专利名称：用于组织填充的分化的未成熟脂肪细胞和生物可降解支架的移植的制作方法
技术领域：
本发明涉及将衍生自人类脂肪组织的前脂肪细胞(preadipocyte) 分化成脂肪细胞并将这些分化的脂肪细胞连同生物可降解支架移植 进入身体的技术。更具体地，本发明涉及细胞直径在20到40微米的 未成熟脂肪细胞，该细胞是通过从自体或同种异体的人体脂肪组织中 分离前脂肪细胞并在含有生长因子的培养基中培养所述分离的前脂 肪细胞、随后分化脂肪细胞而获得的，本发明涉及一种用生物可降解 支架培养未成熟脂肪细胞的方法，以及一种将未成熟脂肪细胞连同生 物可降解支架一起移植进入体内的方法。
背景技术：
目前，脂肪的自体移植相当普遍。自体脂肪移植的历史可以追溯 到1890年代，这种技术随着1980年吸脂技术的引入而被广泛使用。 结果，大量具有验证根据的案例和记录表明自体脂肪移植是安全的。 特别地，脂肪移植广泛地用于各种各样的应用，例如减缓衰老皮肤的 皱褶，矫正和重建唇线、脸线和发际线，以及鼻整形术。另外，脂肪 移植还可以用于多种领域，如由于皮肤烫伤或外伤造成的皮肤凹陷， 由于癌切除术等造成的组织缺陷，产生如缺陷区域矫正手术的满意结 果。
然而，用简单的吸脂术从脂肪组织获得的脂肪的移植示出术后脂 肪移植物的较短的存活期以及持续性的不令人满意的结果，包括移植 的脂肪体积的40-60%的高吸收率，因此需要进行脂肪的再移植(S Eremia et al， 2000， Dermatol. Sur. 26， 1150-1158; and Fulton JE et al， 2001， Dermatol. Clin. 19(3)， 523-530)。
由于这些原因，人们进行了大量的研究以从通过吸脂术获取的脂
肪块(bulk fat)中分离纯脂肪细胞。为此，一些研究小组和机构将纤 维物质和血液从吸脂术获得的脂肪块中去除掉后进行脂肪移植，但是 至今为止仍未取得满意的结果(G Sattler et al， 2000， Dermatol. Sur. 26， 1140-1144)。
正如上面所讨论的，当将简单地从脂肪组织中分离出来的脂肪移 植进入体内时，会发生移植物体积减少。这是因为大多数如此获得的 脂肪细胞都已经完全成熟，相当一部分细胞在吸脂时被破坏，这是因 为成熟的脂肪细胞在压力下很易碎，所以这就造成了移植后移入率降 低，血运重建(revascularization)或新生血管化(neovascularization) 形成不很顺利。
为此，大量的研究已经或者正在积极地尝试用脂肪组织中含有的 前脂肪细胞作为脂肪移植替代品的可能性。由于从脂肪组织衍生的前 脂肪细胞根据所给的分化条件可以分化成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、 神经细胞等等，这种方法基于应用涉及体内移植前脂肪细胞及其在移 入靶位点后分化成脂肪细胞的机理(M Gimble et al， 2000, Bone 19: 421-428)。然而，前脂肪细胞所表现出的多能性，使得安全移植没有 保障。另外，前脂肪细胞的分化潜能和分化成脂肪细胞的分化率严重 地受到耙移植位点周围生理微环境的影响，因此很难准确预测移植后 可能发生的结果。而且，结合生长因子的治疗作为帮助前脂肪细胞分 化成脂肪细胞的支持疗法还可能会产生安全问题。
为应付这些问题，美国专利No. 6，153，432 (于2000年11月28日 授权)揭示了一种从通过吸脂手术获得的脂肪组织中分离未分化的前 脂肪细胞并将分离的前脂肪细胞分化成移植所需的脂肪细胞的方法， 以及用于其的试剂。特别地，这种方法包括从通过吸脂术获得的脂肪 组织中分离前脂肪细胞；将分离的前脂肪细胞悬浮于基质培养基中， 接种这些悬浮的细胞到培养容器中，并在C02培养箱中在37°C温育 24小时直到前脂肪细胞贴壁在培养容器底部；将基质培养基换成分 化培养基，温育所述细胞3天；将分化培养基替换为脂肪细胞培养基
并将前脂肪细胞分化成脂肪细胞。按照这种方法，可能最大化通过仅 仅移植健康的和未成熟的脂肪细胞获得的所需效果，而不是使用那些 老化的脂肪细胞，这些细胞典型用于传统的脂肪移植技术中，而且这 种方法也可能克服与使用前脂肪细胞可能产生的移植安全性和效率 相关的问题。
然而，在美国专利No. 6,153,432中所揭示的方法仅使用了表述 "分化的含有脂滴(LDs)的脂肪细胞"而没有特别定义分化的脂肪细 胞，因此造成的困难是不能明确地指明和证实将最终从前脂肪细胞获 得的分化脂肪细胞的最佳收获时间以及这些脂肪细胞的质量。
前脂肪细胞的成熟要通过以下几个分化阶段在分化的初始阶 段，在细胞质中形成小脂滴，小脂滴的数量逐渐增多，小脂滴聚集成 大脂滴。 一旦完成成熟， 一个脂滴将占据整个细胞质，细胞的大小也 在成熟的过程中随着脂类积聚而逐渐增大。前脂肪细胞，由于它们不 能确保在移植后能分化成脂肪细胞，而且在细胞收获过程中完全成熟 的脂肪细胞有可能会被破坏，或者在其体内移植后有可能表现出移入 率降低。因此，在相关的技术领域内需要研发一种方法，能够通过特 别限定用于移植的细胞的特征及确保健康和未成熟的脂肪细胞而最 大化所需的移植结果。
在过去的几年中，生物材料领域取得显著的发展。大量材料己经 进入到临床应用，例如其中胶原是代表性的材料。另外，各种各样的 生物材料被用于组织工程领域，包括例如，聚乳酸，聚乙醇酸，胶原 I型衍生物和藻酸盐。通过移植这些生物材料联合外源因子例如类固 醇和生长激素治疗，可能会促进移植基质中的细胞的生长。根据最近 发表的文章，已经证实将bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)和Matrigel (基底膜胶原)一起注射进小鼠中导致形成新的脂肪组织(K Toriyama et al, 2002, Tissue Engineering, vol. 8， 157-165)。即证实了内皮细胞聚 集在Matrigel周围，导致形成新的血管(新生血管化)，同时脂滴在这 些聚集的纤维样细胞中形成。另夕卜，当前脂肪细胞被引入到由聚乳酸 -乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid) (PLGA)形成的聚合物支
架中，该支架随后被移植入大鼠体内，前脂肪细胞分化成脂肪细胞，从而形成脂肪组织(CW Patrick et al， 2002， Tissue Engineering, vol. 8， 283-293)。
尽管在生物材料领域内取得了显著进展，但是目前还没有一种方 法可以通过移植生物材料进入人体后有效地再生脂肪组织。最重要的 原因在于没有找到能够有效地扩增和分化人自体或同种异体脂肪细 胞的最佳条件，以及获得能够以高比率移入并在移植后能维持长时期 的合适形式的分化的脂肪细胞的条件。因而，为了有效治疗软组织缺 乏或缺陷，需要将细胞生产技术和相关生物材料密切协调。
本发明描述 技术问题
因此，本发明正是鉴于以上问题而产生的。本发明的目的在于提 供一种能够通过形成脂肪组织如体内移植天然脂肪细胞和生物可降 解支架来有效地替换(replacing)靶位点的身体体积(body volume) 的方法，这种方法通过建立用于从人体脂肪组织中分离的未分化的前 脂肪细胞生产可移植的分化的未成熟脂肪细胞的技术并通过在体外 将分离的前脂肪细胞和生物可降解支架共培养证实生物可降解支架 中的脂肪细胞的成熟来进行。
技术方案
按照本发明的一个方面，上述和其它目的通过提供用于替换身体 体积的可移植的脂肪细胞组合物来实现，该组合物包含细胞直径20 到40微米的未成熟脂肪细胞，该细胞是通过将脂肪组织衍生的前脂 肪细胞分化成脂肪细胞而获得的。
按照本发明的另一个方面，提供了一种生产可移植脂肪细胞组合 物的方法，包括
(a) 将未分化的从自体或同种异体脂肪组织中分离的前脂肪细胞 分化成脂肪细胞；
(b) 收集细胞直径为20到40微米的分化的未成熟脂肪细胞；及
(C)在体外培养收集的未成熟脂肪细胞和生物可降解支架。 按照本发明的另一个方面，提供了一种移植脂肪细胞的方法，包
括
(a) 将未分化的从自体或同种异体脂肪组织中分离的前脂肪细胞 分化成脂肪细胞；
(b) 收集细胞直径为20到40微米的分化的未成熟脂肪细胞；
(c) 在体外培养收集的未成熟脂肪细胞和生物可降解支架；及
(d) 移植未成熟的脂肪细胞连同生物可降解支架进入体中。 将从自体或同种异体脂肪组织中分离出的未分化的前脂肪细胞
分化成脂肪细胞时，本发明的特点在于具有最大化分化率的脂肪细胞 是通过使用合适的基质培养基、扩增培养基、分化培养基和维持培养 基培养前脂肪细胞并收集那些成熟为预定大小的未成熟脂肪细胞而 获得的。
本发明中用于移植的脂肪细胞是细胞直径为20到40微米的分化 的未成熟脂肪细胞，并在靶移植位点随着数量的逐渐增加而成熟。在 这个阶段的未成熟脂肪细胞的优点如不需要像前脂肪细胞那样需要 分化诱导因子，比成熟的脂肪细胞或其它方法获得的脂肪细胞具有更 优越的存活率和移入率，并使得移植位点的体积逐渐增加。
当本发明获得的未成熟脂肪细胞连同支架一起移植的时候，在移 植初期阶段的体积替换受支架的影响，这种支架是生物可降解的并在 脂肪细胞移入和生长的过程中被吸收，随后移植的缺陷区域将被形态 和特征都和天然脂肪组织相同的脂肪组织所替代。因此，本发明的可 移植脂肪细胞组合物导致在靶移植位点随着脂肪细胞的成熟而逐渐 增加体积，因而可以用于有效地替换身体体积，可以治疗各种由于软 组织缺陷或外观审美缺陷造成的病症。
本发明的上述和其它目的、特征和其它优点通过以下的详细描述 连同附图将被更清楚地理解，其中
图1为显微图(X 400)，显示经油红O染色确定的分化的未成熟 脂肪细胞和成熟脂肪细胞的大小；
图2为将分化的未成熟脂肪细胞引入纤维蛋白中并将其共培养1 个月后，用油红O染色的成熟脂肪细胞的显微图(A, C-F: X 400);
图3为显示将分化的未成熟脂肪细胞引入纤维蛋白中并将其共 培养后分泌到培养上清液中的瘦蛋白的变化的图4为将分化的未成熟脂肪细胞引入藻酸盐珠中并将其共培养 后用油红O染色的脂肪细胞显微图(A: X 40和B-D: X 400)。
最佳方式
在下文中，将更细致地描述本发明。
本文所用术语"前脂肪细胞"是指从脂肪组织中分离的细胞，特别 是具有分化成脂肪细胞的潜能的细胞。
本文所用术语"脂肪细胞"在本发明中是指通过用分化诱导因子 处理前脂肪细胞而形成脂滴并分泌瘦蛋白的细胞，及指由未分化的前 脂肪细胞分化而成的脂肪细胞。
本文所用术语"分化的未成熟脂肪细胞"在本发明中是指通过用 分化诱导因子处理前脂肪细胞而形成脂滴并分泌瘦蛋白的细胞，及指 由未分化前脂肪细胞分化而成的细胞直径在20到40微米的细胞。
本文所用术语"前脂肪细胞分化因子"是指将前脂肪细胞分化成 脂肪细胞所必需的物质，包括例如生物素、胰岛素、泛酸酯 (pantothenate)、地塞米松(dexamethasone)、异丁基甲基黄嘌呤 (isobutylmethylxantine ) (IBMX)禾口卩弓|卩朵美辛(indomethacin)。
本文所用短语"临床应用移植"是指移植由前脂肪细胞分化的未 成熟脂肪细胞以纠正身体轮廓例如缓和或减少由于衰老而导致的皮 肤褶皱，或纠正脸部轮廓，或再生身体上凹陷的区域，例如由于癌切 除术而引起的组织缺陷，伤口造成的凹陷区域，以及身体畸形而导致 的凹陷区域等等。
本文所用术语"同种异体移植"是指移植从衍生自同一物种的其他人或其它动物的特定组织或器官或细胞，及指不可能使用自体组织 或器官或细胞时，移植衍生自其他人或其它动物的组织或器官或细 胞。
本发明包括将从自体或同种异体脂肪组织中分离的未分化的前 脂肪细胞分化成脂肪细胞，有很多不同的分化前脂肪细胞的方法已经
在大量的文献中发表。通过对上述引用到的美国专利No. 6，153，432(于2000年11月28日授权)中揭示的方法的改良，本发明提 出了生产可以在移植后逐渐增加体积的细胞的方法。
可以用在本发明中的前脂肪细胞主要是从(但不仅限于)吸脂术 获得的人类皮下脂肪组织中得到的。
按照本发明，用于移植的分化的自体或同种异体脂肪细胞可以通 过以下方法获得
(1) 从吸脂术得到的脂肪组织中分离前脂肪细胞
脂肪组织用KRB溶液(Krebs-Ringer重碳酸盐溶液)洗涤，用 胶原酶处理，然后离心去除顶端脂层，在底层中加入基质培养基，随 后通过离心从底层中回收前脂肪细胞。
(2) 在基质培养基中培养前脂肪细胞
将前脂肪细胞悬浮于基质培养基中，并接种到培养容器中培养直 到细胞在培养容器底部贴壁。细胞培养24小时，使用含有10%胎牛 血清(FBS)的DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth)作为基质培养基。
(3)在扩增培养基中培养细胞
去除基质培养基后，细胞培养于扩增培养基中，使得足够数量的 前脂肪细胞得到扩增。本文使用的扩增培养基为DMEM/F12加 10%FBS、 EGF (表皮生长因子)、bFGF (碱性成纤维细胞生长因子) 和TGF-betal (转化生长因子betal )，其通过诱导前脂肪细胞的快速 增殖使得细胞数量得到大量增加。
(4)细胞在基质培养基中培养
当培养容器的底部充满单层细胞时，用基质培养基替换扩增培养基，继续培养细胞1到3天。
(5) 细胞在分化培养基中培养
去除基质培养基，细胞在分化培养基中培养。本文使用的分化培 养基为DMEM/F12加3%FBS、生物素、泛酸酯、胰岛素、地塞米松、 异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和吲哚美辛，其诱导前脂肪细胞分化成脂 肪细胞，从而开始在细胞质内形成小脂滴。
(6) 细胞在维持培养基中培养
去除分化培养基，将细胞在维持培养基中培养。本文使用的维持 培养基为分化培养基的一种改良形式，其中的细胞分化诱导因子异丁 基甲基黄嘌呤(IBMX)和吲哚美辛被去除，每2到3天更换一次新鲜 培养基。当在维持培养基中培养时，细胞成熟为脂肪细胞，脂滴的数 量增加并逐渐增加细胞的大小。
特别地，当前脂肪细胞从开始的脂肪组织中分离出来并等份分到 培养容器中时，对于通过吸脂获得的脂肪，调节细胞的脂肪浓度为大 约0.04 M《/cm2，并培养6到8天以保证充分扩增。不进行亚培养，细 胞扩增终止于0代(P0)，随后分化获得具有最大分化率的脂肪细胞。
收集如此分化的脂肪细胞的时期可以如下确定。即前脂肪细胞在 分化培养基中开始形成脂滴。随着在维持培养基中温育时间的增加， 脂滴的数量和大小都随之增加，从而产生成熟的细胞。 一旦细胞充分 成熟，通过积累更多的脂质，脂滴合并成一个占据整个细胞质的脂滴。 在培养过程中，细胞从培养容器底部脱离，悬浮在培养液中。另外， 前脂肪细胞在分化阶段中逐渐增加大小，在分化早期阶段的脂肪细胞 直径为大约10到20微米，而完全成熟的脂肪细胞的大小为大约70 到120微米。按照本发明，优选在分化的脂肪细胞达到细胞直径为 20到40微米时收获细胞。
按照本发明，分化的未成熟脂肪细胞和生物可降解支架在体外共 培养，脂肪细胞在生物可降解支架中的结合和成熟如下确定-
(1)收获分化的未成熟脂肪细胞
在维持培养基中培养的脂肪细胞通过每隔2到3天更换一次新鲜
培养基在培养基维持。用胰蛋白酶/EDTA收获培养6到9天的脂肪细 胞，测量细胞大小。特别地，如此收获的细胞应用在人体上时，优选 在细胞收集前2到4天使用不含牛血清的培养基。
(2) 生物可降解支架
生物可降解支架的材料可以包括但不仅限于纤维蛋白、藻酸盐、 PLGA (聚乳酸-乙醇酸共聚物)和PTFT(聚四氟乙烯)。生物可降解支架
的形式也包括通过注射的可注射形式和通过外科手术的可移植形式。
(3) 将分化的未成熟脂肪细胞移植到生物可降解支架中
细胞直径在20到40微米的未成熟脂肪细胞被移植到生物可降解
支架中，并在培养基中培养。
(4) 测定在生物可降解支架中脂肪细胞的结合和成熟 在生物可降解支架中脂肪细胞的移入和成熟由以下方法测定
① 是通过油红O染色鉴定脂肪细胞以及测定其成熟度和大小的 方法；或
② 通过定量细胞培养上清中的瘦蛋白来证实脂肪细胞的功能。
当上述获得的未成熟脂肪细胞移植到生物可降解支架中时，己证
实移植的细胞很好地移入到靶位点并随着脂滴大小增加以及随后细 胞大小的增加而完全成熟。另外，瘦蛋白的分泌(其是脂肪细胞的特 征功能)也持续增加。
进一步，本发明包括了将分化的未成熟脂肪细胞和生物可降解支 架共移植到体内的步骤。即按照本发明的方法获得的自体或同种异体 脂肪细胞可以连同生物可降解支架一起用于临床应用移植。
本发明模式
现在，参考以下实施例来更详细的描述本发明。这些实施例只是 用来举例说明本发明，并不能理解为限制本发明的范围和精神。
实施例l:生产未成熟脂肪细胞
先，如下从通过吸脂术获得的脂肪组织中分离前脂肪细胞为了去除血液，脂肪组织用相同体积的KRB溶液洗涤3到4次。随后 加入和脂肪组织同体积的胶原酶溶液，然后所述物质在37°C水浴中 反应。所得反应溶液转移到离心管中，在1200rpm和20°C离心10分 钟。去除掉作为上清的脂质和脂肪层，小心地分离出下层，即胶原酶 溶液，不要引起震荡。向其中加入基质培养基，在1200rpm和20°C 离心5分钟。此时，前脂肪细胞沉淀下来，去除上清。
将这样得到的前脂肪细胞悬浮于基质培养基中，接种到培养容器 里，在5。/。C02培养箱中37。C培养24小时，使细胞贴，底部。本文 用到的基质培养基为DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth)力卩10%胎牛血清。
然后，周期性地用扩增培养基替换培养基，细胞继续培养直到培 养容器的底部充满单层细胞。扩增培养基的成分是DMEM/F12， 10% FBS， 5ng/mlEGF， 0.25 ng/ml bFGF，和0.25 ng/ml TGF國bl 。
当培养容器的底部充满单层细胞时，用基质培养基替换扩增培养
基，继续培养细胞3天。
然后，用分化培养基替换基质培养基，培养细胞3天。分化培养 基的成分为DMEM/F12，3%FBS， 33pM生物素，17一泛酸酯，1 ^iM胰岛素，1 nM地塞米松，250 nM异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)和 100,喷哚美辛。
下一步，分化培养基替换为脂肪细胞培养基(维持培养基)，培 养细胞直到收集到的细胞随着脂滴的生长，直径达到20到40微米。 脂肪细胞培养基的成分为DMEM/F12， 3%FBS, 33pM生物素，17一 泛酸酯，100 jiM胰岛素和1 地塞米松。
实施例2:将未成熟脂肪细胞移入支架中并将其共培养 (1)收获分化的未成熟脂肪细胞
向含有在实施例1中生产的未成熟脂肪细胞的培养瓶中加入t胰 蛋白酶/EDTA溶液。所得混合物在培养箱中反应1到15分钟，随后 加入DMEM/F12，使胰蛋白酶/EDTA溶液失活。
收集以上溶液，在1200 rpm和20 °C离心5分钟。去除上清，加 入运送培养基(无酚红DMEM)以悬浮细胞，混合物再按上述条件 离心一次。去除上清，加入适量的运送培养基，进行细胞计数。计算 最终加入的运送培养基的量，并再次离心。
图l.为显微图(X 400)，显示经油红O染色测定的分化的未成熟 脂肪细胞和成熟脂肪细胞的大小。图1A显示收集分化的未成熟脂肪 细胞后测量的细胞大小，其中细胞含有一些脂滴，细胞直径在20到 40微米。图1B为经油红O染色的成熟脂肪细胞的显微图片，在经过 对收集的未成熟脂肪细胞体外三维培养后，其中一些脂滴融合成一个 大脂滴，细胞的细胞直径达到60到100微米。
(2)将分化的未成熟脂肪细胞和纤维蛋白共培养
纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液在使用前10分钟如下准备在装 有冻干纤维蛋白原的小瓶中加入抑酶肽(aprotinin)溶液，放置1到 2分钟，轻微的震荡以完全溶解。在含有凝血酶的小瓶中加入氯化钙 溶液并震荡小瓶直到内容物完全溶解来制备凝血酶溶液。
在步骤(1)中最后离心之后，将凝血酶溶液加入到通过去除上 清液获得的未成熟脂肪细胞中，使得细胞悬浮的浓度为1到5 x 107 细胞/ml。将100微升的凝血酶-细胞悬液和IOO微升纤维蛋白原溶液 混合均匀。过1到2分钟后形成纤维蛋白凝胶(其中导入了未成熟脂 肪细胞)时，加入脂肪细胞培养基并共培养，并每隔3天定期更换培 养基。
图2.为将分化的未成熟脂肪细胞引入纤维蛋白中并将其共培养1 个月后，用油红0染色的成熟脂肪细胞的显微图(A,C-F:X400)。图 2A为收集的分化的未成熟脂肪细胞的显微图片，其中细胞含有一些 脂滴。图2B为将收集的未成熟脂肪细胞引入纤维蛋白后共培养1个 月的纤维蛋白-细胞的显微图。图2C和图2D分别为纤维蛋白凝胶中 成熟的脂肪细胞和用油红O染色的成熟脂肪细胞的显微图片，显示 它们具有和用油红O染色的人类脂肪组织(图2E和图2F)相似的大 小和形态。
图3.为显示将分化的未成熟脂肪细胞引入纤维蛋白中并将其共
培养后分泌到培养上清液中的瘦蛋白的量的变化图。从中可见，纤维 蛋白-细胞的共培养使得瘦蛋白的分泌从共培养的第1天到第14天持 续增加，并在14天后维持一个稳定水平。
从图2和图3中可见，分化的未成熟脂肪细胞通过在纤维蛋白凝 胶中三维培养后得到完全成熟，从而显示出和机体中天然形成的脂肪 组织的细胞生物学相似性。纤维蛋白对未成熟脂肪细胞无毒性，并在 未成熟脂肪细胞成熟的过程中降解，因而为脂肪细胞大小的增加提供 空间。结果，可能最大化未成熟脂肪细胞的移植效果。
(3)将分化的未成熟脂肪细胞和藻酸盐珠共培养
将藻酸盐溶于PBS中制成2%溶液，除菌过滤后保存在室温分别。 制备102mM氯化钙和150mM氯化钠溶液，除菌并保存在室温。
向将步骤(l)最后离心后通过去除上清获得的未成熟脂肪细胞中 加入藻酸盐溶液，使得悬浮的细胞浓度为l到5xl(^细胞/ml。将藻 酸盐-细胞悬浮液装入注射器中，滴入氯化钙溶液中，轻微振荡，放 置IO分钟。当含有未成熟脂肪细胞的藻酸盐珠(直径大约lmm)形 成时，去除氯化钙溶液，用氯化钠溶液洗涤如此形成的珠4次。去除 掉氯化钠溶液后，向珠中加入脂肪细胞培养基并共培养混合物，每3 天更换培养基。
图4为将分化的未成熟脂肪细胞引入藻酸盐珠中并将其共培养 后用油红O染色的脂肪细胞的显微图(A: X 40和B-D: X 400)。 4A: 含有脂肪细胞的藻酸盐珠的显微图；4B:放大400倍下的藻酸盐珠 的显微图；4C:共培养2周后脂肪细胞的显微图；4D:共培养1个 月后用油红O染色的成熟脂肪细胞的显微图。
实施例3:未成熟脂肪细胞和支架的共移植
纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液在使用前10分钟如下准备在含
有冻干纤维蛋白原的小瓶中加入抑酶肽溶液，放置1到2分钟，轻微
振荡直到完全溶解，随后装入注射器中。在含有凝血酶的小瓶中加入氯化钙溶液并振荡小瓶直到内容物完全溶解来制备凝血酶溶液。
向在实施例1步骤(l)最后离心后通过去除上清获得的未成熟脂肪细胞中加入凝血酶溶液，使得悬浮细胞的浓度为1到5xl(^细胞/ml， 将所得悬液装入另一个注射器中。将装有纤维蛋白原溶液的注射器和 装有凝血酶-细胞悬液的注射器分别连接到双注射器套具(dual syringekit)的相应部分，在注射器末端的喷头装上18-规格针头。用 双注射器套具将各100微升的纤维蛋白原溶液和凝血酶-细胞悬液被 混合移植入裸鼠(Crl:Nu/Nu-nuBR)的胸骨区域上方的真皮中。移植后， 将动物饲养1天到12个月，移植位点的组织经活组织切片分离。测 量移植物的分布位点、大小、移入率和存活率。另外，为了证实移植 物和宿主间的免疫排斥现象，进行了免疫染色、生物化学检查和分子 生物学检查。用人类特异性抗体进行的免疫染色反应和用人类特异性 DNA标记的AIu序列进行的PCR技术都证实了检测到分化的人类脂 肪细胞。
从移植位点的组织检査结果证实了移植的未成熟脂肪细胞很好 地移入到小鼠的皮下组织中并在此成长为成熟的脂肪细胞。
工业应用性
如本文所示，当从人类脂肪组织获得的前脂肪细胞分化成的、细 胞直径为20到40微米的未成熟脂肪细胞和支架联合用于自体或同种 异体移植时，在靶移植位点随着体积的逐渐增加，实现了脂肪细胞的 成熟。因此，本发明的脂肪细胞-生物可降解支架组合物可以用于有 效的机体体积替换及可治疗多种由于软组织缺陷或外观审美缺陷引 起的病症。
虽然为了说明目的，已经揭示了本发明的优选实施方案，本领域 技术人员将知道在不偏离如附随的权利要求书中揭示的本发明的范 围和精神的前提下，可以对本发明进行多种修改、添加和替代。
权利要求
1.一种用于替换身体体积的可移植的脂肪细胞组合物，包含通过分化脂肪组织衍生的前脂肪细胞为脂肪细胞而获得的、细胞直径为20到40微米的未成熟脂肪细胞。
2. 权利要求1中的组合物，其用于哺乳动物的自体或同种异体 移植。
3. 权利要求2中的组合物，其中哺乳动物为人类。
4. 生产可移植的脂肪细胞组合物的方法，包括(a) 将未分化的从自体或同种异体脂肪组织中分离的前脂肪细胞 分化成脂肪细胞；(b) 收集细胞直径为20到40微米的分化的未成熟脂肪细胞；及(c) 在体外培养收集的未成熟脂肪细胞和生物可降解支架。
5. 权利要求4中的方法，进一步包括(d)测定生物可降解支架中 脂肪细胞的结合和成熟。
6. —种移植脂肪细胞的方法，包括(a) 将未分化的从自体或同种异体脂肪组织中分离的前脂肪细胞 分化成脂肪细胞；(b) 收集细胞直径为20到40微米的分化的未成熟脂肪细胞；(c) 在体外培养收集的未成熟脂肪细胞和生物降解支架；及(d) 将未成熟的脂肪细胞同生物可降解支架移植进入身体。
7. 权利要求6中的方法，其中脂肪细胞和生物可降解支架是通 过注射移植的。
8. 权利要求6中的方法，其中脂肪细胞和生物可降解支架是通 过外科手术移植的。
9. 权利要求6中的方法，其中移植脂肪细胞和生物可降解支架用于组织重建或美容整形手术。
全文摘要
本发明所提供了将从人类脂肪组织来源的前脂肪细胞分化成脂肪细胞并将这些分化的脂肪细胞联同一种生物可降解支架一起移植进入身体。根据本发明，当将通过脂肪组织衍生的前脂肪细胞分化为脂肪组织而获得的、细胞直径在20到40微米的未成熟脂肪细胞与一种支架联合用于自体或同种异体移植时，脂肪细胞在目标移植位点的成熟使得脂肪细胞体积逐步增长。因此，本发明中的这种脂肪细胞-支架组合物可以用作有效的身体体积替换，可以治疗多种由于软组织缺陷或外观审美缺陷造成的疾病。
文档编号C12N5/077GK101203601SQ200680022417
公开日2008年6月18日 申请日期2006年4月21日 优先权日2005年4月21日
发明者李圣求, 金仁玉, 金美亨 申请人:安特罗根有限公司