用于检测和定量多种亚细胞组分的方法

专利名称：用于检测和定量多种亚细胞组分的方法
用于检测和定量多种亚细胞组分的方法 相关申请的交叉引用本申请要求2005年9月22日提交的美国专利申请号11/233,200的优先 权，美国专利申请号11/233,200是2002年5月17日提交的美国专利申请号 10/130,559的部分连续申请，美国专利申请号10/130,559是1999年11月18 日提交的PCT/US99/27608 (WO 01/37192)的国家阶段的申请，本申请还要求 2004年9月22日提交的美国临时专利申请序列号60/612,067的权益，上述 专利全部的公开内容通过引用以不与本申请公开内容相违背的程度并入本 申请。
背景技术：
本发明涉及一种使用免疫染色和荧光标记原位杂交技术检测和定量细 胞的多种亚细胞组分的方法。具体地说，免疫染色与原位杂交的结合虑及枱r 测细胞的亚细胞组分，如母体血液样品中的胎儿血红蛋白。本方法可用于遗 传病的产前和/或胚胎植入前的诊断。存在许多用于染色和分析细胞及其组分的技术。在诊断遗传病中，能同 时使用许多此类技术对于详细研究样品非常有利。然而，现有技术的联合并 没带来优于单独使用的技术的任何优势。特别另人感兴趣的是，例如，对生 物样品同时应用免疫染色和荧光原位杂交(FISH)分析的能力为同时获得例如 有关同一个细胞具体的蛋白和核酸组分的定量数据提供了潜力。然而，传统 或标准的免疫染色和FISH方法是相互排斥的。成功的FISH分析所要求的苛 刻条件通常与重要的可识别的抗原的保留或者与用于正确检测细胞组分的 稳定的基于抗体的信号持续不相容。因此，在使用基因打靶与可视化和定量 技术诊断遗传病中，需要研发更好的技术。发明内容提供了一种用于制备免疫染色和原位杂交分析的生物样品的单个连续 的方法。在一实施方案中，提供了一种用于鉴定细胞中多种细胞组分的方法，所述方法包括使细胞样品与至少一种抗体反应，其中每一种抗体与具体的细胞组分结 合并产生独特的荧光信号；使用一种或多种核酸探针，通过原位杂交处理细胞；其中，构建与所述 细胞中的目标核酸序列杂交并产生独特的荧光信号的每一种核酸探针，；产生所述反应的和处理的细胞样品的一个或多个图像；以及 检测和分析所述图像中对应于所述抗体和所述核酸探针的荧光信号。


在附图中，其中类似的参考指示表示类似的元素 图1是概括本发明的一实施方案的流程图；图2是用于本发明一方面的一实施方案中的分析体系的结构图； 图3是导致检测第 一信号的阶段I的流程图； 图4A和图4B结合在一起是导致检测第一信号的阶段II的流程图； 图5是检测第二信号的流程图；图6是使用连续涂片技术说明本发明一实施方案的各种装置的示意图；图7是用于本发明一方面的一实施方案中的分析和试剂分散体系的结 构图；图8是表示本发明的一实施方案的略图，其中具有多物镜显微系统； 图9是图像"构成"方法；图IO是本发明的一实施方案校准步骤的流程图；图11是本发明一实施方案预处理步骤的流程图；以及图12A和12B是本发明一实施方案主要处理步骤的流程图；图13是如实施例1中所述的本发明方法制备的细胞的联合的免疫染色 和FISH分析的显微照片，所述联合的免疫染色和FISH分析通过免疫染色 鉴定所述细胞中的胎儿血红蛋白和通过使用FISH鉴定所述细胞中的X和Y 染色体。本发明的详细描述在本文所述的实施方案中，提供了 一种用于检测和定量细胞样品中细胞 的亚细胞组分的方法。所述方法可适用于含有细胞的多种生物样品如血液样 品，特别适用于诊断母体血液中的遗传病。在一实施方案中，所述方法包括从免疫染色的一种或多种抗体产生荧光 信号，所述荧光信号是使用的每一种抗体所特有的，并持续到随后的用于荧 光原位杂交分析(FISH)的细胞样品处理后。在一实施方案中，所述方法包括 选择使用的FISH探针的期望的或独特的焚光团，其允许不连续地清楚呈现 和定量产生的每一个和所有的荧光信号——来自细胞样品的免疫组织化学 和FISH荧光信号。在一实施方案中，提供了 一种操作计算机系统来检测由至少一 目标核酸 定义的遗传病(genetic condition)是否存在于样品中的方法。所述方法包括使 用探针和与样品杂交的探针的数码图像以及计算目标并分析统计期望值，检 测是否存在遗传病。计算可包括例如计算遗传异常(genetic abnormality)被检 测到的次数并将该计数与具体组织类型、细胞类型或样品中异常的统计期望 值比较。计算可包括计算遗传异常发生的次数并将该计数与同一样品中细胞 类型出现的次数或者正常核酸在同 一样品中出现的次数比较。计算可包括计 算多于一种不同的遗传异常在单个细胞中发生的次数。也可用计算机系统鉴 定细胞类型、进行细胞计数、检查细胞形态等，和将这种信息与遗传异常的 计数进行比较或使这种信息与遗传异常的计数相关联。可进行各种诊断分 析。在一实施方案中，提供了 一种操作计算机系统来检测由至少一种目标核酸定义的遗传病是否存在于固定的样品中的方法，所述方法包括接收固定 的样品的数码图像，优选彩色图像，所述样品已在使焚光团标记的探针与目 标核酸特异性地杂交的条件下经历了荧光原位杂交，以及焚光免疫染色以4t 测感兴趣的第一目标；在计算机中处理图像，以分离第一目标，如细胞組分； 测定感兴趣的第一目标，所述目标在具体预定特征中显示了与目标核酸有关 的探针；计算具有探针信号的感兴趣的第一目标；以及相对于统计期望值分 析第一目标例如细胞的计数，以检测是否存在遗传病、这种方法可适用于许 多遗传病，包括其中遗传病是人类21号染色体三体性。除了上述的，可以 理解，统计期望值可基于例如组织类型。计算机可用于鉴定受检测的细胞的 组织类型，^L组织类型也可以是已知的。在一些实施方案中，接收步骤还包括产生红色、绿色和蓝色像素的图像 文件的步骤，所述图像文件代表在接收的彩色图像中在各自的像素位置红 色、绿色和蓝色的强度。在一些实施方案中，处理步骤还包括下列步骤在 背景中手动选择多个像素；测定对应于背景部分的彩色强度值范围；以及将 具有在测定的范围内的彩色强度值的图像的那些区域鉴定为背景。在一些实 施方案中，在测量步骤前，可在计算机中进行处理以过滤彩色图像，以便使 彩色图像中的暗像素的彩色强度值变得较亮，而使彩色图像中的亮像素的彩 色强度值变得较暗。过滤步骤还包括使彩色图像通过孔填充过滤器；使填 充彩色图像通过腐蚀过滤器；在腐蚀填充彩色图像上进行单独的操作，以定 义区域周围的轮廓；通过进行逻辑NOT操作，选择轮廓内的像素；以及在 选择的像素和填充的彩色图像间，进行逻辑AND操作。在一些实施方案中，通过目标核酸与第二核酸的比率，进一步定义遗传 病。因此，所述方法还包括鉴定具有与第二核酸有关的具体预定特征的第二 目标，并计算鉴定的第二目标；其中分析第一目标的计数包括得到第一目标 计数与第二目标计数的比率。在一些实施方案中，目标核酸定义显性的特征， 第二核酸定义相应的隐性特征。根据得到的比率，这些实施方案中的方法可 包括提示遗传病拥有显性特征、拥有隐性特征或拥有显性特征并携带隐性特 征。当目标核酸是第二核酸的重排时，所述方法还包括选择与重排和非重排 核酸之间的断裂区(breakregion)杂交的探针。最后，所述方法可包括提示遗传病具有与所发现的比率有关的严重水平。根据本发明的一实施方案，提供了一种计算机软件产品，其包括计算 机可读存储介质，该介质已在其中固定了一系列计算机指令，所述指令指导 计算机系统计算在用目标特异性荧光团标记的含有细胞的样品中目标物质 的存在，所述指令指导下列步骤接收焚光团标记的样品的数码彩色图像； 获得荧光团标记的样品的彩色图像；在彩色图像中，将感兴趣的目标与背景 分离；测量感兴趣的目标的参数，以便计算具有特异性特征的目标；以及相 对于统计期望计数分析目标的计数，以测定遗传异常。可让指令执行有关上 述方法的所有变化。根据本发明的另 一实施方案，提供了 一种用于分析含有细胞的样品的图 像的装置，所述含有细胞的样品用目标特异性荧光团进行了标记，该装置包 括计算机系统，其执行图像处理软件；以及存储介质，其中固定有一系列 图像处理指令，所述指令包括接收荧光团标记的样品的数码彩色图像，获得 荧光团标记的样品的彩色图像，将彩色图像中感兴趣的目标与背景分离，测 量感兴趣的目标的参数以便计算具有特异性特征的目标，以及相对于统计期 望计数分析目标的计数，以测定遗传异常。再者，可变化计算机指令以执行 上述的所有变化。在又一实施方案中，提供了 一种处理体液或组织样品图像数据的计算机 执行的方法，所述方法包括产生第一图像集的子集，所述第一图像集代表 在第一次放大时拍摄的体液或组织样品的图像，所述子集代表可含有稀有细 胞的候选斑点(candidate blob);产生第二图像数据集的子集，所述第二图像 数据集代表在第二次放大时拍摄的候选斑点的图像，所述第二图像数据集的 子集代表稀有细胞；在计算机内存中存储所述第二数据集的子集；测量感兴 趣的目标的大小和颜色参数，以便鉴定具有与目标核酸有关的具体规定的特 征的目标；计算在测量步骤中鉴定的目标；并相对于统计期望计数分析目标 的计数，以检测是否存在遗传异常。在一实施方案中，提供了一种方法，所述方法包括下述步骤测量，在 计算机中进行处理，以过滤彩色图像以使彩色图像中暗像素的彩色强度值变得较亮，而使彩色图像中亮像素的彩色强度值变得较暗。过滤可包括下述步骤使彩色图像穿过孔填充过滤器；使填充的彩色图像通过腐蚀过滤器；在 腐蚀的填充彩色图像上进行分离操作，以确定区域周围的轮廓；通过进行逻 辑NOT操作，在轮廓内选择像素，以及进行在选择的像素和填充的彩色图 像间进行逻辑AND操作。在一实施方案中，通过使用计算机化的显微视觉系统观察来自体液或组 织样品的单层细胞的光场(optical field),来检测指示存在稀有细胞的信号， 从而产生第一图像数据集的子集。在一实施方案中，所述方法可进一步产生 红色、绿色和蓝色像素的图像文件，所述图像文件代表在收到的彩色图像中 各自像素位置的红色、绿色和蓝色强度。根据本发明的某些方面，所述处理 还包括在背景中手动选择多个像素；测定对应于背景部分的彩色强度值的范 围；以及将具有在测定的范围内的彩色强度值的图像的那些区域鉴定为背 景。在一实施方案中，可测量信号，以确定其是否是有意义的信号水平。可 将第 一 和/或第二图像数据的子集转化成更适于通过本文中所述的计算机控 制和处理的表征。图像数据从例如Red Green Blue (RGB)信号转化成色调发 光々包和度(Hue Luminescence Saturation, HLS)信号。利用过滤器和/或遮光 板(mask)区分满足预选择标准的那些细胞并除去不满足预选择标准的那些 细胞，因此鉴定例如稀有细胞。在本发明的另一实施方案中，提供了 一种操作实验室服务(laboratory service)的方法，所述方法包括接收体液或组织才羊品，制备体液或组织才羊 品涂片，在涂片中用荧光免疫染色对感兴趣的目标免疫染色；用设计为与具 有诊断意义的核酸序列杂交的荧光探针处理涂片；操作计算机化的显微镜以 便软件程序基于通过免疫染色和核酸探针产生的焚光信号自动鉴定带有具 有诊断意义的杂交核酸序列的感兴趣的目标。在本发明的又一实施方案中，提供了计算机软件产品，其包括计算机可 读存储介质，所述介质已在其中固定了一系列指令，所述指令当通过计算机 执行时，指导进行检测感兴趣的目标的步骤，所述感兴趣的目标带有具有诊 断意义的核酸序列。所述步骤包括产生第一图像数据集的子集，所述第一 图像数据集代表在第一次放大时拍摄的体液或组织样品的图像，所述子集代 表可含有感兴趣的目标如细胞或稀有细胞(在10,000个细胞中少于1个细胞)的候选斑点；产生第二图像数据集的子集，所迷第二图像数据集代表在第二 次放大时拍摄的候选斑点的图像，所述第二数据集的子集代表感兴趣的目标；在计算机内存中存储第二数据集的子集；测量与针对具有诊断意义的核 酸序列(与感兴趣的目标有关)的荧光核酸探针有关的焚光，以鉴定具有与 目标核酸有关的预定特征的目标；计算在测量步骤中鉴定的目标；以及相对 于统计上期望的计数分析目标的计数，以检测是否存在遗传异常。根据本发明的 一 实施方案，提供了 一种制备用于诊断过程的细胞样品的 方法。获得细胞样品并将其作为单层固定于基质(substrate)上，细胞样品包 括稀有细胞，其以每10,000个细胞中不多于一个细胞的量(即不多于0.01%) 存在于样品中。用针对稀有细胞的荧光免疫染色将单层进行免疫染色，随后有细胞和感兴趣的核酸序列存在的焚光信号，使用计算机化的显微视觉系 统，观察涵盖了至少一部分细胞样品的光场。检测每一个信号，并且确定其 中信号得以检测的坐标(coordinates)，供用于诊断过程。稀有细胞的计数可 用于^f故出诊断，所述稀有细胞显示了与疾病状态或异常有关的核酸序列。通 过计算机化的显微系统，可自动做出试验性诊断。在一实施方案中，稀有细 胞以不多于细胞的0.001%而存在。在其他的实施方案中，稀有细月包以不多 于0.0001%、 0.00001%或甚至0.000001%而存在。在本发明的另一个实施方案中，待检测的稀有细胞类型是可见于来自动 物或患者的细胞或组织样品中的癌细胞。样品可以是血液或含有细胞的其他体液或组织活一企。作为该实施方案的说明，描述于下文第5部分的癌细胞标 记，如GM4蛋白，端粒末端转移酶蛋白或核酸，以及p53蛋白或核酸，可 用于以通过本发明的具体应用测定的方式产生第一或第二信号。在本发明的一实施方案中，当稀有细胞类型存在于样品中时，本发明的 方法以不少于80%的频率检测稀有细胞类型。在其他的实施方案中，检测频 率不少于85%、 90°/。、 95%和99%。根据本发明的一实施方案，提供了 一种制备用于诊断过程的血液样品的 方法，所述方法包括制备含有天然存在浓度的胎儿细胞的未富集的母体血 液样品的涂片；用针对所述胎儿细胞的焚光免疫染色处理所述涂片；用针对感兴趣的核酸序列的荧光核酸探针处理所述涂片；对于指示胎儿细胞存在的荧光信号，使用计算机化的显微视觉系统观察涵盖一部分涂片的光场；以及 以来自所述核酸探针的荧光信号的方式，鉴定具有感兴趣的核酸序列的胎儿细月包。在一实施方案中，进一步处理信号，以表示稀有细胞的形态尺寸。在另 一个实施方案中，用标记处理细胞，以提高稀有细胞与其他细胞的光学差别。 在该实施方案中，信号可例如来自选择性地与稀有细胞结合的标记。在另一 实施方案中，诊断过程包括移向确定的坐标，并放大光场直到图像是分离的 稀有细胞。在某些实施方案中，将光场跨越一系列部分细胞，所述一系列部分细胞 基本上涵盖了所有细胞。这是可以通过例如在计算机化的显微视觉系统的控 制下相对于计算机化的显微视觉系统的镜头移动细胞而实现。在另一实施方 案中，确定第一信号获得处的坐标，随后在坐标确定后，接触特别是在这些 坐标处的稀有细胞。在某些实施方案中，诊断信号可用于鉴定稀有细胞。在其他的实施方案 中，定位信号(locating signal)可用于鉴定稀有细胞，并在细胞定位后，获得诊断信号。在一实施方案中，所述稀有细胞以每10,000个细胞中不多于一个细胞 (即不多于细胞的0.01%)而存在于样品中。在其他的实施方案中，所述稀有 细胞以不多于0.001%、 0.00001%或甚至0.000001%而存在。在一特别重要的实施方案中，所述稀有细胞是来自母体血液的细胞样品中的胎儿细胞。优 选地，所述样品含有4又天然存在浓度的胎儿细胞，所述胎儿细胞可不多于0.001%、 0.0001%、 0.00001%、 0.000001%或甚至0.0000001%。在任何前述的实施方案中，可在例如显微玻片上制备细胞，或基质可具 有针对基质校对的坐标体系，以便将在一步骤中鉴定的稀有细胞的坐标返回至稍后的另一步骤。同样，实施方案中的所述基质具有其宽度IO倍的长度， 所述基质在一方向上被显著拉长。长度可以甚至是宽度的20倍。所述基质 可以是柔性薄膜(flexiblefilm),并且在一重要的实施方案中，是拉长的柔性 薄膜，其可携带较大量的细胞。如从较大量的涂片的母体血液提供的。在任何上述实施方案中，可选择来自免疫染色的焚光信号和来自核酸探针的焚光 信号，借此，当两者同时存在时，它们不彼此掩盖。根据实施方案，此类方法可使用未富集或富集的样品，如含有天然存在 的胎儿细力包的母体血液。通过阅读本发明的下列详细描述和各种示例性实施方案的描述，结合附 图，可更好地理解本发明。尽管相对于作为体液或组织样品的胎儿细胞、稀 有细胞类型和血液，详细描述解释了本发明，但对于本领域技术人员显而易 见的是，本发明可应用于并且实际上包括基于任何细胞类型和任何体液或组 织样品的诊断，特别是在基质上将样品保存为单层细胞的情况。在本发明范围内的体液和组织样品包括但不限于血液、组织活^r、脊髓 液(spinal fluid)、月卤脊液(meningeal fluid)、尿液、月申》、包液(alveolar fluid)等。只于 于细胞不以单层形式天然存在的那些组织样品，可通过本领域技术人员已知 的标准技术来分离细胞。这些技术包括但不限于组织的胰蛋白酶、胶原酶、 或分散酶处理。在一实施方案中，本发明用于检测和诊断胎儿细胞。在示例性的实施方 案中可用荧光免疫显示细胞身份。例如，免疫染色可以是结合于针对例如血红蛋白s-链(即胎儿血红蛋白)的荧光染料。另外，用细胞识别算法辨别的 每一细胞对有核红细胞的特征形态相似性的度量可用于确定细胞身份。诊断可以基于核酸探针信号(或基于免疫染色信号和核酸探针信号的联合)。在一示例性的实施方案中，FISH包括将稀有细胞类型如胎儿细胞的变 性的试验DNA与变性的dioxygenin(DIG)标记的基因组探针杂交。洗涤含有 试验DNA的样品并允许其结合与焚光团偶联的抗-DIG抗体。任选地，通过 用荧光团偶联的抗-Fab抗体温育，加入第二层荧光团(例如FITC)。在一实施 方案中，FISH包括将稀有细胞的变性的DNA与含有DNA序列的荧光标记 的探针杂交，所述DNA序列与用特殊的焚光团直接标记的具体的目标DNA 区同源。通过在光场中从其他目标和背景中区分感兴趣的目标的装置和方法，可进行自动化的样品分析。自动化系统的实例公开于1994年IO月4日授予的 美国专利号5,352,613中。另外， 一旦目标得以鉴定，可测量和存储颜色或 与所述目标有关的其他感兴趣的参数，所述颜色即包含目标的像素的红色、 绿色和蓝色组分的组合。可按如下进行遗传病的自动化的样品分析和诊断(i)接收固定的样品的 数码彩色图像，所述固定的样品在使荧光标记的探针与目标核酸特异性地杂 交的条件下经历了荧光原位杂交；(ii)在计算机中处理彩色图像，以在彩色 图像中将感兴趣的目标与背景分离；(iii)测量感兴趣的目标的参数，鉴定具 有具体特征的目标；(iv)计算鉴定的目标；以及(v)相对于统计上的期望计数， 分析目标的计数，以测定遗传病。所述方法可用于诊断与染色体数目和/或 重排畸变有关的遗传病。因此，例如，通过使用标记探针的组合，本发明可 用于检测染色体重排，所述标记的探针检测重排的染色体片段和所述片段移 入的染色体。更普遍地，除了三体性，使用本发明的这一方面的方法结合正 确选择的荧光探针，可检测包括移位、缺失和插入的基因扩增和重排。如本文中所用的，"遗传异常"指相对于从健康受试者(即具有正常染色 体組的个体)获得的染色体的对应数目和/或重排，在一条或多条染色体的数 目和/或重排中的畸变。遗传异常包括，例如染色体的增加、缺失、扩增、 移位和重排，其特征是通常少至约15个碱基对和大至完整的染色体的核苷 酸序列。遗传异常也包括点突变。所述方法可用于测定固定的样品中一个或多个遗传异常，所述固定的样 品即附着于固体载体的样品，所述附着于固体载体的样品优选以保存样品中 含有的细胞组分和亚细胞组分的结构完整性的方式进行处理。将含有样品的 细胞固定于固体载体如玻璃玻片的方法对本领域普通技术人员而言是熟知 的。样品可含有至少一种目标核酸，其分布指示遗传异常。对于"分布"，其 意味着在已知包括目标核酸的一种或多种核酸(如染色体)中，目标核酸的存 在、缺失、相对量和/或相对位置。在一实施方案中，目标核酸指示21号染 色体三体性，并且因此，所述方法可用于诊断唐氏综合症(Down，s Syndrome)。在一实施方案中，用于唐氏综合症分析的样品来自母体的外周血。更具体地说，根据标准的方法，细胞分离自外周血，根据标准的方法(参阅例如实施 例)，将所述细胞附着于固体载体，以便允许检测目标核酸。荧光原位杂交指核酸杂交技术，其使用荧光团标记的探针特异性地与目 标核酸杂交，并因此促进目标核酸的可视化。此类方法对本领域的普通技术人员而言是熟知的，并公开于例如美国专利号5,225,326、美国专利申请序 列号07/668,751、 PCT WO 94/02646中，其全部内容通过引用并入本申请。 通常，原位杂交可用于测定在含有核酸的样品中核酸的分布，如以单个细胞 水平包含于组织中。此类技术已用于核型分析应用(karyotyping application) 以及用于检测包含于细胞中的具体基因的存在、缺乏和/或排列。然而，对 于核型分析，通常允许样品中的细胞增殖直到中期(或分裂间期)，以便在 将细胞附着于固体载体进行原位杂交反应之前，获得"中期散布(metaphase spread)"。简单而言，荧光原位杂交包括把样品固定于固体载体上，并通过使样品 和至少含有沉淀剂和/或交联剂的培养基接触，保持含于样品中的组分的结 构完整性。用于"固定"样品的实例性的介质描述于实施例中。可选的固定剂 对本领域的普通技术人员而言是熟知的，并描述于例如上文提到的专利和/ 或专利申请中。可通过将目标核酸变性以便其能与包含于杂交溶液中的互补探针杂交， 来进行原位杂交。可将固定的样品同时或顺序地与变性剂和杂交溶液接触。 因此，在一实施方案中，将固定的样品与含有变性剂和至少一种寡核苷酸探 针的杂交;容液接触。所述探针具有至少基本上与目标核酸的核苷酸序列互补 的核苷酸序列。杂交溶液可任选地含有 一 种或多种杂交稳定剂(hybrid stabilizing agent)、緩沖剂(buffering agent)和选才奪性的膜孑L形成剂(selective membrane pore-forming agent)。优化实现具体的探针与具体的目标核酸杂交 的杂交条件在本领域普通技术人员的水平内。对于探针，术语"基本上互补"指足以实现本发明的目的的互补性的量， 即在用于实施本发明的杂交条件下，其足以允许探针与核酸目标杂交而不允 许探针与非目标核酸序列结合。此类条件对原位杂交领域的普通技术人员而言是已知的。本发明可用的遗传异常包括下述那些即对于它们而言，相对于从具有正常的染色体组的个体获得的染色体，在一条或多条染色体的数目和/或排列中存在畸变。可通过本发明检测的示例性的染色体包括人类X染色体、Y 染色体和13、 18和21号染色体。例如，靶核酸可为完整的染色体，如21 号染色体，其中所述染色体三个拷贝的存在(目标核酸的"分布")指示遗传异 常(唐氏综合症)。可用于与目标核酸(如染色体)特异性杂交的示例性探针 是可定位于对遗传异常具有诊断价值的染色体的探针。参阅例如Harrison's Principles oflnternal Medicine,第12版，编辑Wilson等，McGraw Hill, N. Y.， N. Y. (1991)。通过检测胎儿细胞中的21号染色体三体性(下文讨论)，本发明的一实施 方案是针对唐氏综合症的产前诊断，所述胎儿细胞存在于例如母体外周血、 胎盘组织、绒毛(chorionic villi)、羊水(amniotic fluid)和胚胎组织中。然而， 本发明的方法并不限于分析胎儿细胞。因此，例如，含有目标核酸的细胞可 以是真核细胞(如人类细胞，包括来自血液、皮肤、肺的细胞，以及包括正 常来源和肿瘤来源的细胞)；原核细胞(如细菌)和植物细胞。根据一实施方案， 本发明可用于区分各种病毒毒抹。根据该实施方案，目标核酸可以是非包膜 病毒或包膜病毒(具有非包膜的膜，如脂质蛋白膜)。参阅例如Asgai,如上。 可通过本发明检测的示例性的病毒包括人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒和疱渗 病毒。根据标准的实践，可用荧光团(荧光"标签"或"标记")标记寡核苦酸探针。 可将荧光团直接连接于探针(即共价键)或者间接连接于探针(例如可将生 物素连接于探针，而荧光团可共价连接于亲和素；生物素标记的探针和荧光 团标记的亲和素可形成复合物，其可在本发明的方法中作为荧光团标记的探 针起作用)。可根据本发明的方法和装置使用的荧光团对本领域普通技术人员而言 是熟知的。这些荧光团包括4,6-二脒基-2苯基吲哚，DIPA)、异硫氰酸荧光素 (FITC)和若丹明。参阅例如实施例。对于可根据本发明的方法使用的一系列 示例性焚光团，也可参阅1983年2月5日授权于Gribnau等的美国专利号 4,373,932，其内容通过引用并入本申请。具有彼此不同的激发和发射波镨的荧光团的存在，允许在单一固定的样品中同时可视化多于一个目标核酸。如 下文所讨论的，示例性的荧光团对可用于同时可视化同 一个固定的样品中的 两种不同的核酸目标。目标核酸的分布指示遗传异常。参阅例如Asgari,如上。可检测的遗传 异常包括突变、缺失、增加、扩增、移位和重排。例如，通过检测光场中焚 光信号的缺失，鉴定缺失。为了检测基因序列的缺失，制备一组探针，其与 目标核酸互补，所述目标核酸存在于正常的细胞，但不存在于异常的细胞。 如果所述探针与固定的样品中的核酸杂交，那么将检测到序列，相对于该序 列，将细胞定义为正常的。然而，如果所述探针不与固定的样品杂交，将不 会检测到信号，相对于该序列，将细胞定义为异常的。根据本领域普通技术 人员已知的标准实践，在原位杂交反应中包括适当的对照。可通过例如检测荧光团标记的探针与染色体多核苷酸重复片段(目标核 酸)的结合，来鉴定与目标核酸增加有关的遗传异常。为了检测基因序列(如 21号染色体三体性)的增加，制备一组与目标核酸互补的探针。标记的探针 与含有三个拷贝21号染色体的固定细胞的杂交，如实施例中所讨论的。通过选择探针并进行上述方法，可鉴定扩增、突变、移位和重排，所述 探针可与正常序列和疑有扩增、突变、移位或重排的序列之间的核酸目标中 的断裂点特异性地结合。以这种方式，可将菱光信号归功于目标核酸，而所 述目标核酸反过来可用于指示受试验的样品中遗传异常的存在或缺乏。所述 ，探针可具有与5夸越正常个体而非异常个体的DNA断裂点的核酸序列互补的 序列。用于检测遗传异常的探针对本领域普通的技术人员而言是熟知的。可利用的计算机控制系统的实施方案的创新特色是一 列具有相同光学 特征的两个或多个物镜。将所述物镜排列成一排，每一个物镜具有自身的Z 轴运动机制，以便可将它们单独聚焦。这种系统可装备适宜的机械装置，使 得可交换多个物镜座(objective holder),以适合普通单镜头显微镜可覆盖的同 样的多种放大需求。可将每一个物4竟连接于其自身的CCD照相机。每一个照相才几可连接于 图像获得装置。对于每一个获得的光场，计算机可在显微镜的样品上纪录其 物理位置。这可通过使用计算机控制的x-y机械镜台实现。通过照相机提供的图像是数码的并且存储于主机的内存中。计算机可追踪所用的物镜阵列的特征，以及机动化的镜台的位置。每一个图像的存储特征可用于匹配在实际的拼缀图(patchwork)的正确位置中 的图像，所述拼缀图即在计算机内存中"组成"的图像。主^L系统可由软件系统来驱动，所述软件系统通过适宜的装置驱动程序 控制系统的所有机械组分。所述软件可含有图像构成算法，其在计算机内存 中组成了数码图像，并为进行进一步的算法提供了组成的图像。通过图像分 解、合成和图像处理，可检测具体样品的特殊的具体特征。在一实施方案中，同时检测免疫染色信号和探针信号两者。可分开处理 信号(同时也分开处理来自免疫染色和探针的不同荧光团的信号)。在一实施 方案中，在单独的一組坐标免疫染色和探针信号两者同时存在或甚至来自两 种组分相互作用(如通过配偶体信号的信号抑制)的单一信号，可用于诊断 目的。通常，用于产生免疫染色信号的材料和技术不应当不利地干扰用于产生 第二探针的材料和技术(至不可接受地影响诊断的程度)，反之亦然。免疫染色或探针也不应当将即将测量的细胞特征破坏或改变到不可接受地影响诊断的程度。最后，任何其他期望的或要求的对细胞的处理，通常不应该将用 于产生第一和第二信号的材料或技术，干扰到不可接受地影响诊断的程度。在本发明的一实施方案中，当将要检测稀有细胞类型时，本发明的方法 以不少于80%的频率检测稀有细胞类型。在其他的实施方案中，检测频率不 小于85%、 90%、 95%和99%。尽管对于可同时检测的突变的数量，标记单个等位基因的单个荧光团可 产生上限，但使用组合化学可用于许多可同时标记和检测的等位基因具体突 变的数量。落于本发明范围内的染色体异常包括但不限于21号染色体三体 性、18号染色体三体性和13号染色体三体性和性染色畸变，如XXX、XXY、 XYY。使用组合化学(combinatorial chemistry),本发明的方法可用于it断大 量的重排，包括在遗传病和癌症中观察到的移位。落于本发明范围内的孟德 尔病(Mendelian disorders)包括但不限于嚢性纤维化(cystic fibrosis),血色素沉 着症(hemochromatosis)、 高月旨血症(hyperlipidemias)、 马凡氏纟宗合症(MarfanSyndrome)和结締组织的其他遗传病、血红蛋白病(hemoglobinopathies)、泰萨 二氏症(Tay- Sachs syndrome)或已知突变的任何其他疾病。组合化学燃料的 使用虑及同时标记和检测多个等位基因，因此使确定普通疾病如译喘的遗传 因素和/或对癌症如前列腺癌、乳房癌、结肠癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等 具有特异性的几种分子标记的存在成为可能。本发明的一种用途是在癌症领域。针对非癌细胞背景，从形态上可识别 具体类型的癌细胞。因此可将癌细胞的形态学用作第一信号。热休克蛋白也 是在大多数恶性癌症中表达的标记。对热休克蛋白具有特异性的标记的抗 体，如荧光标签抗体，可用于产生第一信号。同样，存在对具体的癌症或具 体的组织具有特异性的抗原，如前列腺特异性抗原，对癌症或组织抗原如前 列腺特异性抗原具有特异性的抗体可用于产生此类癌细胞的第一信号。因此，根据本发明，可鉴定和表征其他细胞背景中的稀有癌细胞。特征 描述可包括证实存在癌细胞的诊断、测定癌症类型、通过测定存在与癌症风 险有关的遗传变化的标记来测定癌症风险等。遗传变化的标记使评估癌症风险成为可能。它们提供了有关暴露于致癌 剂下的信息。它们可检测由暴露于致癌剂下引起的早期变化，并鉴定具有特 别高的癌症发展风险的个体。此类标记包括膀胱癌中9号染色体上的LOH, 和在结肠直肠癌中4企测的chromosomelp缺失以及7、 17和18号染色体的增 加/失去。肺癌的发展要求多个基因变化。癌基因的激活包括K-ras和myc。肿瘤 抑制基因的失活包括Rb、 p53和CDKN2。经历变化的具体基因的鉴定可用 于对一定会变成恶性的细胞进行检测，并允许鉴定药物和基于基因的治疗的 潜在目标。在测定三体性中，本发明虑及测定三体性在单个细胞中的存在，和/或 测定一组细胞中具有三体性的单个细胞的频率(其可在不知道那一个细胞是 三体性的情况下实现，即计算的细胞的总数和计算的染色体的总数)。随后， 可评估三体性的存在或与三体性有关的疾病的风险。承认信号可计算并可与其他信息(如其他的信号计数，有关不同组织类 型的推测的信号频率的统计信息)比较以便产生相关的诊断信息是重要的。结合鉴定信号对，对本发明做了描述，其中一个信号鉴定目标稀有细胞 如胎儿细胞，另一个信号用于评估细胞如具有遗传缺陷的胎儿细胞的状态。 应理解，根据本发明的某些实施方案，只需要检测单个的信号。例如，对于 胎儿细胞携带Y染色体以及对于异常的诊断是在Y染色体上的情况，那么 鉴定遗传异常的信号可以与鉴定胎儿细胞的信号相同。作为另一个实施例， 在所观察的特征是隐性特征的情况下，可使用单独的信号。信号对也可用于 检测两个等位基因的存在或疾病的存在，所述疾病是通过不同基因中两种或 更多种突变的存在而诊断的。在这些情况下，信号对(或甚至几个信号)可鉴 定表型和具有所述表型的细胞两者。此类实施方案对于本领域普通技术人员 而言是显而易见的。
具体实施方式
实施例1下列方法使用免疫染色技术分析存在含有胎儿血红蛋白的细胞的血液样品，并通过荧光标记原位杂交技术测定相同的细胞中X和Y染色体的存 在。在磷酸緩沖盐溶液中漂洗并在溶于磷酸緩冲盐溶液的2%曱醛中进一步固 定。随后顺序在磷酸緩沖盐溶液、继之含有Tween 20的pH 7.6的Tris緩 冲盐溶液中漂洗细胞。除去多余的液体后，加入封闭剂，并将玻片在湿润的 小室中温育。除去封闭溶液后，加入于封闭剂中的初级抗体(primary antibody) 稀释液，并将细胞在湿润的小室中温育30-120分钟。随后除去抗体溶液， 并将细胞在含有Tween 20的pH 7.6的Tris缓沖盐溶液中漂洗几次。除去 多余的液体，加入于封闭剂中抗小鼠第二抗体的稀释液，并将细胞在湿润的 小室中温育30-120分钟。随后除去抗体溶液，再将细胞在含有Tween 20 的pH7.6的Tris緩沖盐溶液中漂洗几次。除去多余的液体后，加入于碱性 磷酸緩冲盐溶液中的HNPP/FastRed燃料的新鲜的过滤的溶液，并将细胞样 品温育10分钟。除去染色的溶液，并将细胞在含有Tween 20的pH7.6的 Tris緩冲盐溶液中漂洗，随后用于含有Tween 20的pH 7.6的Tris緩冲盐溶液中的DAPI的溶液漂洗。将细胞在含有Tween 20的pH 7.6的Tris緩 冲盐溶液中漂洗两次，随后在标准的柠檬酸盐溶液中漂洗，除去多余的液体， 并将细胞空气干燥。随后将细胞在37 。C预热的0.005%胃蛋白酶中温育5分 钟。随后将细胞在50 mM MgCl2的磷酸缓沖盐溶液中洗涤5分钟，随后在 磷酸緩沖盐溶液中洗涤两次，除去多余的液体，并将细胞干燥。随后加入杂 交中的荧光标记的FISH探针(如DNA和/或RNA )溶液，将含有细胞的玻 片上部加上盖玻片，随后将细胞在74 。C温育2.5分钟，随后在37。C，于湿 润的小室中温育4-16小时。除去盖玻片，将细胞在室温下0.4x的标准柠檬 酸盐溶液中洗涤2分钟。除去多余的液体，并将细胞空气干燥和固定，用于 显微镜观察和分析。实施例2装置图1的结构图显示适于体现本发明这一方面的实施方案系统的基本元 件。此类系统的基本元件包括X-Y镜台201、汞光源(mercury light source) 203、装配有才几动化物镜转动架(换镜旋座)207的荧光显微镜205、彩色CCD 照相机209、个人计算机(PC)系统和一个或多个监控器213、 215。作为标准组件，所述系统的各元件可以定制或购买的成品。每一个元件 将得以更详细地描述。X-Y镜台201可以是适用于所选择的显微镜205的任何机动化的位置镜 台。优选，X-Y镜台可以是机动化的镜台，其可连接于个人计算机并使用特 定的编辑软件命令进行电子控制。当使用此类电子控制的X-Y镜台201时， 插入PC 211扩充总线(expansion bus)的"镜台控制电路"卡将镜台201与PC 211连接。镜台201还应该能手动驱动。电子控制的镜台如在此所描述的， 是由显微镜制造商生产的，例如包括Olympus (日本东京)，以及其他的制造 商如LUDL (美国纽约)。显微镜205可以是例如装配有反射光荧光照明装置203和具有20 x和油 浸的60x或63x物镜的机动化物镜转动架207的任何荧光显微镜，提供了600x的最大放大率。机动化的换镜旋座207优选连接于PC211以及在使用 特定的编辑软件命令连续放大之间进行电子开启。当使用此类电子控制的机 动化的换镜旋座207时，插入PC 211扩充总线的换镜旋座控制电路卡将镜 台201与PC211连接起来。装配显微镜205和镜台201，以包括汞光源203， 其能提供全部光场的 一致和基本上均匀的照明。显微镜205产生由照相机209观察的图像。照相机209可以是所连接的 任何彩色3芯片CCD照相机或其他的照相，以提供电子输出和提供高敏感 性和分辨率。将照相机209的输出供给安装在PC 211的帧抓取器(frame grabber)和图像处理电路板。所发现的适合的照相机是SONY 930 (SONY,日 本)。可结合本发明使用各种帧抓取器系统。帧抓取器可以是例如线路板的 MATROX IM-CLD (彩色图像捕获模块)和MATROXIM-640 (图像处理模块) 的装置的组合，其可从MATROX (加拿大蒙特利尔)获得。板上硬件上的 MATROX IM-640的模块特征支持图像处理能力。这些能力compliment 了 MATROX IMAGINGLIBRARY(MIL)软件包的能力。因此，其提供了对基于 MIL的软件算法非常快的执行。MATROX板支持对于专用的SVGA监控器 的显示。除了通常与PC系统211 —起使用的监控器外，还提供专用监控器。 可使用适宜与MATROX图^f象处理电路板一起使用的任何SVGA监控器。可 与本发明结合使用的专用监控器是ViewSonic 4E (Walnut Creek, CA) SVGA 监控器。为了具有可利用的足够的处理和存储能力，PC 211可以是至少具 有32 MB RAM和至少2GB的硬盘驱动存储空间的任何基于INTEL PENTIUM的PC。 PC211优选还包括监控器。除了在此描述的具体特征外， PC211是常规的，并且包括键盘、打印机或其他期望的未显示的外围设备。使用MATROX IMAGING LIBRARY (MIL), PC211可执行MICROSOFT0++中编辑的涂片分析软件程序。MIL是功能软件库(software library),包括 控制帧抓取器211运转的那些软件，以及处理由帧抓取器211捕获的用于随 后作为^^盘文件图像存储于PC 211的那些软件。MIL含有许多专门的图像 处理程序，特别适宜进行此类图像处理任务，如过滤、目标选择和各种测量 功能。涂片分析软件程序可作为WINDOWS 95应用程序运行。程序提示(program prompt)和测量结果显示于计算机监控器213上，而需要通过成像硬 件211的图像显示于专用成像监控器215上。为了使用涂片分析程序处理显微图像，首先校准系统。校准补偿操作中 的每天变化以及从一个显微镜、照相机等到另一个显微镜、照相机等的变化。 在这个阶段中，观察校准图像并设置下列校准参数系统的颜色反应；在含有待扫描的胎儿细胞的涂片的玻片上，区域的尺寸或范围；当使用20x和60x(或63x)的放大率时，光场的实际尺寸；以及当使用20x和60x(或63x)的放大率时，最大和最小的胎儿细胞核区域。检测目标识别信号可在两个阶段运行检测算法。第一阶段可是预扫描阶段I,在图2的实 施方案流程图中描述，其中使用低放大率和高速度鉴定可能的胎儿细胞位 置。例如可选择20x的物镜，并开始寻找胎儿细胞程序将自动化镜台(图2， 201)移动至起始点，如含有涂片的玻片的一个 角(步骤301)。在预设置起始点的镜台x-y位置是记录(步骤303)的光场。使用CCD照相机209获得光场(步骤305)，并将其转移至PC211，作为 RGB (红色/绿色/蓝色，Red/Green/Blue)图像。将RGB图像(步骤 307)转化成ILLS(色调/亮度/饱和度， Hue/Luminance/Satumtion)图像。将色调分量二元量化(步骤309)为黑色和白色图像，以便将具有在 190-255之间的色调值的像素设置为0 (黑色)，代表有意义的区域(斑点)， 而每一个其他的像素值设置为255(白色，背景)，斑点代表可能的胎儿细胞 核区域。测量二元量化的图像中每一个斑点的区域。如果以20x的放大率，其大 小上在约20-200像素范围外，将斑点的像素设置为值255(背景)；将其从进 一步处理中排除(步骤311、 313、 315和317)。随后，使用定做的MATROX功能，计算每一个斑点重心(center of gravity, CG)的坐标(步骤319)。斑点的重心是这样一个点，即在该点上，从斑点形状 材料的薄的均匀密度片中的切割(cut-out)平衡。沿着当前光场的z-y位置将 这些坐标存储于数据库中，因此，使用较高的放大率可将斑点再定位于下一 个处理阶段。类似地，处理其他的光场，记录每一个随后光场的x-y位置，直到涵盖 整个玻片(步骤321和323)。阶段II，在图3A和3B实施方案流程图中描述，包括最终胎儿细胞的识 别过程选择63x的放大率(步骤401)。程序移动自动化的镜台(图2, 201)，以便早期发现的CG的第一位置的 坐标(其是可能的胎儿细胞核区域)，处于光场的中心(步骤403 )。使用CCD照相机(图2， 209)，获得光场，并将其转移至计算机作为RGB 图像(步骤405)。将RGB图像转化成HLS模式(步骤407)。程序随后通过计算像素的数量，产生亮度柱状图(步骤409)，其亮度值 等于亮度的每一个可能的值。将计数存储为长度256的阵列，其含有将每一 个指标对应于阵列的灰度值。程序接下来分析亮度值分布曲线(步骤411)，如通过存储于阵列中的值 所表示的，并且定位最后的峰。已发现该峰包括表示图像中的血浆区域的像 素值。分析亮度分布曲线的功能计算使曲线光滑的9点移动平均值；计算 通过10点灰度值距离定义的线的正切；计算这些线的坡度(以度表示)； 找到其中曲线具有0坡度的连续的点，并且如果它们表示最小值(曲线中的 谷)，将这些点(灰度)设置为-l,如果它们表示最大值(曲线中的峰)，则将这 些点(灰度)设置为1;随后通过在灰度值阵列中找到1或-1的位置，找到曲 线中峰或谷的位置。程序随后将位于亮度分布的谷中的像素的灰度值设置为截止值(cut-off value),其在分布的最后峰之前出现(步骤413)。使用这种截止值，程序随后产生(步骤415)第二个二元量化图像。这是 一个黑白图，其中将对应于具有低于切割点的灰度值的亮度图像中的像素的像素设置为255 (白色)，以及将对应于具有高于切割点的灰度值的亮度图像 中的像素的像素设置为O(黑色)。将这种图像的白色斑点处理为细胞，而黑 色区域则处理为非细胞区域。将关闭过滤器(closing filter)应用于第二次二元量化的图像(步骤417); 以这种方式，将孔即白色区域内的黑点关闭。现在程序测量细胞的区域。如果任何细胞的区域小于200像素，那么排 除这些细胞，即将由这些细胞组成的像素设置为像素值255(黑色)(步骤 419)。将发现于MIL的孔填充函数应用于剩余的斑点(步骤412)。处理后，所得的二元量化的图像是掩体(mask)，其白色区域仅表示细胞。现在基于HLS图像的饱和度分量，区分红细胞和白细胞。所述掩体用 于将处理限制于仅仅细胞区域。程序现在计算像素的数量，其饱和度值是饱和度的每一个可能的值。将 计数存储为长度256的阵列，其含有具有将每一个指标对应于阵列的灰度值 的像素计数(步骤4")。程序现在分析(步骤425)如通过存储于阵列中的值所表示的饱和度分 布曲线，以及定位第一个峰。这个峰包括表示包含于白细胞中的区域的像素值。将与峰后的第 一个最小值(谷)一致的灰度值设置为截止点(cut-off point) (步骤427)。使用这个截止断值，程序产生(步骤429)第三个二元量化图像。将对应 于具有高于截止点的灰度值的饱和度图像中的像素的像素设置为255(白色)。它们组成红细胞区域。将对应于具有低于截止点的灰度值的饱和度图 像中的像素的像素设置为O(黑色)。这种第三次二元量化的图像的白色斑点 是属于红细胞的区域的种子。将关闭过滤器应用于(步骤431)第三次二元量化的图像，以这种方式，将孔即白色区域的黑点关闭。将发现于MIL的孔填充函数应用于剩余的斑点(步骤433)。处理后，所得的二元量化的图像是新的掩体，其仅含有白细胞。现在将MIL的抹去边界斑点函数应用于(步骤435)剩余的斑点，除去包 括与图像区域边界一致的像素的那些斑点。此类斑点不能包括于进一步的处 理中，因为当其与图像区域的边界一致时，不知道丢失了多少细胞。将腐蚀过滤器应用于这种掩体6次；由此，将任何连接的斑点(白细胞 种子)分开(步骤437)。应用14次"厚"过滤器(步骤439)。"厚"过滤器等同稀释过滤器。也就 是说，通过在斑点的外围连续地加入一排像素，其增加了斑点的大小。如果 生长的斑点遇到了在紧挨它生长的邻近斑点，厚过滤器不连^^妄两个生长的斑 点。由此，邻近的斑点可被分离。用RECONSTRUCTFROMSEED MIL运算器，将第一次二元量化的掩 体(含有所有的细胞)以及第三次二元量化的掩体(含有白细胞的分离的种子) 联合起来。由此构建的第四个掩体含有从第一个掩体拷贝的斑点(细胞)，其 得到第三个掩体的允许，因此代表白细胞(步骤441)。测量第四个掩体的斑点的面积和紧密度(compactness):面积(Area, A)是 斑点中像素的数量；紧密度来自斑点的周长(perimeter， p)和面积(A),其与 p274 (A)相等。形态越是巻曲的，值越大。环具有最小紧密度值(l.O)。周长 是斑点中边界的总长，具有楼梯效应(staircase effect)修正值，其是当对角线 数字化时产生的(计算内角(insidecomer)为1.414，而不是2.0)。将斑点保留 于第四个掩体中，只要它们的面积在1000和8000像素之间，并且具有小于 3的紧密度，因此考虑了具有相对粗糙轮廓的细胞。将接触图像边界的斑点 排除于进一步的处理中(步骤443)。以下列方式(步骤445、 447、 449和451)将第四个掩体应用于色调分量将来自色调分量的像素拷贝至新图像中，保留它们的色调值，前提是它 们的坐标与"掩体"中的白色(255)像素一致；将新的图像中所有的其他像素设 置为O(黑色)(步骤445)。检查值介于190-255的在每一个连续的非0像素区域的像素值，即，对 应于红细胞图像的那些斑点。计算在每一个斑点中此类像素的数量(步骤 447)。如果多于200个此类的像素，那么斑点表示有核红细胞。存储每一个此 类细胞重心的坐标。将掩体二元量化，以便将具有非0值的像素设置为 255(白色)；并将掩体存储为单独的标记图像文件才备式(Tagged Image File Format, TIFF)文件(步骤449)。程序移动至可能的胎儿细胞的下一个存储的坐标，所述坐标与先前步骤 中存储的任何坐标都不一致。重复全部的过程，直到已经鉴定了预置数量的 有核红细胞。将结果存储于结果文本文件中，所述结果包括有核红细胞坐标、 各掩体文件名称以及血液玻片的各种特征代码。坐标得以存储的有核红细胞 是所寻求的胎儿细胞(步骤451)。在鉴定感兴趣的目标如胎儿细胞之后，通过例如原位PCR或PCR原位 杂交或FISH产生第二个信号，如上所述。检测it断信号将包括原位PCR或PCR原位杂交处理的细胞的涂片定位于镜台上(图 2， 201)。如果需要，在定位之前，进行校准步骤。校准允许软件补偿操作 中的每天变化以及从一个显微镜、照相机等到另一个显微镜、照相机等的各 种变化。可如于图4流程图中所显示的，进行一种实施方案方法中的诊断信 号的检测，按如下进行选4奪60x(63x)物镜放大率(步骤501)。根据从第一信号的检测进行编辑的结果文件的数据，将x-y镜台移动至 第一个胎儿细胞位置，如上所述(步骤503)。使用CCD照相机(图2， 209)获得光场，并将其转移至计算机(图2， 211), 作为RGB图像(步骤505)。将RGB图像转化成HLS模式(步骤50"。装载含有黑色和白色掩体的TIFF文件，作为单独的图像(步骤509)。 将不与掩体中白色区域对应的色调分量设置为0 (黑色)(步骤511)。搜寻代表胎儿细胞的剩余区(remaining area)的与产生下列PCR的信号 对应的像素值。例如，信号可以是彩色的，其由于存在碱性磷酸酶而产生， 即红色。搜寻色调分量的非黑色区域的0-3之间变化的像素值(步骤513)。将镜台移动至下一个非处理的胎儿细胞，并重复上述过程(步骤515)。PC 211执行称为SIMPLE的软件程序，所迷程序控制帧抓取器和图像 处理电路217的运行。SIMPLE也处理由帧抓取器和图像处理电路217捕获 的图像，并且随后存储图像并在PC 211中将数据处理为盘文件。SIMPLE 提供了具有专门的程序的基于图像的环境，所述专门的程序特别适宜执行诸 如如过滤、目标选择和测量的图像处理任务。大多数SIMPLE的任务是由人 类才喿作员使用连接于PC 211的指示装置(pointing device)如鼠标或轨迹球 (TrackBall)(未显示)来指导的。为了使用SIMPLE来处理图像，首先必须进行许多图像校准步骤。在一 实施方案中，将使用荧光原位杂交(FISH)技术正确染色的新玻片放置于荧光 显^f鼓镜下。待识别的感兴趣的目标，即细胞核或染色体区域，具有具体的染 色特征。通过联合荧光检测方法，可在具体的样品中同时描绘多个目标。也 就是说，如果用在不同的波长下发出荧光的不同荧光团标记不同的靶标，那 么可使软件程序分开鉴定发射不同荧光团的目标，前提是全部彩色信息在图力性的目标。每一个目标可发射对应于两种或多种荧光团的波长，但，例如， 每一个强度可以不同。因此，在处理过程中，使用显微图像的所有三种彩色分量。对于在显微镜下插入的每一个新的样品，首先执行预处理步骤。图11 的流程图显示本发明的这个实施方案的预处理步骤。预处理可用于允许软件 补偿样品间的变化。在一实施方案中，将含有FISH处理的细胞的玻片定位于X-Y镜台201 中。将X-Y镜台201移动至发现含有稀有细胞的初始观察位置。重复执行 处理循环(processingloop)，直到预定量的具体类型的稀有细胞得以测量。在 该实施方案的应用中，鉴定染色体DNA的多个目标，执行循环，直到20-100 个细胞核已得以处理。可在ASCII文件中收集表示这些细胞核中染色体区域测量的数据。过滤步骤12000可按如下在逐像素(pixel-by-pixel)的基础上运行。在步 骤12001中，将孔填充过滤器应用于图像。这种过滤器，可从SIMPLE语言 获得，其通过搜寻亮目标中的暗区域，决定何时暗孔已显示于较亮的荧光染 色体中。增亮这些区域。在临时图像文件12101中，保存孔填充过滤器的输 出，以及将其用作向腐蚀过滤器的输入，步骤12003。腐蚀过滤，其也可通 过SIMPLE语言获得，取代在核心(kernel)中具有最暗像素的小核心的中心 像素。所用的核心可以是3x3。接下来进行单独的操作——步骤12005，使 目标生长，直至它们相遇但未合并。这个步骤也产生定义所有目标边界的轮 廓。逻辑NOT操作——步骤12007，引起轮廓内的像素变成选择的，而不 是轮廓。最后，在步骤12009中，步骤12007的结果与存储的临时图像文件 12101进行逻辑AND计算。这仅产生在待保存的临时图像文件12101和步 骤12007的输出两者中得以定义的那些像素。如果使用荧光检测方法的组合，可检测每个细胞核中多于两个染色体的 区域。因此，识别有关21号染色体的2个染色体区域、有关18号染色体的 另外2个染色体区域、有关X染色体的1个染色体区域和有关Y染色体的1 个染色体区域是可能的，使发现通过计算杂交信号检测的可能的数量畸变 (numerical aberration)成为可能。通过经由SIMPLE的外部应用程序完成 20100个细胞核的测量之后，可执行杂交信号的计算，并使用CLIPPER (COMPUTER ASSOCIATES, CA)编辑。这个程序可阅读测量结果ASCII文 件，并根据它们的RGB颜色组合，将检测的染色体区域分类。当在组合中 使用两种或更多种不同的荧光团时，可用RGB颜色值的不同组合区分不同 的目标，其中一些目标可通过多于一种的荧光团进行标记。例如，可用红色 和绿色荧光团对目标染色，但一个目标可接受发射30%的红色和70%的绿色 的焚光团，另一个目标可接受发射70%的红色和30%的绿色的荧光团，而第 三个目标可接受仅发射红色的荧光团。根据它们的相对发射，可区分这三种 目标。对于操作员选择的统计上有意义的水平，如果指示对应于具体染色体 如21号染色体的染色体区域的信号的数目多于两个，那么可发表确定具体 样品中21号染色体三体性的可能性增加的报告。尽管结合含有细胞的样品中染色体异常的临床检测，描述了本发明，但 本文中公开的图像处理方法具有其他的临床应用。例如，所述的图像处理步骤可用于使尿液分析过程自动化。当本申请的技术与1993年10月7日提交 的申请序列号08/132,804联合时，对多种细胞类型，可基于它们的形态，进 行可视化和分析。对于诊断疾病的目的，可观察细胞的形态，对此已经将细 胞形态和生理疾病相关联。此类疾病对本领域技术人员而言是已知的。参阅 例如Harrison,如上。基于这些技术，可检测各种细胞特征和异常。最后， 应注意，样品的具体来源不是对本发明的限制，因为样品可获自血液样品、 血清样品、尿液样品或子宫颈的细胞样品。本文中所述的细胞可视化和图像 分析技术可用于通过分析单个细胞(通过分离的细胞的形态或其他特征)可 斗企测的任何疾病。对人类胎儿血红蛋白(Research Diagnostics Inc., NJ)以及胚胎￡血红蛋白 链(Immuno-Rx, GA)具有特异性的抗体可商购获得，并且可用作荧光标记的 抗体，或通过使用荧光标记的第二抗体产生焚光信号。通过对稀有细胞进行 其他类型的染色或标记，可产生焚光，如本领域所知的。需要这种处理步骤 的焚光染色类型在本领域是已知的，因此不对此做进一步详细的讨论。计算机和图像处理技术经常变化。满足上述方法和和装置的需要而没在 此详细描述的新技术也显而易见地在本发明的考虑范围内。例如，上文提到 了某些常规的像素和文件格式，但也可以使用其他的格式。可使用本领域已 知的JPEG或GIF技术或将要研发的其他技术压缩图像文件。处理可在RGB 颜色描述空间而非目前所用的HLS空间中进行。如本领域的技术人员所期 望的，可使用其他的颜色空间，特别是搜寻后特征的检测因此得以增加时。已结合本发明的多个具体的实施方案对本发明做了描述。其他的变化对 本领域技术人员而言是显而易见的，并认为落于本发明的范围内，其受到附 加于本发明的权利要求和其等同物的限制。在本发明的实施方案中，阐明了分析细胞的亚细胞组分的实施例，用于 例如在产前和胚胎植入前基因诊断中^r测染色体异常，或胚胎或胎儿细胞的 性染色体。图13是细胞的联合免疫染色和FISH分析的显微照片，其存在胎儿血红蛋白以及鉴定细胞中的X和Y染色体。胎儿血红蛋白存在于样品中，如通 过橙色荧光信号所显示的，该信号从细胞中4企测的并且遍及图右下四分之一。在细胞的细胞核中，X和Y染色体分别显示为绿色、水红色焚光点。
权利要求
1.一种用于鉴定细胞中多种细胞组分的方法，所述方法包括使细胞样品与至少一种抗体反应，其中每一种抗体与具体的细胞组分结合并产生独特的荧光信号；使用一种或多种核酸探针，通过原位杂交处理所述细胞样品；其中构建与所述细胞中的目标核酸序列杂交并产生独特的荧光信号的每一种核酸探针；产生所述反应的和处理的细胞样品的一个或多个图像；以及检测并分析所述图像中对应于所述抗体和所述核酸探针的荧光信号。
2. 根据权利要求l的方法，其中所述细胞样品是血液样品。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述样血液样品是外周血液样品。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述样血液样品来自怀孕的雌性。
5. 根据权利要求1的方法，其还包括对与对照比较的所述焚光信号进 行定量的步骤。
6. 根据权利要求1的方法，其中构建与所述细胞样品中X和/或Y染色 体杂交的一种或多种核酸探针。
7. —种操作计算机系统来检测由至少 一种目标核酸定义的遗传病是否 存在于细胞样品中的方法，所述方法包括下列步骤对固定的样品进行成像，所述固定的样品具有针对核酸的杂交的荧光团 标记的探针，和针对感兴趣的细胞的非核酸组分的荧光免疫染色，其中 所述探针的荧光标记和免疫染色不同；^r测来自所迷样品的荧光；以及测定感兴趣的目标的数量，所述目标显示了来自所述免疫染色和所述探 针的焚光，以及根据此数量的显示来自所述免疫染色和所述探针两者的荧光的细胞的 统计期望值，测定是否存在遗传病。
8. 根据权利要求7的方法，其中构建与所述细胞样品中的X和/或Y 染色体杂交的核酸探针。
9. 根据权利要求7的方法，其中所述免疫染色与胎儿血红蛋白结合。
10. —种制备含有天然存在浓度的胎儿细胞的母体血液样品的方法，所 述方法包括用针对感兴趣的细胞的非核酸组分的荧光免疫染色处理所述样品； 用针对感兴趣的核酸序列的荧光核酸探针处理所述样品；使用计算机化的显微视觉系统，观察涵盖一部分细胞样品的光场，所述 计算机化的显微视觉系统为操作性配置，以检测来自所述荧光免疫染色和所述荧光核酸探针的荧光信号；以及通过所述荧光信号检测的方式，鉴定具有感兴趣的核酸序列的感兴趣的 细胞。
11. 根据权利要求10的方法，其中所述感兴趣的细胞是胎儿细胞。
12. 根据权利要求11的方法，其中所述胎儿细胞来自母体血液。
13. 根据权利要求10的方法，其中所述核酸探针含有X和/或Y染色体 DNA序列。
14. 根据权利要求10的方法，其中所述计算机化的视觉系统使用一物 镜以获得来自所述免疫染色和所述核酸探针的荧光信号。
15. 根据权利要求10的方法，其还包括基于鉴定为具有感兴趣的核酸 序列的感兴趣的细胞的数量，自动化产生试-验性诊断。
全文摘要
提供了一种用于检测和定量来自细胞样品中的多种和特有荧光信号的方法。所述方法联合了免疫组织化学和荧光标记原位杂交技术。所述方法可用于鉴定细胞的具体亚细胞组分，如染色体和蛋白质。
文档编号C12Q1/68GK101243192SQ200680029988
公开日2008年8月13日 申请日期2006年9月22日 优先权日2005年9月22日
发明者M·基尔帕特里克, T·P·塔法斯 申请人:艾可尼西斯公司