芽孢杆菌属菌种p203菌株的多肽的制作方法

专利名称：：芽孢杆菌属菌种p203菌株的多肽的制作方法芽孢杆菌属菌种P203菌抹的多肽发明领域本发明涉及功能性多肽，所述多肽由新的芽孢杆菌属菌种5a"7/wp/a/^o^erah的菌林基因组中包含的多核苦酸编码。该菌种的参考菌株是作为DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203(Bacz7/wsp.P203)。本发明还涉及编码这些多肽或促进它们的表达的多核苷酸和这些多核芬酸的构建体，以及用于制备所述多肽的方法。本发明更进一步涉及包含所述多肽和多核苷酸的组合物，以及所述多肽的用途。本发明还进一步涉及以登录号DSM17419保藏的细菌芽孢杆菌属菌种P203。发明背景嗜碱芽孢杆菌属菌抹(alkaliphilicBacillusstrains)是工业生物技术中的焦点。嗜碱菌抹并且特别是这些菌种的酶，在生物技术方法需要高pH值下的酶活性(或甚至最大活性)的生物技术应用中有巨大的潜力(Horikoshi:MicrobiologyandMolecularBiologyReviews,Vol.63，No.4,1999)。作为新催化剂来源的嗜碱芽孢杆菌属菌抹的实例是克劳氏芽孢杆菌(及c/aw7)、及;weMcfo/^ww、5.c/arA7'z'、及gz7wo""。在寻求新酶的过程中，还已知通过对可能的候选物进行特异性酶试验来筛选这些新酶。这种方法受到酶试验可用性的限制，并且无法鉴定活性还未知的功能性酶或多肽。此外，全基因组测序是从给定微生物获得全部基因信息的一种已知方法，i"列^口Fleischmannetal.;腾o/ege"owese^rwe"c&sa"da^em6(yo/i/aemop/zz7ws/"/7we"zaeiW;Nature269:496-512;(1995)中所述。大多数用于工业用途的酶是由微生物分泌至介质(medium)的酶。然而，微生物基因组中只有小部分编码分泌性蛋白。例如，枯草芽孢杆菌基因组或其最近的亲缘菌抹基因组中仅大约4。/。编码分泌性蛋白(VanDijletal.:尸ra^'"^-awpoW5ac/〃wssw6"7&:agewowe-6asecroadma/;in"Bacillussubtilisanditsclosestrelatives-Fromgenestocells;p.337-355;A.L.Sonenshein(ed.);ASMPress2002)。基因组测序的一个缺点是获得的序列中绝大多数编码非分泌性蛋白。基因组测序的另一个缺点(尤其对于真核生物如真菌)是，基因组大小较之细菌基因组大许多倍，使得用这种方法来发现基因的成本更高并且费时更久。cDNA的随机测序(表达序列标签或EST)是能够发现分泌性蛋白的另一种方法。通常而言，EST方法具有两个与分泌性蛋白鉴定有关的缺点；l)依赖于测序cDNA文库所用的诱导条件，非常少的cDNA,通常是0.5%-15°/0或者甚至1-5%的cDNA编码分泌性蛋白。2)克隆全部来自由mRNA得到的cDNA汇集物(pool),所述mRNA存在于生物体中，与各个特定基因的诱导水平成比例。还已知信号捕获(signaltrapping),它是一种使用与自身缺乏信号的细胞外报告基因的翻译融合来鉴定基因(包括编码信号肽的核苷酸)的方法(WO01/77315)。发明简述本发明发现新的芽孢杆菌属菌种万ac/〃w;/^^oWmsz;y的菌抹。这种菌种的参考/模式菌抹是以DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203。所述菌抹在pH(7-11)和低温(4-30。C)下生长。对这种菌株感兴趣的原因在于，公知菌抹和菌抹DSM17419之间的系统发生学距离(phylogeneticdistance)显著，并且该菌抹的生长条件与工业酶的多种应用中的条件相似。微生物的基因组含有数千种不同的基因；某些基因编码多肽，某些基因编码RNA。微生物的基因组中仅有限数目的基因编码功能性多肽，所述功能性多肽由该微生物分泌至周围的介质，为微生物提供外部作用(externalpurpose)。这些多肽引起工业上兴趣的原因是，可在连续过程中以可观的量产生这些多肽而不破坏产生该多肽的细胞。本发明的目的是鉴定和提供从芽孢杆菌属菌种P203菌抹分泌的多肽，该菌种以登录号DSM17419保藏，所述多肽对芽孢杆菌属菌种P203菌抹具有功能性作用，因为这些多肽不但可用于工业目的，而且它们还可按工业上相关的方法和量来产生。在第一个方面，本发明提供功能性多肽，所述多肽由芽孢杆菌属菌种Sflc/〃wp/朋feWm^菌抹的基因组中包含的多核苷酸编码，该菌抹以登录号DSM17419保藏；本发明还提供分离的成熟功能性多肽，其与可获得自细菌菌抹芽孢杆菌属菌种P203的相应的分泌性多肽有至少70%同一性并且显示相同的功能。在进一步的方面，本发明提供编码本发明所述多肽的多核苦酸；包含编码所述多肽的多核香酸的核芬酸构建体，所述多核苷酸与指导多肽在宿主细胞中产生的一种或多种调控序列可操作地连接；包含本发明所述核苷酸构建体的重组表达载体和包含本发明所述核苷酸构建体的重组宿主细胞。在更进一步的方面，本发明提供制备本发明所述多肽的方法，其包括(a)培养菌抹，所述菌抹包含编码本发明的多肽的核苷酸序列，并且能够表达和分泌所述多肽，和(b)回收所述多肽。在进一步的方面，本发明提供包含本发明的多肽的组合物；和用于制备这种组合物的方法，其包括将本发明所述多肽与赋形剂混合。在进一步的方面，本发明提供包含本发明的多核苷酸的组合物；和用于制备这种组合物的方法，包括将本发明所述多核苷酸与赋形剂混合。在进一步的方面，本发明提供本发明所述多肽或包含所述多肽的组合物在多种应用中的用途。在最后的方面，本发明提供电子存储介质，其包含本发明的多肽的氨基酸序列信息或本发明的多核苷酸的核苷酸序列信息。序列表本申请含有附加在申请中的序列表形式的信息，并且还于数据载体上随本申请一同提交。将数据载体的内容完整并入本文以作参考。SEQIDNO:1编码SEQIDNO:2中包含的丝氨酸蛋白酶；SEQIDNO:3编码SEQIDNO:4中包含的碳酸酐酶；SEQIDNO:5编码SEQIDNO:6中包含的碳酸酐酶；SEQIDNO:7编码SEQIDNO:8中包含的木聚糖酶；SEQIDNO:9编码SEQIDNO:10中包含的多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶(rhamnogalacturonanlyase);SEQIDNO:11编码SEQIDNO:12中包含的半乳聚糖酶。附图简述图1显示芽孢杆菌属菌种P203的生长特征。图2显示来自芽孢杆菌属菌种P203的碳酸酐酶的稳定性。图3显示乙酰唑胺(acetazolamide)对碳酸酐酶的抑制。图4显示金属离子、叠氮化物和其它试剂对碳酸酐酶的抑制。发明详述定义术语"同一性"用于本文中应理解为两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的同源性。就本发明而言，通过使用VectorNTI7.1版(Informaxinc.,7600WisconsinAvenue,Suite#1100，Bethesda，MD20814,USA)程序中的AlignX确定两个氨基酸序列之间的同一性程度。使用ClustalW算法(NucleicAcidResearch,22(22):4673-4680，1994)产生氨基酸比对。使用以下的附加参数缺口开启罚分(Gapopeningpenalty)为10，缺口延伸罚分(Gapextensionpenalty)为0.05，缺口分离罚分范围(Gapseparationpenaltyrange)为8。配对比对参数是K元组(Ktuple)=1，缺口罚分=3,缺口长度开启罚分(gaplengthopeningpenalty)=10,缺口延伸罚分=0.1,窗口大小(windowsize)=5和对角线(diagonals)=5。使用如上所述相同的算法和软件包确定两个核苷酸序列之间的同一性程度，例如采用以下设定缺口罚分为10,并且缺口长度罚分为10。配对比对参数是K元组-3，缺口罚分=3和窗口=20。术语"功能性多肽，，用于本发明上下文中的意思是能够由细胞表达和分泌的多肽，并且所述多肽组成操:作单元，其能够依据设计以通过细胞完成的功能来进行4喿作。任选地，所述多肽可能需要辅因子以具有预期的功能。功能性多肽的一个实例是催化活性多肽或酶，其辅助细胞催化细胞周围环境中的反应。另外的实例可以是作为信号物质发挥作用的多肽。进一步的实例是作为对环境参数(细胞周围环境中的化学物质)的感应物(sensor)(受体)而发挥功能的多肽，或对于其它生物体具有活性的多肽(抗4敬生物的(多)肽)或对细胞的结构完整性作出贡献的多肽。术语"成熟区"用于本文涉及氨基酸序列或多肽的部分，意思是氨基酸序列或多肽中作为成熟功能性多肽的部分或区或结构域或片段。术语"核苦酸序列中编码成熟多肽的区"用于本文的意思是核苷酸序列中，从编码成熟多肽第一个氨基酸的三联体算起，直至编码成熟多肽最后一个氨基酸的三联体的区。术语"分泌性多肽，，用于本文应理解为在细胞中表达之后，被转运或释放至周围的胞外介质中的多肽，或被结合/嵌入至细胞膜中而使该多肽的至少一部分曝露于周围的胞外介质的多肽。本发明的多肽本发明涉及多肽，其与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌株的分泌性多肽相似。具体而言，本发明提供分离的成熟功能性多肽，所述多肽与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌才朱的相应分泌性多肽是至少70°/。，优选80%或更高，例如90%、95°/。、96%、97%、98%或99%同一的，并且显示与其相同的功能。具体而言，本发明的多肽由以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹分泌，目的是为所述的具体细胞提供功能。在以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌株基因组的数千种可能的基因中，测定这种基因组中编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的6种分泌性功能性成熟多肽的多核苷酸是功能性的，即所述多核苷酸由所选宿主细胞翻译成功能性多肽。此外在具体的实施方式中，用包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的多核苷酸转化大肠杆菌宿主，在培养所述大肠杆菌宿主时，编码成熟多肽的基因全部能够表达，并且它们对应的成熟多肽能够分泌。通过比较6种多肽序列与已知序列的同源性或同一性，对所述多肽的具体功能进行注释。确定全部6种分泌性功能性多肽均为酶。具体而言，所述分离的多肽选自下组(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列有至少70%同一性SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽，和(b)由核苦酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在高严紧条件下与选自下组的多核苷酸探针杂交(i)核苷酸序列的互补链，所述核苷酸序列选自下组SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，(ii)核香酸序歹'j中包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区；其中所述多肽显示SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中相应的成熟多肽的功能。在一个具体实施方式中，本发明的多肽选自由以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹分泌并且由本发明人分离的酶；即选自下组的酶木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶。本发明还提供选自下组的分离的酶(a)包含氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与选自下组的成熟酶的氨基酸序列有至少70°/。同一性由以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹分泌的木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶，和(b)由核香酸序列编码的酶，所述核苦酸序列在高严紧条件下与选自下组的多核苷酸探针杂交(i)核苷酸序列的互补链，所述核苷酸序列包含于以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌林的菌抹中，并编码选自下组的成熟酶由该菌抹分泌的木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶；(ii)核苷酸序列中包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列包含于以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹中，并且编码选自下组的成熟酶从该菌抹分泌的木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸肝酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶；并且其中所述酶具有选自木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶的功能。本发明的多肽是分离的多肽，优选本发明所述多肽的制备物含有按重量计至多90。/。的可能与其天然结合的(nativelyassociated)其它多肽材料(更低百分比的其它多肽材料是优选的，例如按重量计至多80%,按重量计至多60%,按重量计至多50%,按重量计至多40°/。按重量计至多30%，按重量计至多20%,按重量计至多10%，按重量计至多9%,按重量计至多8%，按重量计至多6%,按重量计至多5%，按重量计至多4%,按重量计至多3%,按重量计至多2%,按重量计至多1%和按重量计至多0.5%)。因此，优选本发明所述分离的多肽是至少92%纯，即本发明所述多肽按重量计占制备物中存在的全部多肽材料的至少92%，并且更高的百分比是优选的，例如至少94%纯，至少95%纯，至少96°/。纯，至少96%纯，至少97°/。纯，至少98%纯，至少99%和至多99.5°/。纯。具体而言，优选本发明所述多肽是"基本上(essentially)纯的形式"，即所述多肽制备物基本上不含与其天然结合的其它多肽材料。这能够通过例如借助熟知的重组方法制备本发明所述多肽来实现。本发明所述多肽可以是合成制备的、天然存在的或它们的组合。在具体的实施方式中，本发明的多肽可以从-微生物获得，所述^f敫生物例如原核细胞、古细菌细胞或真核细胞。可通过遗传工程对所述细胞进行进一步修饰。在具体实施方式中，本发明所述多肽是在大约10。C至大约80。C范围内(特别在大约20°C至大约60。C的范围内)的温度显示最优酶活性的酶。在具体实施方式中，本发明所述多肽是酶，其在高至100。C，特别是高至80。C，更特别是高至60。C的温度在功能上稳定。在具体实施方式中，本发明所述多肽是酶，其显示出选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟酶的酶活性的至少20%,特别至少40%，例如至少50°/。，特别是至少60°/。，例如至少70%，更特别是至少80°/。，例如至少90%,最特别至少95%，例如大约或至少100。/。的酶活性。具体而言，所述分离的成熟功能性多肽与可获得自以登录号DSM17419保藏的细菌菌抹芽孢杆菌属菌种P203的相应分泌性多肽是至少70%同一的并且显示与其相同的功能；特别地，本发明所述多肽包含、含有或由下述氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽组成的组中的多肽序列具有至少70%同一性。百分比同一性特别是至少95%,例如至少96%,例如至少97%，并且甚至更特别是至少98%,例如至少99%或甚至100。/。的同一性。在另外的具体实施方式中，百分比同一性是至少50%;特别是至少60%,特别是至少65%,特别是至少70%,特别是至少75%,特别是至少80%,并且甚至更特别是至少85%的同一性。在具体实施方式中，本发明所述多肽的氨基酸序列与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽有至多十个氨基酸(例如十个氨基酸)，特别是至多五个氨基酸(例如五个氨基酸)，例如至多四个氨基酸(例如四个氨基酸)，例如至多三个氨基酸(例如三个氨基酸)，特别是至多两个氨基酸(例如两个氨基酸)，例如一个氨基酸的差异。本发明的多肽可以是野生型多肽，其分离自天然来源例如登录号为DSM17419的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌林，或其它野生型菌抹；然而本发明还包含人工变体，在所述人工变体中例如通过在所述多肽中添加、取代和/或缺失一个或多个氨基酸来对本发明的多肽进行突变，并且同时保持该多肽的功能和/或其它性质。因此，本发明的多肽可以是人工变体，在所述人工变体中，对包含成熟多肽或由成熟多肽组成的氨基酸序列进行氨基酸的至少一个取代、缺失和/或插入，所述成熟多肽是SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽。本发明的多肽还包括本发明所述氨基酸序列的功能性片段，和编码本发明所述氨基酸序列的功能性片段的核酸，包括如本文所述由以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹分泌的成熟酶的片段，包括选自下组的酶的片段由以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹分泌的木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶。人工变体可通过本领域已知的标准技术构建，其后通常进行筛选和/或表征。标准技术包括经典诱变，例如通过UV照射细胞或用化学诱变剂处理细胞，如Gerhardtetal.(1994)所述；体内基因改组，如WO97/07205中所述；体外改组，如Stemmer,(1994)或WO95/17413所述，随积3秀变，如EisenstadtE.etal"(1994)所述;PCR技术，如Poulsenetal.(1991)所述；家族改组(familyshuffling),如J.E.Ness,etal，NatureBiotechnology,vol.17，pp.893-896(1999)戶斤述；定,泉i秀变，3口Sambrooketal.(1989),Sambrooketal.,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY所述。对核苷酸取^的才既述可见于侈ij》口Fordetal.,1991,ProteinExpressionandPurification2,p.95-107。也可以使用这些标准遗传工程方法，从编码一种或多种本发明的亲本酶的基因中制备变体核苷酸序列的各种文库，将酶变体在适当的宿主细胞中表达，并且选择优选的变体。通过本领域已知的一系列技术能够建立各种文库(ReetzMT;JaegerKE,inBiocatalysis-fromDiscoverytoApplicationeditedbyFessnerWD，Vol.200，pp.31-57(1999);Stemmer，Nature,vol.370,p.389-391，1994;ZhaoandArnold,Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,vol.94，pp.7997-8000，1997;或Yanoetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，vol.95，pp5511-5515，1998)。在本发明的具体实施方式中，(人工变体以及野生型酶中的)氨基酸改变是对性质较不重要的(ofaminornature),其为不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代；小缺失，通常是一至大约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端曱疏氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸，例如多组氨酸序列(poly-histidinetract)、#元原表4立或结合i或。保守取代的实例在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和曱硫氨酸)，芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸)。大体上不改变和/或削弱蛋白质功能的氨基酸取代是本领域已知的，例如H.NeurathandR丄.Hill,1979,In,TheProteins,AcademicPress,NewYork所述。最常出现的交换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、丁yr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及这些反过来的交换。在具体实施方式中，氨基酸改变具有这样的性质使得多肽的理化性质改变。例如，可进行改进酶热稳定性的氨基酸改变、改变底物特异性的氨基酸改变、改变最适pH的氨基酸改变等。具体而言，在本发明的多肽中，尤其在选自由SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽组成的组的多肽中，用于产生人工变体的这些取代、缺失和/或插入的数目是至多10,如至多9，例如至多8,更优选至多7，例如至多6，如至多5，最优选至多4,例如最多3,如至多2，特别是至多1。在具体实施方式中，人工变体是变体，其在动物包括人中，与亲本酶相比具有改变的，优选降低的免疫原性，特别是变应原性。术语"免疫原性"在本上下文中应理解为，在施用于动物时，包括静脉内、皮肤、皮下、口服和气管内施用时，人工变体产生改变的(特别是降低的)免疫应答的能力。术语"免疫应答"在本上下文中的意思是，人工变体的施用引起动物体内免疫球蛋白如IgE、IgG和IgM水平的改变，或引起动物体内细胞因子水平的改变。定位蛋白中的免疫原/抗原表位、制备免疫原性改变的变体的方法和测量免疫应答的方法是本领域熟知的，并且在例如WO92/10755、WO00/26230、WO00/26354和WO01/31989中描述。术语"变应原性，，在本上下文中应理解为，引起动物体内IgE产生改变(特别是降低)的人工变体能力，以及结合来自所述动物的IgE的能力。具体而言，将所述多肽变体气管内施用于动物所产生的变应原性是特别感兴趣的(也称作呼吸变应原性)。在进一步的实施方式中，本发明的多肽是由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在至少高严紧条件下，特别是在非常高严紧条件下，与选自下组的多核苷酸探针杂交(i)核苷酸序列的互补链，所述核苷酸序列选自下组SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，(ii)核苷酸序列中包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列选自下组SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，(iii)(i)或(ii)的片段，其编码分泌性多肽，所述分泌性多肽具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的相应成熟多肽的功能(J.Sambrook,E.F.Fritsch,andT.Maniatus,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)。具体而言，本发明的多肽由包含选自下组的核苷S吏序列的多核苷酸编码SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区或由于遗传密码的简并性而与之有所不同的序列。更具体而言，本发明的多肽由下述多核苷酸编码，所述多核苷酸由选自下组的核苷酸序列组成SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区或由于遗传密码的筒并性而与之有所不同的序列。SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽的氨基酸序列或其片段，可以用于设计多核苷酸探针，以根据本领域熟知的方法从不同属或种的菌抹中鉴定和克隆编码本发明的酶的DNA。具体而言，依据标准的Southern印迹方法，能够使用这些探针与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以在其中鉴定和分离相应的基因。这些探针可能远远短于完整的序列，但长度应为至少15，优选至少25，更优选至少35个核苷酸，如长度是至少70个核苷酸。然而，优选所述多核苷酸4笨针的长度是至少100个核苷酸。例如，所述多核苷酸^:针的长度可以是至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少400个核苷酸或至少500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是至少600个核苷酸，至少700个核苷酸，至少800个核苷酸或至少卯0个核苷酸的多核苷酸一笨针。DNA和RNA探针均可使用。通常对所述探针进行标记用来检测相应的基因(例如，用32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。因此，可以筛选从这些其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中的DNA,所述DNA与上述4笨针杂交并且编码本发明的酶。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术，来分离这些其它生物体的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA或分离的DNA转移至或固定在硝酸纤维素或其它适合的载体材料上。为了鉴定与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核香酸具有所需同源性和/或同一性或与所述核香酸同源和/或同一的克隆或DNA，将具有固定的DNA的载体材料用于Southern印迹。就本发明而言，杂交表示在高至非常高严紧条件下，核苷酸序列与标记的多核苷酸4果针杂交，所述多核苷酸探针又与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苷S臾序列杂交。可以使用X射线片或通过本领域已知的任何其它方法检测在这些条件下与多核苷酸探针杂交的分子。只要在本上下文中使用术语"多核苷酸探针"，应将其理解为这样的探针含有至少15个核苷酸。在感兴趣的实施方式中，多核苷酸4冢针是选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苦酸序列的互补链。在另一个感兴趣的实施方式中，多核苷酸探针是选自下组的编码酶的核普酸序列的互补链SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11。在另外的感兴趣的实施方式中，多核苷酸才果针是选自下组的核苷酸序列中的成熟多肽编码区的互补链SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区。对于长度为至少IOO个核苷酸的长探针，将高至非常高严紧条件定义为在42。C,在5XSSPE、1.0%SDS、5XDenhardt溶液、100pg/ml剪切并且变性的鲑精DNA中，根据标准Southern印迹方法进行预杂交和杂交。优选地，至少100个核苷酸的长探针含有不多于1000个核苷酸。对于长度至少100个核苷酸的长探针，最终使用O.lxSSC、0.1%SDS,在60。C(高严紧性)；优选使用0.1xSSC、0.1°/。SDS,在68。C(非常高严紧性)，将载体材料洗涤三次，每次15分钟。尽管不是特别优选，但是预期同样可以使用较短的探针，例如长度从大约15至99个核苷酸的探针，如长度从大约15至大约70个核苷酸的探针。对于这些短探针，将严紧条件定义为在比用根据Bolton和McCarthy计算法(1962,PraceW，o/7V加'o"a/^co^ew;;。/5We"ces48:1390)得出的Tmj氐5。C至10。C，在0,9MNaCl、0.09MTris画HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、1xDenhardt溶液、1mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)、1mM磷酸二氣納(sodiummonobasicphosphate)、0.1mMATP牙口0,2mg每ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤。对于长度大约15个核苷酸至99个核苷酸的短〗笨针，将载体材料在比计算得出的Tm低5。C至10。C，在6XSCC加0.1%SDS中洗涤一次15分钟，再使用6XSSC洗涤两次，每次15分钟。SEOIDNO:2,丝氨酸蛋白酶在具体的实施方式中，本发明的多肽是丝氨酸蛋白酶，其包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成所述氨基酸序列与可获得自芽孢杆菌属菌种P203菌抹的丝氨酸蛋白酶，具体而言与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌林的菌抹的丝氨酸蛋白酶，更具体而言与SEQIDNO:2中包含的成熟丝氨酸蛋白酶，具有至少70%，如至少80%或85%,特别是至少95%,更特别是至少96°/。，更特别是至少97%,更特别是至少98%,更特别是至少99%或最特别是100%同一性。在实施例4中将进一步描述本发明的丝氨酸蛋白酶。SEOIDNO:4，碳酸酐酶在具体的实施方式中，本发明的多肽是-友酸酐酶，其包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成所述氨基酸序列与可获得自芽孢杆菌属菌种P203菌抹的碳酸酐酶，具体而言与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹的碳酸酐酶，更具体而言与SEQIDNO:4中包含的成熟碳酸酐酶，具有至少70%,如至少80%或85%，特别是至少95%,更特别是至少96%,更特别是至少97%,更特别是至少98%，更特别是至少99%或最特别是100%同一性。在实施例8中将进一步描述本发明的碳酸酐酶。SEOIDNO:6,碳酸酐酶在具体的实施方式中，本发明的多肽是碳酸酐酶，其包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成所述氨基酸序列与可获得自芽孢杆菌属菌种P203菌抹的碳酸肝酶，具体而言与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹的碳酸酐酶，更具体而言与SEQIDNO:6中包含的成熟碳酸酐酶，具有至少70%,如至少80°/0或85%,特别是至少95%，更特别是至少96%，更特别是至少97%,更特别是至少98%，更特别是至少99。/。或最特别是100%同一性。SEOIDNO:8,木聚糖酶在具体的实施方式中，本发明的多肽是木聚糖酶，其包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成所述氨基酸序列与可获得自芽孢杆菌属菌种P203菌株的木聚糖酶，具体而言与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌林的木聚糖酶，更具体而言与SEQIDNO:8中包含的成熟木聚糖酶，具有至少70%，如至少80%或85°/。，特别是至少95%,更特别是至少96°/。，更特别是至少97%,更特别是至少98。/。，更特别是至少99%或最特别是100%同一性。在实施例6中将进一步描述本发明的木聚糖酶。SEOIDNO:10,多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶在具体的实施方式中，本发明的多肽是多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶，其包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成所述氨基酸序列与可获得自芽孢杆菌属菌种P203菌抹的多聚鼠李半乳糖趁酸裂合酶，具体而言与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹的多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶，更具体而言与SEQIDNO:8中包含的成熟多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶，具有至少70%，如至少80%或85%，特别是至少95°/。，更特别是至少96%,更特别是至少97%,更特别是至少98°/。，更特别是至少99%或最特别是100%同一性。在实施例5中将进一步描述本发明的多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶。SEOIDNO:12,半乳聚糖酶在具体的实施方式中，本发明的多肽是半乳聚糖酶，其包含下述氨基酸序列或由下述氨基酸序列组成所述氨基酸序列与可获得自芽孢杆菌属菌种P203菌株的半乳聚糖酶，具体而言与可获得自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹的半乳聚糖酶，更具体而言与SEQIDNO:8中包含的成熟半乳聚糖酶，具有至少70°/。，如至少80%或85%，特别是至少95%，更特别是至少96%,更特别是至少97%,更特别是至少98%，更特别是至少99%或最特别是100%同一性。在实施例7中将进一步描述本发明的半乳聚糖酶。多核苷酸本发明还涉及多核苷酸，特别是分离的多核苷酸，其包含编码本发明的多肽的核香酸序列或由编码本发明的多肽的核苷酸序列组成。在具体的实施方式中，核苷酸序列示于SEQIDNO:1、SEQIDN0:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中，包括由于遗传密码的简并性而与之有所不同的核苷酸序列。在进一步的实施方式中，本发明的多核普酸序列是经修饰的核苷酸序列，其包含选自下组的核苷酸序列或由选自下组的核苦酸序列组成SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，并且所述经^修饰的核香酸序列与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中包含的亲本核苷酸序列相比，包含至少一个修饰/突变。用于分离和/或克隆编码酶的核苷i^f列的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。例如可通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选以检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组DNA克隆本发明的核苷酸序列。参见，例如,Innisetal.，1990,PCR:AGuidetoMethodsandApplication,AcademicPress,NewYork。可以使用其它扩增方法，例如连接酶链式反应(LCR)、连接活化转录(ligatedactivatedtranscription;LAT)和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可以通过遗传工程中使用的标准克隆方法获得核苷酸序列，所述方法将核苷酸序列从其天然位置重新定位到它将被复制的不同位点。克隆方法可以包括切除和分离期望的片段，其包含编码多肽的核苷酸序列；将所述片段插入载体分子中；和将重组载体并入宿主细胞中，其中将对所述核苷酸序列的多个拷贝或克隆进行复制。所述核苷酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的来源，或它们的任何组合。具体而言，所述多核香酸包含下述核苦酸序列，优选由下述核苷酸序列组成，所述核香酸序列与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苷酸序列具有至少50%同一性。特别地，所述核苷酸序列与选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苷酸序列具有至少65%同一性，更特别是至少70°/。同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95°/。同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97。/。同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100%同一性。特别地，所述核苷酸序列包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苷酸序列。在甚至更具体的实施方式中，所述核苷酸序列由选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区的核苷酸序列组成。具体而言，所述多核香酸包含下述核苷酸序列，优选由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列编码选自木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶的成熟酶，并且所述核苷酸序列与编码选自下组的成熟酶的核苷酸序列具有至少50%同一性，特别是至少65%同一性，更特别是至少70%同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95%同一性，更特别是至少96%同一性，更特別是至少97°/。同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100%同一性由以登录号17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的菌抹分泌的木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶。SEOIDNO:1在具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，并且包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所迷核苷酸序列与SEQIDNO:1中编码成熟丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列具有至少70。/。同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95%同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97%同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100%同一性。SEOIDNO:3在具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，并且包含下述核苷S交序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQIDNO:3中编码成熟碳酸酐酶的核苷S1^列具有至少70%同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少卯％同一性，更特别是至少95%同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97%同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100%同一性。SEOIDNO:5在具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，并且包含下述核苷酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQIDNO:5中编码成熟碳酸酐酶的核苷酸序列具有至少70%同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95%同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97°/。同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100%同一性。SEOIDNO:7在具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，并且包含下述核苷酸序列或由下述核苷S吏序列组成，所述核苷S吏序列与SEQIDNO:7中编码成熟木聚糖酶的核苷S^列具有至少70%同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95%同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97%同一性，更特别是至少98。/。同一性，更特别是至少99°/。同一性或最特别是100%同一性。SEOIDNO:9在具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，并且包含下迷核苷S吏序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQIDNO:9中编码成熟多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶的核苷酸序列具有至少70°/。同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95%同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97%同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100%同一性。SEOIDNO:11在具体实施方式中，本发明的多核苷酸编码丝氨酸蛋白酶，并且包含下述核苦酸序列或由下述核苷酸序列组成，所述核苷酸序列与SEQIDNO:11中编码成熟半乳聚糖酶的核苷酸序列具有至少70%同一性，更特别是至少80%同一性，更特别是至少90%同一性，更特别是至少95°/。同一性，更特别是至少96%同一性，更特别是至少97%同一性，更特别是至少98%同一性，更特别是至少99%同一性或最特别是100°/。同一性。对编码本发明多肽的核苷酸序列的修饰对于多肽的合成可能是必需的，所述多肽包含的氨基酸序列与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽的氨基酸序列相比具有至少一个取代、缺失和/或插入。对于本领域技术人员显而易见的是，这些修饰能够在保留酶功能的情况下进行，即在对于酶功能重要的区域之外进行。因此优选不修饰例如不取代对于功能关键的氨基酸残基。对于功能关键的氨基酸残基可以根据本领域已知的方法鉴定，例如定点诱变或丙氨酸分区诱变法(参-见r例"V,-CunninghamandWells,1989,Science244:1081-1085)。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的纟支术测定(参见，例如，deVos"a/.，1992,Sc/e"ce255:306-312;Smith"a/.,1992,Jowma/o/Mo/ecw/arB/o/ogy224:899-904;Wlodaver"a/.，1992，F五^S"i^"e^309:59-64)。此外，可以通过？)入核苷酸取代来修饰编码本发明的酶的核苷S臾序列，所述取代不产生由核苷酸序列编码的酶的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择。可以使用本领域已知的任何方法，通过定点诱变来完成将突变引入核苷酸序列，从而将一个核苷酸交换成另一个核苷酸。特别有用的方法是使用带有感兴趣的插入的超螺旋、双链DNA载体和两个含有期望突变的合成引物的方法。各自与载体的相反链(oppositestrand)互补的寡核苷酸引物在温度循环(temperaturecycling)期间依靠尸>DNA聚合酶延伸。并入？1物之后，产生含有交错切口(staggerednicks)的突变质粒。温度循环之后，使用对曱基化和半曱基化的DNA有特异性的Dp"/处理产物，以消化亲本DNA模板并且选择含有突变的合成DNA。也可以使用本领域已知的其它方法。关于核苷酸取代的才既述，可以参阅侈寸^(口Forda/"1991,/Vo&z'"5!xprew/o"aw/i^nyca&o"2:95-107。本发明还涉及多核苷酸，其包含下述核苷酸序列，优选由下述核苷酸序列组成，所述核香酸序列编码本发明的多肽，并且所述核苷酸序列在高严紧条件下，优选在非常高严紧条件下与选自下组的多核苷酸探针杂交(i)核苷酸序列的互补链，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，(ii)核苷酸序列中包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，和(iii)(i)或(ii)的片段，其编码分泌性成熟多肽，所述分泌性成熟多肽具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的相应成熟多肽的功能。应该理解的是，关于核苷酸序列杂交的详细资料和具体内容应与本发明题为"多肽"的部分中讨论的杂交方面相同或类似。本发明还包含适合用于电子设备，优选数字设备的存储介质，其包含本发明所述多肽的氨基酸序列信息，或本发明所述多核苷酸的核苷酸序列信息，具体而言电子或数字形式的，如二进制编码或其它数字编码的任何本发明的多肽或多核苷酸。所述存储介质适合地可以是磁盘或光盘，电子设备可以是计算设备，具体而言可将信息以数字形式存储在所述存储介质上。重组表达载体本发明还涉及包含本发明所述核酸构建体的重组表达载体。上述的多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核苷酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入核苷酸序列或包含所述序列的核酸构建体来表达本发明的核苷酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核苷酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该栽体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA(totalDNA),或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌(5a"7/wsw^'fe)或地衣芽孢杆菌(5^/〃1/^/^"^^^)的cfa/基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨千青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记包括但不限于"w必(乙酰胺酶)、(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、(草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、/2乂W(潮霉素磷S殳转移酶)、m'oD(硝酸还原酶)(nitratereductase),p*yK7(乳清酸核苷_5,-磷酸脱羧酶)(orotidine-5，-phosphatedecarboxylase)、(硫酸腺苦酰转移酶)、^pC(邻氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase))以及它们的等价物。优选用在曲霉属C4^^"g/〃w)细胞中的是构巢曲霉C^perg/〃ws"/d"/a"力或米曲霉(jsperg/〃wsojzae)的am^S和/yK基因禾口吸7jc链審菌(5^e/tomyce51/zygnwco/fcw力的6ar基因。本发明的载体优选含有元件，其允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或允许载体在细胞中独立于基因组自主复制。为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组将载体稳定整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核芬酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组中。所述额外的核苷酸序列使载体能够整合到宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应该优选含有足够数量的核苷酸，如100至1，500-成基对，优选400至1，50(M咸基对，并且最优选800至1,500碱基对，其与相应的目标序列高度同源以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAMpi的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARS1，ARS4，ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。复制起点可以具有突变，所述突变使复制起点在宿主细胞中的功能是温度敏感的(参见，例如，Ehrlich,1978,7V。ceW"gso/AeAto/o""/^caofew;;o/5W認w固75:1433)。可以将多于一个拷贝的本发明的核苷酸序列插入宿主细胞以增加基因产物的产生。核苷酸序列拷贝数的增加可通过如下方法获得将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或使所述核苷酸序列包括可扩增的选择性标记基因，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝的细胞，并且由此得到核酸序列的额外拷贝。用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrooketal.,1989,见上文)。重组宿主细胞本发明还涉及包含本发明所述核酸构建体的重组宿主细胞，将所述重组宿主细胞有利地用于多肽的重组产生中。将包含本发明核苷酸序列的载体引入宿主细胞中，从而将该载体保留作为染色体整合体(chromosomalintegrant)或作为前述的自复制的染色体外载体。宿主细胞可以是单细胞微生物，例如，原核生物，或非单细胞微生物，例io，真4亥生物。有用的单细胞微生物是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌属细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(Bacz7/wsa汰a/op/n7w力、解淀粉芽孢杆菌(5ac〃/usawy/o/z々i^/^c/e"s)、4豆芽孑包4干菌(5a"7/Ms6reWs)、环^犬芽孑包4干菌(^cz7/iw"7rw/(3""、克劳氏芽孑包杆菌(万""7/twc/(3,7)、凝结芽孑包杆菌(_Sa"7/w<scoagw/a""、杣烂芽孑包杆菌(5acz7/ws/aw/w"、迟緩芽孑包杆菌(^ac/〃ws/e"^s)、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(5ac〃/w、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bac/〃wsto3ra^zem7op/2z7Ms)、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(5<3"'〃1f/n^/"g&ra&);或链霉菌属(5"^ptomyces)细月包，例如，浅青紫链霉菌(5^e/fcwyc"//v/(ia"力和鼠灰链霉菌(5^印tom少c^，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌和假单胞菌属菌种(尸wWomo"ossp.)。在另外优选的实施方式中，芽孢杆菌属细胞是嗜碱的芽孢杆菌属。可通过如下方法实现将载体引入到细菌宿主细胞例如原生质体转化(参见，例如，ChangandCohen,1979,ilfo/ecw/wGe"era/168:111-115),4吏用感受态纟田月包(参见，例如，YoungandSpizizin,1961,Jowr"a/o/Sac&n'o/ogy81:823-829或DubnauandDavidoff-Abelson,1971，Jo画a/o/Mo/翻/ar万/o/ogy56:209-221),电穿孑L(参见，例如，ShigekawaandDower,1988,5/o&c/zw々wes6:742-75l)或接合(参见，例如，KoehlerandThome,1987，/ow""/o/^Gcten'o/ogy169:5771-5278)。宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在优选的实施方式中，宿主细胞是真菌细胞。"真菌"用在本文包括以下门子嚢菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和才妻合菌门(Zygomycota)(^口由Hawksworthefa/"爿zVwwoW/2a"<i5&63^Z)/c"ow"o/77zeFwwg7',8thedition,1995，CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth"a/.，1995,见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfiongi)(Hawksworth&a/.,1995,见上)。在更优选的实施方式中，真菌宿主细胞是酵母细胞。"酵母"用在本文包括产子嚢酵母(ascosporogenousyeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌类(FungiImperfecti)(芽生菌类(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如万z'o/ogy^Mf爿cf/v/riaso/TeaW(Skinner,F.A.,Passmore，S.M.，andDavenport,R.R.，eds，^p/.5ac/e〃'o/.S少wpo57.wmiSen'&sNo.9,1980)中所述。在更加优选的实施方式中，酵母宿主细胞是念珠菌属(OmAWa)、汉逊酵母属(/7arae"w/a)、克鲁维酵母属(尺/w;/veram;;ce"、毕赤酵母属CP/c/2/a)、酵母属((S"cc/2"ro，cey)、裂殖酵母属(^Sc/z^wacc/2"ra，cas)或西洋蓍霉属(J^roH7'a)细胞。在最优选的实施方式中，酵母宿主细胞是卡尔酵母OSacc/wramycescar/s6ergera&)、酉良酒酵母((S(3cc/wromycasceww、/ae)、冲唐4匕酵母(iSacc/2aram^yces(i/oy她'cw力、道格拉氏酵母(&cc/2fl厂o/w;Kcescfowg/os//)、克鲁弗酵母(iSacc/zorawycesWw_yvm〕、诺地酵母(5"acc/zaramjc&swor6e腦》或卵形酵母OSacc/wramycesovz/om^)纟田月包。在另夕卜最优选的实施方式中，酵母宿主细月包是乳酸克鲁维酵母(i:/w"eraw^ces/a"/"细胞。在另外最优选的实施方式中，酵母宿主细』包是K3trraw/a/&o/>^ca细胞。在另外更优选的实施方式中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌，，包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawkswortha/.,1995,见上文，所定义)的所有丝状形式(filamentousform)。丝状真菌的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在甚至更优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是(但不限于)以下种类的细胞枝顶孢霉属(^remom'wm)、曲霉属、镰孢属(F^aWwm)、腐质霉属(//wmz'co/a)、毛霉属(M"cor)、毁丝霉属(辟ce/Zo;7/^ora)、脉孢菌属(7Vewra5pora)、青霉属(尸em."7"iwz)、才炎孑包壳属(77n.e/aWa)、7b/y/。c/aiiz'wm或木霉属(7Hc/zo(ierma)。在最优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉(^y;e/^7/^y"衡附or/)、臭曲霉(^/erg/〃wsy^幼V/us)、日本曲霉(/^/ew'〃z^y.apo"/c—、构巢曲霉、黑曲霉0^;^^///^"&w)或米曲霉细胞。在另外最优选的实施方式中，丝状真菌宿主细胞是^干孢状镰孢(F^g〃'mw6ac的VZ/ozVifes)、禾谷镰孢(i^ya〃'wwcerea/zi)、库威嫌《包(尸iwan'm附croo/bt^//^we)、大刀錄孑包(^Ywar/w附cw/worww)、禾本科嫌孑包(Fusar/w附gra附/"e"rww)、禾赤嫌孑包(尸z^a〃'謂gra附/"謂)、异孑包嫌孑包(Fws"n'ww/zeferos/on^w)、合欠木镰孑包(Fwor/wwwegww<i/)、尖镰孑包(Fwj"n'wwoxr^^/7orw附)、多斗支嫌孑包(F"sanfwwrd/cw/"w附)、4分纟工嫌孑包(F"iW7.w附royew附)、4妻骨木嫌孑包(F^an'wws"w6mc7'"mw)、月夫色嫌孑包(尸wi^j7'wwjarcoc/zra"w)、才以分斗支孑包镰孑包CFksofHw附5porafWc/w'ozVfes)、石克色镰孑包(Fwj"7^wwjw/p/zwwww)、圓镰孑包(Fw^(3r/wwto/oywm)、拟丝孑包镰孑包(Fwj"n'ww加'c/zo决e"'o/^fey)或镶片镰孑包(i^wr^wve"ewa&w)细胞。在甚至最优选的实施方式中，丝状真菌亲本细胞是镶片镰孢(Nirenberg新种)细胞。在另外最优选的实施方式中，丝状真菌宿主纟田月包是净争异腐质霉(//w附/co/a/rao/e"力、才帛状腐质審(T/ww/co/a/"""g7'"os(3)、米黑毛霉(Afwcor附/e/ze/)、p耆《A皇爻丝霉(Afyce//o//^/2。ra^7er附o//zz'/(3)、^且并造月永孑包菌(^Vewray/o;-flcraw")、产秀t青審(户e"/c/〃/ww、土生梭孑包審(7TwWav/"/ermyW力、哈茨木霉(THcAoderwa/"c'fl"ww)、康宁木霉(7h'c/2C^/7W(3A:o"/"g//)、长枝木霉(7Hc/70cferwa细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yeltone/1a/"1984,y//;eJV加'ow"/^cawfe附jKo/5We"cest/S/481:1470-1474中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardierda/.，1989,78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母BeckerandGuarente,/"Abelson，J.N.andSimon,M丄,editors,GWdeto!^"W朋dMo/ecw/arM函odlsEyzz，o/c^，Volume194,pp182-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoe/g/.，1983，Jbwma/o/BaCm'o/ogy153:163;和Hi皿enefa/"1978,JVoceec/zV^o/f/zeiV加'owa/爿cacfem少。/5Wewces75:1920。供体菌林本发明还提供以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹，和包含这种微生物的组合物。本发明还提供由新菌种(Bacz7/M;/a^oWm^)组成的芽孢杆菌属的菌抹。所述新菌种包含耐碱和耐盐的(halo-tolerant)芽孢杆菌属菌抹，所述菌抹在4-30。C的温度，在pH7-11和0-12。/。NaCl浓度的培养基中生长。最佳条件是4-20。C，在pH7.5和10%NaCl中。新菌种的菌抹与相关菌抹可进一步具有以下参数上的不同所述菌抹能够利用甘油、葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、D-甘露醇、熊果苷(arbutin)、七叶苷(aesculin)、水杨苷(salicine)、明胶、柠檬酸(citrate)、甘油基三丁酸酯(glyceryltributyrate)、D-麦芽糖、D-海藻糖、脱脂乳、AZCL-酪蛋白、AZCL-阿聚糖(AZCL-arabinan)和AZCL-半乳聚糖，而不能利用淀粉、Tween20、AZCL-木葡聚糖、AZCL-支链淀粉(AZCL-pullulan)、AZCL-阿拉伯木聚糖、AZCL-糊精(AZCL-dextrain)、AZCL-纤维素、AZCL-卩-葡聚糖、AZCL-木聚糖、还原型直链淀粉(redamylose)、还原型支链淀粉(redpullulan)和还原型淀粉(redstarch)。观察到ONPG的水解。吲哚(indol)产生(使用Kovdp试剂)为阴性，VogesProskauer反应(乙偶姻(acetoin)产生)以及对过氧化氢酶和氧化酶活性的测试为阳性。菌株P203与模式抹Bac/〃asg/feom7(登录号DSM8722)就16SrDNA序歹寸而言具有98。/。核苷酸同一性。菌抹P203的生长特性示于图1。基于比较性16SrDNA分析，相较于与任何其它已知的芽孢杆菌属菌种，Bac/〃ws//a^Wm^与5ac/〃usg/6som7更具相关性。然而，在DSMZ,Braunschweig,Germany通过反相HPLC测定Sa"7/wp/aAro^em&菌抹P203和最近缘的已知芽孢杆菌属菌种5.g/fco""模式抹之间的DNA同源性是(25.8-29.5%)DNA-DNA杂交和G+CDNA含量。使用弗氏压石争器(Frenchpress)(ThermoSpectronicTM)分离DNA,并且通过层析在羟基磷灰石上纯化，如(Cashion，da/.，1977)所述。DNA-DNA杂交如Ley,J.D.，Cattoir，H.&Reynaerts,A.(1970):ThequantitativemeasurementofDNAhybridizationfromrenaturationrates.五wrJ"B/oc/zem12,133-42中所述进行，如Huss,V.A.R"Festl,H.&Schleifer,K.H.(1983):StudiesonthespectrophotometricdeterminationofDNAhybridizationfromrenaturationrates.SystApplMicrobiol4,184-192.中所述对该方法进行修改，使用Cary100型BioUV/VIS-分光光度计，其配有珀耳帖-恒温6x6多室交换器(Peltier-thermostated6x6multicellchanger)和带有原位温度4果测器的温度控制器(Varian)。制备酶多肽的方法本发明还涉及产生本发明的酶的方法，其包括(a)培养包含编码本发明的酶的核苷酸序列的菌抹，所述菌抹能够表达和分泌该酶，和(b)回收所述酶。在具体的实施方式中，所述菌抹是野生型菌林如芽孢杆菌属菌种P203菌林DSM17419,而在另外的实施方式中，所述菌4朱是如上文所述的重组宿主细胞。在本发明的这些方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述酶的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基可从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果酶分泌到营养培养基中，则能够从所述培养基中直接回收该酶。可以j吏用本领域已知的方法回收所得酶。例如，可以通过常^L方法/人营养培养基中回收酶，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提if又、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过本领域已知的多种方法纯化本发明的多肽，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或才是取(参见,侈'H口，jPrafe/w户wnycadow,J.-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本发明的方法还包括WO01/77315Al的TAST方法，将该方法用于以登录号17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的样品，即将来自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹基因组(例如来自基因文库)的基因，通过转座子标记，与编码无信号报告分子如p-内酰胺酶的基因融合；在显示报告分子存在的培养基中，如含有氨千青霉素的培养基中，培养宿主细胞克隆，所述克隆包含与编码无信号报告分子如p-内酰胺酶的基因通过转座子标记融合的、芽孢杆菌属菌种P203菌抹DSM17419的基因；4佥出分泌才艮告分子的克隆；并分离该克隆中包含的、以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的基因和多肽。宿主细胞克隆包含与编码无信号报告分子如(3-内酰胺酶的基因通过转座子标记融合的、来自以登录号17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的基因，在显示报告分子存在的培养基(如含有氨千青霉素的培养基)中培养所述宿主细胞克隆时，将4又;险出(例如存活)表达和分泌所述信号分子(例如P-内酰胺酶)的克隆。然而，只有在下述条件下才会分泌报告分子与报告分子基因融合的基因具有宿主菌株中能够识别的完整启动子和核糖体结合位点(即在现实中(inreallife)由细胞表达而产生多肽的基因)；并且翻译报告分子以将合成多肽转运通过细胞质膜并且正确折叠。因此，将融合基因插入选择的宿主细胞中时，其中检出报告分子存在(例如氨千青霉素抗性)的克隆将含有来自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹的基因，所述基因编码功能性分泌性多肽。转基因植物本发明还涉及转基因植物、植物部分或植物细胞，将其用编码本发明的酶的核苷酸序列转化，从而表达和产生所述酶。在一个实施方式中，能够将植物作为宿主，用于以可回收的量产生酶。可/人才直物或4直物部分回收酶。或者，可以将含有该重组酶的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养i介值、适口性(palatability)和流变性质(rheologicalproperties)，或用于破坏抗营养因子。具体而言，可以将表达该酶的植物或植物部分用作改进的起始材料，用于燃料酒精(foel-alcohol)或生物乙醇(bio-ethanol)的生产。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶才直物的实例是草(grasses),如草地早熟禾(meadowgrass)(蓝草(bluegrass),早熟禾属(尸oa));饲用牧草(foragegrass)如羊茅(festuca)、黑麦草(lolium);寒i也型斗丈草(temperategrass),长口Agrostis;牙口谷类，侈寸浊口,小麦、燕、麦、，繁、麦、大麦、稻(rice)、高粱和玉蜀黍(maize)(玉米)。双子叶植物的实例是烟草(tobacco),豆类(legumes),如羽扇豆(lupins),马铃薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean),和十字花科的(cruciferous)才直物(十字花牙牛(familyBrassicaceae)),如花才耶菜(cauliflower),油菜籽(rapeseed)和紧密相关的模型生物体拟南芥C4raZH^o/whAa/z'a"a)。植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)。具体的植物组织，如叶绿体(chloroplast)、质夕卜体(apoplast)、线斗立体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧4匕物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的子代。表达本发明的酶的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简而言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞将编码本发明的酶的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖成为转基因植物或植物细胞。表达构建体便利地是包含编码本发明的酶的核苷酸序列的核酸构建体，当的调节序列可操作地连接。此外，表达构建体可包含对于鉴定整合了表达构建体的宿主细胞有用的选择性标记，和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。调节序列的选择，如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达酶而确定。例如，编码本发明酶的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的组织或植物部分如种子或叶。调节序歹ll由例如Tague"/.，1988,尸te尸—'o/ogy86:506所述。对于组成性表达，可以使用35S-CaMV(Franck"a/.,1980,CW/21:285-294)。器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(stomgesinktissue)如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards&Coruzzi，1990,^4"".iev.Gew".24:275-303),或来自代谢库组织(metabolicsinktissue)如分生组织的启动子(Ito"a/.,1994,P/a"fMo/.S/o/.24:863-878)，种子特异性启动子如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、3求蛋白(globulin)或白蛋白(albumin)启动子(Wu"a/.,1998,户/aW朋dCe〃尸/7j^/o/ogy39:885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Wc/a/a6a)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad1998，Jowr"a/o/P/am/7y^o/ogy152:708-711)，来自种子油体蛋白(oilbodyprotein)的启动子(Chenefa/.，1998,PlantandCellPhysiology39:935-941)，来自欧洲油菜(^row/cawa/^)的贮藏蛋白napA启动子，或本
技术领域：
已知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的Acs启动子(KyozukaWa/.,1993，尸/aW尸/z;w'o/ogy102:991-1000),小球藻病毒(chlorellavirus)腺嘌呤曱基转移酶(adeninemethyltransferase)基因启动子(MitraandHiggins,1994,尸/a^Mo/ecw/ar26:85-93)，或来自稻的<aWP基因启动子(Kagaya"a/.,1995,Mo/ecw/araw/gewera/ge"幼b248:668-674)，或伤口i秀导型启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu&a/.,1993,P/a"fMo/ecw/ar所o/ogy22:573-588)。启动子增强子元件也可以用于实现本发明的酶在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，将其置于启动子和编码本发明的酶的核苷酸序列之间。例如Xu"a/.,1993,见上，公开了使用稻肌动蛋白l基因的第一内含子以增强表达。选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可用的那些。将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Jgra^cfeWww)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection),粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser1990,Sc/e"ce244:1293;Potrykus,1990,说o/7fec/wo/og);8:535;Shimamotoda/"1989,胸ww338:274)。目前，才艮癌土;裏4干菌(^gra6a"en'wmfwwe/acz'ews)介导的基因转移(genetransfer)是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见HooykasandSchilperoort,1992,户/a^Mo/ecw/"r万/o/ogy19:15-38)。而这种方法也能够用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物通常优选其它转化方法。目前，产生转基因单子叶植物的优选的方法是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织(embryoniccalli)或发育中的胚(developingembryos)(Christou，1992,PteJow雇/2:275-281;Shimamoto,1994,C鮮ewfQpZ"/owAofec/wo/ogv5:158-162;Vasiletal.,1992,&o/Tec/z"o/ogy10:667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法，是基于原生质体转化，如由OmirullehW"/.,1993,尸/a"fMo/ecw/wB/o/ogv21:415-428所描述的。转化之后，根据本领域熟知的方法选择已将表达构建体并入其中的转化体并且再生成为完整植物。本发明还涉及用于产生本发明的酶的方法，其包括(a)在有益于产生所述酶的条件下培养转基因植物或植物细胞，其包含编码本发明的酶的核苦酸序列；和(b)回收所述酶。包含多肽的组合物及其制备本发明提供包含本发明多肽和优选的赋形剂的组合物；和用于制备这种组合物的方法，其包括将本发明的多肽与赋形剂混合。具体而言，所述组合物包含至少两种不同的本发明多肽，优选至少3种，更优选至少4种，更优选至少5种，更优选至少6种不同的本发明多肽。大多数组合物包含将菌抹样品发酵时分泌的全部多肽，所述菌林是以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹，或其突变体，其中缺失或添加了一个或多个基因。在具体实施方式中，本发明的多肽是组合物(例如单组分组合物)中的主要(auxilliaryagent)或化合物，包括溶剂、载体、稳定剂等。所述组合物可以进一步包含一种或多种额外的酶，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶(cutinase)、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、oc-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡糖苦酶、(3-葡糖苷酶、卣素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖香酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。所述组合物可以依照本领域已知的方法制备，并且可为液体或固体组合物的形式。例如，可以使用本领域已知的配制多肽和/或药物产品的方法配制所述酶组合物，例如配制成包覆或未包覆的颗粒(granule)或微颗粒(micro-granule)。因此可以将本发明的多肽以下述形式提供颗粒，优选无粉尘(non-dusting)颗粒，液体，尤其是稳定的液体，浆液或保护多肽(protectedpolypeptide),对于一些应用，可能优选将多肽固定在固体基质上。可以板照本领域已知的方法使包括在组合物中的多肽稳定，例如通过添加限制多肽氧化的抗氧化剂或还原剂使组合物中的多肽稳定，或通过添加聚合物如PVP、PVA、PEG或其它有益于固体或液体组合物中多肽稳定性的合适聚合物使其稳定。在进一步的实施方式中，本发明的组合物是洗涤剂组合物，除本发明的多肽之外，所述组合物还包含表面活性剂和任选的选自下组的化合物增清剂(builders)如沸石，漂白剂如过石友酸盐，漂白增强剂(bleachenhancers)如TAED或NOBS,抑泡剂，芳香剂(fragrants)等。在进一步的实施方式中，本发明的组合物是饲料组合物，除本发明的多肽之外，所述组合物包含谷类(cereal)或谷物(grain)产品。在进一步的实施方式中，本发明的组合物是包含本发明多肽的食品组合物，如烘烤用面粉组合物(baker'sflourcomposition)、酉良造产品(brewedproduct)、果汁、油或猪油(lardproduct)产品。在进一步的实施方式中，本发明的组合物是制浆组合物(pulpingcomposition),除本发明的多肽之外，所述组合物还包含浆状物(pulp)。多肽或包含它们的组合物的用途在更进一步的方面，本发明提供本发明的多肽或多核苷酸或包含所述多肽或多核苷酸的组合物在本文用于商业研究目的的多种应用中的用途，特别是在(技术)处理如工业上或家庭中进行的处理中的用途。因此，本发明包含方法，其包括将本发明的多肽或本发明的多核苷酸用于(技术)工业、研究或家庭处理(householdprocess)中。在一个实施方式中，将本发明的多肽或组合物用于清洁纤维素织物。在另一个实施方式中，将本发明的多肽或组合物用于制备食品或饲料添加剂。而在另一个实施方式中，将本发明的多肽或组合物用于处理木素分解(lignolitic)材料和浆状物。具体而言，可以使用碳酸酐酶从C02排放流中固定碳，例如在使用碳酸酐酶从气流分离C02的膜反应器中，将其用于例如发电烟气排出管(electricalgenerationfluegasstack)、温室气体中的应用，也可用于非常失见应用如驾马史员座抢(pilotcockpit)和宇航员太空服，以保持呼吸气体中C02不在毒性水平。在另一个实施方式中，碳酸酐酶通过产生能够与溶于含水介质的离子(特别是二价离子如钙)复合的碳酸氢根(bicarbonate),并且辅助这些离子从含水介质中絮凝或沉淀，从而对于促进水从含水介质中的纯化或矿化是有用的。在一些应用中，能够使用这种沉淀作用来降低水硬度，而在其它应用中，如在造纸方法中，或在土壤和岩石的修复(remediation)中，这种沉淀作用可以具有增加某些产品的重量、体积或不透明性(opacity)的额外益处。此外，也可以使用碳酸酐酶作为药物开发的靶，所述药物如^友酸酐酶抑制剂(例如磺胺类(sulphonamide)衍生物)。洗涂剂7〉开可以将本发明所述多肽添加至洗涤剂组合物，并且由此成为洗涤剂组合物的成分。可以将本发明的洗涤剂组合物例如配制为手洗或机洗的洗涤剂组合物，包括适合于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和添加了漂洗剂的织物柔软剂组合物，或将其配制为用于通常家庭硬表面清理操作的洗涤剂组合物，或配制用于手洗或机洗的餐具洗涤(dishwashing)操作。在具体的方面，本发明提供包含本发明的酶的洗涤剂添加剂。所述洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它酶，如蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶，和/或过氧化物酶。通常所选酶的性质应该与选择的洗涤剂相容(即，最适pH，与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶应该以有效量存在。蛋白酶合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。其中包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。所述蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性樣t生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶(subtilisin),特别是源自芽孢杆菌属的那些，例如，枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源)和镰孢属蛋白酶，在WO89/06270和WO94/25583中描述。有用的蛋白酶的实例是在WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的变体，特别是在一个或多个以下位置具有取代的变体27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。优选的商业上能够获得的蛋白酶包括Alcalase⑧、Savinase、Primase、Duralase、Esperase⑧和Kannase(NovozymesA/S)，Maxatase、Maxacal⑧、Maxapem、Properase、Purafect、PurafectOxP、FN2⑧和FN3(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自如下的脂肪酶腐质霉属(同物异名嗜热霉属(77^rmom少ces)),例如，来自疏棉状腐质霉(H/a"wgz'"o;a)(细毛嗜热霉(7:/am^/"ayM力)如EP258068和EP305216中所述，或来自特异腐质霉如WO96/13580中所述，假单胞菌属(尸"i^omoww)月旨肪酶，例如，来自产碱假单胞菌CR0/0//^"^)或类产碱假单胞菌(户(EP218272)、洋葱假单胞菌(Pcepac/a)(EP331376)、施氏假单胞菌(户(GB1，372，034)、荧光假单胞菌(P^7wo/^cms)、假单胞菌属菌种菌抹SD705CWO95/06720和WO96/27002)、Pw^cora/"era&(WO96/12012)、芽孢杆菌属脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(DartoisWa/.,1993，所oc/^w/cad所o/^;^ca^cto,1131:253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(5.pww7w)(WO91/16422)的脂肪酶。其它实例是例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中描述的那些脂肪酶变体。优选的商业上能够获得的脂肪酶包括LipolaseTM、LipolaseUltraTM和Iipex(NovozymesA/S)。淀粉酶合适的淀粉酶(oc和/或P)包括细菌和真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程化的变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属获得的a-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的特殊菌抹，在GB1,296,839中有更详细的描述。有用的淀粉酶的实例是在WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体，特别在一个或多个以下位置具有取代的变体15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商业上能够获得的淀粉酶是DuramylTM、TermamylTM、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S)、Rapidase和Purastar(GenencorInternationalInc.)。纤维素酶合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属菌属的纤维素酶，例如，产生自特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢的真菌纤维素酶，其公开于US4,435,307、US5,648,263、US5，691，178、US5,776,757和WO89/09259。特别合适的纤维素酶是碱性或中性纤维素酶，其具有保护颜色的益处(colourcarebenefits)。这种纤维素酶的实例是在EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5，686，593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT7DK98/00299中描述的那些。商业上能够获得的纤维素酶包括Celluzyme和Carezyme(Novozymes)、Clazinase⑧和PuradaxHA(GenencorInternationalInc.)和KAC-500(B)(KaoCorporation)。过氧化物酶/氧化酶合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Opn'"附)(例如，来自灰盖鬼伞(C."'"eww))的过氧化物酶，及其变体，如在W093/24618、WO95/10602和WO98/15257中描述的那些。商业上能够获得的过氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含所有这些酶的组合添加剂可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。可将本发明的洗涤剂添加剂(即单独的添加剂或组合的添加剂)配制成例如，颗粒(granulate)、液体、浆等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，具体为无粉尘(non-dusting)颗粒，液体，具体为稳定的液体，或浆。例如，可以如美国专利号4,106,991和4,661,452中所公开的产生无粉尘颗粒，并且可以任选地通过本领域已知的方法包覆。蜡制包覆材料(waxycoatingmaterial)的实例是具有1000至20000的平均摩尔质量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG);具有从16至50个的环氧乙烷单元的乙lL^化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中醇含有从12至20个碳原子，并且其中具有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单S交甘油酯和甘油二酯和甘油三酯。适用于流化床技术的成膜涂覆材料的实例提供于GB1483591。例如，可根据已经建立的方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来稳定液体酶制剂。可以根据公开于EP238,216中的方法来制备保护酶。本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒、糊剂或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70°/。的水和0-30%的有机溶剂，或是非水的(non-aqueous)。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，其可以是非离子的，包括半极性的和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。所ii^面活性剂通常以按重量计0.1%至60°/。的水平存在。当包括于此时，所述洗涤剂将通常含有大约1%至大约40%的阴离子表面活性剂，如线性烷基苯磺酸酯(alkylbenzenesulfonate)、a-烯烃磺酸酯(olefmsulfonate)、烷基硫酸酯(alkylsulfate)(脂肪醇硫酸酯(fattyalcoholsulfate))、醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)、仲链烷石黄酸酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸，或肥皂(soap)。当包括于此时，洗涤剂将通常含有大约0.2%至大约40%的非离子表面活性剂，如醇乙lL&化物、壬基苯酚乙氧基化物、烷基聚糖苷(alkylpolyglycoside)、烷基二曱基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylatedfattyaddmonoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物("葡糖酰胺(glucamide)")。洗涤剂可以含有0-65%的洗涤剂增清剂或复合剂例如沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸酯(phosphonate)、碳酸盐(carbonate)、杵檬酸盐、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶硅酸盐或分层珪酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例是羧曱基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咬-N-氧化物)、聚(乙烯咪唑)、聚羧酸酯(polycarboxylates)如聚丙烯酸酯(polyacrylates)、马来S^/丙烯酸共聚物和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗涤剂可以含有漂白体系，其可以包含H202源如过硼酸盐或过碳酸盐，其可以与形成过酸的漂白激活剂如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯磺酸(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。或者，漂白体系可以包含过氧酸，例如，酰胺、二酰亚胺(imide)或石风类型的过氧酸。可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的酶，所述常规稳定剂例如，多元醇如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸书t生物，例如，芳香硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物如4-曱酰苯基硼酸(4-formylphenylboronicacid)，并且可以例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制所述组合物。洗涤剂还可以含有其它常规洗涤剂成分，例如，织物整理剂(fabricconditioner)包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、防腐蚀剂、悬污剂、防污物再沉积剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂(opticalbrightener)、水溶助剂(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnishinhibitors)或香料。目前预期的是，可将任何酶(特别是本发明的酶)以相当于每升洗涤液0.01-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液0.05-5mg酶蛋白，特别是每升洗涤液0.1-1mg酶蛋白的量添加到洗涤剂组合物中。本发明的酶可以额外地并入〃/Hf于WO97/07202的洗涤剂配制物，WO97/07202并入本文作为参考。保藏的微生物本发明的申请人根据关于用于专利程序的国际认可的微生物保藏的布达佩斯条约将以下微生物保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeglb,D-38124Braunschweig,Germany):2005年6月23日；芽孢杆菌属菌种P203菌抹；DSM登录号DSM17419。实施例实施例1:鉴定由芽孢杆菌属菌种P203菌抹，DSM17419分泌的功能性多肽A.基因组文库构建使用标准分子生物学技术(Ausubleetal.1995"CurrentprotocolsinmolecularbiologyPubl:JohnWileyandsons)从芽孑包杆菌属菌种P203菌才朱(DSM17419)中制备染色体DNA。将制备的DNA用她o/部分切割，并且通过超速离心按蔗糖梯度分离。提取3-10千碱基(kilobase)的片段，使其沉淀并在适当的緩冲液中重悬。4吏用StratageneZAPExpressTM预消化载体试剂盒和StratageneZAPExpressTM预消化Gigapack②克隆试剂盒(BamHI预消化的)(StratageneInc.,USA),根据经销商的指导/建议制备基因组文库。所得lambdaZAP文库包含L25xl06个蚀斑形成单位(pfh)，收集其中的40,000个用于大量切除(massexcision)。汇集(pool)所得的10,000个大肠杆菌菌落，并且使用QiagenSpinMinipr印试剂盒(Qiagen，Germany)制备质粒。将含有质粒DNA的大约1ml洗脱物用1体积份的乙酸钠pH5和2体积份的96%乙醇在离心机中以20000rpm在4。C沉淀，用70°/。(体积/体积)乙醇洗涤，在室温干燥，并且在20(H效升TE缓冲液中重悬。芽孢杆菌属菌种P203菌抹的质粒汇集物(plasmidpool)DNA的DNA浓度为0.7^效克Af敖升。B.转座子构建和制备TransposonAssistedSignalTrapping(转座子辅助的信号捕获；TAST)方法学中的基本原理，如WO01/77315A1中所述，是将所选基因组内的全部基因通过转座子标记与编码无信号P-内酰胺酶的基因融合。因此，宿主细胞克隆包含与编码无信号(3-内酰胺酶的基因通过转座子标记融合的基因组基因，将所述宿主细胞克隆在含有氨千青霉素的培养基中培养时，只有那些表达和分泌(3-内酰胺酶的克隆存活。然而，只有在下述条件才会分泌(3-内酰胺酶与J3-内酰胺酶基因融合的基因具有宿主菌抹能够识别的完整启动子和核糖体结合位点(即在现实中由细胞表达而产生多肽的基因)；并且翻译(3-内酰胺酶，从而将合成多肽转运通过细胞质膜并且正确折叠。因此，将融合基因插入选择的宿主细胞中时，那些氨千青霉素抗性的克隆含有编码功能性分泌性多肽的基因。通常在使用TAST方法学时，甚至不需要表达完整的基因。用转座子标记基因时，基因N末端部分表达为蛋白融合体(proteinfusion)显示该基因含有完整的转录、翻译和分泌序列。因此，通常认为基因N末端部分表达为蛋白融合体足以确保完整基因的表达和分泌。由此可得出以下结论，通过TAST方法获得的基因实际上确实编码分泌性功能性多肽。含有卩-内酰胺酶报告基因的5VgJ4转座子的构建根据WO01/77315Al的指导，使用标准分子生物学技术构建含有无信号卩-内酰胺酶基因的转座子。首先使用较读聚合酶(proofreadingpolymerase)(PfiiTurbo，Stratagene,USA)从载体pUC19)中PCR扩增出无信号|3-内酰胺酶基因。所得PCR片段含有辅助克隆的限制位点A^I和五coiI。质粒pEntranceposon(Cam，含有Entranceposon和抗生素抗性标记C4r(在转座子中编码氯霉素抗性)，该质粒获得自Finnzymes，OY(EspooFinland)。将所述质粒用限制酶Mrt和五co贝消化，凝胶纯化，并且与含有无信号P-内酰胺酶的片段连接。将连接物(ligation)转化到电感受态的(electro-competent)DH10B细胞中，并且通过限制分析鉴定了含有重组质粒的大肠杆菌克隆，所述重组质粒具有无信号(3-内酰胺酶，将这种大肠杆菌克隆命名为SigA2。对于转座子制备，如下构建出较小的SigA2衍生物，其缺乏编码J3-内酰胺酶的Wa基因使用两个寡核芬酸引物SigA2NotU-P5'-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3，(SEQIDNO:15)和SigA2NotD-P5，扁CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3,(SEQIDNO:16),其向夕卜(directingoutward)结合至SigA2中Wa基因的起始和终止处，PCR扩增无Wa基因的SigA2。将这种PCR反应中产生的大约3,6kb的扩增物重新连接(relegate)并且转化至合适的大肠杆菌菌抹中。从能够在LB氯霉素上生长而不能在LB氨千青霉素上生长的转化体中分离3,6kb的质粒。这种质粒保留了两个BglII位点，并且缺乏活性基因，将该质粒称为pSig4(参见专利申请PA2004000010)。用BglII消化60微升浓度为0.3微克/微升的pSigA4质粒DNA制备物，并在琼脂糖凝胶上分离。洗脱2kb的SigA2转座子DNA条带，使用"GFXTMPCR,DNAandGelBandPurificationKit"(AmershamPharmaciaBiotechInc,USA)根据经销商的说明纯化并且在200微升EB緩冲液中洗脱。C.转座子标记从pSigA4制备的转座子携带编码P-内酰胺酶的5，-截断的基因，其中已将分泌信号去除。p-内酰胺酶仅在蛋白被分泌至周质时赋予大肠杆菌氨千青霉素抗性，而细胞质表达p-内酰胺酶不赋予氨千青霉素抗性。没有信号序列，J3-内酰胺酶将不被转运至周质，因此克隆不会在含有氨千青霉素的培养基上生长。将无信号p-内酰胺酶基因包含在转座子内时，使转座子边缘(border)和p-内酰胺酶编码区之间是连续的开读框。以这种方式，将修饰的转座子转座至编码分泌性蛋白的基因中时，能够引发与靶基因以符合读框的方式(inframe)融合。其产生分泌至大肠杆菌周质的融合基因产物，并且赋予对氨苄青霉素的抗性。如果将转座子即使以符合读框的方式整合入编码非分泌性蛋白的基因，相应的宿主也不会成为氨千青霉素抗性。对于芽孢杆菌属菌种P203菌抹基因组文库的体外转座子标记，将250纳克的SigA2转座子与2.5微克芽孢杆菌属菌种P203菌抹基因组文库质粒汇集物DNA的DNA浓缩物、2.5孩i:升的FinnzymesMuATransposase(0，22microgram/microliter)和IO微升来自FinnzymesOY(Espoo,Finland)的5x緩沖液混合成总体积50微升，并且在30。C温育3小时，之后在75。C热失活10分钟。如下将DNA沉淀添加5微升3M乙酸钠pH5和110微升96%乙醇，在-20。C温育20小时，并在20000rpm离心30分钟。将粒状沉淀用70%乙醇洗涤、干燥并在IO微升TE緩沖液中重悬。D.转化和选l奪将电感受态的大肠杆菌DH10B细胞通过在BioradGenePulse设备上根据制造商的说明进行电穿孔转化(50uF、25mAmp、1.8kV,使用5樣么升经转座子标记的质粒汇集物，将其与1mlSOC培养基混合，在37。C预温育1小时并且铺于含25微升/毫升氨千青霉素、50微升/毫升卡那霉素、10微升/毫升氯霉素的LB上，并在30。C温育2-3天。从抗性转化体中选择1152个菌落。4吏用Templyphi500试剂盒(AmershamBiosciences)才艮据制造商的说明通过滚环扩增(rollingcircleamplication)从信号捕获文库中制备用于DNA测序的模板)。E.质粒制备和测序对大约500个经转化子标记的质粒用A2up引物AGCGTTTGCGGCCGCGATCC(SEQIDNO:13)测序，所述引物向上游读码至转座子标记的基因中；并且，在第二反应中，用B引物TTATTCGGTCGAAAAGGATCC(SEQIDNO:14)测序，所述31物向下游读码至转座子标记的基因中。R序列装配和注释使用程序PhredPhrap将获得的序列装配成重叠群(contig)(BrentEwing,LaDeanaHillier,MichaelC.Wendl，andPhilGreen,Base-callingofautomatedsequencertracesusingphredI.Accuracyassessment(1998)GenomeResearch8:175-185;BrentEwingandPhilGreen,Base-callingofautomatedsequencertracesusingphredII,Errorprobabilities(1998)GenomeResearch8:186-194)。其后将获得的重叠群与标准公开的DNA和蛋白质序列数据库中的可用序列进行比较，所述比较使用程序BLASTX2.0al9MP-WashU[M-Jul-1998][Buildlinux-x8618:51:4430-Jul-1998](Gish,Warren(1994-1997).Unpublished;Gish,WarrenandDavidJ.States(1993).Identificationofproteincodingregionsbydatabasesimilaritysearch.Nat.Genet.3:266-72》获得的序列是功能性基因，其编码完整的并且是功能性的多肽，因为它们是作为氨千青霉素抗性克隆获得的，如上文中所说明。实施例2:通过同源性确定功能通过与已知功能的基因或多肽的序列比对来注释多肽SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12的功能。将本发明的多肽与重叠群公开数据库和内部数据库中一系列紧密关联(closestrelated)序列进行比较。随后使用程序BLASTX2.0al9MP-WashU[14-Jul-1998]将重叠群与能够在标准公开DNA和蛋白序列数据库中获得的序列比4交。将SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12与其它数据库中同它们最紧密关联的、具有已知功能的序列进行序列比对，对所述序列比对的仔细分析使得基于氨基酸同一性程度来预测这些多肽的功能成为可能。即使当整体氨基酸同一性在40%以下，通常难以做出良好的预测时，我们能够通过仔细分析和理解(interpret)多肽序列的催化位点或重要区域的氨基酸残基，来预测SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12的功能。如果已知序列中催化位点的氨基酸同样存在于本发明的多肽中，与充分的整体氨基酸同一性结合，得出以下结论来自芽孢杆菌属菌种P203(DSM17419)的多肽与已知序列具有相同的功能。实施例3:制备SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12的多肽为了制备SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12的多肽，通过如下方法表达SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中包含的编码这些多肽的基因将编码开读框的DNA与在适当宿主菌抹中适合于基因表达的启动子、核糖体结合位点和终止子DNA融合，所述适当宿主菌抹例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌或芽孢杆菌属菌种P203菌抹的衍生物。所述启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。可以将任何信号序列与其它细菌的合适信号肽交换。表达构建体可以是质粒或线性DNA的一部分。其能够通过重组整合到宿主菌抹的基因组中，或能够存在于宿主细胞中的质粒上。然后，将携带目标基因的转化细胞以期望的体积在合适培养基中培养。如果使用的是诱导型启动子，基因表达通过添加诱导物来起始。否则不需要诱导物，而培养细胞直至合适量的蛋白从目标基因产生。然后收获培养物并且通过标准方法回收蛋白。实施例4:蛋白酶可以分析合成并且分泌丝氨酸蛋白酶的宿主菌抹培养液或细胞溶解产物在合适的緩冲液中的所述活性。将合适体积的这种样品点样(spoton)至琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL-酪蛋白(Megazymetm)和追当pH的适当緩沖剂。将所述平板在适当的温度，例如55°C温育适当的时间，例如一天。活性可以作为样点周围的蓝色晕圈(halo)观察到。作为AZCL-酪蛋白的替代物，可以使用未标记的酪蛋白。在未标记的酪蛋白点样的琼脂糖平板上，在丝氨酸蛋白酶存在时形成澄清区域。实施例5:多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶多聚鼠李半乳糖醛酸是果胶的毛状区(hairyregion)中存在的主要多糖。多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶(PL4和PL11)和多聚鼠李半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)(GH28)是能够降解果胶的多聚鼠李半乳糖醛酸主链的酶，但对于均聚半乳糖醛酸(homogalacturonan)不具特异性。在合适温度，例如30。C，在适当的緩冲液中，使用适当体积的合成并且分泌多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶的宿主菌株培养液或细胞溶解产物用于测量活性。将适当体积的这种样品点样至琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL-多聚鼠李半乳糖醛酸I(Megazyme)。将平板在适当的温度，例如30。C,温育合适的时间，例如一天。活性可以作为样点周围的蓝色晕圈观察到。作为替代物，可将AZCL-半乳聚糖或AZCL-脱支阿聚糖(AZCL-debranchedarabinan)或未标记的马铃薯果胶半乳聚糖或多聚鼠李半乳糖醛酸添加至琼脂平板或作为底物溶液添加到酶试验。酶活性能够作为样点澄清区域周围的蓝色晕圈检出，或通过Mutter,M.etal,,C7zarac欣iz(3"'owo/Aecom6z'"awfi/wm"oga/acfwrawa"^^pergz.〃wsacw/eams,PlantPhysiol.(1998)117:141—152和McKie，V.etal.,^ce〃w/o化，Biochem.J.(2001)355，167-177/>开的方法才全出。实施例6:木聚糖酶木聚糖酶是内作用的(endo-acting)酶，其切割|3-1，4-木糖聚合物。对于酶制备物中内-l,4-木糖聚酶的测量可以使用XylanaseAssayKit(Megazyme)。或者，在合适的温度，例如30。C，在适当的緩冲液中，使用适当体积的合成并且分泌木聚糖酶的宿主菌抹培养液或细胞溶解产物用于测量活性。将适当体积的这种样品点样至琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL-木聚糖或AZCL-阿拉伯木聚糖(Megazyme)。将所述平板在适当的温度，例如30。C,温育适当的时间，例如一天。活性可以作为样点周围的蓝色暈圈观察至ij。实施例7:半乳聚糖酶这种类型的蛋白是半纤维素酶，其能够水解短的木-寡糖(shortxylo-oligosaccharide)，例如阿聚糖。可以测试适当緩冲液中合成或分泌木糖苷酶的宿主菌抹培养液或细胞溶解产物的所述活性。在合适的温度，例如30。C,在适当的緩冲液中，使用适当体积的合成并且分泌木聚糖酶的宿主菌抹培养液或细胞溶解产物用于测量活性。将适当体积的这种样品点样到琼脂糖平板上，所述平板含有不溶性显色底物AZCL-阿聚糖(Megazyme)。将所述平板在适当的温度，例如30。C，温育适当的时间，例如一天。活性可以作为样点周围的蓝色晕圈观察到。实施例8:在枯草芽孢杆菌中表达芽孢杆菌属菌种P203菌林的碳酸酐酶将地衣芽孢杆菌a-淀粉酶(AmyL)的信号肽通过PCR以符合读框的方式融合于编码碳酸酐酶的基因(SEQIDNO:3)。将编码所得编码序列的DNA通过同源重组整合在枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组上。在三启动子系统(triplepromotersystem)的调控下表达所述基因构建体(如WO99/43835中所述)，所述系统由包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌ct^//"启动子、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(a/^丄)和解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(amy0的启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因作为标记(例如Diderichsenetal.，爿we/w/c/ow/"gvec/or^br5acz7/wssw6ri//5.尸/osm/d，30，p.312,1993中戶斤述)。通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以验证正确的构建体DNA序列。选择了一个这样的克隆。碳酸酐酶(SEQIDNO:4)表达克隆的发酵在旋转摇床(rotaryshakingtable)上的1L带挡板的Erlenmeyer摇瓶中进行，所述摇瓶每个含有400ml补充以34mg/1氯霉素的LB培养基。将克隆在25-30°C发酵3天。根据Wilbur,K.M.andAnderson,N.G"五/ecrowen'ca"<ico/or/mefn.cdeferw/打"howo/c<ar6ow/c朋/z)Wraw，JBiolChem，1948，176，p.147-154测定碳酸酐酶活性。或者，以对-硝基苯酚乙酸酯(para-nitrophenolacetate)作为底物，冲艮据Chirica,L.C.etal.,7/e//co6ac&rpy/on;Biochim.Biophys.Acta，2001,1544,p.55-63可将石友酸酐酶活性测量为酯酶活性。标准试验含有900微升PNPA、10孩i升300mMTrispH7.5和90微升碳酸酐酶蛋白溶液。预温育5分钟之后，将酶添加至PNPA緩冲混合物，并且在10分钟的时间内，以分光光度法监测石英比色皿(quartzcuvette)中在348nm吸光度的增力口(由于底物的水解和对硝基苯酚的释放)。作为两个活性试验中的阳性对照，可以使用牛碳酸酐酶的溶液(Calbiochem,1mg每mL)。实施例9:在大肠杆菌中表达芽孢杆菌属菌种P203菌林的碳酸酐酶作为实施例8的替换方法，可以将碳酸酐酶在大肠杆菌中表达。使用基因特异性引物BOCAfWd(5，TAGTCCGTACATATGAGAAAAACAA3，)(SEQIDNO:17)和BOCArev(5，TTCAAAGCTTATAGTGAAATCCAACT3，)(SEQIDNO:18)从芽孢杆菌属菌种P203基因组DNA(用QiagenGenomicDNAKit,19060提取)扩增了碳酸酐酶PCR产物(SEQNO.3)，通过将pGEM-T载体(Promega)和所述碳酸酐酶PCR产物(SEQNO.3)连接来产生质粒pEG131377-9。将所述质粒用作才莫板来产生质粒pETBlueCA。通过如下方法构建用于在大肠杆菌中表达碳酸酐酶的质粒pETBlueCA:用基因特异性引物pQECAfWd(5'ATCCGCATGCTGAGAAAAACAAA3')(SEQIDNO:19)和pQECArev(5'AATTAAGCTTAATAGTGAAATCCAACT3，)(SEQIDNO:20)从质粒模板pEG131377-9进行PCR扩增，之后将所述PCR产物与线性pETBlue-1AccepTorTM载体系统(Novagen)根据制造商的说明连接。将质粒转化到化学感受态大肠杆菌NovaBlueSinglesTM细胞(Novagen)中，用于蓝白筛选。三种质粒的插入通过DNA测序来验证，所述测序使用引物pETBkieUP、pETBlueDOWN(Novagen,在插入区侧翼的引物)和引物CAmitSEQrev(5，CACTTGGTGAATGGAAATG3，)(SEQIDNO:21)。发现质粒pETBlueCA克隆8号(pETBlueCA8)是正确的，并且将其转化至化学感受态大肠杆菌Tuner(DE3)pLacI细胞中，用于在lac启动子(IPTG诱导型)的调控下过量表达来自芽孢杆菌属菌种P203的碳酸酐酶。实施例10:芽孢杆菌属菌种P203菌抹的碳酸肝酶(SEQIDNO:4)的纯化和表征纯化将培养液离心(10000g，15分钟)，将上清小心地/人沉淀物倾析。将汇集的培养物上清通过错流过滤(crossflowfiltration)(MW截留(cut-off)10,000Da)浓缩至体积的1/10，并且在碳酸酐酶特异性层析柱上纯化。对于来自S"W/wj//朋^W/em^的重组碳酸酐酶的纯化，制备高选择性亲和柱。原则上，如前所述制备亲和片主(Khalifah，R,G.etal.,Gar6o"-73"wc/e<arwagwe/z'cmsw""cepra6eo/a"/ve-5"/fe/o"/z加'ora/z膽""c^r厶om'c"w/zj^oye万，Biochem.1977，16，p.2241-7)，但进行以下改变将磺胺(sulfonamide)配体4-氨基曱基苯磺酰胺(4-aminomethylbenzenesulfonamide)(0,2g,Sigma)溶解在12mL偶耳关缓冲液中(O.lMNaHC03,pH8,0.5MNaCl)。将1g活化的CHS印harose4BTM(AmershamBiosciences)溶解在大约20ml1mMHCl中，并且用250mL1mMHCl在烧结玻璃(sinteredglass)滤器上充分洗涤。用6mL1mMHCl从所述滤器洗脱凝胶，将其加至50mLFalcon管内溶解的配体中。将混合物在室温颠倒地(end-over-end)轻柔旋转1小时。为了去除过量的配体，用250mL偶联緩冲液洗涤凝月交。通过用0.1MTris-HCl,pH8洗涤凝月交并且在该^i冲液中温育1小时来进行任何剩余活性基团的封闭。封闭之后，使用三个循环的a)250mL0.1MTris,pH8，0.5MNaCl和b)0.1M乙酸钠，pH4,0.5MNaCl来洗涤凝月交。将凝胶转移至烧杯，使用之前用加样緩冲液D(0.25MNa2S04，25mMTrispH83)充分(extensively)洗涤。将5mL亲和介质(affinitymedia)添加至50mL浓缩的实施例8的培养液中，或添加至实施例9的无细胞粗蛋白提取物。将悬液在室温平稳地搅拌1小时，随后倒入柱中，依靠重力将柱填实。用加样体积IO倍体积的緩冲液D彻底洗涤柱直至不再才全测到蛋白。通过关闭出口并且添加10ml洗脱M^冲液E(0.4MKSCN,25mMTrispH8.3)来开始碳酸酐酶的洗脱。将柱以适度摇动温育10分钟之后，收集500微升级分。在第一活性级分之后，汇集含有碳酸酐酶活性的级分(通常为级分4-10)。将汇集的级分在具有MW10,000Da截留的Centricon装置中(Millipore,于4000xg)使用10倍体积碳酸酐酶贮存緩沖液(storagebuffer)F(100mMTris-HClpH8.0，50pM石克酸锌)彻底地进行再緩沖(re-bufferedintensively)。将纯化的碳酸酐酶的等分试样贮藏在-20°C，直到进一步使用。纯化的重组碳酸酐酶在SDS聚丙烯酰胺凝胶上显示单一的蛋白条带。表征才艮4居K.M.andAnderson,N.G"￡7ecromerz'c<awdco/cWmefn'ccfeferm/"ado"o/caAom'ca"/z;^ra",JBiolChem，1948,176,p.l47-154来测定碳酸酐酶活性。测试纯化的重组碳酸酐酶在4-60。C、1和17小时的温度稳定性。发现蛋白在緩冲液F中在4。C、l周是稳定的，活性损失最小(原始活性的97±4%)，并且在室温(20。C，原始活性的95±4%)是稳定的。蛋白在緩沖液F中在-20。C贮存一周之后，未检测到活性损失(原始活性的99±4%)。碳酸酐酶的稳定性在超过37。C的温度迅速降低(参见图2)。发现将重组碳酸酐酶贮存在补充以1mM二硫苏糖醇(DTT)的緩沖液F中使该酶稳定。重组碳酸酐酶的抑制研究使用叠氮离子和特异性碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺(acetazolamide)(Sigma)来进行。用于叠氮化物的ICso值是500^M，用于乙酰唑胺的IC5。值是0.09^M,在7.5乙酰唑胺存在时观察到完全抑制(参见图3)。通过二价和三价金属离子、叠氮化物和其它试剂来抑制碳酸酐酶通常用于蛋白质科学中(参见图4):使用以下抑制剂:<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>表l:抑制剂将酶与lmM所述物质以总体积5(M效升在冰上预温育1小时，之后用10微升的所述混合物按WilburandAnderson,1948方法测试活性。将无添加剂(水)的对照设置为100%活性。在总试验体积中，当给定的浓度为lmM时，对于洗涤剂TritonX100和离子Fe3+及Cr2+(表1中用星号标记)的试验有所不同。改为提供25浓度的化学品时的活性。实施例11:半乳聚糖酶的表达将地衣芽孢杆菌a-淀粉酶(AmyL)的信号肽通过PCR以符合读框的方式融合于编码半乳聚糖酶的基因(SEQIDNO:12)。将编码所得编码序列的DNA通过同源重组整合在枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组上。在三启动子系统的调控下表达所述基因构建体(如WO99/43835中所述)，所述系统由包括稳定序列的苏云金芽孢杆菌c^y/tt4启动子、地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因(am少丄)和解淀粉芽孢杆菌a-淀粉酶基因(flm少0的启动子组成。使用编码氯霉素乙酰转移酶的基因4乍为才示^己(例长口Diderichsenetal"^/c/owz'"gve"or5fl"7/w■yw^'/k30，p.312，1993中所述)。通过DNA测序分析氯霉素抗性转化体以验证正确的构建体DNA序列。选择了一个这样的克隆。半乳聚糖酶(SEQIDNO:12)表达克隆的发酵在旋转摇床上的500ml带挡板的Erlenmeyer摇瓶中进行，所述摇瓶每个含有100ml补充以34mg/1氯霉素的LB培养基。将克隆在30。C发酵3天。用OPNG作为底物测定活性。实施例12:芽孢杆菌属菌种P203菌抹半乳聚糖酶活性的验证试验.-将50微升实施例17的无细胞上清添加至750微升的溶于50mM磷酸緩沖液pH7.6中的4.5mM邻-硝基苯基半乳吡喃糖芬(ortho-nitrophenylgalactopyranoside)(ONPG)溶液中。将混合物在40。C温育15分钟，通过添加300孩t升1M碳酸钠终止反应。在光i普测量之前将溶液在13,000rpm离心1分钟，如有必要用水稀释。用光学法在420nm测量邻-硝基酚盐(o-nitrophenolate)的吸光度。权利要求1.功能性多肽，其由芽孢杆菌属菌种Bacillusplakortiensis的菌株基因组中包含的多核苷酸编码，所述菌种以登录号DSM17419保藏。2.分离的成熟功能性多肽，其可获得自以登录号DSM17419保藏的细菌菌株芽孢杆菌属菌种P203。3.权利要求2的多肽，其选自下组(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基断列与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽的序列具有至少70%同一性；(b)由核苦酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在高严紧条件下与选自下组的多核苷酸探针杂交(i)核香酸序列的互补链，所述核芬酸序列选自下组SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区，(ii)核苷酸序列中包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列选自下组SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区；(c)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:IO和SEQIDNO:12中包含的成熟多肽的片段；其中所述多肽具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的相应成熟多肽的功能。4.权利要求2的多肽，其中所述多肽是具有选自下组的功能的酶木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶。5.权利要求4的酶，其选自下组(a)具有氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与选自SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟酶的氨基酸序列具有至少70%同一性；(b)由核苷酸序列编码的酶，所述核苷酸序列在高严紧条件下与选自下组的多核苷酸探针杂交(i)核香酸序列的互补链，所述核香S复序列选自下组SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟酶的区；(ii)核苷酸序列中包含的cDNA序列的互补链，所述核芬酸序列选自下组SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区；(c)SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的成熟酶的片段，并且其中所述酶具有SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10和SEQIDNO:12中包含的相应成熟多肽的功能。6.权利要求2的多肽，其中编码所述多肽的多核苷酸由选自下组的核苷,列组成SEQIDNO:1、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11中编码成熟多肽的区或由于遗传密码的筒并性而与之有所不同的序列。7.分离的酶，其选自下组(a)包含氨基酸序列的酶，所述氨基酸序列与选自木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶的成熟酶的氨基酸序列具有至少70%同一性，所述酶由以登录号DSM17419保藏的菌抹芽孢杆菌属菌种P203的菌4朱分泌；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在高严紧条件下与选自下组的多核香酸探针杂交(i)核苷酸序列的互补链，所述核香酸序列包含于以登录号DSM17419保藏的菌抹芽孢杆菌属菌种P203的菌抹中，并编码选自下组由所述菌株分泌的成熟酶木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶；(ii)核苷酸序列中包含的cDNA序列的互补链，所述核苷酸序列包含于以登录号DSM17419保藏的菌抹芽孢杆菌属菌种P203的菌抹中，并编码选自下组由所述菌抹分泌的成熟酶木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶；(c)成熟酶的片段，所述成熟酶选自下组木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶，所述酶由以登录号DSM17419保藏的菌抹芽孢杆菌属菌种P203的菌抹分泌；其中所述酶具有选自下组的功能木聚糖酶、丝氨酸蛋白酶、碳酸酐酶、多聚鼠李半乳糖醛酸裂合酶和半乳聚糖酶。8.包含权利要求1-7的多肽的组合物。9.权利要求8的组合物，包含至少两种不同的权利要求1-7的多肽，优选至少3种，更优选至少5种，更优选至少10种，更优选至少15种，更优选至少20种不同的权利要求l-7的多肽。10.权利要求8的组合物，包含将芽孢杆菌属菌种P203菌株DSM17419或其突变体的样品发酵时分泌的全部多肽，所述突变体中缺失或添加了一个或多个基因。11.权利要求8的组合物，进一步包含一种或多种额外的酶。12.权利要求8的组合物，其特征在于是洗涤剂组合物，其除所述多肽之外，还包含表面活性剂。13.权利要求8的组合物，其特征在于是饲料组合物，其除所述多肽之外，还包含谷类或谷物产品。14.权利要求8的组合物，其特征在于是食品组合物。15.权利要求8的组合物，进一步包含多糖或多糖的混合物。16.用于制备权利要求8的组合物的方法，包括将权利要求1-7的多肽与贝武形剂混合。17.多核苷酸，其具有编码权利要求1-7的任一项中限定的多肽的核苷酸序列。18.包含权利要求17的多核苦酸的组合物。19.核S吏构建体，其包含权利要求17中限定的核芬酸序列，所述核苷酸序列与一个或多个在宿主细胞中指导所述多肽产生的调控序列可操作地连接。20.包含权利要求19的核酸构建体的重组表达载体。21.包含权利要求19的核酸构建体的重组宿主细胞。22.用于产生权利要求l-7的多肽的方法，其包括(a)培养菌抹以产生多肽，所述菌抹以其野生型形式能够产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。23.用于产生权利要求1-7的多肽的方法，其包括(a)在有益于产生多肽的条件下培养如权利要求22中限定的重组宿主细胞；和(b)回收所述多肽。24.权利要求23的方法，其包括(i)将来自以登录号DSM17419保藏的芽孢杆菌属菌种P203菌抹基因组的基因，经由转座子标记，与编码无信号报告分子的基因融合，(ii)在显示所述报告分子存在的培养基中培养宿主细胞克隆，所述克隆包含芽孢杆菌属菌种P203菌抹(DSM17419)的经融合的基因，(iii)检出分泌报告分子的克隆，和(iv)分离该克隆中包含的芽孢杆菌属菌种P203菌4朱(DSM17419)的基因和多肽。25.适合用于电子设备的存储介质，其包含权利要求1-7的多肽的氨基酸序列信息或权利要求17的多核苦酸的核苦酸序列信息。26.—种方法，其包括在工业或家庭技术方法中使用权利要求1-7的多肽或权利要求17的多核苦酸。全文摘要本发明公开了新菌株芽孢杆菌属菌种P203(Bacillusplakortiensis)；还公开了获得自以登录号DSM17419保藏的细菌菌株芽孢杆菌属菌种P203的分离的成熟功能性多肽。文档编号C12N9/50GK101243181SQ200680030011公开日2008年8月13日申请日期2006年8月15日优先权日2005年8月16日发明者普雷本·尼尔森,莱因哈德·威尔廷,马丁·博彻特申请人:诺维信公司