒科的病毒，或 其衍生物。副粘病毒是一组以非分节的负链RNA为其基因组的病毒，包括 副粘病毒亚^f(Paramyxovirinae)(包括:呼吸道病毒属(i ^; /rav/n^)(也称为副 粘病毒属(Paramyxov/n^),,腮ji炎病毒属(7 z^w/av/n^), 和麻渗病毒属 (Mor&'〃/v/TO力,以及肺病毒亚科(Pneumovirinae)(包括月市病毒属(尸wewwov/ra》 和间质性肺病毒属(ikfetopwewmovzVw力)。适用于本发明的副粘病毒的具体实 例有，仙台病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒(RS 病毒)，牛痘病毒，疽热病毒，浙吳副流感病毒(SV5)，和人副；克感病毒1,2,和 3型，等等。更具体地例如，仙台病毒(SeV)，人副流感病毒-l(HPIV-l)，人 副流感病毒-3(HPIV-3),海豹瘟热病毒(phocine distemper vims，PDV)，犬瘟 热病毒(canine distemper vims ， CDV),;每豚麻渗病毒(dolphin molbillivirus)(DMV)， 小反刍兽疫病毒(peste-des-petits- ruminants virus, PDPR),麻渗病毒(MV)，牛瘟病毒(RPV)，亨德拉病毒(Hendra)，立百病毒 (Nipah)，人副流感病毒-2(HPIV-2),猴副流感病毒5 (SV5)，人副流感病毒 4a(HPIV-4a),人副流感病毒4b (HPIV4b)，腮腺炎病毒(Mumps)，和新城疫 病毒(NDV)。更优选的实例包括选自以下组的病毒仙台病毒(SeV)，人副 流感病毒-1 (HPIV-1),人副流感病毒-3(HPIV-3)，海豹瘟热病毒(PDV)，犬 痙热病毒(CDV),海豚麻渗病毒(DMV)，小反刍兽疫病毒(PDPR)，麻渗病毒 (MV)，牛瘟病毒(RPV),亨德拉病毒(Hendm),和立百病毒(Nipah Vims)。本 发明的病毒优选属于副粘病毒亚科(包括呼吸道病毒属，腮腺炎病毒属和麻 渗病毒属)，更优选属于呼吸道病毒属(也称副粘病毒属)的病毒或其衍生物。本发明可利用的呼吸道病毒属的病毒包括，人副流感病毒1型(HPIV-1),人副流感病毒3型(HPIV-3),牛副流感病毒3型(BPIV-3),仙台病毒(也称鼠 副流感病毒1型)，猴副流感病毒10型(6Vm/fl" para/"y7we"z" v/rw-7 0， SPIV-10) 等。在本发明中，最优选仙台病毒。这些病毒可源自天然林，野生型抹， 突变林，实验室传代抹，人工构建抹等。0020本发明中，"载体"是用于将核酸导入细胞的承运体。负链RNA病毒载 体是源自负链RNA病毒的用于将核酸导入细胞的承运体。SeV等的负链 RNA病毒载体作为基因导入用载体，具有十分优异的特性。由于负链RNA 病毒没有DNA期，仅在宿主细胞的细胞质中进行转录和复制，故它们不发 生染色体整合。因此，不会造成由染色体异常所导致的癌症或永生化等安 全问题。负链RNA病毒的这种特征在作为载体使用时对其安全性有很大贡 献。当用于表达外来基因时，即使在连续多次传代后，SeV也几乎不表现 任何碱基突变。这表明其基因组具有高度稳定性，并且能长期稳定表达所 插入的外来基因(Yu, D. ef a/., Genes Cells 2, 457-466 (1997》。进而，使SeV 衣壳结构蛋白缺失时，在插入基因的大小及包装上具有一定灵活性等性质 方面具有优势。传播型SeV载体，可以导入至少5.5kb的外来基因，并且可 以通过添加转录单位来同时表达两种或两种以上的基因。0021已知仙台病毒对啮齿类动物具有致病性，可以引起肺炎。但对人类不 具有病原性。该观点可由鼻内施用野生型仙台病毒不会对非人类灵长类 以及人造成严重的有害作用的报道中得到支持(Hurwitz, J. L. d Vaccine 15: 533-540， 1997、 Slobod, K. S. et al" Vaccine 22: 3182-3186,2004)。 更引人注目的优点还可例举以下2点。即"高感染性"和"高表达水平"。 SeV载体通过与细胞膜糖脂及糖蛋白的唾液酸结合来进行感染，由于唾 液酸在几乎所有的哺乳动物及鸟类细胞中均有表达，因此具有广镨感染 性，即高感染性。当基于SeV复制子的传播型载体释放病毒粒子时，这 些病毒粒子可以再度感染周围细胞。大多数RNP，在被感染细胞的细胞 质中被复制，并随着细胞分裂而被扩散到子代细胞，从而可以期待持续 表达。SeV载体具有非常广的组织适用范围。更进一步地，由于具有只 在细胞质内转录和复制的特征性表达机制，可使其插入的基因的表达量非常高(Moriya, C. et al., FEBS Lett. 425(1): 105-111， 1998; WO 00/70070)此 外，通过缺失包膜基因而获得的非传播型SeV载体也已经回收成功(WO 00/70070; Li， HO, et al., J. Virol. 74(14): 6564-6569,2000)。因此可以对SeV 载体进行改良，使其在维持"高感染性"和"高表达量"的同时，提高其"安全性"。0022本发明的负链RNA病毒载体，包含负链RNA病毒的基因组RNA。术 语'基因组RNA，是指具有形成包含负链RNA病毒特定病毒蛋白质的RNP 的功能的RNA,是具有表达基因组中的基因的功能的RNA。随着核酸的复 制，形成子代RNP。负链RNA病毒的RNA以反义序列编码其基因。通常， 负链RNA病毒的RNA基因组，在3，前导区和5，尾随区之间含有的病毒 基因以反义序列并列存在。各基因的开放阅读框(ORF)之间存在 一 组序 列转录终止序列(E序列)，间插序列(I序列)和转录起始序列(S序列)， 编码各基因ORF的RNA可以被转录成单独的顺反子。本发明载体的基 因组RNA,包含该RNA所编码的基因群的表达，以及编码RNA自身 的自主性复制所必需的病毒蛋白N(核衣壳，又称核蛋白(NP)), P(磷)和 L(大蛋白)的反义RNA序列。所述RNA还可以编码形成病毒粒子所必 需的M(基质)蛋白。进而，该RNA还可以编码病毒粒子感染所必需的包 膜蛋白。负链RNA病毒的包膜蛋白包含，引起细胞膜融合的F(融合)蛋 白，以及病毒粘附于细胞所必需的HN(血凝素-神经氨酸酶)蛋白或H(血 凝素)蛋白。但是，某些特定类型的细胞的感染并不需要HN蛋白(Markwell, M.A. a/.， Pro" Natl. Acad. Sci. USA 82(4): 978-982 (1985》，只要有F蛋白 便可以实现感染。RNA也可以编码除了 F蛋白和/或HN蛋白以外的包膜蛋 白。0023本发明的负链RNA病毒载体可以是，例如，负链RNA病毒的基因组 RNA和病毒蛋白形成的复合体，即核糖核蛋白体(RNP)。 RNP,例如可以 与所需转染试剂一起导入细胞。这种RNP，更具体地，可以是包含负链 RNA病毒的基因组RNA, N蛋白，P蛋白，和L蛋白的复合体。RNP导 入细胞后，在病毒蛋白的作用下，从基因组RNA中编码病毒蛋白的顺 反子进行转录的同时，基因组也进行自我复制，形成子代RNP。基因组RNA的复制，可以通过RT-PCR， Northern杂交等检测来确认RNA拷贝 数的增加。0024本发明的负链RNA病毒载体优选负链RNA病毒的病毒粒子。术语"病 毒粒子，，指含有核酸的微小粒子,在病毒蛋白的作用下由细胞内释放出。负链 RNA病毒的病毒粒子具有这样的构造，其中，具有由上述基因组RNA和病 毒蛋白形成的上述RNP，该RNP被包裹在细胞膜由来的脂质膜(也称包膜) 中。病毒粒子可以具有传染性。传染性是指根据负链RNA病毒载体的细胞 粘附能力和膜融合能力，将所含有的核酸导入附着的细胞内的病毒粒子的 能力。本发明的负链RNA病毒载体可以是具有传播性或非传播性的载体。 "传播性，，是指，病毒载体感染宿主细胞时，在该细胞内病毒可以进行自我复 制，并产生感染性病毒粒子。0025例如，分类于副粘病毒亚科的病毒的基因通常概述如下。通常N基因 也可表示为[NP]。呼吸道病毒(i ^/ /ravz'n^) NPP/C/V M F HN - L 腮腺炎病毒(i w^/av/ms」 NP P/V M FHN(SH) L 麻渗病毒(Mo/^7Z/Wms」 NPP/C/V M F H- L0026例如仙台病毒的每个基因的碱基序列的数据库登录号分别为N基因为 M29343、 M30202、 M30203 、 M30204、 M51331、 M55565、 M69046、和 X1721S; P基因为M30202、 M30203、 M30204、 M55565、 M6卯46、 X00583、 X17007、及X17008; M基因为D11446、 K02742、 M30202、 M30203、 M30204、 M69046、 U31956、 X00584、及X53056; F基因为D00152、 D11446、 D17334、 D17335、 M30202、 M30203、 M30204、 M69046、 X00152、及X02131; HN 基因为D26475、 M12397、 M30202、 M30203、 M30204、 M69046、 X00586、 X02808、及X56131; L基因为D00053、 M30202、 M30203、 M30204、 M6卯40、 X00587、 X58886。其他病毒编码的病毒基因有N基因、如CDV、 AF014953; DMV、 X75961; HPIV-1、 DO 1070; HPIV-2、 M55320; HPIV-3、 D10025; Mapuera、 X85128; Mumps、 D86172; MV、 K01711; NDV、 AF064091;PDPR、 X74443; PDV、 X75717; RPV、 X68311; SeV、 X00087; SV5、 M81442;及Tupaia、 AF079780; P基因、如CDV、 X51869; DMV、 Z47758; HPIV-1、 M74081; HPIV-3、 X04721; HPIV-4a、 M55975; HPIV-4b、 M55976; Mumps、 D86173; MV、 M89920; NDV、 M20302; PDV、 X75960; RPV、 X68311; SeV、 M30202; SV5、 AF052755;及Tupaia、 AF079780; C基因、 如CDV、 AF014953; DMV、 Z47758; HPIV-1、 M74081; HPIV-3、 D00047; MV、 AB016162; RPV、 X68311; SeV、 AB005796;及Tupaia、 AF079780; M基因、如CDV、 M12669; DMV、 Z30087; HPIV-1、 S38067; HPIV-2、 M62734; HPIV-3、 D00130; HPIV-4a、 D10241; HPIV-4b、 D10242; Mumps、 簡171; MV、 AB012948; NDV、 AF0柳19; PDPR、 Z47977; PDV、 X75717; RPV、 M34018; SeV、 U31956;及SV5、 M32248; F基因、如CDV、 M21849; DMV、 AJ224704; HPN-1、 M22347; HPIV-2、 M60182; HPIV-3、 X05303、 HPIV-4a、 D49821; HPIV-4b、 D49822; Mumps、 D86169; MV、 AB003178; NDV、 AF048763; PDPR、 Z37017; PDV、 AJ224706; RPV、 M21514; SeV、 D17334;及SV5、 AB021962; HN(H或G)基因、如CDV、 AF112189; DMV、 AJ224705; HPIV-1、 U709498; HPIV-2、 D000865; HPIV-3、 AB012132; HPIV-4A、 M34033; HPIV-4B、 AB006954; Mumps、 X99040; MV、 K01711; NDV、 AF204872; PDPR、 Z81358; PDV、 Z36979; RPV、 AF132934; SeV、 U06433;及SV-5、 S76876。但是，已知每种病毒有多种毒林，并由于毒林 之间的差异，所以除上述序列以外还存在着包括其他序列的基因。 0027这些病毒蛋白的ORF可以在基因组RNA中借助上述E-I-S序列而排列 成为反义序列。离基因组RNA 3，端最近的ORF仅需要位于3'前导区和该 ORF之间的S序列，而不需要E序列或I序列。离基因组RNA5，端最近的 ORF只需要位于5，尾随区和该ORF之间的E序列，不需要I序列和S序列。 而且，两个ORF可以作为单个顺反子例如使用内部核糖体进入位点(IRES) 序列进行转录。此时，这两个ORF之间则不需要E-I-S序列。例如在野生 型副粘病毒中，典型的RNA基因组以反义顺序依次包含3，前导区和编码N、 P、 M、 F、 HN、和L蛋白的ORF,及5，尾随区。本发明的基因组RNA中， 基因的排列并不限于此。但优选与野生型病毒一样，在3'前导区之后的依 次编码N、 P、 M、 F、 HN、和L蛋白的ORF,其后是5，尾随区。但有些负链RNA病毒并不包含所有6种病毒基因，即便如此也优选将这些病毒基因如上述野生型病毒同样排列。通常持有N、 P、和L基因的载体，可以在 细胞内从RNA基因组自主表达基因，还可由此复制基因组RNA。进而，在 编码F基因和HN(或H)基因以及M基因等包膜构成蛋白的基因的作用下， 形成感染性病毒粒子，并将它们释放到细胞外。因此，称该载体为传播型 病毒载体。可以将编码包括Ap或IL-10在内的多肽的基因如后所述插入到 该基因组中的非蛋白编码区域。0028此外本发明的负链RNA病毒载体可以缺损野生型负链RNA病毒中的 一个或多个基因。病毒基因组RNA,只要编码RNP重构时所必须的病毒蛋 白(N,L及P)，即使不编码包膜构成蛋白也可在细胞内进行复制，并表达基 因。例如根据病毒种类不同，可例举至少可以缺失下列至少一种编码F、 H、 HN、 G、 M、及Ml等的包膜构成蛋白基因的载体(WO 00/70055及WO 0(V70070; Li， H,O. et al., J. Virol. 74(14): 6564-6569， 2000)。具体地，不含 M、 F、 HN基因或它们的任意组合的病毒载体，也是本发明优选使用的载 体。这种病毒载体可以通过，例如外源性提供缺陷基因产物来重构。如此 制备的病毒载体和野生型病毒一样，粘附于宿主细胞后，引起细胞融合。 但由于导入细胞中的载体基因组中缺失有病毒原本具有的某一基因，它们 不会形成与原来的病毒一样具有感染力的子代病毒粒子。因此，这种病毒 是一种一次性基因导入的安全实用型病毒载体。基因组中缺失的基因，例 如可以是F基因和/或HN基因。例如，通过将表达F基因缺失型重组负链 RNA病毒基因组的质粒载体，与F蛋白表达载体和NP、 P、 L蛋白表达载 体一起转染宿主细胞，可以重构病毒载体(W000/70055和WO00/70070; Li, H.-O. " a/., J. Virol. 74(14) 6564-6569 (2000))。也可以通过，例如，利用已经 在其染色体中整合了 F基因的宿主细胞来制备病毒。以外源性方式供应这 些蛋白时，这些蛋白的氨基酸序列不必与病毒序列相同，可以使用突变基 因或者其他病毒来源的同源基因作为代用品，只要它们的核酸导入活性与 天然型相同或更高即可。0029此外，本发明的病毒载体可以制成包含下述包膜蛋白的载体，所述包 膜蛋白可与衍生该载体基因组的病毒的包膜蛋白不同。例如，在重构病毒时，可以通过在包装细胞中表达除了载体来源病毒的包膜蛋白以外的其它 包膜蛋白来制备包含所需包膜蛋白的病毒载体。对这类蛋白无特殊限制， 可以包括其它病毒的包膜蛋白，例如，水泡性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白(J.Virology 39: 519-528,1981)。本发明的病毒载体，包括含有VSV-G等包膜 蛋白的假型病毒载体，所述包膜蛋白来自与衍生该基因组的病毒不同的病 毒。通过设计使上述包膜蛋白不被病毒RNA基因组编码时，病毒粒子感染 细胞后不会表达这些蛋白。0030本发明的病毒载体可以是，例如，在其包膜表面含有如下蛋白的载体， 所述蛋白例如为粘附因子，配体，受体等可以附着于特定细胞的蛋白质，抗体或其片段；或者是，嵌合蛋白，其中所述蛋白位于细胞外区域，而源 自病毒包膜的多肽位于细胞内区域。由此，还可以制备靶向特定组织的载 体。所述蛋白可以由病毒基因组编码，或者也可以通过在重构病毒时，通 过表达病毒基因组以外的基因(例如，其他的表达载体或宿主染色体上的基 因)来供给。0031本发明的载体所含的任一病毒基因可以通过修饰野生型基因而获 得，例如为了降低病毒蛋白的免疫原性，或者提高RNA转录效率或复 制效率。具体而言，例如，在负链RNA病毒载体中，可通过修饰至少一 种复制因子N基因，P基因和L基因来增强转录或复制功能。包膜蛋 白之一的HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性；但是，当4吏前一 种活性降低时，可以提高病毒在血液中的稳定性；当改变后一种活性时， 可以调控其感染能力。通过修饰F蛋白，可以调控膜融合能力。例如， 通过分析可成为细胞表面抗原分子的F蛋白或HN蛋白的表位，以此来 制备一种使上述蛋白抗原性减弱了的病毒载体。并且，为抑制二次放出 粒子或VLP (病毒样粒子)的放出，也可在病毒基因中导入温度敏感性 突变(WO 2003/025570)。例如、在M基因中导入G69E、 T116A、及A183S; 在HN基因中导入A262T、 G264、及K461G;在P基因中导入L511F;在 L基因中导入N1197S及K1795E等突变。当然，可导入的温度敏感性突变 并不限于此。(参照WO 2003/025570)。0032本发明的载体可以缺失辅助基因。例如，通过敲除V基因(一种SeV辅助基因)，可以在不影响培养细胞中的基因表达和复制的情况下，使SeV对宿主如小鼠的致病性显著降低(Kato, A. " a/., 1997, J. Virol. 71: 7266-7272, 1997; Kato， A. ^"/.，EMBO J. 16: 578-587， 1997; Curran， J. WO 01/04272, EP1067179)。这种减毒载体特别优选作为体内或回体(ex Wvo)基因导入用无毒性病毒载体来使用。0033本发明的载体，在上述负链RNA病毒载体的基因组中可以包含编码外 来基因A(3的核酸。编码A卩的氨基酸数不受制限。例如可以是A(31-40、任何多肽都可以用作A(3。所述多肽必须包含来自天然A(3(例如A(343)的氨 基酸序列的连续6个或6个以上氨基酸、优选连续7个或7个以上氨基酸、 或连续8个或8个以上氨基酸(Harlow, Antibodies: A laboratory Manual, 1998; Chapter 5 page 76)，以使其显示对A卩的抗原性。例如，针对Aj342(序列号: 27的1-42)的B细胞表位大半集中在N末端的第1~第15氨基酸序列区域 内(Cribbs,D.H.etal., Int. Immunol. 15(4): 505-14,2003)。所以，作为从载体 表达的A卩肽，可以优选使用包含A(342的第1 ~第15的氨基酸的多肽。此 外还可使其表达包含A(342的第1 ~第21或第4~第10的氨基酸的多肽(特 開2005-21149)。进而，已知可以阻止淀粉样蛋白纤维形成，具有保护神经 能力的抗A卩单克隆抗体10D5及6C6，可以识别相当于AP42的第3~第6 位的4个氨基酸表位(EFRH;序列号27的3-6) (Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol, 88: 85-90, 1998; Frenkel， D. et al.， J. Neuroimmunol, 95: 136-142, 1999)。识别该同一表位的单克隆抗体508F,也可抑制由A卩导致 的神经毒性(Frenkel, D. et al., J. Neuroimmunol. 106: 23-31, 2000)。因此，可 以优选使用包含该序列的A卩序列中的6 ~ 8个氨基酸或以上的多肽。细胞 免疫表位集中在A卩的C末端区域。表达包含A(31-21等的N末端片断，不 包含A|322 ~43的C末端附近的序歹'K序列号27的22 ~ 43)的片断，相对 而言可以使体液免疫胜过细胞免疫。本发明的载体，也可优选使用编码包 含天然A卩肽(A(339、 A(340、 A(341、 Ap42及A^43，分别对应于序列号27 的1~39、 1—40、 1~41、 1 ~42及1 43)序歹'J的载体。较短的A卩肽片断， 可以适当地与载体蛋白融合制成多肽来提高免疫原性后使用。载体蛋白包含钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、兔血清白蛋白(RSA)、人 血清白蛋白(HSA)、鸡卵白蛋白(OVA)、血小板球蛋白(TG)等。短肽可由约 1~5个间隔氨基酸介导与载体蛋白融合。抗原多肽(分泌型时为成熟多肽) 的长度范围(不含载体蛋白部分的氨基酸长)优选10 ~ 200个氨基酸、更优选 15 100个氨基酸、更优选20- 80个氨基酸。0034本载体编码的Ap多肽优选包含确保可从细胞中分泌出来的分泌信号。 分泌信号序列可使用白细胞介素(IL) -2及组织纤溶醇原激活物(tPA) 等所需分泌蛋白的信号序列，优选使用A卩前体蛋白(APP)的N末端 信号序列。具体地，包含例如序列登录号NP-958817的分泌信号序列(碱 基序列参照，例如序列登录号NM-201414)。即适合本发明的载体为编 码附加有分泌信号的A|3肽。0035本发明的载体还可包含编码作为外源性基因的Th2细胞因子和/或抗炎 性细胞因子的核酸。Th2细胞因子指的是与1型辅助T纟田月包(Thl细胞)比较， 优先产生2型辅助T细胞(Th2细胞)的细胞因子。具体地，包含IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-9、 IL-IO、及IL-13。本发明中，载体所编码的细胞因子优选IL-4、 IL-IO、及IL-13，更优选IL-IO。各细胞因子基因的碱基序列及氨基酸序列 是已知的(IL-4 : NM—000589 、 NP—000580 、 AAH66277 、 AAH67515 、 NP—758858、 NP_067258、 NP—958427; IL-5:薩—000879、 NP—000870、 CAA31210、 NP—034688、 NP—068606; IL-6: NM—000600、 NP—000591 、 XP—518992、 AAB30962、 NP一112445; IL匿9:醒一000590、 NP一000581、 AAH66284、 AAH66287、 NP—032399、 XP—341488; IL-IO: NM—000572、 NP—000563、 CAG46825、 NPJ)34678、 NPJ)36986; IL-13: NM—002188、 NP一002179、 AAB01681、. NP一032381、 NP—446280)。0036由载体所编码的IL-IO等TH2细胞因子，可以是全长(即野生型)， 也可以是部分肽(即活性片段)，只要其保留有所述活性。例如，N末 端的信号序列可以适当地被其他信号序列置换。或细胞因子作为和其他 肽的融合蛋白来表达。0037对载体所编码的A|3以及IL-IO等细胞因子的来源没有限制，也可^f吏用包含小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猪、牛、马、驴、羊、狗、黑猩猩、猴以及人类等在内的所有哺乳动物。A(3及细胞因子的来源可以是同种的来 源，也可以是异种来源。但最好使用与给药对象相同的同种来源。编码这 些细胞因子的核酸的核苷酸序列可从上述数据中得到。对于小鼠IL-IO,还 可从如Genbank序列登录号AY410237及NM—010548获得；人IL-10可从 Genbank序列登录号AY029171及NM—000572获得。本发明载体适用的r编 码Ap的核酸」为人ApcDNA(序列号1)。适用的「编码IL-10的核酸J为 小鼠IL-10cDNA序列(序列号2)及人IL-10cDNA序列(序列号3)。由于 密码子的简并性，具有与上述序列号1 3的碱基序列不同序列的核酸，， 只要具有与上述碱基序列相同的氨基酸序列，就可以与序列号1 ~ 3 —样 适用于本发明的载体。上述外源性基因的插入区域，可选择例如基因组的 蛋白非编码区内的适当部位。例如，3，-前导区和最靠近3'末端的病毒蛋白 ORF之间；各种病毒蛋白ORF之间；和/或最靠近5'末端的病毒蛋白ORF 和5，-尾随区之间。而且缺欠F或HN基因等的基因组中，外源基因可插入 到该缺陷区域。将外来基因导入副粘病毒时，优选插入基因组的多核香酸 的链长为6的倍数(J. Virology, 67(8): 4822-4830， 1993 )。插入的外来基因 和病毒ORF之间，应配有整套的E-I-S序列。借助E-I-S序列串连插入2个 或多个外来基因。或借助IRES插入所需外来基因。 0038载体所携带的外来基因的表达水平，可通过添加在该基因上游(负链3， 侧)的转录起始序列的类型来调节(WO 01/18223)。也可以通过外来基因插 入基因组内的位置加以控制。插入位置越靠近负链3，末端则表达水平越高； 反之越靠近5'末端则表达水平越低。因此，为获得所需的基因表达量，或 者为了使外来基因与编码靠近其的病毒蛋白的基因保持最佳组合，可以适 当调整外来基因的插入位置。 一般来说，获得A(3的高表达水平是有利的， 顾优选将编码A(3的外来基因与高效转录起始序列相连，并将其插入负链基 因组3，末端附近。具体地，将外来基因插入3，-前导区和最靠近3，末端的病 毒蛋白ORF之间；或者插入最靠近3，-末端的病毒基因ORF和第2靠近基 因的ORF之间。野生型副粘病毒中最靠近基因组的3'末端的病毒蛋白基因 是N基因，第2号靠近的是P基因。另外，在不需要导入基因的高表达水平的情况下，为获得最佳期望效果，可以，例如将外来基因插入载体中尽 可能靠近负链基因组5 ，端的位置或选择低效转录起始序列来抑制病毒载体 的基因表达水平。0039为使载体表达2个多肽(含有A卩的多肽及含有Th2细胞因子的多肽)时， 可以将所述编码各多肽的核酸插入载体的基因组中。该2个核酸也可分别 插入各自不同的位置，或由E-I-S序列介导串联排列插入到一个位置。此时 优选使用转录起始效率高的S序列。例如3'-UCCCACUUU-5，(负链RNA; 序歹'J号6) 、 3，-UCCCAGUUU-5，(负链RNA ; 序歹'J号7)、 或 3'-UCCCACUTJA-5，(负链RNA;序列号8)。0040本发明的载体，在插入编码A(3及Th2细胞因子的基因的位置之外还可 持有其他外来基因。对这样的外来基因没有特殊限制。例如，可以是监控 载体感染的标记基因或是细胞因子及激素等免疫系统调节基因。本发明的 载体可以持有编码信号传递调节因子、细胞因子、激素、受体、抗体、及 它们的片段的一个或多个基因。本发明的载体，可以直接给药于活体靶位， 或间接给药，即将本发明的载体感染到患者自身来源的细胞或其他细胞， 再将该感染细胞注入靶位(回体)给药，如此导入基因。0041本发明的载体对于治疗阿尔茨海默病，防止或阻止其病情发展提供 了极为先进的方法。将本发明的载体施用于Ap大量沉淀的24 - 25个月 龄的APPTg小鼠时，显示出了非常显著的A(3沉淀去除效果。该效果仅 通过 一 次鼻腔内给药就得到了确认。本发明的载体可作为对患者侵袭性 较低的治疗手段来使用。由于未在中枢神经系统观察到炎症反应，可进 一步证明本载体具有更高的安全性。0042为制备本发明的载体，可以在哺乳动物细胞中，在有包含负链RNA病 毒基因组RNA(或其互补链)的RNP重构时所必需的病毒蛋白(即N， P，和 L蛋白)存在的条件下，转录本发明的编码负链RNA病毒基因组RNA的 cDNA。病毒RNP可以通过产生负链基因组(即与病毒基因组反义链相同) 或正链(编码病毒蛋白的有义链)来重构。优选通过转录产生正链来提高载体重构的效率。RNA末端，优选尽可能正确反映天然病毒基因组3，-前导区和 5，-尾随区序列的末端。例如，为了正确调节转录产物的5，-末端，可以利用 T7 RNA聚合酶的识别位点作为转录起始点，也可以在细胞中表达该RNA 聚合酶。例如，为了调节转录产物的3，-末端，可以在转录产物的3，-末端编 码自我切割型核酶，以便用该核酶正确切割3'-末端(Hasan, M. K. " a/., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820， 1997; Kato， A. e/"/" 1997， EMBO J. 16: 578-587， 1997; Yu, D. " a/., Genes Cells 2: 457-466， 1997)。0043可以按照例如Hasan, M. K. et al., J, Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al.， EMBO J. 16: 578-587， 1997;和Yu， D. et al., Genes Cells 2: 457-466中记载的方法构建携带有外来基因的重组仙台病毒载体。0044首先，制备包含目的外来基因的cDNA碱基序列的DNA样品。优选此 DNA样品在25ng/pl或更高的浓度，可以通过电泳确认为单一质粒。下面 是一个利用NotI位点将外来基因插入到编码病毒基因组RNA的DNA中的 实例。当目的cDNA碱基序列中包含Notl识别位点时，优选事先用定点诱 变法等来改变该碱基序列以除去该位点，但不改变所编码的氨基酸序列。 目标基因片段通过PCR从所述DNA样品扩增并回收。通过在一对引物对 的5'区添加Notl位点，使扩增片段的两个末端都为Notl位点。引物中包括 E-I-S序列或其片段，使外来基因插入病毒基因组之后，在外来基因的ORF 和其两侧病毒基因ORF之间各有一个E-I-S序列。0045例如，正向的合成的DNA序列在5，-末端包含任意两个或多个核苷酸 (优选4个核苦酸，更优选ACTT,不包括GCG和GCC等来自Notl识别位 点的序列)，以确保被Notl切断。在该序列的3，-末端添加Notl识別序列 gcggccgc。另外，在3，-侧还添加任意9个核苷酸或9力。6的倍数个核苷酸 作为间隔序列。进一步地，还在3，-末端添加所需cDNA的ORF的约25个 核苷酸的序列，它从起始密码子ATG开始并包括ATG。优选地，从所需cDNA 选取约25个核苷酸以使正向的合成的寡DNA的3，-末端的最后一个核苷酸 为G或C。0046反向的合成的DNA序列在5'末端包含任意两个或多个核苷酸(优选4 个核苷酸，更优选ACTT,不包括GCG和GCC等来自Notl识别位点的序 列)。在该序列的3，-末端添加Notl识别序列'gcggccgc，。另外，在3，-末端还 添加寡DNA片段以调整长度。该寡DNA的长度如下设计最终PCR扩增 产物的Notl片段，包括添加的E-I-S序列，总链长为6的倍数个核苷酸(所 谓"6的法则"；Kolakofski， D., " a/., J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, R and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830， 1993)。当在插入该引物中的寡DNA片段3，画 末端添力。E-I-S序列时，仙台病毒S序列的互补序列优选 5，-TTTCACCCT-3，(SEQIDNO: 9), 5，-TTTGACCCT-3，(SEQ ID NO: IO)或 者5，-ATTCACCCT-3，(SEQ ID NO: 11); I序列的互补序列优选5，-AAG-3，； E序列的互补序列优选5，-TTTTTCTTACTACGG-3，(SEQ ID NO: 12);进一 步在该3'-末端添加自所lTxDNA序列终止密码子起反向计数的约25个核 芬酸的互补序列，使其最后一个核苦酸为G或C，制得反向的合成的DNA 的3，末端。0047PCR可以利用Taq聚合酶或其它DNA聚合酶，按照常规方法进行。扩 增的目的片段用Notl消化，然后插入pBluescript(商标)(Stratagene)等质粒载 体的NotI位点。所得PCR产物的碱基序列用测序仪确认，选出具有正确序 列的质粒。质粒中的插入片段用Notl切出，克隆到包含基因组cDNA的质 粒的NotI位点。也可以不利用质粒载体，直接将所述片段插入NotI位点， 获得重组仙台病毒cDNA。0048例如，重组仙台病毒基因组cDNA可以根据文献记载的方法构建(Yu, D. a/.， Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan， M. K. a/., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997)。例如，首先将含有Notl识别位点的18bp间隔序列 (5'-(G)-CGGCCGCAGATCTTCACG-3'; SEQ ID NO: 13)克隆到仙台病毒基 因组cDNA(pSeV(+))中前导序列与N蛋白ORF之间，得到带有源自S肝炎 病毒反基因组链的自我切割型核酶位点的质粒pSeV18+b(+)(Hasan, M. K." "/., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)。将外来基因片,殳插入 pSeV18+b(+)的Notl位点，能获得含有所需外来基因的重组仙台病毒cDNA。0049如上制备的编码重组病毒基因组RNA的DNA，在上述病毒蛋白(L、 P 和N)存在的情况下，在细胞内被转录，以重构本发明的载体。本发明提供， 用于制备本发明载体的、编码本发明载体中病毒基因组RNA的DNA。本 发明还涉及将编码载体基因组RNA的DNA用于制备本发明载体的用途。 重组病毒可以按照公知的方法重构(WO 97/16539; WO 97/16538; WO 00〃0055; WO 00〃0070; WO 01/18223; WO 03/025570; Durbin, A. R et al" Virology 235: 323-332, 1997; Whelan, S. P. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M. J. et al., EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, R et al., EMBO丄14: 5773-5784, 1995; Lawson, N. D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481， 1995; Garcin， D. et al., EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Baron， M. D. and Barrett, T,, J. Virol. 71: 1265-1271, 1997; Bridgen, A. and Elliott, R. M.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404， 1996; Hasan, M. K. et al" J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al" EMBO J. 16: 578-587, 1997; Yu, D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Tokusumi, T. et al., Vims Res. 86: 33-38, 2002; Li, H,O. et al.， J. Virol. 74: 6564-6569, 2000)。使用这些方法能从DNA重构负链RNA病毒， 包括副流感病毒、水疱性口炎病毒、狂犬病毒、麻渗病毒、牛瘟病毒和仙 台病毒。本发明载体可以用这些方法重构。当病毒载体DNA中缺失F、 HN 和/或M基因时，无法形成感染性病毒粒子，但可以将这些缺失了的基因和 /或编码其它病毒包膜蛋白的基因导入宿主细胞并表达，从而能产生感染性 病毒粒子。0050具体地，所述病毒可以如下步骤制备(a)在表达N、 P和L蛋白的细胞 中转录编码负链RNA病毒基因组RNA(负链RNA)或其互补链(正链)的 cDNA， (b)从这些细胞或其培养上清中回收包含基因组RNA的RM>复合体。 为了进行转录，将编码基因组RNA的DNA连接到适当的启动子的下游。 如此转录的基因組RNA,在有N, L和P蛋白存在的情况下复制形成RNP 复合体。然后，在有M、 HN和F蛋白存在的情况下，形成包裹在包膜中的 病毒粒子。例如，可以将编码基因组RNA的DNA连接到T7启动子的下游， 然后通过T7 RNA聚合酶转录成RNA 。除了包含T7聚合酶识别序列的启 动子以外，可以利用其它任何所需的启动子。或者，也可以用体外转录的RNA转染细胞。N、 L及P蛋白质也可通过质粒等适当的表达载体在细胞 内表达。启动子的具体实例，包含CMV及CAG启动子(Niwa，H. etal.Gene. 108: 193-199,1991;专利/>开1995, 3-168087)。0051从DNA开始的基因组RNA的转录所必需的T7 RNA聚合酶等酶类， 可以通过例如，转导能表达它们的质粒载体或病毒载体，或者将其基因整 合入细胞染色体以便能诱导它们的转录，然后在病毒重构时诱导表达来提 供。基因组RNA以及病毒重构所必需的病毒蛋白，可以例如通过转导能表 达它们的质粒来提供。在供给这些病毒蛋白时，可以使用辅助病毒，例如 野生型负链RNA病毒或一些变异的负链RNA病毒，但这有可能导致这些 病毒的混入，因此并不优选这种方法。0052将表达基因组RNA的DNA导入细胞的方法包括，例如(i)制备能被 目的细胞摄入的DNA沉淀的方法，(ii)制备包含DNA的带正电的复合体的 方法，所述复合体具有较低细胞毒性且适于目的细胞的摄入，和(iii)利用电 脉沖在目的细胞膜上瞬时开孔的方法，孔的大小仅足以让目的DNA分子通过。0053方法(ii)中可以使用各种转染试剂，例如DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Roche #1811169)等。方法(i) 中，可以用磷酸钙进行转染，用这种方法导入细胞的DNA被吞噬体摄入， 但已知足量的DNA也能^皮摄入细胞核中(Graham, F. L. and Van Der Eb, J.， 1973, Virology 52: 456; Wigler， M. and Silverstein, S.， 1977， Cell 11: 223)。 Chen 和Okayama研究了导入技术的最佳条件，他们报道说(l)细胞和共沉淀物 的温育条件为2~4% C02, 35°C, 15~24hr， (2)环状DNA比线性DNA 活性更高，和(3)当沉淀混合液中DNA浓度为20-30昭/ml时，可形成最佳 沉淀(Chen, C. and Okayama， H., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745)。方法(ii)适于 瞬时转染。已知更早的方法是配制具有所需DNA浓度比的DEAE-葡聚糖 (Sigma #D-9885 M.W. 5xl0"混合液进行转染。由于大多数复合体在内体中 降解，可以加入氯奮来提高转染效力(Calos,M.R, 1983， Proc. Natl. Acad. Sci. USA80: 3015)。方法(iii)被称为电穿孔方法，由于没有细胞选择性，它比方法(i)和(ii)应用更广。可通过优化脉冲电流的持续时间、脉沖形式、电场强度(电极间空隙，电压)、缓冲液的导电率、DNA浓度和细胞密度使转染效力最大化。0054在上述三种方法中，方法(ii)操作简单，并且能用大量的细胞检测大量 样品，因此转染试剂适用于在重构载体时将DNA导入细胞中，转染试剂优 选但不限于Superfect Transfection Reagent (QIAGEN，目录号301305)或 DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Roche,目录号1811169)。0055具体地，可以4会下述方法从cDNA重构病毒0056在6—24孔塑料板或100mm Petri培养皿中，用4及限必需培养基(MEM) 将猴肾细胞LLC-MK2培养至100%铺满，所述培养基含有10%胎牛血清 (FCS)和抗生素(100U/ml青霉素G和100昭/ml链霉素)。将表达T7聚合酶 的重组痘苗病毒vTF7-3在l吗/ml补骨脂素存在的情况下于UV中暴露20 分钟灭活，然后以2 PFU/细胞的量感染细胞(Fuerst, T. R. " a/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122-8126,1986; Kato， A. " a/,, Genes Cells 1: 569-579, 1996)。可以适当调整补骨脂素的添加量和暴露于UV的时间长短。感染1 小时后，将2-60 (ig(更优选3-20 )ig)编码重组仙台病毒基因组RNA的DNA 和表达病毒RNP生成所必需的反式作用病毒蛋白的质粒(0.5-24吗 pGEM-N、 0,25-12吗pGEM-P和0.5-24 |ig pGEM陽L) (Kato, A. " a/., Genes Cells 1: 569-579, 1996)，采用Superfect (QIAGEN)的脂转染方法等进行转染。 表达N、 P和L蛋白的载体的量优选比例为2:1:2;质粒的量优选调整为， 例如，1-4 jigpGEM-N、 0.5-2吗pGEM-P、 1-4吗pGEM-L。0057转染的细胞在不含血清的MEM中培养，所述MEM根据需要，可以含 有100吗/ml利福平(Sigma)和阿糖胞苷(AraC),优选浓度为40吗/ml的阿糖 胞苷(AmC)(Sigma)，以便将药物浓度调整至最佳，从而使痘苗病毒的细胞 毒性最小而病毒的回收率最高(Kato,A. "a/., 1996, Genes Cells 1: 569-579)。 转染后将细胞培养48-72hr,然后回收细胞，冻融三次使细胞破碎。用含RNP 的细胞裂解物再度感染LLC-MK2细胞并培养。或者，回收培养上清，将其添加到LLC-MK2细胞的培养液中，使其感染细胞并进行培养。转染可以如 下进行例如，与脂转染胺，聚阳离子脂质体等形成复合体，然后导入细 胞。具体地，可以使用各种转染试剂。例如，DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN #301305), DOTAP, DOPE和DOSPER (Roche #1811169)。为了防止 在内体中降解，还可加入氯p套(Calos, M. P.， 1983, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。在导入了RNP的细胞中，进行从RNP表达病毒基因和RNP复 制的过程，使载体扩增。将所得病毒液(上清)稀释(例如,106-倍)，再使用新 的细胞反复进行扩增，可以完全除去痘苗病毒vTF7-3。将扩增重复例如3 次或3次以上。所得载体可以在-80。C贮存。为了重构缺陷了包膜蛋白编码 基因、不具有传播能力的病毒载体，可以用表达该包膜蛋白的LLC-MK2细 胞进行感染，或者可以与表达该包膜蛋白的质粒一起转染。另一种方法是， 将转染的细胞覆盖在表达该包膜蛋白的LLK-MK2细胞上层并进行覆层培 养，使缺陷型病毒载体扩增(见WO 00/70055和WO 00/70070)。0058回收的病毒的滴度可通过测定CIU(细胞感染单位)或血凝素活性(HA) 来确定(WO 00〃0070; Kato, A. " a/" 1996， Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y" Hemaggulutinating virus of Japan-liposome隱mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306， 1999)。携 带GFP(绿色荧光蛋白)等标记基因的载体，可以利用所述标记作为指标，直 接计数受感染的细胞来定量(例如，GFP-CIU)。如此测定的滴度可与CIU做 等同处理(WO 00〃0070)。0059只要能重构病毒载体，对重构所用的宿主细胞无特殊限制。例如，在 仙台病毒载体等的重构中，可以使用来自猴肾的LLC-MK2细胞(ATCC CCL-7)和CV-1细胞(例如，ATCCCCL-70)、来自仓鼠肾的BHK细胞(例如， ATCC CCL-10)等的培养细胞、及人体细胞等。通过在这些细胞中表达适当 的包膜蛋白，可以获得包膜中包含这些蛋白的感染性病毒粒子。此外，为 了获得大量的仙台病毒载体，可以用从上述宿主中获得的病毒载体感染受 精鸡卵，从而扩增该载体。已经开发了使用鸡卵制备病毒载体的方法 (Nakanishi M, " a/" ed. (1993), "State-of-the-Art Technology Protocol inNeuroscience Research III， Molecular Neuron Physiology", Koseisha, Osaka, pp. 153-172)。具体地，例如将受精卵在孵化器中在37-38。C下培养9-12天使其 形成胚。将病毒载体接种到尿嚢腔，进一步将该受精卵培养数日(例如3曰) 使病毒载体繁殖。可根据所要增殖的重组仙台病毒的不同而改变培养时间 等条件。然后，回收含有病毒的尿嚢液。可以用常规方法从尿嚢液中分离 和纯化仙台病毒载体(Tashiro， M., "Virus Experiment Protocol," Nagai, Ishihama， ed., Medical View Co., Ltd., pp. 68-73,(1995)。0060例如，可以如下重构和制备F基因缺失型仙台病毒载体(见WO 00/70055 和WO 00/70070)。0061O构建F基因缺失型仙台病毒基因组cDNA和F基因表达质粒 仙台病毒(SeV)的全长基因组cDNA， pSeV18+b(+) (Hasan, M. K. & a/" 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)("pSeV18+b(+)，，也称"pSeV18+，，)的 cDNA用Sphl/Kpnl消化，回收消化片段(14673bp),将该片段克隆到pUC18, 得到质粒pUC18/KS。在pUC18/KS上构建F基因缺失位点。F基因的缺失， 通过联合应用PCR以及连接反应来构建，结果F基因的ORF ^皮去除 (ATG-TGA= 1698bp),与例如atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 14)连4矣，由 此构建F基因缺失型SeV基因组cDNA (pSeV18+/AF)。用F基因上游引物 只寸[正向 5'-gttgagtactgcaagagc/序歹'J 号 15 、 反向 5'-tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaacc/序歹'J号16]及F基因下;捧引物 只寸[正向5'-atgcatgccggcagatga/序歹U号17、反向5'-tgggtgaatgagagaatcagc/ 序列号18]进行PCR,所得PCR产物通过EcoT221限制酶位点连接。按上 述方法获得的质粒用Sacl和Sail消化，回收含有F基因缺失部位的片段 (4931bp)，将其克隆到pUC18，得到pUC18/dFSS。用DraIII消化该 pUC18/dFSS,回收片段，将其与pSeV18+中包含的F基因区域的DraIII片 段置换，连接后得到质粒pSeV18VAF。0062将外来基因插入到，例如pUC18/dFSS中F基因缺失部位的Nsil和 NgoMIV限制酶位点。为此，例如，可以用尾部为NsiI(NsiI-tailed)和尾部为 NgoMIV(NgoMIV-tailed)的引物扩增外来基因片段。0063<2〉制备表达SeV-F蛋白的辅助细胞为了构建表达仙台病毒F基因(SeV-F)的Cre/loxP诱导型表达质粒，通 过PCR扩增SeV-F基因，将扩增产物插入到可由CreDNA重组酶诱导基因 产物表达而设计的质粒pCALNdLw (Arai, T. " a/., J. Virology 72, 1998, plll5-1121)的唯一 Swal位点，由此构建质粒pCALNdLw/F。0064为了从F基因缺失型基因组回收感染性病毒颗粒，建立表达SeV-F蛋 白的辅助细胞抹。可以使用例如SeV增殖中常用的猴肾细胞抹LLC-MK2 细胞。在37。C和5 % C02中用含有下列成分的MEM培养LLC-MK2细月包 10。/o热灭活胎牛血清(FBS)、青霉素G钠(50U/ml)和链霉素(50吗/ml)。由于 SeV-F基因产物具有细胞毒性，用磷酸钙法(利用哺乳动物转染试剂盒 (Stratagene))将为了能通过Cre DNA重组酶表达F基因产物而设计的上述质 粒pCALNdLw/F按已知的方案转染LLC-MK2细胞。0065将质粒pCALNdLw/F (10吗)导入已在10cm培养亚中培养至40%铺满 底的LLC-MK2细胞中，然后用含10 % FBS的MEM培养基(10ml)在37°C 、 5%。02培养箱中培养24小时。24小时后将细胞剥离，悬浮于培养基(10ml) 后，接种到5个10ml培养皿中，其中一皿为5ml、两皿为2ml、两皿为0.2ml， 用含G418 (Gibco-BRL) (1,200吗/ml)和10% FBS的MEM培养基(10 ml)培 养14天，每两天更换一次培养基，选出稳定的基因导入细胞抹。用克隆环 回收上述培养基中生长的G418抗性细胞。回收的各细胞克隆均在10cm培 养皿中扩增到铺满底。0066F蛋白的表达可以通过齐藤等人(Saito " a/.， Nucl. Acids Res. 23: 3816-3821 (1995); Arai, T. " a/" J. Virol 72, 1115-1121 (1998))的方法，即在 6cm培养亚中将细胞培养到铺满底后，例如用MOI = 3的腺病毒AxCANCre 来感染细胞。0067〈3〉F基因缺失型SeV/AF病毒的重构和扩增将上述导入了外来基因的质粒pSeV18VAF用以下方法转染LLC-MK2细胞。将LLC-MK2细胞以5xl06个细胞/皿接种到100mm的Petri培养皿中。 在用T7 RNA聚合酶进行基因组RNA的转录时，将细胞培养24小时后， 用经补骨脂素和长波长紫外线(365nm)处理20分钟的表达T7RNA聚合酶的 重组痘苗病毒(PLWUV-VacT7: Fuerst, T. R. ef a/., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83， 8122-8126(1986))，以MOI约为2的水平，在室温下感染1小时。用例 如装有5只15瓦灯泡的UV Stratalinker 2400 (商品目录号400676 (100V), Stratagene, La Jolla, CA， USA)对痘苗病毒进行紫外线照射。将细胞用无血清 MEM洗涤后，将表达基因组RNA的质粒和分別表达副粘病毒N、 P、 L、 和F+HN蛋白的质粒用适当的脂转染试剂转染细胞。这些质粒的用量比优 选按照上述顺序为6:2丄2:2，但不限于此。例如，表达基因组RNA的质粒 以及表达N、 P 、 L和F+HN蛋白的质粒(pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L和 pGEM/F-HN; WO0(V70070, Kato, A. ^a/" Genes Cells 1, 569-579 (1996))分别 以12吗、4昭、2吗、4吗和4吗/皿的量进行转染。培养数小时后，将细胞 用无血清MEM洗两次，在含40|ig/ml胞嘧啶卩-D-阿拉伯呋喃糖苷(AraC: Sigma, St. Louis, MO)和7.5吗/ml胰蛋白酶(Gibco-BRL, Rockville, MD)的 MEM中培养。回收这些细胞，将细胞沉淀悬浮于Opti-MEM(l(f个细胞/ml)。 将悬浮液反复冻融三次，与脂转染试剂DOSPER (Boehlinger Mannheim) (106 个细胞/25pl DOSPER)混合，在室温下放置15分钟后，转染上述克隆了的 表达F基因的辅助细胞(106个细胞/孔，12孔板)，用不含血清的MEM(含 有40pg/ml AraC和7.5 pg/ml胰蛋白酶)培养，回收上清。缺失了除F以外 的基因，例如HN基因和/或M基因的病毒可以用同样的方法制备。 0068在制备病毒基因缺失型载体时，例如，将在其载体基因组中缺失了不 同的病毒基因的两种或更多种的载体导入同一细胞时，每种载体中缺失的 病毒蛋白可以通过另一种载体的表达来提供。因此，这些载体可以互补缺 失的蛋白，构筑具有感染性的病毒颗粒，其结果通过复制循环可以扩增这 些病毒载体。换而言之，能以较低成本大量产生各种病毒基因缺失型病毒 载体的混合物。由于这些缺失有病毒基因的病毒与未缺失有病毒基因的病 毒相比具有较小的基因组，它们可以携带较长的外来基因。此外，由于缺 失有病毒基因而缺乏增殖能力的病毒，被释放到细胞外以后也只是单纯的 被稀释，而很难维持感染能力，因此它们不会产生后代，在环境释放的管理方面较有利。例如，可以想到分别构建能彼此互补的编码A卩的载体和编码Th2细胞因子的载体，用它们进行共感染。本发明提供一种组合物，该 组合物包含编码包括AP在内的多肽的负链RNA病毒载体，还包含编码Th2 细胞因子的负链RNA病毒载体。本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含 编码包括A卩在内的多肽的负链RNA病毒载体，还包含编码Th2细胞因子 的负链RNA病毒载体。这些组合物和试剂盒可用于减少A(3沉淀。0069当将传播型负链RNA病毒载体施用于个体或细胞后，由于在治疗结束 时必须限制该病毒载体的增殖，顾也可以通过给药RNA-依赖性RNA聚合 酶抑制剂，仅仅特异性的抑制该病毒载体的增殖，而对宿主不造成损害。0070根据本发明的方法，本发明的病毒载体可以以，例如，lx 105 ClU/ml 或以上，优选lx 1(^CIU/ml或以上，更优选5xl()eCKJ/ml或以上，更优选 1 x 107 CRJ/ml或以上，更优选5x 107 ClU/ml或以上，更优选lx 108 ClU/m 或以上，更优选5x 1()SCIU/ml或以上的滴度，被释放到病毒生产细胞的培 养基中。病毒滴度可以用本说明书及其他记载方法测定(Kiyotani, K. " Virology 177(1), 65-74 (1990); WO00/70070)。0071可以将回收的病毒载体纯化使其达到基本纯。纯化方法包括过滤、离心分离和柱纯化等公认的纯化分离方法或上述方法的组合。"基本纯"是指病 毒载体在其样品中占主要成分。 一般来说，当样品中所含的全部蛋白(作为承运体和稳定剂加入的蛋白除外)中，来自病毒载体的蛋白比例为10%或以 上，优选20%或以上，更优选50%或以上，优选70%或以上，更优选80%或以上，进一步优选90%或以上时，可以确定为基本纯的病毒载体。病 毒的具体纯化方法包括，采用纤维素硫酸酯或交联多糖硫酸酯的方法(特公昭JP62-30752、特公昭JP62-33879和特公昭JP62-30753),以及吸附于含有 硫酸岩藻糖的多糖和/或其分解产物上的方法(WO 97/32010)。0072在制备包含载体的组合物时，该载体可以根据需要与可药用承运体或 赋形剂混合。"可药用承运体或赋形剂"是指可以与本发明载体一起给药，不 明显抑制该载体的基因导入活性的材料。例如，该载体可以用生理盐水或磷酸盐緩冲液(PBS)等适当稀释，制成组合物。当载体在鸡卵中增殖时，"可 药用承运体或赋形剂"可以包含尿嚢液。另外，包含载体的组合物还可以含 有去离子水和5%葡萄糖水溶液等承运体或赋形剂。进一步地，还可以含有 上述以外的植物油、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂和杀菌剂等。另外，可 以添加防腐剂或其它添加剂。包含本发明载体的组合物可以用作试剂或药 物。本发明涉及抗淀粉状蛋白沉淀药物的制作方法。所述抗淀粉样蛋白沉淀药物包含编码AP肽的负链RNA病毒载体或该载体所导入的细胞以及含 有可药用承运体或赋形剂在内的组合物的制造步骤。本发明还涉及在抗淀 粉样蛋白沉淀药物的制造过程中，负链RNA病毒载体及产生该载体的细胞， 或该载体导入细胞的使用。0073含有本发明载体的组成物可以包含生物聚合体等有机物，羟基磷灰石 (hydroxyapatite)等无机物。具体地，包含胶原基质，聚乳酸聚合物或共 聚物，聚乙二醇聚合物或共聚物和它们的化学衍生物，它们的组合，作为 承运体。0074本发明的组合物还可以包含Th2细胞因子和/或以可表达样式编码Th2 细胞因子的核酸。所述Th2细胞因子可以是全长(野生型)多肽，或保持 活性的部分肽。例如N端和/或C末端氨基酸(例如1-30氨基酸，具体为 1、 2、 3、 4、 5、 10、 15、 20、 25氨基酸)的缺失，不会影响细胞因子活性。 并且，N末端的信号序列可被其他信号序列适当置换。另外，细胞因子也 可作为与其他的肽的融合蛋白来表达。编码Th2细胞因子的核酸或插入表达载体，或接续到肌动蛋白启动子(actin promoter )、 EF1启动子、CMV启 动子、CAG启动子等适合的启动子。核酸，可包含在负链RNA病毒载体或 任何其他的表达载体内。Th2细胞因子被负链RNA病毒载体编码时，Th2 细胞因子也可与A卩在同一载体内被编码，或者Th2细胞因子也可在其它负 链RNA病毒载体内被编码。具体地，编码A卩的本发明负链RNA病毒载体 在不编码Th2细胞因子的情况下，对于Thl /Th2的平衡，将Th2细胞因子 或Th2细胞因子载体与编码A(3的本发明载体组合并共同施用时，移位到 Th2。例如，可使用的Th2细胞因子可从如下组中加以选择。IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-9、 IL-IO、及IL-13、或它们的组合。Th2细胞因子，还可从IL-4、IL-IO、及IL-13等中优选。0075本发明的组合物还可包含佐剂。具体为，本发明载体即使不编码Th2 细胞因子，也可使用含有Th2佐剂的组合物，使Thl / Th2平4耔转位到Th2。 Th2佐剂指的是相对1型辅助T细胞(Thl细胞)，使2型辅助T细胞(Th2 细胞)更具活性化的佐剂。具体地，所述佐剂包含氬氧化铝(alum)、霍乱毒 素(B亚单位)、曼森血吸虫卵(Schistosoma mansoni egg)4是取蛋白(例如 Lacto-N-fucopentaose III)等(Grun， J. L. and P. H. Maurer, Cellular Immunol, 121: 134-145， 1989; Holmgren, J. et al.， Vaccine 11:1179-1184, 1993; Wilson, A.D. et al., Vaccine 11: 113-118, 1993; Lindsay, D,S. et al, Int. Arch. Allergy Immunol. 105: 281-288, 1994; Xu-Amano， J. et al.， J. Exp. Med. 178: 1309-1320: 1993; Okano, M. et al.， J. Immunol. 167(l):442-50, 2001)。本发明的组合物还 可包含任意的其它成分。例如，作为给药后监测用的标记，或免疫系统调 节因子、信号转导调节因子、细胞因子、激素、受体、抗体、及它们的片 段等的一种或多种化合物。本发明的组合物，还可包含编码信号转导调节 因子、细胞因子、激素、受体、抗体、及它们的片段等的一种或多种肽的 一种或多种载体。0076通过将生产的负链RNA病毒或包含该病毒的组合物给药于个体，可诱 导对A(3的免疫应答，从而减少A卩的沉淀。载体可与Th2细胞因子，Th2 细胞因子表达载体，以及Th2佐剂组合给药。载体的给药，可以是体内给 药，也可由细胞介导进行间接(回体)给药。所接种的负链RNA病毒载体， 只要持有可从基因组RNA对所携带的抗原多肽基因的表达能力，则无需是 感染性病毒粒子，也可以是非感染性病毒粒子及病毒核(包含基因组及与 基因组结合的病毒蛋白质的RNA复合体)。本说明书中，负链RNA病毒载 体指的是一种复合体，其在被感染细胞中可复制自身的基因组RNA，同时 具有表达所携带基因的能力。该复合体包含核蛋白(RNP)，所述核蛋白 (RNP)含有来自负链RNA病毒载体的基因组和基因组RNA的复制及病 毒在表达携带的基因时所必须的病毒蛋白。RNP是包含例如负链RNA病毒 的基因组RNA以及N、 L、及P蛋白的复合体。具体来说，本发明的负链 RNA病毒载体包括含有基因组RNA及结合基因组RNA的病毒蛋白(如负链RNA病毒的核衣壳)的感染性病毒粒子、非感染性病毒粒子(也称病毒样粒子(VLP))及RNP。即使从病毒粒子中去除包膜的RNP (病毒核)， 一旦导入到细胞中，便可在细胞内复制病毒基因组RNA。 (WO 97/16538; WO 00/70055)。也可将RNP或VLP与所望的例如转染剂组合进行接种(WO 00/70055; WO 00/70070)。0077通过细胞接种载体时，将负链RNA病毒载体导入适当的培养细胞或从 被接种动物体内采集的细胞中。在体外(试管或培养i),使负链RNA病毒 感染细胞时，感染要在例如培养液或生理盐水等所需的生理水溶液中，在 体外(或回体)进行。MOI (感染复数(multiple of infection):即每个细月包 的感染病毒数)优选1 - 1000的范围，更优选2-500，更优选3 -300,进 而优选5- 100。负链RNA病毒与细胞短时间接触即可。例如1分钟或以 上，优选3分钟或以上，5分钟或以上，10分钟或以上。也可接触20分钟 或以上。例如，1-60分钟，更优选约5-30分钟。也可以4妄触4交长时间， 例如几天或几天以上。0078包含病毒基因组RNA在内的RNP以及非感染性病毒粒子(病毒样粒 子(VLP)可用已知的转染剂法导入细胞。具体如磷酸钙法(Chen， C. & Okayama， H., BioTechniques 6:632-638, 1988; Chen， C. and Okayama, H., Mol. Cell. Biol. 7: 2745, 1987)、 DEAE-葡聚糖法(Rosenthal, N., Methods Enzymol. 152:704-709, 1987)、各种核糖体转染剂(Sambrook, J. et al.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989)、以及电穿孑L法(Ausubel， R et al" In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, NY, Vol, 1, Ch. 5 and 9， 1994)等本行业公认的 多种技术转染细胞。转染剂中可添加氯喹以防止在内体中的降解。(Calos， M. R， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015， 1983)。 转染剂包括 DOTMA(Roche) 、 Superfect Transfection Reagent(QIAGEN， Cat No.301305)、 DOTAP 、 DOPE 、 DOSPER(Roche #1811169)、 TransIT-LT 1 (Mirus， Product No.CLONfectin(商品目录号)(Clontech #8020-1)等。已知包膜病毒在形成病毒粒 子时，将会摄取源于宿主细胞的蛋白，该些蛋白在导入细胞时，会具有某种抗原性，可能是导致细胞毒性的原因。(J. Biol. Chem.， 272: 16578-16584， 1997)。因此，使用去除包膜的RNP是有利的(WO 00/70055)。0079通过将编码病毒基因组RNA的表达载体，及编码复制基因组RNA时 所需的病毒蛋白(N、 P和L蛋白)的表达载体导入细胞，可在细胞内直接 形成病毒RNP 。如此制备导入了病毒载体的细胞。0080调制负链RNA病毒载体导入了的细胞后，可进行12小时-5天的细胞 培养(优选1 - 3天)，使其表达A(3肽。所得细胞可直接或作为细胞提取液 对动物进行接种。但优选使用表达A(3肽的细胞来进行接种。也可将具有信 号肽的Ap肽通过载体加以表达后，并使其被分泌到细胞外。导入了载体的 细胞提取液，可用表面活性液溶解细胞膜的手法或反复冻结-融化等方法制 备。Triton X-100及Nonidet P-40等非离子表面活性剂所适用的浓度范围为 0.1 ~1%。例如，用PBS清洗后，通过离心回收细胞块，在TNE缓沖液 [25mMTris-HCl(pH7.5)、 150mMNaCl、 lmMEDTA、 1% Nonidet P-40]内再 度悬浮后，置于冰中10-30分钟，然后通过孵育悬浮液而得。用做抗原的 蛋白质可在细胞质内溶解时，将制备而得的细胞提取液离心(10,000xg、 10 分钟)处理，沉淀滤出不要的不溶成分。所得上清可用于免疫。在不希望使 用表面活性剂的部位，制备细胞提取液时，清洗后将细胞悬浮于PBS中， 经5-6次反复冻结-溶解，细胞被破坏后也可制备细胞提取液。细胞提取 液可与转染剂一起给药。0081将产生编码A(3肽的负链RNA病毒载体的核酸施用于动物，并通过在 动物体内生成由负链RNA病毒载体所表达的A卩肽，可诱导免疫。产生负 链RNA病毒载体的核酸，指的是表达生成重组负链RNA病毒载体时所需 的RNA及蛋白群的核酸组。具体地，所述核酸指包含编码A(3的负链RNA 病毒载体基因组RNA及其互补链(反基因组RNA,即正链)的核酸，以及 编码包含负链RNA病毒基因组RNA在内的RNP构成蛋白质群的核酸的核 酸组。这些核酸都含有可以表达所编码的RNA及蛋白质所需的启动子。例 如CMV启动子(Foecking， M.K， and Hofstetter H., Gene 45: 101-105, 1986)、 逆转录病毒LTR(Shinnik, T. M. et al., Nature, 293: 543-548, 1981)、 EF1启动子、及CAG启动子(Niwa， H. et al., Gene. 108: 193-199, 1991、特开平 3-168087)。作为核酸，优选使用质粒载体。负链RNA病毒的基因组中优选 携带有编码构成包含基因组RNA的RNP的病毒蛋白群(典型为N、 L、 P) 的基因，以及亲代野生型病毒具有的所有包膜构成蛋白的基因。负链RNA 病毒基因组，在缺失有包膜构成蛋白的任何一种基因时，编码与感染性病 毒粒子的形成相关的包膜蛋白(例如基因组缺失的包膜蛋白或VSV-G等 其他包膜蛋白)的核酸，可以包含在上述核酸组内。通过将这些核酸给药 于动物，可在动物体内生成重组负链RNA病毒。构成含有负链RNA病毒 基因组RNA的RNP的病毒蛋白群，指的是与病毒基因组RNA共同形成 RNP,并构成核衣壳(nucleocapsid)的蛋白质。这些蛋白是基因组复制和基因 表达时所必需的蛋白群，典型的包含N、 P、 L蛋白。具体地，本发明涉及 包含以下步骤的方法对动物接种(i)编码AP的负链RNA病毒的基因组 RNA或其互补链的核酸；和(ii)编码N、 P、 L蛋白质的核酸。在这些被 接种的动物中，形成含有基因组RNA的RNP,并表达A卩肽。该基因组也 可以编码Th2细胞因子。0082此外，也可接种预先其中导入了编码基因组RNA或其互补链的核酸和 编码构成上述RNP的病毒蛋白群的核酸的细胞，或该细胞的提取液。生成 负链RNA病毒载体的核酸的详细情况可参考以下文献WO 97/16539; WO 97/16538; WO 00/70055; WO 00/70070; WO 01/18223; WO 03/025570; Durbin: A. P. et al., Virology 235: 323-332, 1997; Whelan， S, R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388-8392, 1995; Schnell. M. J. et al.， EMBO J. 13: 4195-4203, 1994; Radecke, F. et al.， EMBO J. 14: 5773-5784, 1995; Lawson, N. D. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481， 1995; Garcin, D. et al.， EMBO J. 14: 6087-6094, 1995; Kato， A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996; Baron, M. D. and Barrett, T., J. Virol. 71: 1265-1271, 1997; Bridgen, A. and Elliott, R. M,, Pro" Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404， 1996; Hasan， M. K. et al., J, Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997; Kato, A. et al.， EMBO丄16: 578-587, 1997; Yu, D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Tok麵mi， T. et al" Vims Res. 2002: 86; 33-38, 1997; Li， H.-O. et al.， J. Virol" 74: 6564-6569， 2000。0083将生成负链RNA病毒载体的核酸接种于动物时，编码Ap的负链RNA 病毒的基因组RNA或编码其互补链的核酸，与编码N、 P、 L蛋白的核酸可 按5: 0.5: 0.5: 2的重量比导入动物体内。核酸的比例可适当调整。例如 使用表达质粒时，可用编码含有编码A卩的病毒基因组RNA(正链或负链) 的质粒5吗~ IOOO吗，以及N表达质粒0.5吗 200吗，P表达质粒0.5吗 200吗，L表达质粒2吗 500吗进行给药。核酸的给药，例如可将棵DNA 直接或与转染剂混合后注入实施。转染剂中含有例如阳离子脂质体 (lipofectamine)及聚阳离子脂质体。具体可利用如下试剂DOTMA(Roche)、 Superfect(QIAGEN #301305〉、 DOTAP、 DOPE、 DOSPER(Roche # 1811169)、 TransIT-LTl(Mirus, Product No. MIR 230)。0084本发明载体的给药量视疾病种类、患者的体重、年龄、性别、症状、 给药目的、给药组合物的剂型、给药方法和导入基因类型等而异。给药途 径可以适当选择，例如，经皮、鼻腔内、经支气管、肌肉内、腹腔内、静 脉内、及皮下给药，但不限于此。尤其优选肌肉(例如腓肠肌)或皮下给 药、点鼻或喷雾给药、手掌或足背皮内、脾脏内直接给药、腹腔内给药等。 接种部位可为一到多处，如2-15处均可。接种量可根据纟皮接种动物，接 种部位及接种次数等适当调整。载体可约105 -约10"CIU/ml，优选约107 -约109CIU/ml,更优选约lx108 -约5xl()8CIU/ml的范围内的给药量， 也可与可药用承运体組合给药。对人的一次给药量换算成病毒滴度为lx 104CIU - 5x 1011 CIU (细胞感染单位),优选2x 105CIU - 2x 1010 CIU。给药次 数可视其临床上可容许范围内的副作用，可为一次或多次给药。1日给药次 数也可依此调整。尽管一次给药也可收到明显的效果，但给药本载体1次 以上，其效果会更加显著。0085多次给药时可在例如首次给药约1年后再次给药。优选给药途径，例 如为鼻腔内或肌肉内给药。为了增强疗效可反复给药。多次给药时优选使 用上述携带编码A卩核酸的负链RNA病毒载体，生成病毒载体的核酸，病 毒载体或生成载体的核酸所导入的细胞，以及细胞提取液进行接种。0086在通过细胞(例如人细胞)进行接种载体(回体给药)时，优选对自身细胞感染负链RNA病毒载体，并使用104 - 109个细胞，或优选105 -108个细胞或其细胞提取液。该载体可用于对人类以外的其它动物的接种，给药量可以根据目的动物和人的体重比或给药部位体积比(例如，平均值) 换算药量。含有本发明载体的组合物的给药对象，包括拥有免疫系统的所 望的脊推动物(人或非人脊推动物)，优选鸟类及哺乳动物，更优选哺乳动 物(包括人或非人哺乳动物)。具体地，哺乳动物包括人以及猴等非人灵长 类，小鼠、大鼠等啮齿类，兔、绵羊、山羊、猪、牛及狗等其他所有的哺乳动物。作为给药对象的动物，例如患有阿尔茨海默病的个体，A(3水平亢 进的个体，A(3沉淀亢进的个体，具有阿尔茨海默病型变异基因的个体等。0087通过本发明的方法可以诱导对A|3的免疫应答。所述对Ap的免疫应答， 可以通过抗A(3抗体的产生，脑组织内A(3量的减少以及A卩沉淀的减少等 确认。抗A(3抗体的产生，可通过^r测血液中的抗AP抗体来测定。抗体水 平可才艮净居ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)或乌赫特朗尼法测定。 ELISA法是将抗原吸着在多孔板上，制备抗血清。将制备的抗血清阶段性2 倍稀释(开始溶液1: 1000)，然后加到多孔板中完成抗原抗体反应。为 了进行发色反应，将免疫动物的抗体与作为2次抗体的由过氧化物酶标记 的异种抗体发生反应。吸光度在最大发色吸光度的1/2时，根据抗体的稀 释倍数可算出抗体效价。另外，乌赫特朗尼法是在琼脂内使抗原及抗体扩 散，其免疫沉降反应结果呈现白色沉降线。沉降线可以用于测定发生免疫 沉降反应时抗血清的稀释倍数的抗体效价。脑组织中的A(3量，可以用例如 脑组织的提取物及Biosource ELIS A kit测定。0088A卩沉淀(老年斑)的减少效果，可以通过以下方法测定将脑组织切 片用70%蚁酸处理，用5%&02使内源性过氧化物酶失活后，使抗A卩抗体 和切片发生反应，然后用过氧化物酶标2次抗体进行DNA染色。染色后， 在显^t镜下观察并测定A(3蓄积部分的面积。与未施用本载体时相比，如果 测出蓄积部分面积减少时，则可判断A(3的沉积量减少。此外，将 1 -Fluoro-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene(FSB^与A卩具 有亲和性的化合物静注给药后、利用MRI观察在活体内的老年斑(Higuchi M et al., Nat. Neurosci, 8(4):527-33， 2005; Sato， K, et al., Eur. J. Med. Chem. 39:573, 2004; Khmk, W. E. et al.， Ann. Neurol. 55(3):306-19, 2004)。如上通过非4曼 袭性沉淀图像技术可确认本发明载体的效果。 0089本发明包含关于测定AP免疫反应方法的如下步骤。即将本发明的载体 或包含载体的组合物导入含有AP沉淀的对象的步骤，以及检出该对象体内对该对象体内沉淀的A(3量的检出步骤。根据上述方法，可以监控对A卩的 免疫反应和/或A(3沉淀的减少效果。


图1Litmus SalI/Nhelfrg-MtsHNtsPLmut-dFmlL10(以下简称Litmus TS-dF mlL10)的构建过程示意图。在Litmus TS-dF的F基因缺失部位导入突 变使其含有Notl位点，在此插入用Notl切出的mIL-10基因。的构建过程示意图。将插入到pBluescript(商标)中Notl部位的A(3基因切出、 插入到pSeV18+Notl/TS-dF的Notl部位。图3pSeV18+A(3/MtsHNtsP511Lmut-dF mILlO (以下筒称 pSeV18+A卩/TS-dF mILlO)的构建过程示意图。将pSeV18+A(3/TS画dF和 Litmus TS-dF mILlO用Sail和Nhel切出所需片段进行置换。图4SeV-A(31-43/mlL-10或对照载体鼻腔内给药4和8周后的APP 转基因小鼠血清中的抗A卩抗体水平示意图。图5SeV-A(31-43/mlL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基 因小鼠前脑叶中的老年斑示意图。图6SeV-Api-43/mlL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基 因小鼠头顶叶中的老年斑示意图。图7SeV-A(31-43/mlL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基 因小鼠海马中的老年斑示意图。图8SeV-Api-43/mlL-10或对照载体鼻腔内给药8周后的APP转基 因小鼠老年斑(前脑叶、头顶叶、及海马)的定量结果示意图。图9SeV-Ap卜43/mlL-IO或对照载体鼻腔内给药S周后的APP转基因小鼠中枢神经系统淋巴细胞浸润探讨结果示意图。前脑叶中的T细胞浸润以CD3为指示剂进行了检测。海马中的神经小胶质细胞的变化以Iba-l 为指示剂进行了检测。图1 0SeV-A(31-43/mIL-10或对照载体鼻腔内给药S周后的APP转 基因小鼠脑组织中的A卩量示意组图。图1 1SeV-Af31-43/mlL-10b或对照载体肌肉内给药4和S周后的 APP转基因小鼠血清中的A卩抗体水平示意图。图1 2SeV-Apl-43/mlL-]0或对照载体肌肉内给药8周后的APP转 基因小鼠前脑叶中的老年斑照片。图1 3SeV-A卩l-43/mlL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转 基因小鼠头顶叶中的老年斑照片。图1 4SeV-A(31-43/mlL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转 基因小鼠海马中的老年斑照片。图1 5SeV-A卩l-43/mlL-10或对照载体肌肉内给药8周后的APP转 基因小鼠的老年斑(前脑叶、头顶叶及海马)的定量结果示意图。图1 6SeV-A卩l-43/mlL-10或对照载体肌肉内给药8周后的在前脑 叶中的淋巴细胞浸润探讨结果的照片。图1 7SeV-A(31-43/mlL-10或对照载体的肌肉内给药8周后的脑组 织中A卩量的示意组图。图1 8SeV-A(31-43/mIL-10鼻腔给药后的正常小鼠的血清抗AJ3抗 体水平图。图1 9编码细胞因子的仙台病毒治疗用载体的鼻腔内给药后的正常 小鼠的血清抗A卩抗体水平示意图。0090实施本发明的最佳形态通过以下实施例具体说明本发明，但并不限于此。本说明书中引用的 文献可供参照。0091[实施例1 ]构建携带A(3基因的负链RNA病毒基因组cDNA。 (1 - l)NotI片段的构建(负链RNA病毒载体的转录信号的附加)作为模版，通过在人A(3肽1 ~43(序列号27)中加入淀粉样蛋白前 体蛋白(APP:序列登记号AF282245)的分泌信号(1 ~ 18氨基酸)，作为编码 分泌型A卩肽(序列号28)的基因(特開2005-21149;序列号1),用 phAbeta-Nnotl(序列号19)和phAbeta-Cnotl(序列号20)的2种引物进行 PCR，将所得PCR产物用Notl消化，然后在pBluescript(商标)II KS(Stratagene) 中克隆，构建了包含仙台病毒转录信号的A卩肽基因的Notl片段(序列号 21)。小鼠IL-10(mlL10)也同样，以mIUO cDNA为模板(序列登记号 NMJ)10548;序列号2)，用pmlL10-N(序列号22)及pmlL10-C(序列号 23)2种引物进行PCR。所得PCR产物用Notl消化后、在pBluescript(商标)II KS(Stratagene)中克隆，构建了包含仙台病毒转录信号的IL10基因的Notl 片段(序列号24)。 0092序列号1AAGTCGCTATGACAACACCGCCCACCATGAGTCC 序列号21gcggccgccaaggttcacttATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCCGACTTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccgc 序列号2GAAAAGCTAA 序列号22TGCCTG序列号23TTAGCTTTTCATTTTGATCATCATGTATGCTTC 序列号24gcggccgccaaagttcaATGCCTGGCTCAGCACTGCTATGCTGCCTGCTCTTGATGATCAAAATGAAAAGCTAAccgtagtaagaaaaacttagggtgaaagttcatcgcggccg0093(1 - 2)在F基因缺失部位插入mILlO NotI片断将在9个位点导入了氨基酸突变(M蛋白G69E、 T116A及A183S; HN蛋白A262T、 G264R及K461G; P蛋白质L511F; L蛋白N1197S 及K1795E)的 F基因缺失型 SeV载体(WO 2003/025570)的 cDNA(pSeV8+Notl/TSAF)通过Sail及Nhel消化后、亚克隆到了 Litmus38(New England Biolabs)中。接着在所获得的含有M及HN基因的 Litmus TSAF质粒的F基因缺失部位，导入NotI切割位点的突变。模板使 用Litmus TSAF，然后利用F—lit3008—Notl(序列号25)及R—lit3020—Notl(序 列号26)2种引物进行PCR、由此来导入Notl切割位点(图1上)。将此Litmus TSAF NotI用NotI消化后，插入mILlO基因的NotI片段(图1下)。序列号25: AAGCGGCCGCCTCAAACAAGCACAGATCATGGATG 序列号26: AGGCGGCCGCTTAATTAACCAAGCACTCACAAGG0094(l-3)构建携带AP基因的F基因缺失型SeVcDNA在被NotI消化了的pSeV18+Notl/TSAF上的NotI部位插入A卩肽基因的NotI片段，构建了携带有A卩基因的F基因缺失型SeVcDNA(pSeV18+A(3/TSAF)(图2)。0095(1-4)构建同时携带有A(3基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV基因 组cDNA。使用Sail和Nhel消化pSeV18+Ap/TSAF后，回收了不含有M及HN 基因的片段。同时，用Sail和NheI消化Litmus TSAF-mILlO,并制备了包 含M及HN基因的片段。将该2个片段连接后，构建了携带有AP基因和 IL-10基因的F基因缺失型SeV基因组cDNA(pSeV18+A卩/TSAF-mEL10)(图3)。0096[实施例2]仙台病毒载体的重构和扩增病毒的重构及扩增，按照Li等报告的方法(Li， H,O. et al., J. Virology 74: 6564-6569,2000; WO (XV70070),及改良法(PCT/JP2005/00705)进行。由于病毒载体是F基因缺失型，所以使用了提供F蛋白的辅助细胞。该辅助细胞是使用Cre/loxP诱导表达系统制备的。该系统利用了通过Cre DNA重组酶 诱导表达基因产物而设计的质粒pCALNdLw(Arai, T. et al.， J. Virol. 72: 1115-1121， 1988),按照Saito等方法(Saito, I. et al., Nucl. Acid Res. 23: 3816-3821, 1995; Arai, T. et al., J. Virol. 72: 1115-1121, 1998),在由 pCALNdLw质粒转化了的细胞中感染表达Cre DNA重组酶的重组腺病毒 (AxCANCre)0097通过上述方法制备了携带有A卩基因的F基因缺失型SeV载体 (SeV18+A(3/TSAF),和同时携带有A(3基因和IL-10基因的F基因缺失型SeV 载体(SeV18+A(3/TSAF-mlL10)。编码SeV18+A卩/TSAF-mlL10的正链DNA 序列号为4，编码基因组RNA(负链)的核苷酸序列号为5。作为对照， 取代A(3基因和IL-10基因，在F基因缺失部位制备了携带LacZ基因的SeV 载体(86￥18+ LacZ /TSAF;也称为「 SeV LacZ J )。0098[实施例3]对阿尔茨海默病试验动物模型进行SeV-A卩l-"/mlL10鼻腔 内给药及其效果(3 - 1)试^r动物及给药方法使用24 ~ 25个月龄的APP转基因鼠(Tg2576)(Hsiao， K., et al., Science 274:99-102, 1996)，探讨了本发明的SeV18+A卩/TSAF-mlL10(以下称为 rSeV-Apl-43/mIL-10」)的效果。将小鼠分为治疗组和对照组，每组各4只 小鼠。对治疗组小鼠进行了 SeV-A卩l-43/mlL-10(每只5xl06 CIU)鼻腔内给 药，对对照组小鼠进行了 SeVLacZ(每只5xl06CIU)鼻腔内给药。0099(3 - 2)测定血清中的抗A(3抗体在上述处置4-8周后，对小鼠进行了采血，并测定其血清中的抗 A卩42抗体量。将A(31-42肽(5吗/mL)吸附在96孔试验平板(Nunc， MaxiSorp) 上。用5。/。脱脂乳/TBS-T緩冲液阻断后，加入小鼠血清(500倍稀释)，用过 氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体进行了检测。抗体效价根据ELISA的吸光度 来测定评价(O.D.450)。0100结果如图4所示。与对照组相比，治疗组的每只小鼠的抗体效价均有明显增加。0101(3 - 3)SeV-A(31-43/mIL-10的老人斑去除效果对上述仙台病毒载体鼻腔内给药8周后的小鼠(27或28月龄)进行了 解剖，并制备了前脑叶皮质，头顶叶及海马皮质的脑组织切片。为了测定A卩 蛋白或老年斑，对上述组织的冷冻切片做了如下处理。将组织切片用70% 的蚁酸处理后，用5% 11202使内源性过氧化物酶灭活。然后，将组织切片 与兔抗pan-A(3抗体(1000倍稀释)发生反应，加入过氧化物酶标二次抗体， 进行DAB染色。将染色了的切片在连接有显微镜的3CCD照相机下观察， 并测定各区域的AJ3蓄积面积，并计算其面积率。0102切片的染色结果如图5 (前脑叶)，图6(头顶叶)，图7(海马)所示。 A卩沉积面积率如图8所示。前脑叶，头顶叶，海马的老年斑经 SeV-Aj31-43/mlL-10给药后，比对照组明显减少了 10%-20%。0103(3 - 4)SeV-A(31-43/mlL给药的安全性探讨用上述(3-3)同样的方法制备了给药后8周期间(26~27个月龄)的治疗 组及对照组d 、鼠的前脑叶及海马组织的冷冻切片。使用抗CD3抗体(T细 胞)、抗Iba-l抗体(小胶质细胞)，对冷冻切片进行ABC法染色，确认是否 有中枢神经系统的淋巴细胞浸润及神经小胶质细胞的变化。如图9所示， 在治疗组及对照组的前脑叶和海马中均未观察到所述T淋巴细胞(作为pan T细月包标记的CD3阳性的细胞)的浸润。该结果表明，使用本载体进行治疗 时，可引起中枢神经系统炎症的可能性极低。作为神经小胶质细胞标记的 IBA-1阳性细胞的量，在对照组和治疗组之间显示为同等程度，以此确认了 在治疗组中未出现极端活化(蓄积)。0104(3 - 5)测定脑组织中A(3沉淀将小鼠的大脑及小脑沿正中裂切开， 一半在-80。C下迅速冷冻后保存。 将脑半球置于lml的TBS溶液中使其均一化后、用桌型超离心机在IOO，OOO g下，离心1小时。保存可溶性级分(TBS级分)。将不溶级分在2。/。SDS中 溶解并均一化后，再在100,000 g下离心1小时。保存所得的可溶性级分(2%SDS级分)。将不溶级分在70 0/。蚁酸中溶解并均一化后再进行100,000 g 下的1小时离心。保存所得可溶性级分(蚁酸级分)。脑组织中的A(340及42, 使用Biosource ELISAkit进行测定。将TBS级分4倍稀释；2 % SDS级分进 行400 ~ 2000倍稀释；蚁酸级分用lMTris溶液稀释1000倍。为便于测定， 将稀释了的级分用ELISA稀释液再进行(2 ~ 10倍)稀释。0105如图10所示，在SDS级分，蚁酸级分，以及TBS级分中均能确认至'j， SeV-A(31-43/mIL-10投药后脑组织中的Ap水平明显降低。0106[实施例4]对阿尔茨海默病实验动物模型进行SeV-A卩l-43/mlL10的肌 肉内给药的效果(4 - l)动物及给药方法除给药途径以外，与上述鼻腔内给药完全相同，将5xl()SCIU给药量的 SeV-A卩l-43/mlL-10载体注入后肢大腿月几肉内。0107(4 - 2)测定血清中抗A卩抗体通过使用与上述鼻腔内给药的相同手法，测定了 SeV-Api-43/mlL10肌 肉内给药后的小鼠血清中的抗Ap抗体量。其结果如图11。 0固(4 - 3)SeV-A卩l-43/mlL10的老年斑消失效果通过使用与上述鼻腔内给药的相同方法，将SeV-Api-43/mIL10载体肌 肉内给药后，探讨了脑前叶，头顶叶，及海马中的老年斑消失效果。其结 果如图12 (前脑叶)，图13 (头顶叶)，图14 (海马)所示。AJ3沉积面积 率如图15所示，显示了各处的A(3沉淀的减少。0109(4 - 4)SeV-Api-43/mIL10给药安全性的探讨与上述鼻腔内给药的方法相同，将SeV-A卩l-43/mlU0载体肌肉内给药 后确认了中枢神经系统内的淋巴细胞浸润情况。如图16所示，在对照组和 治疗组中均未观察到前脑叶中的淋巴细胞浸润。0110(4 - 5)测定脑组织中的Ap与上述鼻腔内给药的方法相同，将SeV-A(31-43/mIL10载体肌肉内应合药 后测定了脑组织中的AJ340及AP42。结果如图17所示。在lt个可溶性级分 中，都确i人到A(3水平的减少。0111[实施例5]对正常小鼠进行SeV-Apl-"/hlL10鼻腔内给药后出现抗体效 价的上升(5-1)动物及给药方法使用 6 周龄的 C57BL/6N 小鼠检验了本发明 SeV18+Api画43/TSAF-hlL10(以下也称r SeV-A卩l-43/ML-10」)的效果。将小 鼠分为3组，每组各6只。按组分别对每只小鼠进行了 SeV-Api-43/hIL-lO 鼻腔内给药(组l: 5xl()5ciU/只、组2: 5xl06CIU/^、、组3: 5xl07 CIU/ 乂、)。0112(5 _ 2 )测定血浆中的抗Ap抗体 给药前及给药2, 4,及8周后分别对小鼠进行了采血，并测定了小鼠 血浆中存在的抗AJ342抗体量。将AJ31-42肽(4)ig/mL)吸附在96孔的试验平 板上(Nunc, MaxiSorp)。用1 %BSA/2 %山羊血清/ TBS -T緩冲液阻断后， 加入小鼠血浆(300倍稀释)，用过氧化物酶标抗鼠IgG抗体检测。抗体效价 根据ELISA的吸光度的测定来评价(O.D.450)。0113结果如图18所示，抗A(3抗体量在3个组中随着时间的推移逐渐增加。 通过载体给药，随着给药量的增加抗体量也增加，但在组2 (5xl()SciU/只) 及组3 (5xlO CIU/只)中未观察到抗体量的明显差异。该结果表明.，由于 给药本发明的试剂(SeV-Api-43/hlL-10)所产生的对抗A(3抗体的诱导，不是 特异的只存在于阿尔茨海默病实验小鼠模型(APP Tg小鼠)中，在正常小鼠 中也获得了充分的效果。0114[实施例6]在对正常小鼠鼻腔内给药过程中编码对阿尔茨海默病治疗载 体的细胞因子的效果(6- l)动物及给药方法将编码有数个细胞因子的基因插入到上述阿尔茨海默病治疗载体中。使用6周龄的C57BL/6N小鼠检验了这些仙台病毒载体的效果。将小鼠分为 3组，每组各6只。将仙台病毒载体(携带有编码A(3肽基因、以及携带有编 码鼠IL-4、 IL-5、或IL-6基因的载体；分别称为SeV-A卩l-42/mlL-4、 SeV-A卩l-42/mlL-5、或SeV-A卩l-42/mlL-6)，对每只小鼠进行鼻腔内给药 (5xl06 CIU/10|il)。0115(6 - 2 )测定血浆中的抗A卩抗体 给药前及给药1及2周后，对小鼠进行采血，并测定小鼠血浆中的抗A卩 抗体量。将A卩l-42肽(4吗/mL)吸附在96孔试验平板上(Nunc， MaxiSorp)。 用r/。BSA/2。/。山羊血清/TBS -T缓冲液阻断后，加入小鼠血浆(300倍稀 释)，用过氧化物酶标抗鼠IgG抗体纟全测。抗体效价根据ELISA的吸光度的 测定来评价(O.D.450)。0116结果如图19所示。抗A卩抗体量在3个组中都随着给药后时间的推移 逐渐增加。结果表明IL-4、 IL-5、及IL-6具有有效诱导抗A(3抗体的效果， 由此优选含有同时携带编码A(3抗原的核酸、和IL-4、 IL-5、 IL-6中之一或 数个细胞因子的核酸的仙台病毒载体的制剂，该制剂在阿尔茨海默病的治 疗中可诱导抗AP抗体。0117产业实用性本发明提供了可以有效减少A(3沉积的一种新型负链RNA病毒载体。 本发明的载体可有效地治疗阿尔茨海默病。
权利要求
1. 一种负链RNA病毒载体，该载体含有编码β淀粉样蛋白的核酸。
2. 权利要求1的负链RNA病毒载体，其中所述载体还包含编码Th2 细胞因子或其部分肽的核酸。
3. 权利要求2的负链RNA病毒载体，其中所述Th2细胞因子或其部分 肽是IL-10或其部分肽。
4. 权利要求l的载体，其中所述负链RNA病毒载体是副粘病毒载体。
5. 权利要求4的载体，其中所述副粘病毒载体是仙台病毒载体。
6. 权利要求l的载体，其中所述P淀粉样蛋白是Aj343或其部分肽。
7. 权利要求l的载体，其中所述卩淀粉样蛋白来源于人。
8. 权利要求3的载体，其中所述IL-IO源于小鼠或人。
9. 权利要求1的载体，其中所述(3淀粉样蛋白是序列号为1的核苷酸 序列所编码的多肽或其一部分。
10. 权利要求3的载体，其中所述IL-10是序列号为2或3的核苷酸序 列所编码的多肽。
11. 权利要求1的负链RNA病毒载体，其中所述载体包含序列号为5的核酸。
12. 包含权利要求1-11中任一项所述的载体及药理学上可容许的承运 体的组合物。
13. 权利要求12的组合物，其中还包括(i)以可表达样式编码Th2细 胞因子或其部分肽的核酸，(ii) Th2细胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐剂。
14. 权利要求13的组合物，其中包含Th2细胞因子、其部分肽或Th2佐剂。
15. 权利要求13的组合物，其中包含以可表达样式编码Th2细胞因子或其部分肽的核酸。
16. 权利要求15的组合物，其中所述Th2细胞因子是由包含有编码p 淀粉样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体所编码的。
17. 权利要求15的组合物，其中所述Th2细胞因子是由包含编码卩淀 粉样蛋白的核酸的负链RNA病毒载体以外的载体所编码的。
18. 权利要求12的组合物，该组合物是药学组合物。
19. 用于治疗和预防阿尔茨海默病的药学组合物，包含权利要求1-11 中任一项所述的载体。
20. 权利要求19的组合物，还包含(i)以可表达样式编码Th2细胞因 子或其部分肽的核酸，(ii) Th2细胞因子或其部分肽，或(iii)Th2佐剂。
21. 权利要求18或19的药学组合物，是用于鼻腔内给药的药学组合物。
22. —种使卩淀粉样蛋白沉淀减少的方法，其中包含给药权利要求1-11中任一项所述的载体，或者包含该载体的组合物的步骤。
23. —种阿尔茨海默病的治疗或预防方法，其中包含给药权利要求l-11中任一项所述的载体或者包含该载体的组合物的步骤。
24. 权利要求22或23中所述的方法，所述给药为鼻腔内给药。
25. 权利要求22或23中所述的方法，所述给药为肌肉内给药。
26. 权利要求22或23的方法，其中还包含给药Th2细胞因子、其部分 肽、Th2佐剂或编码Th2细胞因子及其部分肽载体的步骤。
27. 权利要求26的方法，其中所述方法为给药Th2细胞因子、其部分 肽、或Th2佐剂的方法。
28. 权利要求26中所述的组合物，其中给药编码Th2细胞因子或其部 分肽的载体。
全文摘要
本发明是以提供一种对阿尔茨海默病具有更高安全性和有效性的疫苗疗法为目的。构筑携带有Aβ基因的负链RNA病毒载体后，以鼻腔内给药方式将其给药到24-25月龄的APP转基因小鼠体内。在测定血清中抗Aβ抗体水平时，与对照组相比给药组明显增高。组织学探讨结果显示，前脑叶，头顶叶，以及海马中的任一组织内，都显示了给药本发明载体所引起的老年斑的显著减少。脑内Aβ水平也有显著下降。并且，本发明载体的给药，没有引起对中枢神经系统的淋巴细胞浸润。
文档编号C12N15/09GK101228272SQ20068002222
公开日2008年7月23日 申请日期2006年4月20日 优先权日2005年4月20日
发明者井上诚, 原英夫, 德炭由美子, 田平武, 米满吉和, 长谷川护 申请人:生物载体株式会社;国立长寿医疗中心总长代表的日本国