枯草蛋白酶的制作方法

专利名称：：枯草蛋白酶的制作方法枯草蛋白酶序列本申请含有以下序列SEQIDNO:l-编码芽孢杆菌属菌种(Bacillussp.)菌抹Zi344的枯草蛋白酶(subtilase)的DNA。核酸337至1143编码成熟枯草蛋白酶。SEQIDNO:2-芽孢杆菌属菌种菌抹Zi344的枯草蛋白酶的氨基酸序列。成熟枯草蛋白酶是氨基酸113至381。SEQIDNO:3-编码芽孢杆菌属菌种菌抹EP655的枯草蛋白酶的DNA。核酸343至1149编码成熟枯草蛋白酶。SEQIDNO:4-芽孢杆菌属菌种菌抹的枯草蛋白酶的氨基酸序列。成熟枯草蛋白酶是氨基酸115至383。SEQIDNO:5-编码芽孢杆菌属菌种菌抹p203的枯草蛋白酶的DNA。核酸343至1149编码成熟枯草蛋白酶。SEQIDNO:6-芽孢杆菌属菌种菌抹p203的枯草蛋白酶的氨基酸序列。成熟枯草蛋白酶是氨基酸115至383。SEQIDNO:7至SEQIDNO:27是人工引物。SEQIDNO:28-编码芽孢杆菌属菌种菌4朱EP63的枯草蛋白酶的部分DNA序列。SEQIDNO:29-芽孢杆菌属菌种菌株EP63的枯草蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQIDNO:30-编码芽孢杆菌属菌种菌株ZI120的枯草蛋白酶的部分DNA序列。SEQIDNO:31-芽孢杆菌属菌种菌抹ZI120的枯草蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQIDNO:32-编码芽孢杆菌属菌种菌林ZI130的枯草蛋白酶的部分DNA序列。SEQIDNO:33-芽孢杆菌属菌种菌抹ZI130的枯草蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQIDNO:34-编码芽孢杆菌属菌种菌抹ZI132的枯草蛋白酶的部分DNA序列。SEQIDNO:35-芽孢杆菌属菌种菌抹ZI132的枯草蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQIDNO:36-编码芽孢杆菌属菌种菌抹ZI340的枯草蛋白酶的部分DNA序列。SEQIDNO:37-芽孢杆菌属菌种菌抹ZB40的枯草蛋白酶的部分氨基酸序列。SEQIDNO:29、31、33、35和37的氨基酸序列是将C-末端截短的成熟枯草蛋白酶。保藏微生物称为p203的野生型菌抹于2005年6月23日根据布达佩斯条约以保藏号DSM17419保藏在德意志微生物和细胞培养物保藏中心。所述保藏物含有本文称为p203A的枯草蛋白酶基因，所述基因与SEQIDNO:5相同。发明领域本发明涉及来自芽孢杆菌属(Bacillus)野生型菌抹的新的枯草蛋白酶，还涉及构建和产生这些蛋白酶的方法。此外，本发明涉及要求保护的所述枯草蛋白酶在洗;条剂，^口-冼衣-洗〉奈剂或自动;先石宛洗;条剂(automaticdishwashingdetergent)中的用途。发明背景在洗涤剂工业中，使用酶作为洗涤配制物(washingformulation)的一部分已经超过30年。从商业的前景看，蛋白酶是这些配制物中关联最大的酶，但是也经常使用其它的酶包括脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或酶的混合物。对具有适当性质的蛋白酶的探求既包括发现天然存在的蛋白酶，即所谓的野生型蛋白酶，也包括改变熟知的蛋白酶，例如通过对编码所述蛋白酶的核酸序列进行遗传操作来改变。通常用于洗涤剂的一个蛋白酶家族是枯草蛋白酶。将这个家族进一步分为6个不同的亚组(SiezenR丄andLeunissenJ.A.M.:1997,ProteinScience,6，501-523)。这些亚组之一的枯草溶菌素(Subtilisin)家族被进一步分成亚组"真枯草溶菌素(I-S1)"、"高碱性蛋白酶(I-S2)，，和"胞内蛋白酶"。Siezen和Leunissen也鉴定出某些枯草溶菌素家族的蛋白酶，但是不属于任何所述亚组。真枯草溶菌素包括蛋白酶如枯草溶菌素BPN，(BASBPN)、枯草溶菌素Carlsberg(ALCALASE,NOVOZYMESA/S)(BLSCAR)、肠系膜肽酶(mesentericopeptidase)(BMSAMP)和枯草溶菌素DY(BSSDY)。高碱性蛋白酶包括蛋白酶如枯草溶菌素309(SAVINASE,NOVOZYMESA/S)(BLSAVI)、枯草溶菌素PB92(BAALKP)'、枯草溶菌素BL或BLAP(BLSUBL)、枯草溶菌素147(ESPERASE,NOVOZYMESA/S)、枯草溶菌素仙台(subtilisinSendai)(BSAPRS)和碱性弹性蛋白酶YaB。在这种对枯草溶菌素家族的分组之外，近来还基于其成员的三维结构鉴定出另外的枯草溶菌素亚组，TY145样枯草溶菌素。TY145样枯草溶菌素包括蛋白酶如TY145(芽孢杆菌属菌种TY145的枯草蛋白酶，NCIMB40339,在WO92/17577中描述)(BSTY145)、枯草溶菌素TA41(BSTA41)和枯草溶菌素TA39(BSTA39)。最初在NovoNordiskA/S的WO93/18140中对蛋白酶的PD138型进行了物理化学性的描述，其中公开了一种产生此类型蛋白酶的菌林。在WO93/18140中，基于免疫交叉反应(immunologicalcrossreaction)描述了蛋白酶的PD138型，所述反应使用针对纯化的蛋白酶的多克隆兔抗体进行。公开了所述蛋白酶的初级结构。之后，将产生这种蛋白酶的芽孢杆菌属菌种在分类学上戈'j分为Bac/〃z^g^so""(Nielsenetal.1995)。5acz'〃wsgz'feom'z'的才莫式冲朱与WO93/18140中描述的菌林相同。WO2003/054184和WO2003/054185公开来自Bacz7/wg/Zwom7的菌株的碱性枯草蛋白酶。发明简述本发明人已分离了属于枯草溶菌素家族的PD138样蛋白酶亚组的新蛋白酶，其具有有利的性质，如低温时在洗涤剂中改进的性能。附图简述图1,基于比对构建显示成熟枯草蛋白酶肽序列关系的系统树(phylogenetictree),所述比对使用DNAStar程序包中程序MegAlignTM版本5.05的ClustalV功能中的默认设置。图2.序列比对，所述序列由PCR筛选图1获得。定义在进一步详细讨论本发明之前，将首先对以下术语和惯例进行定义。术语"枯草蛋白酶，，指根据SiezenWa/.，/Voto'"4(1991)719-737和Siezenetal.Sc/e"ce6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶的亚组。丝氨酸蛋白酶或丝氨酸肽酶是蛋白酶的亚组，其特征在于在活性位点具有丝氨酸，它与底物形成共价加合物(adduct)。此外，枯草蛋白酶(和丝氨酸蛋白酶)的特征在于除丝氨酸之外具有两个活性位点氨基酸残基，即组氨酸和天冬氨酸残基。枯草蛋白酶可分成6个亚分区(sub-divisions),即枯草溶菌素家族、Thermitase家族、蛋白酶K(ProteinaseK)家族、羊毛碌u抗菌肽酶(Lantibioticpeptidase)家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。枯草溶菌素家族(EC3.4.21.62)可以进一步分为3个亚组，即I-Sl("真，，枯草溶菌素)、I-S2(高碱性蛋白酶)和胞内枯草溶菌素。酶的定义或分组可以变化或改变，然而，在本发明的上下文中，以上将枯草蛋白酶分成亚分区和亚组的划分应理解为Siezenetal"Prafe/打4(1991)719-737andSiezenetal./Voe/"Sc/e"ce6(1997)501-523中所述的。术语"亲本"在本发明的上下文中应理解为对其进行修饰以产生蛋白变体的蛋白。亲本蛋白可以是天然存在的(野生型)多肽，或可以是其通过任何适当的方法制备的变体。例如，亲本蛋白可以是天然存在的蛋白的变体，其已经通过取代、化学修饰、缺失或截短天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸残基，或通过将一个或多个氨基酸残基添加或插入天然存在的多肽中的氨基酸序列而进行了修饰。因此术语"亲本枯草蛋白酶"指对其进行修饰以产生枯草蛋白酶变体的枯草蛋白酶。"同源性，，或"与......同源"在本发明的上下文中应该以其常规含义理解，两个氨基酸序列之间的"同源性"应<吏用UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup(UWGCG)程序包的GAP程序中定义的"相似性"来确定，使用比对参数、比较矩阵、缺口和缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)的默认设置。GAP罚分的默认值，即GAP产生罚分(GAPcreationpenalty)为3.0和GAP延伸罚分为0.1(ProgramManualfortheWisconsinPackage,Version8,August1994,GeneticsComputerGroup,575ScienceDrive,Madison,Wisconsin,USA53711)。所述方法也描述于S.B.NeedlemanandC.D.Wunsch,JournalofMolecularBiology,48,443-445(1970)中。同一性能够从相同的计算中求得。两个氨基酸序列之间的同源性也能够使用UWGCG程序包版本9.1的GAP程序通过"同一性"或"相似性，，来确定，使用比对参数、比较矩阵、缺口和缺口延伸罚分的默认设置，应用时也可以使用以下参数缺口产生罚分=8和缺口延伸罚分=8,全部其它参数保持它们的默认值。所述程序的输出除了氨基酸比对之外，还有对两个序列之间"百分比同一性，，和"相似性，，的计算。使用UWGCG程序包版本9.1计算的数字与版本8的稍有不同。术语"位置"在本发明的上下文中应理解为在肽或多肽中从所迷肽/多肽的N末端计数的氨基酸编号(thenumberofanaminoacid)。依赖于枯草蛋白酶所属的亚组，本发明中使用的位置编号涉及不同的枯草蛋白酶。发明详述产生新枯草溶菌素的菌抹的筛选在对产生新枯草蛋白酶的芽孢杆菌属菌林的搜寻中，我们基于与万"C/〃Mg/foom'/相关的16SrDNA相似性选择了许多菌抹。将芽孢杆菌属菌抹P203、EP655、ZI344、EP63、ZI120、ZI130、ZI132和ZI140在标准芽孢杆菌属发酵培养基(BP-X，添加0.1MNaHCO3以将pH调至9)中发酵。能够以免疫学方法通过交叉反应同一性测i式(cross-reactionidentitytest)来测定免疫化学性质。能够根据N.HAxelsen，Handbookofimmunoprecipitation-in-gelTechniques.BlackwellScientificPublications(1983傳5和14章，通过串联交叉免疫电泳(tandemcrossedimmunoelectro-phoresis)，或通过熟杀口的奥克4争洛尼平4反只又向免疫扩散法(ouchterlonydoubleimmunodiffusionprocedure)来进行所述同一性测试。术语"抗原同一性"和"部分抗原同一性"在同书的第5、19和20章中描述。使用AlcalaseTM作为标准来分析培养液的蛋白酶活性。将具有10CPU/L或更高活性、的培养液包括在免疫分析中。所述分析包括两种不同的多克隆兔抗体；AB41是针对PD138蛋白酶产生的抗体(WO93/18140)。另外的抗体是针对PD490蛋白酶产生的AB65(未公布)。所述分析得出两组针对AB41具有部分反应的蛋白酶。其中一组也对AB65具有部分反应，而另一组与AB65的反应同一(reactidenticalwithAB65)。第三组包括PD138,得到与AB41的同一反应并且与AB65的部分反应。PCR筛选将编码如上所述显示新免疫化学性质的蛋白酶的基因部分用标准PCR反应扩增，所述PCR反应使用从可用序列设计的PCR引物，参见实施例1。用DNASTARTM分析核苷酸序列，并且基于以PD138作为基准的核苷酸序列多样性，确认了用抗体鉴定的新组。以来自PCR筛选的序列为基础的系统树示于图1。来自PCR筛选的序列的ClustalV比对示于图2。本发明的全长枯草蛋白酶的克隆和表达反向PCR用特异性DNA引物和从适当细菌菌抹提取的染色体DNA进行反向PCR,将所述引物设计为与获得自部分蛋白酶基因的PCR产物的DNA序列互补。对菌株P203、EP655和ZI344进行反向PCR，而不对菌林EP63、ZI120、ZI130、ZI1342和ZI140作进一步研究。对反向PCR产物进行核苦酸测序，以获得编码基因N和C末端部分的区域。全长枯草蛋白酶的产生用特异性引物扩增枯草蛋白酶基因，所述引物在引物的5'端具有限制性位点，使其能够与质粒pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryinAstab/Sav(US5,955,310)的Savinase信号肽基因融合。选择蛋白酶阳性菌落，并且通过DNA序列分析确认由该表达构建体表达的酶的编码序列。本发明的枯草蛋白酶本发明的枯草蛋白酶包括来自芽孢杆菌属菌抹ZI344、EP655、P203、EP63、ZI120、ZI130、ZI1342和ZI140的枯草蛋白酶，分别如SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35和SEQIDNO:37中所示。WO2003/054184公开来自万acz'〃wg/feom7，DSM14393的碱性蛋白酶，所述菌抹与ZI344具有大约85.9%氨基酸序列同一性，并且与EP655和P203具有大约87%氨基酸序列同一性。此外，来自^^7/wsg/^o"/z',DSM14393的碱性蛋白酶与来自ZI120和ZI130的枯草蛋白酶(SEQIDNO:31和33)的部分序列具有88.2%同一性；与来自EP63、ZI132和ZI340的枯草蛋白酶(SEQIDNO:29、35和37)的部分序列分别具有88.1%、86.8%和83.8%同一性。编码Sa"7/wj^'&yow7,DSM14393的蛋白酶的核酸序列与SEQIDNO;l是大约75.5%同一的，并且与SEQIDNO's:3和5是大约80.2°/0同一的。编码Bac/〃wsg/Zwow7,DSM14393的蛋白酶的核酸序列与编码ZI340(SEQIDNO:36)、ZI120(SEQIDNO:30)、ZI130(SEQIDNO:32)、EP63(SEQIDNO:28)和ZI132(SEQIDNO:34)的枯草蛋白酶部分序列成熟部分的核酸序列分别是72.2%、75.7%、75.7%、76.2%和75.5%同一的。因此，本发明的枯草蛋白酶与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37是至少90%同一的。优选地，所述枯草蛋白酶与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37是至少91%同一的，更优选所述枯草蛋白酶与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37是至少92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一的。相应地，根据本发明的枯草蛋白酶由如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所示的分离的核酸序列编码。优选地，所述核酸序列与SEQIDNO:l，SEQIDNO:3或SEQIDNO:5是至少81%同一的，更优选所述核酸序列与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36是至少82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或至少99%同一的。此外，编码本发明枯草蛋白酶的分离的核酸序列与SEQIDNO:l,SEQIDNO:3，SEQIDNO:5，SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所示核酸序列的互补链，在如下所述的低严紧条件，至少在中严紧条件，至少在中/高严紧条件，至少在高严紧条件，至少在非常高严紧条件下杂交。杂交.决定核香酸探针和同源DNA或RNA序列之间杂交的合适实验条件包含将含有待杂交的DNA片段或RNA的滤纸(filter)在5xSSC(氯化钠/杵檬酸钠，Sambrooketal.1989)中预浸10分钟；并将所述滤纸在5xSSC、5xDenhardt溶液(Sambrooketal.1989)、0.5%SDS和100pg/ml声处理变性的鲑精DNA(Sambrooketal.1989)的溶液中预杂交；之后在含有浓度为lOng/ml随机引物(randomprimed)(Feinberg，A.P.andVogelstein,B.(1983)所ocAem.132:6-13)、32p-dCTP标记的(比活性〉1x109cpm/jig)探针的相同溶液中，在大约45。C杂交12小时。随后对于不同的严紧条件，在2xSSC、0.5。/。SDS中，和至少55。((低严紧性)，更优选至少60。C(中严紧性)，还更优选至少65。C(中/高严紧性)，甚至更优选至少70。C(高严紧性)，并且甚至更优选至少75°C(非常高严紧性)，将滤纸洗涤两次30分钟。变体组合》f饰本发明还包含任何上述枯草蛋白酶变体与对其氨基酸序列进行任何其它修饰的组合。特别预想的是与其它本领域已知的、为酶提供改进性质的修饰组合。这些组合包含位置222(改进氧化稳定性)，218(改进热稳定性)，使酶稳定的Ca"-结合位点中的取代，例如位置76，和许多其它从现有技术中显而易见的位置。在进一步的实施方式中，本文描述的枯草蛋白酶变体可以有利地与在以下位置中任一的一种或多种修饰組合27、36、56、76、87、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、120、123、167、170、206、218、222、224、232、235、236、245、248、252和274(BPN'编号方式)。新枯草蛋白酶因为在以下位置36、57和158至162的缺失而与BPN，的初级结构不同。新枯草蛋白酶比BPN，短6个氨基酸。表达和分离蛋白的方法为了表达本发明的酶，通常在允许期望的分子产生的条件下在适合的营养培养基中培养上述宿主细胞，所述宿主细胞已经用包含核酸序列的载体转化或转染，所述核酸序列编码本发明的酶，培养之后从该细胞或培养液中回收这些分子。用于培养宿主细胞的培养基可以是任何适合于培养所述宿主细胞的常规培养基，如含有适当补充物的复合培养基(complexmedia)或基本培养基。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公布的成分制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。可以使用本领域已知的方法制备培养基(参见，例如，关于细菌和酵母的参考文献；Bennett,J.W.andLaSure，L.,editors,MoreGeneManipulationsinFungi,AcademicPress,CA，1991)。如果本发明的酶分泌至营养培养基中，可以将它们直接从该培养基中回收。如果它们未分泌，可以将它们从细胞溶解产物中回收。可以通过常规方法从培养基中回收本发明的酶，所述常规方法包括通过离心或过滤从培养基分离宿主细胞；通过盐例如硫酸铵的方法沉淀上清或滤出液中的蛋白质成分；依赖于所述的酶，通过多种层析方法进行纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。可以使用本领域已知的、对于这些蛋白有特异性的方法检测本发明的酶。这些检测方法包括特异性抗体的使用、产物的形成或底物的消失。例如，可以使用酶试验以测定分子的活性。用于测定各种类型的活性的方法是本领域已知的。可以通过多种本领域已知的方法纯化本发明的酶，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦(IEF))、差示溶解度(例如，硫S吏铵沉淀)或提取(参见，1"列长口，ProteinPurification,J-CJansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。将包含编码本发明的酶的DNA序列的表达载体转化/转染至异源宿主细胞中时，有可能实现该酶的异源重组生产。使用异源宿主细胞的优势是有可能产生高度纯化的酶组合物，其特征在于不含在同源宿主细胞中表达蛋白或肽时通常存在的同源杂质。在本上下文中，同源杂质的意思是源自同源细胞的任何杂质(除本发明的酶之外的其它多肽)，本发明的酶最初从该同源细胞获得。洗涤剂应用可以将本发明的酶添加至洗涤剂组合物并且由此成为该洗涤剂组合物的成分。包括适合于预处理沾污织物的洗衣添加剂组合物和漂洗添加的织物柔软剂组合物；或可配制成用于一般家庭硬表面清洁搡作的洗涤剂组合物；或可配制用于手洗或4几洗洗碗操作，特别是用于自动洗碗(ADW)。在具体的方面，本发明提供包含本发明的酶的洗涤剂添加剂。洗涤剂添加剂以及洗涤剂组合物可以包含一种或多种其它的酶，例如蛋白酶、脂肪酶、角质酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶(mannanase)、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶，和/或过氧化物酶。通常所选酶的性质应与选择的洗涤剂相容(即最适pH、与其它酶和非酶成分的相容性等)，并且所述酶应该以有效量存在。蛋白酶:合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些蛋白酶。微生物来源是优选的。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选是碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶-样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草溶菌素，特别是源自芽孢杆菌属的那些枯草溶菌素，例如，枯草溶菌素Novo、枯草溶菌素Carlsberg、枯草溶菌素309、枯草溶菌素147和枯草溶菌素168(在WO89/06279中描述)。胰蛋白酶-样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和WO89/06270和WO94/25583中描述的镰孢属(i^sahww)蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是WO92/19729、WO98/20115、WO98/20116和WO98/34946中描述的变体，特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。优选的商业上能够获得的蛋白酶包括Relase、Alcalase、Savinase、Primase、Everlase、Esperase、Ovozyme、Coronase、Polarzyme和Kannase(NovozymesA/S)、Maxatase、Maxacal、MaxapemTM、Properase、Purafect、PurafectOxP、FN2、FN3、FN4TM和PurafectPrimeTM(GenencorInternational,Inc.)、BLAPX和BLAPS(Henkel)。脂肪酶:合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(/^mz'co/a)(同物异名嗜热霉属(77^mom;;ces))的脂肪酶，例如EP258068和EP305216中所述来自疏棉状腐质霉/a"wgz'"osa)(细毛嗜热霉(73/朋wg/"osw")的脂肪酶或WO96/13580中所述来自特异腐质霉(//./rao/ms)的脂肪酶；假单胞菌属脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌CRa/ca/z'ge"e力或类产碱假单胞菌OR(EP218272)、洋葱假单胞菌CRce/7ac/a)(EP331376)、施氏假单胞菌(Pwwfeen〕(GB1,372,034)、荧光假单胞菌(PyZwomsce"力、假单胞菌属菌种菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、i3w&cora/"m^(WO96/12012);芽孢杆菌属脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartoisetal.(1993),BiochemicaetBiophysicaActa，1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(及(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(5./wm7w力(WO91/16422)。其它实例是脂肪酶变体，例如在WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中所述的那些。优选的商业上能够获得的脂肪酶包括Lipolase和LipolaseUltra(NovozymesA/S)。淀粉酶:合适的淀粉酶(a和/或(3)包括细菌或真菌来源的那些淀粉酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。淀粉酶包括，例如，获得自芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌(及//c/zem/orm&)的特殊菌株的a-淀粉酶，在GB1,296,839中有更详细的描述。有用的淀粉酶的实例是WO94/02597、WO94/18314、WO96/23873和WO97/43424中描述的变体，特别是在以下位置中的一个或多个具有取代的变体15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商业上使用的淀粉酵是Duramyl、Termamyl、Stainzyme、Fungamyl和BAN(NovozymesA/S)、RapidaseTM、Purastar和PurastarOxAmTM(来自GenencorInternationalInc.)。纤维素酶:合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些纤维素酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属(J7z/e/m^)、枝顶孢霉属(Jcwwo"/ww)的纤维素酶，例如从特异腐质霉、嗜热毁丝霉(肘^^//0//^/20决wwop/zz7a)和尖镰孢(Fwsan'wwoxwporam)产生的真菌纤维素酶，如US4,435,307、US5,648,263、US5,691,178、US5,776,757和WO89/09259中所公开的。特别适合的纤维素酶是具有颜色保护(colourcare)益处的碱性或中性纤维素酶。这些纤维素酶的实例是在EP0495257、EP0531372、W096/11262、W096/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其它实例是纤维素酶变体，例如在WO94/07998、EP0531315、US5,457,046、US5,686,593、US5,763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中描述的那些变体。商业上使用的纤维素酶包括Celluzyme、Renozyme⑧和CarezymeTM(NovozymesA/S)、ClazinaseTM*PuradaxHA(GenencorInternationalInc.)和KAC-500(B)TM(KaoCorporation)。过氧化物酶/氧化酶:合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Copn'"w力例如来自灰盖鬼伞(C.c&erew)的过氧化物酶，和它们的变体，如WO93/24618、WO95/10602和WO98/15257中所述。商业上有用的过氧化物酶包括Guardzyme(NovozymesA/S)。半纤维素酶:适合的半纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些半纤维素酶。包括化学修饰的或蛋白质工程的突变体。合适的半纤维素酶包括甘露聚糖酶、地衣酶(lichenase)、木聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、乙酰木聚糖酯酶、葡糖酪酸糖苦酶(glucorunidase)、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶和阿拉伯呋喃糖苷酶，如WO95/35362中所述。合适的甘露聚糖酶在WO99/64619中描述。通过添加含有一种或多种酶的单独的添加剂，或通过添加包含全部这些酶的组合添加剂，可将洗涤剂酶包括在洗涤剂组合物中。能够将本发明的洗涤剂添加剂，即单独添加剂或组合添加剂，配制成例如颗粒(granulate)、液体、浆等。优选的洗涤剂添加剂剂型是颗粒，尤其是无粉尘的颗粒；液体，尤其是稳定化的液体；或浆。无粉尘的颗粒可以例如按US4,106,991和4,661,452中公开的产生，并且可以任选地通过本
技术领域：
已知的方法进行包覆。蜡质包覆材料的实例是具有1000至20000的平均摩尔重量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG);具有16至50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子且其中存在15至80个环氧乙烷单位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的单和二和三酸甘油酯。适于通过流化床技术施用的成膜包覆材料的实例在GB1483591中给出。例如，可以通过才艮据已确定的方法添力口-多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸来使液体酶制备物稳定。保护的酶可根据EP238,216中公开的方法来制备。本发明的洗涤剂组合物可以是任何方便的形式，例如，条、片剂、粉剂、颗粒(granule)、糊剂(paste)或液体。液体洗涤剂可以是含水的，通常含有多至70%水和0-30%有机溶剂，或是非水的。洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂，所述表面活性剂可以是非离子的(包括半-极性的)和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的。表面活性剂通常以，換重量计0.1%至60%的水平存在。当包括于其中时，洗涤剂将通常含有大约1%至大约40%的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸酯(linearalkylbenzenesulfonate)、a-烯烃磺酸酯、烷基硫酸酯(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸酯(alcoholethoxysulfate)、仲烷基磺酸酯(secondaryalkanesulfonate)、a-磺基脂肪酸曱酯、烷基-或烯基琥珀酸或月巴皂(soap)。当包括于其中时，洗涤剂将通常含有大约0.2°/。至大约40%的非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基聚苷(alkylpolyglycoside)、烷基二曱胺氧化物(alkyldimethylamineoxide)、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylatedfattyacidmonoethanolamide)、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酸酰胺，或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物("葡糖酰胺(glucamides)，，)。洗涤剂可以含有0-65。/。的洗涤剂增效剂(builder)或络合剂例如沸石、二磷酸盐/酯、三磷酸盐/酯、膦酸盐/酯(phosphonate)、碳酸盐/S旨、柠檬酸盐/酯、氮川三乙酸(nitrilotriaceticacid)、乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐或层状v圭酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。洗涤剂可包含一种或多种聚合物。实例是羧曱基纤维素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯他啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸盐/酯(polycarboxylate)例如聚丙烯酸盐/酯、马来酸/丙烯酸共聚物和曱基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。洗涤剂可含有漂白体系，所述体系可包含H202源例如过硼酸盐或过碳酸盐，可将其与形成过酸的漂白活化剂例如四乙酰乙二胺或壬酰氧苯石黄酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)组合。可供选择的是，漂白体系可包含过氧酸，例如酰胺、二酰亚胺或^风型的过氧酸。.可以使用常规稳定剂使本发明的洗涤剂组合物中的酶稳定化，所述稳定剂例如，多元醇例如丙二醇或甘油，i瞎或^唐醇，乳酸，硼酸或硼酸^f汙生物，例如，芳香族硼酸酯，或苯基硼酸(phenylboronicacid)衍生物例如4-曱酰苯基硼酸，并且所述组合物可按例如WO92/19709和WO92/19708中所述配制。洗涤剂也可含有其它常规洗涤剂成分例如织物调节剂，包括粘土、泡沫促进剂、抑泡剂、抗腐蚀剂、悬污剂、防污物再沉积剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、助水溶物(hydrotrope)、晦暗抑制剂(tarnishinhibitors)或香料。在洗涤剂组合物中，可以以相当于0.01-100mg酶蛋白每升洗涤液，优选0.05-5mg酶蛋白每升洗涤液，尤其是0.1-1mg酶蛋白每升洗涤液的量添加任何酶，尤其是本发明的酶。还可以将本发明的酶并入WO97/07202中7>开的洗涤剂剂型，将WO97/07202并入本文以作参考。用于自动化洗碗的代表性粉状洗涤剂组合物包括:1)_非离子表面活性剂0.4-2.50/0<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>80:20重量C18/C16的二水合十八烷基二曱胺N-氧化物和二水合十六烷基二曱胺N-氧化物的混合物0-4%70:30重量C18/C16的无水十八烷基二羟乙胺N-氧化物和无水十六烷基二羟乙胺N-氧化物的混合物190-5%<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>非水液体ADW组合物通常包括以下成分:7)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>液体自动洗》宛组合物通常包含以下成分10)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>含有保护的漂白颗粒(protectedbleachparticles)的液体ADW组合物通以下成分11)<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>12)自动洗碗组合物，如l)、2)、3)、4)、6)和10)中所述，其中将过硼酸用过碳酸盐代替。13)自动洗碗组合物，如l)-6)中所述，其额外地含有锰催化剂。所述锰4崔4b剂可以是例长口"Efficientmanganesecatalystsforlow-temperaturebleaching",Nature369,1994，pp.637-639中描述的化合物之一。才才泮牛和方法用于产生枯草蛋白酶变体的方法本发明提供产生分离的根据本发明的酶的方法，其中将已经用编码所述酶的DNA序列转化的合适的宿主细胞在允许该酶产生的条件下培养，并且从培养物中回收所得的酶。将包含编码所述酶的DNA序列的表达载体转化至异源宿主细胞中时，有可能能够异源重组产生本发明的酶。由此有可能制备高度纯化的枯草蛋白酶组合物，其特征在于不含同源杂质。用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适合于培养所述宿主细胞的常规培养基。表达的枯草蛋白酶可以方便地分泌至培养基中，并且可以通过熟知的方法从该培养基中回收，所述方法包括通过离心或过滤从培养基分离细胞；借助盐(例如硫酸铵)培养基中的蛋白质成分；之后是层析方法如离子交换层析、亲和层析等。实施例1菌抹的选择和使用抗体的筛选在对产生PD138组新枯草蛋白酶的芽孢杆菌属菌林的探寻中，我们基于与5ac/〃wg/feow7相关的16SrDNA相似性选择了许多菌抹。将许多这样的芽孢杆菌属菌抹在标准芽孢杆菌属发酵培养基(BP-X,添加0.1MNaHC03以将pH调节至9)中发酵。免疫化学性质能够以免疫学方法通过交叉反应同一性测试(cross-reactionidentitytest)来测定。才艮才居N.HAxelsen,Handbookofimmunoprecipitation-in-gelTechniques.BlackwellScientificPublications(1983),第5禾口14章，可通过串联交叉免疫电泳或通过熟知的奥克特洛尼平板双向免疫扩散法来进行所述同一性测试。使用AlcalaseTM作为标准来分析培养液的蛋白酶活性。将具有10CPU/L或更高活性的液体包括在免疫分析中。所述分析包括两种不同的抗体；AB41是针对PD138蛋白酶产生的多克隆兔抗体(WO93/18140)。另外的抗体是针对从野生型芽孢杆菌属菌种PD4卯分离的细菌溶菌素产生的AB65(未公布)。所述分析表明两组新的蛋白酶具有针对AB41的部分反应。这些组中的一个还对AB65也具有部分反应(EP655、ZI120、EP63、ZI130和ZI132),而另一个组与AB65的反应同一(ZI344和ZI430)。第三组包括PD138蛋白酶，其与AB41的反应同一并且与AB65的反应部分同一。表l.不同的蛋白酶和它们与两种不同抗体的反应<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>用标准PCR反应扩增部分所述枯草蛋白酶基因，使用以下PCR引物PD138A0(SEQIDNO:7)/PD138A2(SEQIDNO:9)产生大约900nt的PCR产物；PD138A1(SEQIDNO:8)/PD138A2(SEQIDNO:9)产生大约450nt的PCR产物；ZI344F(SEQIDNO:10)/PD138A2(SEQIDNO:9)产生大约800nt的PCR产物。GAGGAGGCNGAGTTNGARGC(SEQIDNO:7)，简并符号N代表肌香，R代表A和G的等量混合。AGTTAGCAGATATAAATAATTCAA(SEQIDNO:8),GTGGAGTAGCCATAGATGTACCA(SEQIDNO:9),TGCAAACGAGGTTGAACAGG(SEQIDNO:10)。PCR反应包括50U/ml的Ampli-taqDNA聚合酶(PerkinElmer)、10xAmplitaq纟爰冲液(MgCl2的终浓度为1.5mM)、0.2mM的每种dNTPs(dATP、dCTP、dTTP和dGTP)、0.2pmol/pl的引物和1piDNA模板。使用HighPureTMPCR模板制备试剂盒(BoehringerMannheimart1796828)如制造者对于从细菌中回收DNA的推荐，从多种芽孢杆菌属菌株中回收模板DNA。通过琼脂糖凝胶电泳评估分离的模板的质量。如果存在高分子量条带，则接受该质量。按以下规程运行PCR:94。C，2分钟；40个循环的[94。C30秒，52。C30秒，68。Cl分钟];68。C10分钟后完成。在TAE緩冲液中用溴化乙锭染色的1。/。琼脂糖凝胶上分析PCR产物，以确认大约1050个核苦酸的单一条带。使用QiagenPCR纯化试剂盒如制造者的推荐回收PCR产物。&序列用DNASTARTM分析所述核苷酸序列，并且基于核香酸序列多样性以PD138为基准确认了用抗体鉴定的新组。以来自PCR筛选的序列为基础的系统树示于图1。来自PCR筛选的序列的ClustalV比对示于图2。实施例2全长枯草蛋白酶的产生反向PCR使用限制酶Mlul、EcoRl和Sacl,对菌抹EP655、P203和ZI344的染色体DNA进行三种消化。消化之后，使用QiaquickPCR纯化试剂盒(art.28106,Qiagen，Germany)将DNA与限制酶分离。将消化产物重新连接，并且使用引物(PCR引物SEQIDNO's:ll-16)进行PCR反应，设计所述引物以识别已经获得的PCR产物的序列。应用以下PCR少见程94。C2分钟；30个循环的[94。C15秒，52°C30秒，72°C2分钟];72°C20分钟。在所述PCR中，引物、DNA聚合酶和緩沖液的量与实施例1中相同。可供选择的规程是94。C2分钟，30个循环的[94。C15秒，52。C30秒，68。C3分钟]，68。C20分钟。并且用Long-templateTaqpolymerase(BoehringerMannheim)和为该聚合酶提供的緩冲液代替八11^1^9@和八11^1血9@緩冲液。在用溴化乙锭染色的0.8%琼脂糖凝胶上分析PCR反应产物。将全部PCR片段回收，并且使用特异性寡聚引物测定核苷酸序列，所述引物不同于PCR反应中使用的那些(测序引物SEQIDNO's:17-22)。使用以下引物来获得反向PCR和测序反向PCR引物ZI344-PCR-R(SEQIDNO:13)ACTCTTTGAATGCCCCAAGGZI344画PCR-F(SEQIDNO:14)AGGTGTACTTGTTGTGGCAGEP655-PCR-R(SEQIDNO:15)AGTAATACCCCAAGGCACCGEP655-PCR-F(SEQIDNO:16)GCGGCTTCAGGTAATAACGG测序引物P203A-seq-R(SEQIDNO:17)CAACTCAACTGATAATACGGP203A-seq-F(SEQIDNO:18)TTCTCTCAATATGGTGCAGGEP655-s叫画R(SEQIDNO:19)AATGCATCAACATCTTCAGGEP655-s叫-F(SEQIDNO:20)GGATATCCTGCACGTTATGCZI344-seq-R(SEQIDNO:21)AGTGCTTCTACATCCTCAGGZI344-s叫-F(SEQIDNO:22)AACGTTGGCTACCCTGCACG全长枯草蛋白酶的产生为了产生菌抹P203、EP655和ZI344的枯草蛋白酶，从野生型菌抹的染色体DNA中扩增蛋白酶基因。对于P203,可以使用菌林DSM17419的染色体DNA。将蛋白酶基因扩增为大约1200nt(核苷酸)的PCR产物。对于P203^f吏用引物P203A-Sacl/P203A-BamHl，对于Zi344<吏用引物Z1344-Sac1/ZI344-Mlul，对于EP655使用引物P203A-Sacl/EP655-MLul。模板DNA是相应的野生型芽孢杆菌属菌抹的染色体DNA。引物P203A-Sacl:TTATGGAGCTCCTAAAAATGAGGAGGCGACC(SEQIDNO.23)P203A國BamHl:TGTATGGATCCAAATAGAGACGAAACCGCCC(SEQIDNO.24)EP655-MLul:GATTAACGCGTCTGCTCTTATCGACTAGCGG(SEQIDNO.25)Z1344隱Sacl:TTATGGAGCTCGATCAATACAAGGAGGCGAC(SEQIDNO.26)ZI344-Mlul:GATTAACGCGTGTTCTTTTATCGTGTAGCTG(SEQIDNO.27)EP655-Sacl:4吏用P203A-Sacl。j吏用Qiaquicktm》走转离心柱(spincolumns)4耍推荐地(Qiagen,Germany)回收PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳来评估分离的模板的质量。按以下规程运行PCR:94。C,2分钟；40个循环的[94。C30秒，52。C30秒，68。C1分钟]，68°CIO分钟后完成。在TAE缓冲液中用溴化乙锭染色的1%琼脂糖凝胶上分析PCR产物，以确认正确大小的单一条带。将所述PCR产物用限制酶Sacl和Mlul消化，并且用GFXTMPCRandGelBandPurificationKit(AmerhamBiosciences)纟屯化。将经消化和纯化的PCR片段连接到Sacl和Mlul消化的质粒pDG268NeoMCS-PramyQ/Prcryin/crylIIAstab/Sav(US5,955,3IO)中。使用连接混合物转化到大肠杆菌TOP10F，(InvitrogenBV，TheNetherlands)中，并且选择几个菌落进行小量制备(QIAprep⑧spin,QIAGENGmbH，Germany)。在转化到枯草芽孢杆菌的菌林中之前，检查纯化的质粒中的插入，所述菌抹源自枯草芽孢杆菌DN1885，带有破坏的apr、npr和pel基因(Diderichsenetal(1990),J.Bacteriol.,172,4315-4321)。所述石皮坏基本上如"Ba"7/z^andotherGram-PositiveBacteria,"AmericanSocietyforMicrobiology,p.618,eds.A丄.Sonenshein,J.A.HochandRichardLosick(1993)中所述进行。将转化的细胞铺板至1。/。脱脂乳LB-PG琼脂平板上，所述平板中补充了6吗/ml氯霉素。将铺板的细胞在37。C温育过夜，并且通过周围的澄清区鉴定出含有蛋白酶的菌落。选择蛋白酶阳性菌落，并且通过DNA序列分析确认表达构建体中表达的酶的编码序列。实施例3纯化和表征纯化本方法涉及2升规模发酵的纯化，用于在芽孢杆菌属宿主细胞中产生本发明的枯草蛋白酶。将大约1.6升发酵液在1升烧杯中在5000rpm离心35分钟。使用10%乙酸将上清调节至pH6.5,并且在SeitzSupraS100过滤平板上过滤。使用装配AmiconS1Y10UP柱(cartridge)的AmiconCH2AUF单元，将滤出液浓缩至大约400ml。将UF浓缩物离心，并且在吸收之前将其在室温、pH7于Bacitracin亲和柱上过滤。使用缓冲液中的25%2-丙醇和1M氯化钠在室温从Bacitracin柱洗提蛋白酶，所述緩冲液含0.01M二曱基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化钩调节至pH7。将来自Bacitracin纯化步骤的具有蛋白酶活性的级分组合并且上样在用緩冲液平衡的750mlSephadexG25柱上(5cm直径)，所述緩冲液含有0.01M二曱基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙调节至pH6.5。将来自SephadexG25柱的具有蛋白水解活性的级分组合并且上样在用緩冲液平衡的150mlCMSepharoseCL6B阳离子交换柱上(5cm直径)，所述纟爰冲液含有0.01M二曱基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化钙调节至pH6.5。使用2升相同緩沖液中0-0.1M氯化钠的线性梯度来洗脱蛋白酶。在最终纯化步骤中，将来自CMSepharose⑧柱的含有枯草蛋白酶的级分组合并且在装配GR81PP膜的Amicon⑧超滤元件(Amicon⑧ultrafiltrationcell)(来自DanishSugarFactoriesInc.)中浓缩。实施例4枯草蛋白酶的稳定性能够在标准WesternEuropean洗碗片測型洗涤剂中评估本发明的枯草蛋白酶的稳定性，在所述洗涤剂中，除实验添加的枯草蛋白酶外无其它的酶。能够将枯草蛋白酶的稳定性测定为将洗涤剂中的枯草蛋白酶温育之后的残余蛋白水解活性。将标准WesternEuropeanTablet洗涤剂的配方定义为成分百分比非离子表面活性剂0-10%泡沫调节齐J(Foamregulators)1-10%漂白剂(过石友酸盐或过硼酸盐)5-15%漂白活化剂(例如TAED)1-5%增效剂(例如碳酸盐、磷酸盐、三磷酸盐、沸石)50-75%聚合物0-15%香料、染料等<1%水和填充剂(例如硫酸钠)平衡蛋白水解活性的试验用酪蛋白作为底物测定蛋白水解活性。将一酪蛋白蛋白酶单位(CPU)定义为在标准条件下，即在大约25。C在pH9.5温育大约30分钟，每分钟释放大约1pM的伯氨基的蛋白酶的量(通过与丝氨酸标准物相比来测定)。也可以通过测量所述蛋白酶对琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基酰替苯胺(succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide)的特异性水解来测定蛋白水解活性。首先将所述底物溶解在例如DMSO(二甲亚石风)中，随后在大约0.035M硼酸盐緩沖液、大约pH9.45中稀释大约50倍。可以将全部蛋白酶样品用相同的硼酸盐緩冲液稀释大约5-10倍。将等体积的底物溶液和样品在ELISA读数平板(readerplate)的孔中混合，并且在大约405nm在25。C读iL将全部样品活性和浓度分别标准化至标准蛋白酶溶液活性和浓度。在分析起始之前最多30分钟，将用于自动洗碗的代表性WesternEuropean片剂型洗涤剂在环境温度溶解(5.5g/L)在9°dH水中。将枯草蛋白酶的样品在BrittenRobinson緩冲液(BrittenRobinson緩冲液是40mM磷酸盐、40mM乙酸盐和40mM硼酸盐)pH9.5中稀释至2-4CPU/ml的浓度。对于分析，将每个样品分开在两种条件下进行测试对于对照，将枯草蛋白酶以1:9稀释在BrittenRobinson緩沖液pH9.5中至终体积1ml。在稀释之后立即分析这种样品。对于洗涤剂稳定性，将枯草蛋白酶样品以l:9稀释在洗涤剂溶液(稳定性测试中的洗涤剂浓度是5g/L)中，在分析前30分钟添加酪蛋白底物，并将这些样品在55°C温育30分钟。通过添力。2体积的酪蛋白底物(酪蛋白底物是100mlBrittenRobinson缓冲液pH9.5中的2g酪蛋白(Merck,Hammerstein等级)，当溶液中含酪蛋白时将pH重新调节至9.5)开始所述试验。将样品在25°C保持恒温30分钟。通过添加5mlTCA溶液终止反应(TCA溶液是89.46g的三氯酸、149.48g的三水合乙酸钠和94.5ml的冰醋酸，溶于2.5L去离子水中)。在环境温度将样品温育至少20分钟，再通过Whatman⑧纸滤器42号过滤。将400pl的滤出液与3mlOPA试剂(OPA试剂由以下组成100ml水中的3.812g的硼砂(borax)、0.08%EtOH、0.2%DTT和80mg的邻-肽二醛(o-phthal-dialdehyd))混合。测量340nm的吸光度，并且基于0.01%L-丝氨酸溶液的标准(Merckart.7769)由游离胺的浓度计算CPU。实施例5微量滴定卵试验(microtitereggassay)(MEA)在本试验中，在洗涤剂存在下，能够在96孔孩i量滴定板中追踪蛋白酶对变性卵蛋白的消化。加热卵蛋白产生视觉上的变化和理化性质上的变化。将清澈半透明的材料转化为乳状底物。这一部分因为变性蛋白质的巯基-二硫键互换反应(sulfhydryl-disulfideinterchangereaction)。例如,力口热4吏卵清蛋白的巯基暴露，暴露的基团形成二硫键。依赖于酶降解卵蛋白的能力，蛋白酶对变性卵蛋白的消化使乳状卵溶液转化成更清澈的溶液。方法a)将200mg卵粉(SanovoInternationalAS)溶解在93,7mL水石更度调节至16。dH的水中来制备卯溶液。历时8分钟的时间将温度增加至85。C而使所述卵溶液变性。b)在琥珀酸緩沖液中将枯草蛋白酶稀释至320nM，所述緩冲液10mM琥珀酸+2mMCaCl2+0,02%非离子表面活性剂(如Brij35)，调节至pH6,5;c)在即将使用时，通过混合5g洗涤剂和937.5mL水(16。dH(Ca2+/Mg2+4:1))制备洗涤剂溶液。洗石宛用洗涤剂可以是有代表性的WesternEurope二合一(使用8。dH)或三合一片剂(使用16。dH)或自动洗碗用粉状产品(使用8。dH)。如果所述洗涤剂已经含有蛋白酶，则应该在微波炉中于85°C5分钟来使洗涤剂溶液失活。d)在96孔微量滴定板的每个孔中添加10^1的320nM酶溶液(终浓度20nM)+150^1洗涤剂溶液(终浓度5g/L,16°d)+卵溶液(320吗卵蛋白/孔)。立即(时间0分钟)在分光光度计上测量OD410nm。在55。C温育精确地20分钟，随后再次测量OD410nm。计算AOD并且将变体的性能与参照枯草蛋白酶进行比4支，所述参照如来自NovozymesA/S的Savinase⑧或Alcalase。将参照的性能设定为AOD=100%。通过使用上述方法，将本发明的枯草蛋白酶对变性卵蛋白的消化与Savinase的情况进行比较。结果作为Savinase⑧性能的性能。/。示于表1:表1<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>权利要求1.具有枯草蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽具有氨基酸序列，其为a)如SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35或SEQIDNO37中所示的氨基酸序列；b)与SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO29、SEQIDNO31、SEQIDNO33、SEQIDNO35或SEQIDNO37的序列是至少90％同一的氨基酸序列；或c)由保藏菌株DSM17419中包含的核苷酸序列编码的氨基酸序列。2.具有枯草蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组a)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36是至少81%同一的；或b)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列能够在中/高严紧条件下与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36的核酸序列或其互补链杂交。3.编码具有枯草蛋白酶活性的多肽的核酸序列，所述序列是a)如SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所示的序列;b)与SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中所示序列是至少81%同一的序列；或c)保藏菌抹DSM17419中包含的序列。4.核酸构建体，其包含权利要求3的核酸序列，所述核酸序列与一个或多个能够指导多肽在适合的表达宿主中表达的调控序列可操作地连接。5.重组表达载体，其包含权利要求4的核酸构建体、启动子和转录和翻译终止信号。6.根据权利要求5的载体，其进一步包含选择标记。7.重组宿主细胞，其包含权利要求6的核酸构建体。8.根据权利要求7的细胞，其中将所述核酸构建体包含在载体上。9.根据权利要求8的细胞，其中将所述核酸构建体整合在宿主细胞基因组中。10.根据权利要求9的细胞，其中所述核酸序列编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35或SEQIDNO:37中所列的氨基酸序列。11.根据权利要求10的细胞，其中所述核酸序列列于SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34或SEQIDNO:36中。12.用于产生权利要求1的多肽的'方法，包括(a)培养芽孢杆菌属菌抹以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述多肽。13.用于产生权利要求1的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽表达的条件下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核酸序列；和(b)回收所述多肽。14.根据权利要求1的具有枯草蛋白酶活性的多肽在洗涤剂中的用途。15.洗涤剂组合物，其包含根据权利要求1的具有枯草蛋白酶活性的多肽。16.权利要求15的洗涤剂组合物，其为洗衣洗涤剂或自动洗碗洗涤剂。全文摘要本发明涉及新的枯草蛋白酶，其来自芽孢杆菌属的野生型菌株，特别是芽孢杆菌属菌株ZI344、EP655、P203、EP63、ZI120、ZI130、ZI1342和ZI140；和构建和产生这些蛋白酶的方法。此外，本发明涉及要求保护的枯草蛋白酶在洗涤剂中的用途，所述洗涤剂如洗衣洗涤剂或自动洗碗洗涤剂。文档编号C12N15/00GK101243182SQ200680029980公开日2008年8月13日申请日期2006年8月15日优先权日2005年8月16日发明者普雷本·尼尔森,马丁·博彻特申请人:诺维信公司