专利名称：：表达异源蛋白酶的方法和组合物的制作方法表达异源蛋白酶的方法和组合物1.发明领域在一个方面，本发明提供了在天然不表达蛋白酶或蛋白酶原(pro-protease)的细胞内表达蛋白酶或蛋白酶原的方法和组合物。在其他方面，本发明提供了在这种细胞内生产病毒如流感病毒的方法。在其他方面，本发明提供了提高生长在表达这种异源蛋白酶或蛋白酶原的细胞内的流感病毒的效价的方法。再在另一方面，本发明提供了用于所述方法和组合物的来自灰色链霉菌OS^e;^om;;c"gn&w力的异源蛋白酶。2.
背景技术：
：流感大流行的定义是因流感疾病而导致的全球性发病率和死亡率迅猛增加。有几种因素影响疾病流行的严重程度和范围，其中包括人群的免疫程度低以及病毒在人群中的传染效率。通常来说，后者不仅受病毒本身的影响，而且受人群的密度和进出该地区的难易的影响。导致大流行的病毒通常都是最近出现的抗原性突变株，人群中的大多数以前未接触过这种突变株，因而未产生或很少产生对该突变株的免疫。另外，人与人之间的有效传播是快速流行的先决条件，在动物性病毒向人群传播的情况下，病毒必须适应在人体内复制，并且能够有效传播。流行性感冒传播速度很快，会造成破坏性的影响。二十世纪最严重的大流行是1918年的大流行，在美国有500,000公民死亡，而全球范围内的死亡人数在2到4千万之间。大流行流感相对快速地启动和传播为应对这种程度的全球性发作提出了几个问题，给急性应答者和健康工作者施加了极大的负担。快速鉴定并对出现的大流行作出反应很明显是解决问题的必要条件；目前在全球范围内已经建立了几套程序用于监测正在出现的流感病毒，其中包括很少导致人患病的禽流感病毒。这些监测数据结合预先定义的大流行预警水平可以确定威胁的可能性并为有效应对提供指导。免疫接种是预防流感年度流行所引起的疾病的最重要公共卫生措施。潜在大流行的确定与患病水平开始明显升高之间短暂的间隔对于制备有效疫苗以保护大部分人群来说是一个大的挑战。在下一次大流行出现之前储备疫苗制备技术和生产基础设施对于减少大量疾病和死亡的出现是十分关键的。制备"大流行疫苗"所需要的较短的反应时间将不允许有过长的研究或处理开发时间以提供有效的反应。到目前为止，在美国针对非大流行株的所有商用流感疫苗都是在含胚鸡蛋内繁殖的。虽然流感病毒可在鸡蛋内良好生长，但是疫苗的生产要依赖鸡蛋的可用性。鸡蛋供应必须是有组织的，用于疫苗生产的病毒株要在下一次流感季节到来前几个月筛选出来，这会限制这种方法的灵活性，因此常常会导致疫苗生产和分配的延迟和短缺。不幸的是，某些流感疫苗病毒株，如2003-04季流行的A/Fujian/411/02原型株，在含胚鸡蛋内不能很好地复制，因此不得不利用细胞培养分离该病毒株，这种方法不仅昂贵而且生产过程耗时很长。最近几年已经开发出了在细胞培养物内生产流感病毒的系统(参见，如，Furminger，f^cc/"e尸rat/w"/o"，Nicholson等编，TextbookofInfluenza324-332页;Merten等(1996)，尸rat/wc"owo//"/7we"zav/rws/"ce〃cw/Zwms1，vac"力e;，ara"o"，Cohen&Shafferman(编)，NovelStrategiesinDesignandProductionofVaccines第141-151页)。一般来说，这些方法都包括用筛选出的病毒株感染合适的永生宿主细胞。虽然相对于在鸡蛋内生产疫苗来说可以克服许多困难，但是并不是所有的流感病毒致病株都可以按照已有的组织培养方法良好生长和制备。另外，许多具有理想特征，例如，减毒特性、温度敏感性和冷适应性，的适于制备减毒活疫苗的病毒株利用已有的方法不能在组织培养物内生长。因此需要l)从细胞培养物生产流感疫苗所需的制造设备和方法和2)开发从细胞培养物制造疫苗的有效技术以预防由季节性流感流行造成的疾病。这些方法和技术可迅速应用于在即将到来的流感大流行时制造和分配流行病疫苗。为使基于细胞培养物的流感疫苗获得批准必须克服的诸多障碍之一是需要蛋白水解切除血凝素(HA)蛋白以使新形成的病毒有效感染新细胞。在动物感染期间，通过动物的内源性胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶切除HA蛋白。在培养时，内肽酶活性通常不足以使流感病毒有力复制。因此，在用感兴趣的流感病毒感染培养细胞后通常在培养基中加入蛋白酶如胰蛋白酶以提高病毒产量。参见，例如，美国专利号5,698,433。然而，在细胞培养基中加入外源蛋白酶会在培养基中引入额外成分、增加复杂性并需要接受额外的管理。此外，加入外源胰蛋白酶(trypin)增加了用细胞培养法制造疫苗的花费。因此，需要不需要添加外源蛋白酶的在培养物中生长流感病毒的新方法和组合物。此外，这种方法和组合物必须克服在细胞内表达活性蛋白酶的固有毒性。本发明能满足这些及其他未满足的需求。本文所引用或讨论的参考文献并不等于承认这些是本发明的现有技术。另外，专利的引用也不等于承认其有效性。3.发明概述本发明提供了在本文中称为"本发明细胞"的细胞，其包含编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸，从而该细胞表达该蛋白酶或蛋白酶原的水平将高于缺乏该核酸的细胞的通常表达水平。在某些实施方式中，所述细胞正常情况下不表达该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞以较低水平，例如以低于最佳或所需特定生物活性的水平表达该蛋白酶或蛋白酶原，所述特定生物活性例如培养诸如流感病毒的病毒。在某些方面，本发明提供了一种包含编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸的细胞，其中所述编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸被稳定整合入该细胞的基因组中。在其他方面，本发明提供了一种包含编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸的细胞，其中所述编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸存在于染色体外。在其他方面，本发明提供了一种包含编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸的细胞，其中所述编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸在该细胞内瞬时表达。在某些实施方式中，所述细胞表达该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞组成型表达该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞诱导型表达该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞分泌该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞在细胞的胞质溶胶中表达该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。在某些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶是S1家族蛋白酶。在某些实施方式中，所述蛋白酶是胰蛋白酶。在某些实施方式中，所述丝氨酸蛋白酶是细菌枯草杆菌蛋白酶。在某些实施方式中，所述蛋白酶是灰色链霉菌的SPRT。在某些实施方式中，所述蛋白酶是表l所列的蛋白酶。在某些实施方式中，所述蛋白酶是蛋白酶原。在某些实施方式中，所述蛋白酶原是胰蛋白酶原。在某些实施方式中，所述蛋白酶原被加工成活性蛋白酶。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原在诱导型启动子控制之下表达。在某些实施方式中，所述诱导型启动子受干扰素或干扰素诱导的下游信号分子诱导。在某些实施方式中，所述诱导型启动子受四环素-调控的表达系统诱导。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原在组成型活性启动子控制之下表达。在某些实施方式中，所述编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸包含指导该蛋白酶或蛋白酶原分泌的分泌信号的编码序列。在某些实施方式中，所述细胞表达约O.lng至约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约1ng至约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约10ng至约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约100ng至约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约1吗至约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约0.1ng至约5吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约0.1ng至约100ng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约0.1ng至约10ng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达约0.1ng至约lng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达的蛋白酶或蛋白酶原的量足以提高在表达该蛋白酶或蛋白酶原的细胞培养物中生长的病毒的效价。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原的分子量基于该酶的蛋白酶原形式计算。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原的分子量基于该蛋白酶的成熟、活性形式计算。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约O.lng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约1ng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约10ng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约100ng蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约1吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约10吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约20吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约30吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约40吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达至少约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞是细菌细胞。在某些实施方式中，所述细菌细胞是大肠杆菌(Eco/Z)细胞。在某些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，所述哺乳动物细胞是犬细胞。在某些实施方式中，所述犬细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，所述MDCK细胞是非致瘤的。在某些实施方式中，所述哺乳动物细胞是灵长类细胞。在某些实施方式中，所述灵长类细胞是非洲绿猴或人类细胞。在某些实施方式中，所述细胞是鸟类细胞。在某些实施方式中，所述鸟类细胞是鸡细胞。在另一方面，本发明提供了一种生产病毒的方法，该方法包括用一种病毒感染本发明的细胞，在允许该病毒复制的条件下培养该细胞，以及从细胞培养物中收集病毒。在一具体实施方式中，所述病毒是流感病毒。在另一方面，本发明提供了一种生产病毒的方法，所述方法包括用包含病毒基因组的核酸转染本发明的细胞，在允许该病毒复制的条件下培养该细胞，以及从细胞培养物中收集病毒。在一具体实施方式中，所述病毒基因组是流感基因组，而所述病毒是流感病毒。一些实施方式中，所述流感病毒对应于乙型流感病毒。一些实施方式中，所述流感病毒对应于甲型流感病毒。在某些实施方式中，所述病毒包括减毒流感病毒、冷适应性流感病毒、温敏流感病毒、或具有这些所需特性的任意组合的病毒。一实施方式中，所述流感病毒是B/AnnArbor/1/66流感病毒株，例如B/AnnArbor/1/66的冷适应性、温敏、减毒毒株。在另一个实施方式中，所述流感病毒是A/AnnArbor/6/60流感病毒株，例如，A/AnnArbor/6/60的冷适应性、温敏、减毒毒株。在某些实施方式中，所述方法包括回收流感病毒并用该病毒来制备诸如疫苗等免疫原性组合物。一实施方式中，所述病毒在施用于例如鼻内给予对象后能够引发免疫应答。一些实施方式中，用于制备疫苗的病毒在施用前经灭活，在其他实施方式中，用活的减毒病毒来制备疫苗。在某些实施方式中，按照本发明的方法制造甲型和乙型流感病毒的重组体和重配体(reassortant)。一实施方式中，制备的疫苗包含从通过本发明方法制造的病毒衍生的活的、灭活的、或杀死的病毒。一实施方式中，通过本发明方法制造的病毒被用来在细胞培养物或蛋中复制其他病毒。一实施方式中，提供的疫苗包含从通过本发明方法制造的病毒衍生的免疫原性多肽。在某些实施方式中，所述细胞表达蛋白酶原，且所述方法还包括在培养基中添加外源蛋白酶。在某些实施方式中，所述外源蛋白酶的最大添加浓度约O.lug/ml。在某些实施方式中，所述外源蛋白酶是胰蛋白酶。在某些实施方式中，所述病毒是DNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是RNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是单链DNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是双链DNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是正义单链RNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是负义单链RNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是双链RNA病毒。在某些实施方式中，所述病毒是逆转录病毒。在另一方面，本发明提供了一种复制流感病毒的方法，该方法包括用流感病毒感染本发明的细胞，在允许该流感病毒复制的条件下培养该细胞，以及从细胞培养物收集流感病毒。在某些实施方式中，这种条件不包括外源添加的蛋白酶或蛋白酶原，例如，胰蛋白酶或胰蛋白酶原。再在另一个方面，本发明提供了一种复制流感病毒的方法，该方法包括用编码流感基因组的核酸转染细胞，在允许该流感病毒复制的条件下培养该细胞，以及从细胞培养物收集流感病毒。在某些实施方式中，这种条件不包括外源添加的蛋白酶或蛋白酶原，例如，胰蛋白酶或胰蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞表达正常情况下该细胞不表达的蛋白酶原或酶活性蛋白酶。在某些实施方式中，所述细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方式中，所述细胞是鸟类细胞。在某些实施方式中，所述细胞是灵长类细胞、犬细胞、仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在某些实施方式中，所述细胞是MDCK细胞。在某些实施方式中，所述细胞是Vero细胞。在某些实施方式中，所述细胞是鸡细胞。再在另一个方面，本发明提供了一种提高生长在细胞培养物中的流感病毒效价的方法，该方法包括在细胞培养物中培养所述流感病毒，其中所述细胞培养物中的细胞表达蛋白酶或蛋白酶原，该蛋白酶或蛋白酶原i)对所述细胞异源，和ii)切除了所述流感病毒的血凝素，从而，相对于通过在不表达异源蛋白酶或蛋白酶原的细胞中培养流感病毒获得的效价而言，提高了生长在所述细胞培养物中的流感病毒效价。在某些实施方式中，所述细胞稳定表达该异源蛋白酶。在某些实施方式中，所述细胞组成型表达该异源蛋白酶。在某些实施方式中，所述细胞诱导型表达该异源蛋白酶。在某些实施方式中，所述异源蛋白酶是胰蛋白酶。在某些实施方式中，所述细胞组成型表达该异源蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞诱导型表达该异源蛋白酶原。在某些实施方式中，所述蛋白酶原是胰蛋白酶原。在某些实施方式中，所述蛋白酶是灰色链霉菌的SPRT蛋白酶。在某些实施方式中，所述蛋白酶原是灰色链霉菌的前-SPRT蛋白酶原(prepro-SPRTprotease)。细胞能够支持病毒复制的一个证据是能够从感染的细胞培养物获得病毒。可通过许多本领域技术人员已知的方法测定病毒产量。例如，可按照测量感染性病毒体的半数组织培养感染量(TCID5。)试验测定样品中存在的病毒的浓度从而量化病毒产量。TCID5o值通常表示为logu)TCID5Q/mL。一实施方式中，所述表达异源蛋白酶的细胞支持流感病毒(例如，co^株)复制到下述logK)TCID5o/mL:至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具体实施方式中，所述表达异源蛋白酶的细胞支持流感病毒(例如，ca/to株)复制到商业化合理的效价(〉107LogTCID50/mL)。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价与在不表达异源蛋白酶的相应细胞且未加入外源蛋白酶如胰蛋白酶的培养物中产生的流感病毒的效价相比，其log,oTCID5()/mL提高至少约0.1，或至少约0.2，或至少约0.3，或至少约0.4，或至少约0.5，或至少约0.6，或至少约0.7，或至少约0.8，或至少约0.9，或至少约l.O，或至少约1.2，或至少约1.4，或至少约1.6，或至少约1.8，或至少约2.0，或至少约2.2，或至少约2.4，或至少约2.6，或至少约2.6，或至少约2.8，或至少约3.0，或至少约3.2，或至少约3.4，或至少约3.6，或至少约3.8，或至少约4.0，或至少约4.2，或至少约4.4，或至少约4.6，或至少约4.8，或至少约5.0。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价与在不表达异源蛋白酶的相应细胞且未加入外源蛋白酶如胰蛋白酶的培养物中产生的流感病毒的效价相比提高至少约10%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约25%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约50%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约100%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约500%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约1000%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约5000%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约10，000%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约30,000%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约50，000%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约70,000%。在某些实施方式中，在表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物中产生的流感病毒的效价提高至少约100,000%。在某些实施方式中，可以培养本发明细胞的细胞培养基是无血清的。在某些实施方式中，可以培养本发明细胞的细胞培养基含有血清(例如，胎牛血清)。在某些实施方式中，可以培养本发明细胞的细胞培养基不含外源添加的动物蛋白质，这种培养基通常被称为"无动物蛋白"或"APF"培养基。在某些实施方式中，可以培养本发明细胞的细胞培养基含有外源蛋白酶(例如，猪胰蛋白酶)。再在另一个方面，本发明提供了一种在细胞中制造异源蛋白酶或蛋白酶原的方法，其中所述细胞能够支持流感病毒复制，所述方法包括在允许所述蛋白酶或蛋白酶原表达的条件下培养包含正常情况下不在细胞内表达的蛋白酶或蛋白酶原的编码核酸的细胞，从而在所述细胞内制造该蛋白酶或蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞表达蛋白酶。在某些实施方式中，所述细胞稳定表达蛋白酶。在某些实施方式中，所述细胞表达蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞稳定表达蛋白酶原。在某些实施方式中，所述细胞将蛋白酶或蛋白酶原分泌入细胞培养基。在某些实施方式中，所述细胞表达约0.1ng至约50吗蛋白酶或蛋白酶原/ml细胞培养物。在某些实施方式中，所述细胞表达的蛋白酶或蛋白酶原的量足以提高生长在表达该蛋白酶或蛋白酶原的细胞培养物中的病毒的效价。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原的表达是诱导型的。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原的表达是组成型的。再在另一个方面，本发明提供了一种制造表达该细胞正常情况下不表达的蛋白酶或蛋白酶原的细胞的方法，该方法包括将操作性连接于影响蛋白酶或蛋白酶原表达的调控元件的编码该蛋白酶或蛋白酶原的核酸引入细胞(该细胞能或不能分泌或释放该蛋白酶或蛋白酶原)，从而使得细胞表达正常情况下该细胞不表达的蛋白酶或蛋白酶原。可采用本领域技术人员已知的任何合适技术和/或载体将核酸引入细胞，对此没有限制。在某些实施方式中，所述核酸以质粒、粘粒、病毒载体、噬菌体、噬菌粒、转座子或人工染色体形式引入细胞。在某些实施方式中，所述核酸以逆转录病毒载体形式引入细胞。在某些实施方式中，所述核酸稳定维持在细胞中。在其他实施方式中，所述核酸是暂时维持的。在某些实施方式中，所述编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸还包含可选标记。利用可选标记来选择那些稳定表达编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸的细胞的方法是本领域技术人员已知的。本领域技术人员已知的在引入了该核酸的细胞中会受到影响的任何可选标记都可用于该实施方式。因此，在某些实施方式中，所述可选标记是抗生素抗性基因。在某些实施方式中，所述可选标记是弥补该细胞缺陷的合成代谢途径中的基因。例如，可将所述编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸引入例如氨基酸合成有缺陷的细胞。该核酸可包含弥补该细胞缺陷的基因。通过在不含该氨基酸的培养基中培养该细胞便可选出包含该合成基因的核酸。本领域技术人员己知的任何此类基因都可用于本发明，对此没有限制。再在另一个方面，本发明提供了与SEQIDNO.:1至少约90%相同的分离核酸。在某些实施方式中，所述分离核酸包含SEQIDNO.:1或者由SEQIDNO.:1构成。在某些实施方式中，所述分离核酸在杂交条件下与编码SEQIDNO.:1的核酸(或其互补链)杂交。在某些实施方式中，所述杂交条件为严格杂交条件。在某些实施方式中，所述杂交条件为高度严格的杂交条件。再在另一个方面，本发明提供了一种包含氨基酸序列SEQIDNO.:2或者由氨基酸序列SEQIDNO.:2构成的分离多肽。再在另一个方面，本发明提供了一种编码包含氨基酸序列SEQIDNO.:2或者由氨基酸序列SEQIDNO.:2构成的多肽的分离核酸。再在另一个方面，本发明提供了一种包含本发明核酸的表达载体。再在另一个方面，本发明提供了一种用本发明的表达载体转染的细胞。4.附图简述图1表示了caA/Vietnam/1203/2004(H5N1)在MDCK细胞中的复制。图2为在用不同逆转录病毒载体转染的细胞中观察到的萤光素酶活性的量的表格。图3图示在MDCK细胞中观察到的萤光素酶活性与用来感染MDCK细胞的逆转录病毒颗粒浓度的比较。图4为显示12种不同单个MDCK克隆和两种不同MDCK克隆混合物中的萤光素酶表达的表格。图5中的表格总结了从在两种不同包装细胞系中制造并用三种不同载体转染的病毒颗粒获得的MDCK克隆。图6A-6C为通过用MDV-A或caA/NC流感毒株感染不同MDCK克隆(图A为对照克隆，图B为Ampho胰蛋白酶原克隆，图C为GP2胰蛋白酶原克隆)获得的流感病毒效价图示。加入的外源胰蛋白酶0.0昭/ml，空心三角形；第l天O.l吗/ml，实心圆形；第l-5天1.0pg/ml，空心方形。图7A-7B为显示16种MDCK克隆中12个克隆的6xHis-标记的胰蛋白酶原表达的western印迹。图8为显示15种不同MDCK克隆中可诱导的萤光素酶表达的表格。图9为编码灰色链霉菌丝氨酸蛋白酶的^^r基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)。图10为wrr基因编码的灰色链霉菌丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图11为编码胰蛋白酶原的核苷酸序列(SEQIDNO:3)。图12为用于克隆^^T基因的正向引物和反向引物(分别为SEQIDNO:5和5)。图13为转染入R3/7克隆的pT-Rex-DEST30/萤光素酶和pT-Rex-DEST30/胰蛋白酶质粒的示意图。5.发明详述5.1定义除非另外定义，所有科学和技术术语的含义都与其相关领域所通常使用的含义相同。为了本发明的目的，将下列术语定义如下。术语"核酸"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核酸序列"是指单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物或其嵌合物或类似物。在本文中，术语还可以包括具有天然核苷酸基本特性的天然核苷酸类似物的聚合物，其中它们可以与天然核苷酸相似的方式与单链核酸杂交(例如，肽核酸)。除非另外说明，本发明特定核酸序列除了包括明确描述的序列以外还包括互补序列。术语"基因"的应用范围很广，是指与生物功能有关的任何核酸。因此，基因包括编码序列和/或其表达所需要的调节序列。术语"基因"适用于具体的基因组序列以及该基因组序列所编码的cDNA和mRNA。基因还包括非表达的核酸片段，例如，形成其他蛋白的识别序列的核酸片段。非表达的调节序列包括"启动子"和"增强子"，调节蛋白如转录因子与之结合可导致临近的或附近的序列转录。"组织特异性的"启动子或增强子是指只能在一种或多种特定组织类型或细胞类型内调节转录的启动子或增强子。术语"载体"是指质粒、病毒载体、重组核酸或cDNA。载体还可以是不能自主复制的裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由同一条链内的DNA和RNA组成的多核苷酸、多聚赖氨酸结合的DNA或RNA、肽结合的DNA或RNA、脂质体结合的DNA等。最常见的是，本发明的载体是质粒。"表达载体"是能够驱动其所包含的核酸表达和复制的载体，如质粒。一般来说，要表达的核酸"操作性连接于"启动子和/或增强子，并受启动子和/或增强子的转录调节控制。"双向表达载体"的特征通常是含有两个启动子，二者相对于两个启动子之间核酸而言方向相反，这样在两个方向上都能启动表达，导致，例如，正(+)或正义链和负(-)或反义链RNA的转录。另外，双向表达载体可以是双义载体，其中病毒mRNA和病毒基因组RNA(cRNA)从同一条链上表达。在本发明的上下文中，术语"分离的"是指基本不包含在其天然环境中与其结合或相互作用的组分的生物材料，如核酸或蛋白质。分离材料还可以包含在其天然环境，例如，细胞，中未发现的材料。例如，如果材料处于其天然环境中，例如细胞内，那么材料在细胞内所处的位置(例如，基因组或遗传元件)对于该环境中的材料来说是非天然的。例如，天然核酸(例如，编码序列、启动子、增强子等)如果通过非天然方式被导入到对该核酸来说是非天然的基因组位点(例如，载体如质粒或病毒载体，或扩增子)中，那么这种天然核酸就变成分离的了。这种核酸也被称为"异源"核酸。术语"重组体"是指通过人为干涉发生人工改变或合成改变(非天然的)的材料(例如，核酸或蛋白质)。改变可在其天然环境或状态内的材料上完成，也可以在从其天然环境或状态中分离出来的材料上完成。特别地，如果指的是病毒，例如，流感病毒，当病毒是通过表达重组核酸来制备的时候，病毒是重组体。术语"重配体"用于病毒时是指病毒包含来源于多个亲本病毒株或资源的基因和/或多肽组分。例如，7:1重配体包括来源于第一亲本病毒的7个病毒基因组片段(或基因片段)和来源于第二亲本病毒的一个互补病毒基因组片段，例如，编码血凝素或神经氨酸苷酶。6:2重配体包含来源于第一亲本病毒的6个基因组片段，最常见的6个内部基因，以及来源于不同亲本病毒的两个互补片段，例如，血凝素和神经氨酸苷酶。术语"引入"用于指异源核酸或分离核酸时是指核酸被插入到真核或原核细胞内，其中核酸可以被插入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转化成自主复制子、或者瞬时表达(例如，转染的mRNA)。该术语包括这些方法如"感染"、"转染"、"转化"和"转导"。在本发明的上下文中，各种方法都可用于将核酸引入到原核细胞内，其中包括电穿孔、钙磷酸盐沉淀、脂质介导的转染(脂质转染法)等o术语"宿主细胞"是指含有载体等异源核酸、支持该核酸复制和/或表达、并任选能制造包括多肽和/或病毒在内的一种或多种编码产物的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母、昆虫、两栖动物、鸟类或哺乳动物细胞，其中包括人细胞。在本发明的上下文中，典型的宿主细胞包括Vero(非洲绿猴肾)细胞、Per.C6细胞(人胚胎视网膜细胞)、BHK(幼仓鼠肾)细胞、原代鸡肾(PCK)细胞、马-达氏犬肾(MDCK)细胞、马-达氏牛肾(MDBK)细胞、293细胞(例如，293T细胞)和COS细胞(例如，COSl、COS7细胞)。术语宿主细胞包括细胞的组合或混合物，其中包括，例如，不同细胞类型或细胞系(例女口，Vero和CEK细胞)的混合培养物。电穿孔的sfVero细胞的共培养在，例如，2004年12月22日提交的PCT/US04/42669中有描述，本文已完整纳入作为参考。术语"人工改造的"用于本文中是指病毒、病毒核酸或病毒编码产物，例如，多肽、疫苗，包含至少一个通过重组方法引入的突变，例如，定向诱变、PCR诱变等。术语"人工改造的"用于指包含一个或多个核苷酸突变和/或氨基酸替代的病毒(或病毒组分或产物)时是指编码病毒(或病毒组分或产物)的病毒基因组或基因组片段不是来源于天然资源，例如通过非重组方法(例如在25'C累进传代)制备的天然病毒株或以前就存在的实验室病毒株，例如，野生型或冷适应性的A/AnnArbor/6/60或B/AnnArbor/1/66株。术语"％序列相同性"在本文中可与术语"％相同性"交互使用，是指利用序列比对程序进行比对时，两个或多个肽序列之间的氨基酸序列相同性的水平，或者两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列相同性的水平。例如，在本文中，80%的相同性是指通过确定的算法所确定的与80%序列相同性同样的事情，是指一个给定的序列与另一长度的另一序列至少有80%是一致的。典型的序列相同性水平包括而不限于与给定序列有60、70、80、85、90、95、98%或更高的序列相同性。术语"％序列同源性"在本文中可与术语"％同源性"交互使用，是指利用序列比对程序进行比对时，两个或多个肽序列之间的氨基酸序列同源性的水平，或者两个或多个核苷酸序列之间的核苷酸序列同源性的水平。例如，在本文中，80%的同源性是指通过确定的算法所确定的与80%序列同源性同样的事情，相应的给定序列的同源物在给定序列的长度上有超过80%的序列同源性。典型的序列同源性水平包括而不限于与给定序列有60、70、80、85、90、95、98%或更高的序列同源性。可用于确定两个序列之间相同性的典型计算机程度包括而不限于一套BLAST程序，例如，BLASTN、BLASTX、禾卩TBLASTX、BLASTP禾卩TBLASTN，在NCBI网站上已经公开，可以在互联网上找到。还可参见Altschul等，1990，/Mo/.说'o/.215:403-10(可特别参考公开的默认设置，艮卩，参数w:4，1=17)和Altschul等，1997，A^c/e/d油i^.，25:3389-3402。如果要评价一个给定的氨基酸序列相对于GenBank蛋白序列数据库和其他公共数据库中的氨基酸序列的相同性时，一般利用BLASTP程序进行序列检索。BLASTX程序优选用于检索已将所有阅读框架翻译成GenBank蛋白序列数据库和其他公共数据库中的氨基酸序列的核酸序列。BLASTP和BLASTX都可采用默认参数运行，即开放缺口罚分为11.0，延伸缺口罚分为1.0，并利用BLOSUM-62矩阵。同上。为了确定两个或多个序列之间的"％相同性"所进行的所选择序列的优选比对可利用MacVector6.5版本的CLUSTAL-W程序完成，其中包括10.0的开放缺口罚分，0.1的延伸缺口罚分，和BLOSUM30相似性矩阵。"特异地杂交"或"特异性杂交"或"选择性地杂交"是指复杂混合物(例如，总细胞的)DNA或RNA中存在特定核苷酸序列时，在严格条件下核酸分子优先与该核苷酸序列结合、形成双链或杂交。术语"严格条件"是指探针与其靶序列优先杂交、与其他序列杂交程度低或根本不杂交的条件。"严格杂交"和"严格杂交洗涤条件"用于核酸杂交试验如DNA印迹杂交和RNA印迹杂交时是序列依赖性的，在不同的环境参数下是有区别的。对核酸杂交的较广泛的指导见于Tijssen，1993，《生物化学和分子生物学实验室技术-用核酸探针杂交》丄fl6orato^Tec/z—wesS/oc/zem/Wrya"c/Mo/ecw/ar说'o/ogy-外6〃'cfea"o"w/AA^c/e/c尸ra6^，第I部分，第2章，"杂交原则和核酸探针分析策略概述"(Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays),纽约艾斯维尔(Elsevier，NY);Sambrook等，2001，《分子克隆实验室手册》(Mo/ecw/arC7om'"g:爿/^oratoryMaww/)，冷泉港实验室(ColdSpringHarborLaboratory),第三版，纽约；以及Ausubel等编的最新版本的《当代分子生物学操作手册》(a^re"/VWoco&Mo/ecw/ar所o/ogy)，纽约格里恩出版合作和威利国际科学出版社(GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NY)。一般来说，高严格杂交和洗涤条件所选择的温度比特异性序列在特定离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5°C。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在特定的离子强度和pH下)。十分严格的条件是指等于特定探针的Tm。对于DNA印迹或RNA印迹中含有约100个以上互补残基的互补核酸在滤膜上的杂交来说，严格杂交条件的一个例子是在42'C、含1mg肝素的50%甲醛，杂交过夜。高严格洗涤条件的一个例子是在72'C、0.15MNaCl中杂交约15分钟。严格洗涤条件的一个例子是在65°C、0.2xSSC中洗涤15分钟。参见Sambrook等对SSC缓冲液的描述。在高严格洗涤之前可先进行低严格洗涤以去除背景探针信号。对于，例如约100个以上核苷酸的双链核酸来说，一种典型的中等严格洗涤条件是在45°C、lxSSC中洗涤15分钟。对于，例如约100个以上核苷酸的双链核酸来说，一种典型的低严格洗涤条件是在40'C、4-6xSSC中洗涤15分钟。一般来说，在特定杂交试验中信-噪比高于不相关探针所具有的信-噪比的2倍(或更高)说明检测到的是特异性杂父。在本文中，除非特别指明，术语"约"是指一个数值不大于或小于该术语所修饰的数值的10%。例如，术语"约5吗/kg"是指从4.5昭/kg到5.5吗/kg的范围。另一个例子，"约1小时"是指从48分钟到72分钟的范围。文中，当提及核酸时，术语"稳定整合的"是指核酸已经与宿主细胞的基因组核酸重组并因此变为了细胞基因组的一部分。稳定整合的核酸可包含可选标记以确保稳定整合的核酸持续成为细胞基因组的一部分。稳定整合的核酸不必在单一位置持续整合入基因组；核酸可在一个以上的位置整合并可以在基因组内从一个位置移动到另一个位置。5.2表达异源蛋白酶或蛋白酶原的细胞表面含有前体血凝素分子(HAO)的流感病毒不能够与细胞融合和造成感染。必需对HAO进行蛋白水解切割分离HA1和HA2亚基，以获得其活性形式。表面具有成熟HA的病毒体可与宿主细胞积极融合并造成感染。体内的一些细胞类型，包括气道中的细胞，含有能激活HA的蛋白酶;然而，许多体外使用的细胞类型，包括MDCK，不含能有效切割HA的活性蛋白酶。对于这些细胞而言，在培养时加入的外源胰蛋白酶的浓度不会对细胞造成负面影响但能够将HA切割并活化。参见，例如，美国专利号5,698,433和5,756,341。猪胰蛋白酶己显示能有效激活HA并且是一些流感研究者为达到该目的所通常使用的。在下述实施例中，评价了表达例如猪胰蛋白酶或胰蛋白酶原的重组细胞并对它们在例如MDCK细胞中支持流感病毒复制的能力进行了筛选。因此，在某些实施方式中，预计重组系统或细胞自身表达的活性蛋白酶或蛋白酶原与本发明有关。从重组细胞系表达克隆的蛋白酶或蛋白酶原能够减少或除去动物衍生产品，而原位提供蛋白酶或蛋白酶原能够最有效地切割HA分子。或者，通过改变对蛋白酶或蛋白酶原表达的调控能够表达细胞在正常情况下不表达的由细胞基因组编码的蛋白酶或蛋白酶原。例如，可通过例如调节蛋白酶或蛋白酶原表达的细胞基因组区域的同源重组而引入指导蛋白酶或蛋白酶原翻译和转录的启动子，如诱导型启动子。通过选择在所选细胞类型中有活性的启动子(和/或其他调节序列)能够在正常情况下不表达蛋白酶或蛋白酶原的细胞中表达该蛋白酶或蛋白酶原。本领域技术人员己知的任何已知用来培养流感病毒的细胞可用于产生本发明的细胞，对此没有限制。例如，用于复制流感病毒的合适的宿主细胞包括，例如，Vero细胞、Per.C6细胞、BHK细胞、MDCK细胞、293细胞以及COS细胞，其中包括293T细胞、COS7细胞。此外，含有两种或多种上述细胞系的共培养物可提髙复制效率，例如可以1:1的比例使用MDCK细胞和293T或COS细胞。在这种实施方式中，共培养的细胞之一或两者都可表达该异源蛋白酶。5.2.1细胞表达的蛋白酶本发明所述的细胞可表达本领域技术人员己知的用于切割HA0流感病毒蛋白的任何蛋白酶。能够评价重组系统制造若干蛋白酶的能力以及将若干蛋白酶工程构建入细胞如MDCK细胞本身的能力。合适的蛋白酶和蛋白酶原包括，但不限于，胰蛋白酶、胰蛋白酶原和SPRT。可以使用的其他示例性蛋白酶列于下面的表l。此外，所述蛋白酶的活性片段也可用于本发明的细胞和方法。熟练的技术人员可按照常规确定某特定蛋白酶是否适用于本发明的细胞和方法。通常，这种试验包括评价病毒蛋白的切割，这种切割是病毒生命周期中的一个重要步骤。可直接或间接评价这种切割，直接评价例如通过监测较大蛋白质到两个较小蛋白质的产生，间接评价例如通过监测该蛋白酶存在时产生的病毒效价。例如，可通过例如评价HA0蛋白的切割或通过监测包含该蛋白酶的细胞培养物中的病毒效价来鉴定适用于培养流感病毒的细胞和/或方法的蛋白酶。表1:蛋白酶<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>5.2.2编码蛋白瞎的载体除了，本领域技术人员已知的用来在细胞内表达异源基因的任何合适方法均可用来表达异源蛋白酶或蛋白酶原。通常，含有编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸的重组核酸构建物是釆用常规的分子生物学技术构建的，然后将该构建物引入感兴趣的宿主细胞系。鉴定包含所需构建物的细胞，然后进行筛选以鉴定以所需浓度表达异源蛋白的细胞。进行这些操作中每一步的方法非常多。适用于该目的的许多载体是公众可以获得的，其中包括但不限于质粒、噬菌体、病毒载体、逆转录病毒载体、人工染色体和附加型(episomal)载体。选择构建物和使用这种载体的方法是本领域技术人员熟知的。这种载体可用于简单的克隆和诱变;然而，当将编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸引入合适的细胞时应采用基因表达载体。可对载体进行选择以容纳长度通常从0.25千碱基(kb)到40kb或者更大的任何所需大小的蛋白酶或蛋白酶原编码序列。载体通常含有各种功能组分，包括克隆(或"多接头")位点、复制起点和至少一个可选标记基因。此外，为表达该蛋白酶或蛋白酶原，载体通常具有一个或多个以下元件增强子元件、启动子、转录终止和信号序列，它们各自位于克隆位点附近，从而操作性连接于编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸。本领域已知的任何启动子或增强子元件都可控制蛋白酶或蛋白酶原蛋白质的表达。可采用的合适启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bemoist和Chambon，1981，Nature290:304-310)、Rous肉瘤病毒3'长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature296:39-42)、四环素(Tet)启动子(Gossen等，1995，Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:5547-5551)或CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)。此外，如果需要暂时控制蛋白酶或蛋白酶原的表达，根据本发明可采用本领域技术人员已知的任何诱导型启动子，对此没有限制。例如，所述调控元件可以是干扰素-反应性诱导型启动子或调控元件。参见，例如，Levy等，1988，Ge腦2:383-393，Reich等，1987，尸AO!S.t/&484:6394-6398，和Pellegrini等，1989，7kfo/CW/说'o/.9:4605-4612。载体也可由于含有激素反应元件如糖皮质激素反应元件(GRE)和雌激素反应元件(ERE)而具有可诱导性，当载体被用于在含有对应的激素受体的细胞内表达时所述激素反应元件可提供激素可诱导性。为降低表达的背景水平，可使用对蜕皮激素(一种昆虫激素)有反应的元件作为替代，与蜕皮激素受体共表达。载体通常含有能使载体在一种或多种所选宿主细胞内复制的核酸序列。然而，当载体试图整合入宿主细胞的基因组时则载体不需要能够自主复制，且实际上也不希望它们能自主复制。通常，该序列使得载体能够独立于宿主的染色体DNA复制并包含复制起点或自主复制序列。各种细菌、酵母、病毒和哺乳动物细胞的这种序列是熟知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性菌，这种2微米的质粒起点适合酵母，各种病毒起点(例如SV40、腺病毒)可用于哺乳动物中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点，除非将它们用于能够复制高水平DNA的哺乳动物细胞，如COS细胞。有利地，载体可含有被称为可选标记的选择基因。该基因编码生长在选择培养基中的转化的宿主细胞存活或生长所必需的蛋白质。因此未被含选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在该培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质能够赋予对抗生素或其他毒素如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素的抗性，弥补营养缺陷型缺陷，或提供生长培养基中不能获得的关键营养素。尽管最常见的是将编码蛋白酶或蛋白酶原的载体引入哺乳动物细胞，但也可有利地釆用哺乳动物可选标记，例如G418抗性基因。许多筛选系统都可以使用，其中包括而不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell11:223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026)以及腺嘌呤核酸核糖转移酶(Lowy等，1980，Cell22:817)基因，这些基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗代谢物耐受性也可用作筛选下列基因的基础dhfr基因，赋予细胞对氨甲碟呤的耐受性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA77:3567;O'Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527);gpt基因，赋予细胞对霉酚酸的耐受性(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072);neo基因，赋予细胞对氨基糖甙G-418的耐受性(Colberre-Garapin等，1981，J,Mol.Biol.150:1);以及hygro基因，赋予细胞对潮霉素的耐受性(Santerre等，1984，Gene30:147)。其他抗生素-抗性基因，如赋予对氨苄青霉素、头孢噻肟、庆大霉素、G41S、潮霉素、利福平、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性的基因也可用作可选标记。表达载体通常含有被宿主生物识别并操作性连接于感兴趣编码序列的启动子。这种启动子可以是诱导型或组成型的。术语"操作性连接的"指所述组分的排列方式允许它们以它们预期的方式发挥作用。控制序列"操作性连接于"编码序列是以这种方式相互连接从而可在与该控制序列相匹配的条件下表达该编码序列。采用常规的连接技术构建编码蛋白酶或蛋白酶原的载体。以要产生所需载体的方式切割、裁剪和重连接分离的载体或DNA片段。需要的话可以已知方式进行分析以证实构建的载体中存在的是正确的序列。构建表达载体、准备体外转录物、将DNA引入宿主细胞、以及进行分析以评价表达和功能的合适方法是本领域技术人员已知的。通过以下常规技术检测样品中是否存在基因序列或者对其扩增和/或表达进行定量Southern或Northern分析，Western印迹，DNA、RNA或蛋白质斑点印迹，原位杂交，免疫细胞化学或核酸或蛋白质分子的序列分析。本领域技术人员将容易了解如果需要如何对这些方法进行改进。当将腺病毒用作表达载体时，可使感兴趣的蛋白酶或蛋白酶原编码序列连接腺病毒转录/翻译控制复合物如晚期启动子和三联前导序列。然后可通过体外或体内重组将这种嵌合基因插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区域(例如，El或E3区)将导致能够存活并能够在受感染宿主内表达蛋白酶或蛋白酶原的重组病毒(例如，参见Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad,Sci.USA81:355-359)。或者可采用逆转录病毒表达载体，其包含Harvey鼠肉瘤病毒(Ha-MSV)长末端重复序列(LTR)，该长末端重复序列侧接启动子和编码修饰的ABC转运多肽的核酸。逆转录病毒载体可以是复制感受态或复制缺陷型的。后一种情况下，病毒传代通常将仅发生在互补宿主细胞内。人工染色体也可用于运送比质粒或逆转录病毒载体可包含并表达的DNA片段长的DNA片段。可构建约6kb到10Mb的人工染色体并通过常规运送方法(脂质体、聚阳离子氨基聚合物、或囊泡)运送以用于治疗目的。(参见，例如，Harrington,J.J.等(1997)Nat.Genet.15:345-355。)为有效翻译插入的蛋白酶或蛋白酶原编码序列还可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。此外，起始密码子应位于所需编码序列的阅读框内以确保翻译完整的插入片段。这些外源翻译控制信号和起始密码子可来自各种天然和合成来源。包含合适的转录增强子元件、转录终止子等可提高表达效率(参见，例如，Bittner等，1987，MethodsinEnzymol.153:516-544)。在某些实施方式中，提供了稳定表达蛋白酶或蛋白酶原的细胞。为制造这种细胞系但不采用含有病毒复制起点的表达载体，可用受合适表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚酰苷酸化位点等)和可选标记控制的DNA转化宿主细胞。引入外源DNA之后，可使工程化的细胞在滋养培养基中生长l-2天，然后转移到选择培养基。重组质粒中的可选标记赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合入它们的染色体组内和生长形成集落，然后可克隆集落并将其扩展成细胞系。5.2.3制造表达异源蛋白酶的细胞的方法所选用于将编码蛋白酶或蛋白酶原的载体引入所需细胞的方法将通常依赖于载体和细胞。转化和将核酸引入宿主细胞的其他方法(例如，结合、原生质体转化或融合、转染、电穿孔、脂质体运送、膜融合技术、高速DNA包被颗粒、病毒感染和原生质体融合)可通过本领域熟知的各种方法实现(参见，例如，Ausubel，同上，和Sambrook等，同上)。可用质粒、粘粒等表达载体转化或转染细菌、酵母、植物或哺乳动物细胞，如上所述，其中所述表达载体包含感兴趣的核酸。或者，可用包含感兴趣核酸的病毒表达载体感染细胞。根据宿主细胞、载体和采用的转化方法，多肽的瞬时表达或稳定表达将是组成型或诱导型的。如上所述，本领域的一般技术人员将能够决定是瞬时表达还是稳定表达多肽，以及是组成型表达还是诱导型表达蛋白质。哺乳动物细胞可被包装的病毒载体直接感染或通过化学或电学方法转染。为进行化学转染，可用CaP04共沉淀DNA或用基于脂质体脂质或非脂质体脂质的试剂引入DNA。可获得进行CaP04转染的市售试剂盒(CalPhosTM哺乳动物转染试剂，美国加州帕罗阿托的克隆科技实验室公司(ClontechLaboratories,PaloAlto，Calif.，USA))，并可用市售试剂进行脂质介导的转染，所述试剂如LIPOFECTAMIN2000、LIPOFECTAMINETM试剂、CELLFECTIN⑧试齐U、LIPOFECTIN⑧试剂(美国加州卡尔斯拜德的因维曲根公司(Invitrogen，Carlsbad,Calif.，USA))，DOTAP脂质体转染试剂、FuGENE6、X-tremeGENEQ2、DOSPER(美国印第安纳州印第安纳波利斯的罗氏分子生物化学公司(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis,Ind.USA))，Effectene、PolyFect⑧和Superfect(美国加州巴伦西亚的恰根公司(Qiagen，Inc.，Valencia,Calif.，USA))。电穿孔哺乳动物细胞的方法可在例如以下文献中找至U:Norton等(编)，GeneTransferMethods:IntroducingDNAintoLivingCellsandOrganisms,BioTechniquesBooks,伊顿出版公司(EatonPublishingCo.)(2000)。其他转染技术包括颗粒轰击转染和微注射。参见，例如，Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(10):4455-9(1993);Yang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87(24):9568-72(1990)。5.2.4培养表达异源蛋白酶的细胞表达异源蛋白酶的细胞可在本领域技术人员已知的任何合适的培养基中培养，对此没有限制。一般来说，细胞在标准的商用培养基中培养，例如添加血清(例如，10%胎牛血清)的Dulbecco改进的Eagle培养基，或者在无血清培养基中培养，培养条件为适于维持中性缓冲pH(例如，pH在7.0至IJ7.2之间)的可控湿度和CO2浓度。可选的是，培养基可以包含抗生素以防止细菌生长，例如，青霉素、链霉素等，和/或其他营养物，例如L-谷氨酰胺、丙酮酸钠、非必需氨基酸、促使产生良好生长特性的其他添加物，例如，胰蛋白酶、(5-巯基乙醇等。在培养物中培养哺乳动物细胞的方法已有很多报道，也是本领域技术人员所熟知的。下列书籍提供了通用方法，例如，Freshney(1983)CultureofAnimalCells:ManualofBasicTechnique,纽约艾伦阿利斯(AlanR.Liss，NewYork);Paul(1975)CellandTissueCulture,第5版，爱丁堡里维斯顿(Livingston，Edinburgh);Adams(1980)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-CellCultureforBiochemists,Work和Burdon(编)，阿姆斯特丹艾斯维尔(Elsevier，Amsterdam)。在流感病毒的体外制备过程中，与为了特定目的的组织培养方法有关的其他细节包括，例如，Merten等，(1996)，尸ra由c"'o"o//",e"zflWrws/"ce〃cw/Zwmsybrv"c"'"epw/ara,/o"，选自Cohen禾卩Shafferman(编)NovelStrategiesinDesignandProductionofVaccines,本文已完整纳入作为参考。另外，通过常规试验可以很容易地确定适合本发明的这种方法的变化。一实施方式中，本发明的细胞被作为贴壁细胞在它们所附着的表面培养。组织培养物细胞可在上面生长的贴壁表面是本领域熟知的。贴壁表面包括但不限于表面修饰的聚苯乙烯塑料、蛋白质涂布表面(例如，纤连蛋白和/或胶原涂布的玻璃/塑料)以及大量巿售微载体(例如，DEAE-Dextran微载体珠，如Dormacell，Pfeifer&Langen;Superbead,FlowLaboratories;苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如Hillex，SoloHill，AnnArbor)。一实施方式中，本发明的细胞被作为悬浮细胞培养，不需要载体。使细胞适应不需要载体的悬浮生长的方法是本领域已知的(参见，例如，美国专利号6,825036和6,455,298)。可选或任选地，可调节本发明细胞表达的蛋白酶或蛋白酶原的水平以使无需任何适应便可使细胞悬浮生长。在某些实施方式中，本发明细胞表达充足水平的蛋白酶或蛋白酶原从而无需适应便可悬浮生长。在其他实施方式中，无需适应作为悬浮细胞生长的本发明的细胞被用于复制病毒。在一具体实施方式中，无需适应作为悬浮细胞生长的本发明的细胞被用于复制流感病毒。一实施方式中，由于能表达蛋白酶或蛋白酶原，因此本发明的细胞无需适应便可作为悬浮细胞生长。在某些实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原是丝氨酸蛋白酶。在其他实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原是胰蛋白酶或胰蛋白酶原。再在其他实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原是哺乳动物胰蛋白酶或胰蛋白酶原。再在另一个实施方式中，所述蛋白酶或蛋白酶原是细菌胰蛋白酶或胰蛋白酶原。一些实施方式中，由悬浮生长的本发明细胞表达的蛋白酶或蛋白酶原的水平为约0.1ng至约50吗/ml细胞培养物。在其他实施方式中，由悬浮生长的本发明细胞表达的蛋白酶或蛋白酶原的水平为至少0.1ng、或至少0.5ng、或至少1.0ng、或至少5.0ng、或至少10ng、或至少20ng、或至少30ng、或至少40ng、或至少50ng、或至少60ng、或至少70ng、或至少80ng、或至少90ng、或至少1昭、或至少2吗、或至少5吗、或至少10|ig、或至少20(ig、或至少30itig、或至少40吗、或至少50吗/ml细胞培养物。用于制造流感病毒的细胞可培养在含血清或无血清培养基中。一些情况下，例如为制造纯化的病毒，需要使宿主细胞生长在无血清条件下。合适的无血清培养基描述于2004年12月23日提交的美国临时申请号60/638,166，2005年1月5日提交的美国临时申请号60/641,139以及2005年12月16日提交的美国专利申请号11/304,589，各申请通过引用全文纳入本文。本领域技术人员将了解，在组织培养时采用血清或动物提取物可能会有缺点(Lambert,K丄等，选自AnimalCellBiotechnology,第1巻，Spier，R.E.等，编，学术出版社，纽约(AcademicPresNewYork),第85-122页(1985))。例如，这些添加物的化学组成在各批次之间可能存在差异，即便来自同一制造商亦是如此。此外，动物或人来源的添加物也可能被外来物质污染(例如，支原体、病毒和朊病毒)。当细胞培养基培养中含有这些被污染的添加物时，这些试剂可严重破坏培养细胞的健康。此外，当在被外来试剂污染的培养物中产生的物质被用于细胞治疗和其他临床应用时，这些试剂可能带来健康风险。最担心的是存在会造成动物的海绵状脑病和人的克-雅(Creutzfeld-Jakob)病的朊病毒。因此，在某些实施方式中，所述培养基完全不含血清。有利地，所述培养基可以完全不含动物产品。因此，在某些实施方式中，所述培养基是无动物蛋白培养基(APF)。在某些实施方式中，未在培养基中添加外源动物衍生的蛋白酶。在某些实施方式中，未在培养基中添加动物衍生产品。具体的培养基配方描述于，例如，2005年12月16日提交的美国专利申请号11/304,589。细胞可以在小规模，例如，少于25ml的培养基、培养管或培养瓶中培养，或者在振荡的大培养瓶、旋转瓶，或者在培养瓶、培养罐或反应器中的微载体珠(例如，二乙胺基乙基葡聚糖微载体珠，如Do謹cell，Pfeifer&Langen;Superbead，FlowLaboratories;苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如Hillex，SoloHill，AnnArbor)上培养。微载体珠是小球(直径在100-200微米之间)，可在单位体积的细胞培养物中提供巨大的表面积以便于粘附细胞生长。例如，l升培养基可包含超过2千万个微载体珠，提供超过8000平方厘米的生长表面。对于病毒的商业生产来说，例如，用于疫苗生产，在生物反应器或发酵罐中培养细胞通常是比较理想的。现有的生物反应器的体积从1升以下到100升以上不等，例如，Cyto3生物反应器(明尼苏达州明尼汤卡的奥斯莫尼克公司(Osmonics，Minnetonka，MN);NBS生物反应器(纽约麦迪逊的新布朗斯韦克科技公司(NewBrunswickScientific,Edison，N丄))；布劳恩生物技术国际公司的实验室规模和商业规模的生物反应器(德国麦逊根的布劳恩生物技术国际公司(B.B腦nBiotech,Melsungen，Germany))。无论培养体积多大，在某些实施方式中，重要的是使培养物维持在低于或等于35"C的温度下以确保在一定程度上冷适应的重组和/或重配流感病毒的有效回收。例如，在某些实施方式中，所述细胞在约32"C到35X:之间培养，温度一般在约32'C到约34t:之间，通常在约33"C。一般来说，可使用能感知和维持细胞培养系统温度的调节器，例如，恒温器，或其他装置来确保温度在病毒复制过程中不会超过35°C。5.3灰色链霉菌的SPRT蛋白酶除了上述蛋白酶，本发明提供了一种称为SPRT的新细菌蛋白酶。如下面的实施例所述，从灰色链霉素克隆出了编码该蛋白酶的基因。如上所述，SPRT蛋白酶适合在用来培养病毒的细胞内表达。^KT基因的核苷酸序列示于图9(SEQIDN0:1)，而SPRT蛋白酶的氨基酸序列示于图IO(SEQIDNO:2)。除了编码wrr基因的天然核酸，还按照本发明预测了与^KT基因的核酸序列同源的核酸编码序列。因此，在某些实施方式中，本发明提供了编码与图9的核酸序列有约99%、约95%、约90%、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、或约50%相同的核苷酸序列的核酸。在另一方面，本发明提供了某多肽的编码核酸，该多肽所具有的序列与图9所示核酸序列编码的多肽序列有约99%、约95%、约卯％、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、或约50%相同。在另一个实施方式中，本发明提供了与包含图9所示核苷酸序列的核酸(或编码表1所示多肽的核酸)杂交的核酸。在某些实施方式中，所述核酸在规定的杂交条件下与包含图9所示核苷酸序列的核酸杂交。在某些实施方式中，所述杂交条件是严格杂交条件。在某些实施方式中，所述杂交条件是高度严格的杂交条件。此外，本发明的核酸还包含编码SPRT蛋白酶的核酸的衍生形式。这种衍生物可通过本领域技术人员已知的任何方法制得，对此没有限制。例如，可通过定点诱变来制备衍生物，其中包括核酸的l、2、3、5、IO或更多个核苷酸的替代、插入或缺失。或者，衍生物可通过随机诱变来制备。随机诱变核酸的一种方法包括在存在O.lmMMnCl2和不平衡的核苷酸浓度的条件下在PCR反应中扩增核酸。这些条件增加了PCR反应中聚合酶错误掺入的几率，导致被扩增的核酸发生随机诱变。在某些实施方式中，与文中所述的野生型酶相比，所述编码SPRT蛋白酶衍生物的衍生核酸具有改进的特性。例如，一些实施方式中，所述衍生核酸编码的衍生SPRT蛋白酶具有更强活性，例如，比活大于野生型酶。一些实施方式中，所述衍生SPRT蛋白酶具有相对于野生型蛋白酶能提高SPRT蛋白酶分泌的衍生分泌信号。一些实施方式中，所述衍生SPRT蛋白酶可具有相对于野生型蛋白酶能提高从SPRT蛋白酶剪切前肽原的衍生前肽原(prepr叩eptide)序列。一些实施方式中，所述衍生SPRT蛋白酶显示出最大活性时的pH不同于野生型蛋白酶。在某些实施方式中，所述pH是培养病毒如流感病毒的优选pH。在其他方面，本发明提供了一种SPRT多肽。在某些实施方式中，所述SPRT多肽的氨基酸序列与图10的氨基酸序列至少约99%、约95%、约90%、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、或约50%相同。在其他方面，本发明提供了一种蛋白质，其多肽的氨基酸序列与表1的氨基酸序列有至少约99%、约95%、约90%、约85%、约80%、约75%、约70%、约65%、约60%、约55%、或约50%相同。此外，本发明提供了本发明所述SPRT多肽或蛋白酶的活性片段。在某些实施方式中，所述活性片段包含图10(或表1)所示氨基酸序列的至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、2卯、300、310、或320个毗连氨基酸，同时保留了蛋白酶活性。熟练的技术人员可通过常规方法鉴定这种活性片段，例如釆用常规技术表达该片段并检测蛋白酶活性。因此，在另一方面，本发明涉及在SEQIDNO:2(或表l)所示成熟多肽或其同源序列中包含一个或多个氨基酸的保守性取代、缺失和/或插入的人工变体。在一具体实施方式中，所述氨基酸的改变本质上极小，即是不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守性氨基酸取代或插入；小的删除，通常为1-约30个氨基酸；小的氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端甲硫氨酸残基；至多达约20-25个残基的小的接头肽；或通过改变净电荷或其他功能而有助于进行纯化的小的延伸，所述其他功能如聚组氨酸通道(poly-histidinetract)、抗原表位或结合域。保守性取代的例子有下组氨基酸内的取代碱性氨基酸(精氨酸，赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活的氨基酸取代是本领域熟知的，并描述于，例如，H.Neurath和R.L.Hill，1979，《蛋白质》(TheProteins),纽约出版社(AcademicPress,NewYork)。最通常发生的改变是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu禾卩Asp/Gly。除了20种标准氨基酸，也可用非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-M-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和a-甲基丝氨酸)取代野生型多肽的氨基酸残基。可用有限数目的非-保守性氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸以及非天然氨基酸取代氨基酸残基。"非天然氨基酸"在蛋白质合成后被修饰，和/或在其侧链具有不同于标准氨基酸的化学结构。非天然氨基酸可以是化学合成的并且可通过商业获得，其中包括2-哌啶酸、四氢噻唑羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸以及3,3-二甲基脯氨酸。或者，所述氨基酸改变的性质为改变多肽的物理-化学特性。例如，氨基酸改变可提高多肽的热稳定性，改变底物特异性、改变最佳pH等。可按照本领域己知的方法如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science244:1081-1085)来鉴定亲本多肽内的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子的每个残基中都引入了丙氨酸突变，并检测了所得突变分子的生物学活性(即，脂肪酶活性)以鉴定决定该分子活性的氨基酸残基。也可参见，Hilton等，1996，J.Biol.Chem.271:4699-4708。通过对结构进行物理分析以及假定接触位点的氨基酸突变也可确定酶或其他生物相互作用的活性位点，所述结构通过诸如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记的技术确定。参见，例如，deVos等，1992，Science255:306-312;Smith等，1992，J.Mol.Biol.224:899-904;Wlodaver等，1992，FEBSLett.309:59-64。也可通过分析与本发明所述多肽相关多肽的相同性来鉴定必需氨基酸。可采用已知的诱变、重组和/或改组方法，然后进行相关筛选方法以制造并测试单个或多个氨基酸取代，所述筛选方法如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，Science241:53-57;Bowie和Sauer，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625中描述的方法。可采用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem.30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)和定区域诱变(Derbyshire等，1986，Gene46:145;Ner等，1988，DNA7:127)。诱变/改组方法可与高通量自动筛选法组合以检测宿主细胞表达的克隆的、诱变多肽的活性(Ness等，1999，NatureBiotechnology17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子并用本领域的标准方法快速测序。这些方法能够迅速测定各氨基酸残基在感兴趣多肽中的重要性，并能够用于结构未知的多肽。5.4表达载体再在另一个方面，本发明提供了表达SPRT蛋白酶或本发明的其他蛋白酶的表达载体(参见，例如，表l)。通常，表达载体是包含操作性连接于编码多肽的核苷酸序列的表达控制序列的重组多核苷酸分子。通过包含合适的启动子、复制序列、可选标记等，表达载体可方便地在原核生物或真核生物中发挥功能，从而导致稳定转录和翻译mRNA。构建表达载体以及在包含该表达载体的细胞内表达基因的技术是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等，2001，《分子克隆实验室手册》，第三版，冷泉港实验室，纽约冷泉港，和Ausubel等编的最新版本的《当代分子生物学操作手册》，纽约格里恩出版合作和威利国际科学出版社。用于表达载体的有用启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松可诱导的MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、组成型MPSV启动子、四环素可诱导的CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)、组成型CMV启动子和干扰素反应型启动子。表达载体应包含与表达SPRT蛋白酶的细胞相容的表达和复制信号。合适的表达载体包括但不限于病毒载体如逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒，质粒载体，粘粒等。将表达载体转染入哺乳动物细胞时优选病毒和质粒载体。例如，表达控制序列中包含CMV启动子的表达载体pcDNAl(加州圣地亚哥因维曲根公司(Invitrogen，SanDiego，CA))能提供良好的转染和表达入这种细胞的速率(rate)。可使用的表达载体的其他例子提供在下面的实施例中。可通过本领域技术人员已知的任何方法将表达载体引入细胞，对此没有限制。这种方法包括但不限于例如，由细胞从溶液中直接摄取该分子；采用例如脂质体或免疫脂质体通过脂转染以帮助摄取；颗粒介导的转染；等等。参见，例如，美国专利号5,272,065;Goeddel等编，1990，Af"/wc&/"￡wz_ymo/ogy，第185巻，加州学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.,CA);Krieger，1990，GeweTra"—r￡x/7myi"/cw—J丄a/70rato7A/arn^/，纽约斯图克通出版社(StocktonPress,NY);Sambrook等，1989，《分子克隆实验室手册》，纽约冷泉港实验室；和Ausubel等编的最新版本的《当代分子生物学操作手册》，纽约格里恩出版合作和威利国际科学出版社表达载体也可含有能简化递送构建物的分离的纯化部分。例如，包含诸如6个组氨酸残基的聚组胺部分可被掺入蛋白质的氨基末端。该聚组胺部分允许通过镍螯合层析在一个步骤中方便地分离蛋白质。在某些实施方式中，在纯化之后可从递送构建物的剩余部分上切除所述纯化部分。在其他实施方式中，所述部分不会妨碍递送构建物功能结构域的功能因此无需切除。5.5操作核酸和蛋白质的其他方法在本发明文中，可按照熟知的分子生物学技术操作包括病毒核酸、编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸等在内的核酸。包括扩增、克隆、诱变、转化等在内的众多这种方法的详细过程描述于，例如，Ausubel等，《当代分子生物学操作手册》(在2006年增补)，约翰威利出版公司(JohnWiley&Sons)，纽约("Ausubel");Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(第三版)，第1-3巻，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，2001("Sambrook")，以及Berger和Kimmel的《分子克隆技术指南，酶学方法》(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology.)，第152巻，力口州圣地亚哥学术出版社有限公司(AcademicPress,Inc.,SanDiego，CA)("Berger")。除了上述参考文献，可在以下文献中找到诸如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、QP-复制酶扩增和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA)等用于例如扩增本发明的cDNA探针的体外扩增技术方法Mullis等(1987)美国专利号4,683,202;PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications(Innis等编)力口州圣地亚哥学术出版社有限公司(AcademicPressInc.SanDiego,CA)(l卿)("Innis");Arnheim和Levinson(19%)C&EN36;TheJournalOfNIHResearch(1991)3:81;Kwoh等(1989)ProcNatlAcadSciUSA86,1173;Guatelli等(1990)ProcNatlAcadSciUSA87:1874;Lomell等(1989)JCUnChem35:1826;Landegren等(1988)Science241:1077;VanBrunt(1990)Biotechnology8:291;Wu和Wallace(1989)Gene4:560;Barringer等(1990)Gene89:117，以及Sooknanan和Malek(1995)Biotechnology13:563。在本发明文中，用于克隆核酸的其他方法包括Wallace等的美国专利号5,426,039。通过PCR扩增巨大核酸的改进方法总结于Cheng等(1994)Nature369:684及其中的参考资料。本发明的某些多核苷酸如寡核苷酸可利用包括基于单核苷酸和/或三核苷酸的亚磷酰胺偶联化学在内的各种固相策略合成。例如，可通过在正在延伸的多核苷酸链中依次加入活化的单体活化三体来合成核酸序歹U。参见例如，Caruthers，M.H.等(1992)MethEnzymol211:3。除了合成所需序列，实质上任何核酸都可从诸多商业来源中的任何一个来源定帝ij，这些商业来源诸如内地合格试剂公司(TheMidlandCertifiedReagentCompany)、泛美基因公司(TheGreatAmericanGeneCompany)、基因表达有限公司(ExpressGen，Inc.)、操纵子技术有限公司(OperonTechnologies,Inc.),等等。此外，通过例如定点诱变可取代病毒多肽、蛋白酶或蛋白酶原中的选定氨基酸残基。例如，为制造具有与所需表型特征如减毒表型、冷适应、温度敏感、被特定蛋白酶剪切等功能相关的氨基酸取代的病毒多肽，可将特定突变引入编码该多肽的病毒核酸节段。定点诱变方法是本领域熟知的并描述于，例如，Ausubel、Sambrook和Berger，同上。各种进行定点诱变的试剂盒可通过商业获得，例如，Chameleon定点诱变试剂盒(乐朱拉的拉斯加特基因公司(Stratagene，LaJolla))，并可按照制造商的说明使用以在分别编码甲型或乙型流感多肽的基因组节段中或在编码蛋白酶或蛋白酶原的核酸中引入例如一个或多个氨基酸取代。5.6采用表达异源蛋白酶的细胞来培养流感病毒在细胞培养物中复制流感病毒的方法是本领域技术人员熟知的(参见上文中题为"培养表达异源蛋白酶的细胞"一节)。通常，这些方法包括用选出的病毒株感染合适的宿主细胞。或者，可采用重组方法将病毒基因组引入宿主(例如，下文中题为"表达蛋白酶或蛋白酶原的宿主细胞中的流感基因组载体"的一节中详细描述的质粒拯救)。如上文的充分论述，通常在培养基中加入外源蛋白酶以在不表达有效切除HAO蛋白的蛋白酶的细胞的细胞培养物中有效制造流感病毒(参见，例如，Appleyard等，1974，J.GenVirol.25:351-357;美国专利5,824,536;4,500,513;和专利公开WO96/15232)。本发明的一个目的是提供表达异源蛋白酶的细胞以复制流感病毒，在一具体实施方式中，目的为提高流感病毒的感染效率以提高细胞培养物中的病毒效价。因此，在某些实施方式中，未在要复制病毒如流感病毒的细胞培养基内添加诸如猪胰蛋白酶等外源蛋白酶。在某些实施方式中，不含外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞培养物产生的流感病毒的效价等于或基本等于加入了外源蛋白酶的不表达异源蛋白酶的细胞培养物产生的效价。在其他实施方式中，不含外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞培养物产生的流感病毒的效价大于加入了外源蛋白酶的不表达异源蛋白酶的细胞培养物产生的效价。再在其他实施方式中，表达异源蛋白酶的细胞培养物能够繁殖流感病毒达到商业上合理的效价(〉l(^LogTCID5o/mL)。再在另一个实施方式中，可在要复制病毒如流感病毒的细胞培养基内添加诸如猪胰蛋白酶或SPRT蛋白酶等外源蛋白酶。这样的实施方式可用于，例如，在以低水平如不足以繁殖病毒达到商业上合理效价的水平表达蛋白酶的本发明细胞内培养病毒。这样的实施方式还可用于其中本发明细胞表达通过蛋白水解切割而活化的蛋白酶原的方法。一实施方式中，提供了在培养细胞中产生负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，其中未在细胞培养基内添加诸如胰蛋白酶等外源蛋白酶。在一具体实施方式中，提供了能复制负链RNA病毒使其在细胞群中达到的效价(log,oTCIDM)/mL)为至少约6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8的方法，其中未在该细胞培养基中添加外源蛋白酶。在某些实施方式中，未添加外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(log,oTCID5o/mL)为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具体实施方式中，未添加外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价的log1QTCIDWmL比未加入诸如胰蛋白酶等外源蛋白酶的不表达异源蛋白酶的相应细胞的培养物中产生的流感病毒的效价大至少约0.1、或至少约0.2、或至少约0.3、或至少约0.4、或至少约0.5、或至少约0.6、或至少约0.7、或至少约0.8、或至少约0.9、或至少约l.O、或至少约1.2、或至少约1.4、或至少约1.6、或至少约1.8、或至少约2.0、或至少约2.2、或至少约2.4、或至少约2.6、或至少约2.6、或至少约2.8、或至少约3.0、或至少约3.2、或至少约3.4、或至少约3.6、或至少约3.8、或至少约4.0、或至少约4.2、或至少约4.4、或至少约4.6、或至少约4.8、或至少约5.0。在其他实施方式中，可在细胞培养基中加入的蛋白酶少于否则应在细胞培养基中加入的蛋白酶。因此，在某些实施方式中，提供了在培养细胞中产生负链RNA病毒的感染性病毒颗粒的方法，其中在所提供的细胞培养基中加入了最小量的诸如胰蛋白酶等外源蛋白酶。在一具体实施方式中，提供了能复制负链RNA病毒使其在细胞群中达到的效价(logK)TCID5o/mL)为至少约6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8的方法，其中在该细胞培养基中添加了约0.1ng/ml至约100吗/ml外源蛋白酶。在另一个特定实施方式中，提供了能复制负链RNA病毒使其在细胞群中达到的效价(log,oTCID5o/mL)为至少约6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8的方法，其中在该细胞培养基中添加了约1mU/ml至约5000mU/ml外源蛋白酶。再在另一个实施方式中，已经添加了约0.1ng/ml至约100ng/ml外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(log,oTCID5(/mL)为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具体实施方式中，已经添加了约0.1ng/ml至约10pg/ml外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(log,oTCID5c/mL)为至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一个具体实施方式中，己经添加了约0.1ng/ml至约1.0pg/ml外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(logK)TCID5o/mL)为至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些实施方式中，已经添加了约1mU/ml至约5000mU/ml外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(log,()TCID5()/mL)为至少6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在一具体实施方式中，已经添加了约lmU/ml至约1000mU/ml外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(log,oTCIDWmL)为至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一个具体实施方式中，已经添加了约1mU/ml至约500mU/ml外源蛋白酶的表达异源蛋白酶的细胞的细胞培养物产生的流感病毒的效价(log,oTCID5o/mL)为至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在某些实施方式中，所述病毒效价在孵育细胞约2天至约10天、或者任选约3天至约7天后获得。在一具体实施方式中，所述病毒效价在孵育细胞2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天、或12天、或14天后获得。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约0.1ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约0.1ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约0.5ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约1ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约5ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约10ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约50ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约100ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约250ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约500ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约750ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约1pg/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约5吗/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约10|ig/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约25pg/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约50吗/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约100pg/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约0.01ng/ml至约100pg/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约lng/ml至约100pg/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约10ng/ml至约100吗/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约100ng/ml至约100吗/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约1^g/ml至约100|Lig/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约10吗/ml至约100吗/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约O.Olng/ml至约10吗/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约0.01ng/ml至约lpg/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约O.Olng/ml至约100ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约0.01ng/ml至约10ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约O.Olng/ml至约1ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约0.01ng/ml至约0.1ng/ml。在某些实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度为约1-5000mU/ml，或5-1000mU/ml，或100-500mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约1mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约5mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约10mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约25mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约50mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约100mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约250mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约500mU/ml。一实施方式中，添加到细胞培养基内的外源蛋白酶的终浓度小于约1000mU/ml。当培养的细胞表达蛋白酶原时，在培养基中加入比有效产生流感病毒通常所需的蛋白酶少的蛋白酶的这些实施方式特别有益。在培养基中加入外源蛋白酶可剪切被保护的前肽、将蛋白酶原转化成其活性形式，从而"敏化(prime)"蛋白酶原。之后，活化的蛋白酶可剪切随后由细胞表达的蛋白酶原，从而将这些新产生的蛋白酶原转化成活性蛋白酶。这样的实施方式因此能够大量减少外源添加的蛋白酶如猪胰蛋白酶的用量。因此，在某些实施方式中，在细胞培养物中只添加一次外源蛋白酶。在某些实施方式中，所述外源蛋白酶与用于感染细胞的病毒同时或几乎同时加入细胞培养物。在某些实施方式中，所述外源蛋白酶与用于感染细胞的病毒在同一天加入细胞培养物。在其他实施方式中，所述外源蛋白酶在加入用于感染细胞的病毒之前加入细胞培养物。在某些实施方式中，所述外源蛋白酶与在细胞中引入载体同时或几乎同时加入制造病毒的细胞培养物。在某些实施方式中，所述外源蛋白酶在将载体引入细胞的同一天加入制造病毒的细胞培养物。在其他实施方式中，在加入引入细胞的载体之前将所述外源蛋白酶加入制造病毒的细胞培养物。或者，在某些实施方式中，所述细胞既表达蛋白酶又表达蛋白酶原。在某些这样的实施方式中，可在诱导型启动子控制之下表达所述蛋白酶以允许所述蛋白酶瞬时表达。这样的实施方式允许蛋白酶瞬时表达，从而激活蛋白酶原。之后，活化的蛋白酶原可继续激活随后表达的蛋白酶原。或者，在某些实施方式中，所述细胞可表达两种或多种蛋白酶或蛋白酶原。某些实施方式中，所述两种或多种蛋白酶原可在相同或不同调控系统控制之下表达，如组成型或诱导型表达。对于诱导型表达的实施方式，为每种可诱导表达的蛋白酶或蛋白酶原选择的可诱导系统可相同或不同。在某些实施方式中，在时间上控制细胞培养物中异源蛋白酶的表达是有益的。例如，在规定时间，例如用流感病毒感染细胞培养物后约1、2、3、4或5天时诱导所述蛋白酶表达被证实是有益的。在其他实施方式中，在用流感病毒感染细胞培养物之前诱导所述蛋白酶表达。再在其他实施方式中，与用流感病毒感染细胞培养物同时诱导所述蛋白酶表达。再在另一个实施方式中，在将引入细胞的载体加入制造病毒的细胞培养物之前、同时或之后诱导所述蛋白酶表达。因此，在某些实施方式中，所述异源蛋白酶可受诱导型启动子控制或者受遗传调控元件控制，如上所述。5.7表达蛋白酶或蛋白酶原的宿主细胞中的流感基因组载体除了依赖于用活病毒感染细胞培养物的基于细胞培养物的方法，可用重组DNA技术如质粒拯救在细胞培养物内制造全感染性流感病毒。参见，例如，Neumann等(1999)q//"y7we"z"爿v/rwsc/o"edcD7V/4s.ProcNatlAcadSciUSA96:9345-9350;Fodor等(1999)/^cweq/7"/7wewz"爿vz>w5戶頻rec函6/na"fJ.Virol73:9679-9682;Hoffmann等(2000)AZ)AC4加"^"/o"》rg^erato/7/"y/wewza^Wms1戶owe妙Z//a，油ProcNatlAcadSciUSA97:6108-6113;WO01/83794;Hoffmann禾口Webster(2000)，t/m.Wre"/o"a/iA^4/o(ymera化/-polymerase77,rarac一"cw，femybrAege"era"owo/〖",e"加jv/rwsyhme/g似//fl，油，81:2843-2847;Hoffmann等(2002)，7escweo/z,"//we"zaJv/n^es々om8//flwm/ifc，99(17):11411-11416;美国专利号6,649,372和6,951,754;美国发明者G·坎宝,G·杜克,J·杨,N·哈扎瑞,莫呈钧申请人:米迪缪尼有限公司