改进的氨基酸和代谢物生物合成的制作方法

专利名称：：改进的氨基酸和代谢物生物合成的制作方法
技术领域：
：本公开涉及细菌氨基酸和代谢物生物合成，更具体而言涉及曱硫氨酸和相关的氨基酸和代谢物的生物合成。背景细菌的工业发酵被用以生产商业上有用的代谢物如氨基酸、核苷酸、维生素和抗生素。已经通过随机诱变和突变体的选择产生了许多在这些发酵方法中使用的细菌生产菌抹(Demain，A丄.7>e"A历Wec/7w0/.18:26画31，2000)。在经诱变的生产菌林和这些菌林的衍生物中，二次突变的积累由于使生长和应激耐受性质改变，可降低代谢物生产的效率。生产菌^f朱和相关的细菌生物体的基因组信息的获得，使得人们有机会通过将克隆的核酸引入幼稚的、未经操作的宿主细胞来构建新的生产菌林，从而使氨基酸的生产得以在不存在有害突变的条件下进行(Ohnishi，J.,etal.jpp/M/cra&o/说otec/zwo/,58:217-223,2002)。类似地，这种信息为鉴定和克服现存生产菌抹的局限性提供了机会。概述本文描述了用于在细菌中产生氨基酸和相关代谢物的组合物和方法。本文描述了经工程化改造使氨基酸和相关代谢物的产生增加的细菌菌林，所述氨基酸包括天冬氨酸衍生氨基酸(例如，曱硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和S-腺苷甲硫氨酸(S-AM))和半胱氨酸。可对所述菌林进行基因工程改造使其含有一种或多种编码多肽(例如，与宿主细胞异源或同源的多肽)的核酸分子(例如，重组核酸分子)，和/或可对它们进行改造以增加或减少多肽的表达和/或活性(例如，通过内源核l饼列的突变)。被表达的多肽一一它们可以通过多种本领域技术人员熟知的方法表达一一包括变体多肽，例如具有降低的反馈抑制的变体多肽。相对于蛋白的野生型形式，变体多肽由氨基酸生物合成途径产物或中间物(例如S-腺苷曱硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸或曱硫氨酸)所致的反馈抑制可以有所降低。本文还描述了变体多肽和经遗传修饰从而含有所述核酸的细菌细胞。本文还提供了核酸的组合以及含有所述核酸的组合的细胞。本文还描述了改进的细菌生产菌株，包括但不限于棒状杆菌型细菌(coryneformbacteria)的菌才朱和肠牙干菌牙牛(Enterobacteriaceae)的菌才朱(例i口,大肠调节曱硫氨酸和相关氨基酸和代谢物的产生的细菌多肽包括，例如，涉及曱硫氨酸、天冬氨酸、高丝氨酸、半胱氨酸、硫、叶酸(folate)和维生素B12的多肽。这些多肽包括催化氨基酸生物合成途径的中间物转化成其它中间物和/或终产物的酶；前体、辅因子、中间物或终产物的输入或输出所需的多肽；和调节这些酶和/或输入输出调节物之表达和/或功能的多肽。下文的表l-6列出某些但非全部的相关多肽。图1示意性描述曱硫氨酸生物合成途径，并且指出产生曱硫氨酸生物合成途径中使用的前体和辅因子的额外途径。这些额外途径在图2-4中描述。对于产生氨基酸和代谢物有用的额外多肽和变体在下文中描述。在多种实施方式中，宿主细菌的一种或多种多肽(例如，涉及氨基酸合成的多肽；例如，相对于对照具有减少的活性的内源多肽)的活性减少。减少涉及氨基酸合成的特定多肽的活性可有助于特定氨基酸和相关代谢物的产生的提高。在一个实施方式中，细菌中二氢吡啶二羧酸合酶多肽的表达缺陷(例如，细菌中的内源c^;^基因突变或缺失)。在多种实施方式中，以下多肽中的一种或多种的表达减少mcbR基因产物、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、曱硫氨酸腺苷转移酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、二氨基庚二酸脱氬酶多肽、ABC转运系统ATP-结合蛋白多肽、ABC转运系统通透酶蛋白多肽、葡糖-6-磷酸异构酶多肽、NCgl2640多肽和ABC转运系统底物结合蛋白多肽。在特定实施方式中，腺苷转移酶(pduO)的表达或活性减少或消除。本文描述了各种细菌，包括宿主细菌(例如，棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌如大肠杆菌细菌)，其包含至少一种(例如，一种、两种、三种、四种或更多)选自下组的重组核酸分子(a)包含编码细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(b)包含编码细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(c)包含编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(d)包含编码细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(e)包含编码细菌二氩吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(f)包含编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(g)包含编码细菌高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(h)包含编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(i)包含编码细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(j)包含编码细菌mcbR基因产物多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(k)包含编码细菌O-琥珀酰高丝氨酸/乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(l)包含编码细菌胱硫醚(3-裂合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(m)包含编码细菌5-曱基四氢叶酸高半胱氨酸曱基转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(n)包含编码细菌5-曱基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸曱基转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(o)包含编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(p)包含编码细菌二氨基庚二酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；或(q)编码表6中所列多肽的核酸分子。在多种实施方式中，核酸分子是分离的核酸分子(例如，所述核酸分子不含有在该核酸分子的来源生物体中天然存在于所述序列侧翼的核芬酸序列，例如，所述核酸分子是重组核酸分子)。重组核酸分子是非天然存在的核酸分子；或者是这样的核酸分子它插入到核酸分子中，使得它侧翼的序列是在其来源生物体中不位于其侧翼的序列。例如，插入表达载体中的编码大肠杆菌(3-半乳糖苦酶的核酸分子是重组核酸分子，插入大肠杆菌基因组中其天然位置的位置的编码大肠杆菌p-半乳糖香酶的核酸分子也是重组核酸分子。重组核酸分子的另一个实例是插入除大肠杆菌基因组之外的基因组中的、编码大肠杆菌p-半乳糖苦酶的核酸分子。除非另外指明，本文的任何核酸分子均可以是重组核酸分子。被编码的多肽，即任何表1-6中的多肽，对于宿主细胞可以是同源或异源的。因此，该多肽可以具有通常存在于宿主细胞物种的细胞中的多肽的序胞中5:多肽:序列。因二，、耻祐分:杆菌天冬:酸激酶多肽在耻祐分枝杆菌(聊coZ)acten'wmswegwa他)中表达时，对于宿主细胞是同源的；而在地中海拟无枝酸菌"wyco/ato/w"weWterra"e/)中表达时，其对于宿主细胞是异源的。在多种实施方式中，多肽选自肠杆菌科多肽、放线菌(Actinomycetes)多肽或它们的变体。在多种实施方式中，多肽是以下;^文线菌物种之一的多肽耻祐分牙支杆菌、皮i若卡氏菌(7Vocani/fifybr/m'ca)、天蓝色4连霉菌(5^eptowycascoe//co/w)、777wmoZuy^a/wca、地中海拟无枝酸菌和棒状杆菌型细菌，包括谷氨酸才奉详干菌(Co^y"e6acfen'wmg/wtow/cwm)禾口白口娱才奉才干菌(Co^ywe6acter/ww^/^en'ae)。在多种实施方式中，多肽是以下肠杆菌科物种之一的多肽菊欧文氏菌(五rvW"/ac/7jAS""Ae附/)、古月萝卜4欠腐欧文氏菌(五rvWw'cCarotovora)禾口大肠杆菌。在多种实施方式中，多肽是以下菌种之一的多肽Bac说w/za/c^wrara、丙酉同丁酉孚才炎菌(C/c^r/tZ/wmaceto6M&//cwm)禾口才直物乳杆菌(丄actoZ)a"7/w;7/awton/m)。在多种实施方式中，多肽是以下菌种之一的多肽耻祐分枝杆菌、T7^m2c^诉da/ksca和天蓝色链霉菌。在多种实施方式中，多肽是具有降低的反馈抑制的变体多肽(例如，相对于所述多肽的野生型形式)。在多种实施方式中，细菌进一步包含额外的涉及氨基酸产生的异源细菌基因产物或重组同源细菌基因产物。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码本文所述异源细菌多肽的核酸分子或编码本文所述同源细菌多肽的重组核酸分子(例如，编码异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽的核酸分子)。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码同源细菌多肽(即，宿主物种固有的细菌多肽或其功能性变体)，例如本文所述的细菌多肽的核酸分子。同源细菌多肽能够以高水平表达和/或有条件地表达。例如，编码同源细菌多肽的核酸可以与使得该多肽的表达水平高于野生型水平的启动子可操作地连接；核酸可以以野生型水平表达蛋白，但是通过增加细胞中编码同源多肽的核酸的拷贝数而增加总表达；并且/或者核酸可以以多个拷贝存在于细菌中。在多种实施方式中，编码异源或同源细菌多肽的核酸分子存在于宿主生物体内的附加体上。在多种实施方式中，编码异源或同源细菌多肽的核酸分子整合在宿主生物体的基因组中。在某些实施方式中，宿主生物体既含有一个或多个编码特定同源或异源细菌多肽的附加型核酸分子，又含有一个或多个整合在宿主生物体基因组中的编码特定同源或异源细菌多肽的分子。在多种实施方式中，细菌天冬氨酸激酶或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(d)77ze，o^/^fl/usc"天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(e)菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，和(f)幼ewme〃ao"e^m^天冬氨酸激酶多肽11或其功能性变体。在特定实施方式中，异源细菌天冬氨酸激酶多肽是大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源细菌天冬氨酸激酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌天冬氨酸半醛脱氩酶多肽或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体，(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体，(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体，和(d)T72emw^诉^/ksca天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽是大肠杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或功能性变体。在多种实施方式中，细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，(b)天蓝色链霉菌磷酸烯醇丙酮S臾羧化酶多肽或其功能性变体，(c)7T^mo6折&yksca磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，和(d)菊欧文氏菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌磷酸烯醇丙酮酸夢友化酶多肽是大肠杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽是谷氨S吏棒杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，(b)天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，和(c)77ze簡o6诉da/kyca丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌丙酮酸羧化酶多肽是谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶或其功能性变体。在多种实施方式中，宿主细菌选自棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌例如大肠杆菌细菌。棒状杆菌型细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌Cb^y"e6acfen'ww^ze環oam/"oge"es、乳发酵短軒菌(&eW6acterz'謂/actoy^rwe"/i/w)、吝'L杀豆牙干菌(Srev/6acten'ww/ac^s)禾口黄色4豆^干菌(5rev/6"cter/wm在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为第l组氨基酸残基；位置301的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置311的苏氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置345的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为脯氨酸，位置301的丝氨酸改变为酪氨酸，位置311的苏氨酸改变为异亮氨酸和位置345的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置301的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置311的苏氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置345的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为脯氨酸；位置301的丝氨酸改变为酪氨酸；位置311的苏氨酸改变为异亮氨酸；和位置345的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置282的丙氨酸改变为第l组氨基酸残基；位置304的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置314的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置348的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置282的丙氨酸改变为脯氨酸；位置304的丝氨酸改变为酪氨酸；位置314的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置348的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置328的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置330的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置350的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置352的缬氨酸改变为除缬氨酸之外的第2组氨基酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置328的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置330的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置350的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置35213的缬氨酸改变为甲硫氨酸。在多种实施方式中，幼ew朋e〃aOT^Vfera/s天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置325的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置345的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置347的缬氨酸改变为除缬氨酸之外的第2组氨基酸残基。在多种实施方式中，幼ewa"e〃ao"eWera/s天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置325的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置345的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置347的缬氨酸改变为曱硫氨酸。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为除丙氨酸之外的1组氨基酸；位置301的丝氨酸改变为6组氨基酸残基；位置311的苏氨酸改变为2组氨基酸残基；和位置345的甘氨酸改变为3组氨基酸残基。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为脯氨酸；位置301的丝氨酸改变为酪氨酸；位置311的苏氨酸改变为异亮氨酸；和位置345的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置325的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置345的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置347的缬氨酸改变为除缬氨酸之外的第2组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置325的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置345的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置347的缬氨酸改变为甲硫氨酸。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置458的脯氨酸改变为第4组氨基酸残基。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置458的脯氨酸改变为丝氨酸。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置448的脯氨酸改变为4组氨基酸残基。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置448的脯氨酸改变为丝氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置449的脯氨酸改变为第4组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置449的脯氨酸改变为丝氨酸。还对包含编码细菌二氢吡啶二羧酸合酶或其功能性变体的核酸分子的棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌如大肠杆菌进行了描述。在多种实施方式中，细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体选自耻垢分枝杆菌二氬吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；77z^vwo6折Ja/^ca二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，具有降低的反馈抑制的异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体是大肠杆菌二氬吡咬二羧酸合酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为第2组氨基酸残基；位置88的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；和位置118的组氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为异亮氨酸；位置88的亮氨酸改变为苯丙氨酸；和位置118的组氨酸改变为酪氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置89的天冬酰胺改变为2组氨基酸残基；位置97的亮氨酸改变为6组氨基酸残基；和位置127的组氨酸改变为6组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置89的天冬酰胺改变为异亮氨酸；位置97的亮氨酸改变为苯丙氨酸；和位置127的组氨酸改变为酪氨酸。在多种实施方式中，大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为第2组氨基酸残基；位置81的丙氨酸改变为第2组氨基酸残基；位置84的谷氨酸改变为第5组氨基酸残基；位置88的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；和位置118的组氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为异亮氨酸；位置81的丙氨酸改变为缬氨酸；位置84的谷氨酸改变为赖氨酸；位置88的亮氨酸改变为苯丙氨酸；和位置118的组氨酸改变为酪氨酸。在多种实施方式中，细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自(a)耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；(b)天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氩酶多肽或其功能性变体；(c)TTzwmo&y^fl/wc"高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；和(d)菊欧文氏菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌高丝氨酸脱氢酶多肽是来自棒状杆菌型细菌的高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体(例如，谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氲酶多肽或其功能性变体，或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体)。在特定实施方式中，高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体是大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置23的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置59的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置104的缬氨酸改变为另一种第2组氨基酸残基；位置378的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；和在位置428的赖氨酸氨基酸残基之后截短高丝氨酸脱氢酶蛋白的改变。在一个实施方式中，谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽由WO93/09225中描述的homd""序列编码(SEQIDNO.3)。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置23的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置59的缬氨酸改变为丙氨酸；位置104的缬氨酸改变为异亮氨酸；位置378的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的缬氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置46的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；和位置364的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。16在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的缬氨酸改变为苯丙氨酸；位置46的缬氨酸改变为丙氨酸；和位置378的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的亮氨酸改变为6组氨基酸残基；位置46的缬氨酸改变为1组氨基酸残基；位置362的甘氨酸改变为3组氨基酸残基；在位置412的精氨酸氨基酸残基之后截短高丝氨酸脱氢酶蛋白的改变。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置46的缬氨酸改变为丙氨酸；位置362的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，7T^rmoZ)诉^高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置192的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置228的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置545的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，77zemw6诉^/^ca高丝氨酸脱氢酶多肽在位置595的精氨酸氨基酸残基之后被截短。在多种实施方式中，r/zermo&y^a/wca高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置192的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置228的缬氨酸改变为丙氨酸；位置545的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置330的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置352的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置330的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置352的丝氨酸改变为苯丙氨酸。在多种实施方式中，细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽选自耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；r/2e，o6诉^/wcaO-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽选自(a)耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体；(b)天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体；和(c)77^rmo&y^a/ksc"O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌O-乙酰高丝氨S交硫化氢解酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽选自耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌曱硫氨酸腺苦转移酶多肽或其功能性变体；T7ze，o6折^/ksca曱辟u氨酸腺香转移酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽是来自大肠杆菌的曱硫氨酸腺普转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置196的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置196的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌甲硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，772^mo6诉^/wca曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，77zem2o6诉^/wca曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，谷氨S吏棒杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置200的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌甲硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置200的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为3组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌曱硫氨酸腺苦转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为谷氨酸残基。具有减少的MetK和/或DapA活性或表达的宿主细胞对于产生曱硫氨酸可能是有用的。因此，宿主细胞可在编码MetK的序列中、编码DapA的序列中或同时在这两个序列中具有至少一个突变。表达调控序列的突变或缺失可以减少这些基因的表达。在多种实施方式中，细菌进一步包含以下中的至少一种(a)编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的核酸分子(例如，重组核酸分子)；(b)编码细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体的核酸分子(例如，重组核酸分子)；(c)编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在特定实施方式中，多肽或其功能性变体中的一种或多种具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，异源细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；772e，o6折^/wca高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，异源细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽选自耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；r/2enw^拆^/wcaO-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；和谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源0-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，异源细菌O-乙酰高丝氨S臾硫化氢解酶多肽选自耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其功能性变体；天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氮解酶多肽或其功能性变体；TTzwmo&y^a/kscaO-乙酰高丝氨酸硫化氬解酶多肽或其功能性变体；和谷氨酸棒杆菌O-乙酰高丝氨S臾硫化氢解酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源O-乙酰高丝氨酸硫19化氢解酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苦转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；7T^mo6诉^/usca甲硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体)的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码钴胺素依赖性曱硫氨S吏合成多肽(MetH)(例如，耻垢分枝杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；7T^，o6诉^/^ca钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；大肠杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体)的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽(Me伍)(例如，耻垢分枝杆菌钴胺素非依赖性甲硫氨酸合成多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；77^mw^诉^/wca钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；大肠杆菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体)的核酸分子(例如，重组核酸分子)。"天冬氨酸家族的氨基酸和相关代谢物"包括，例如，L-天冬氨酸、p-天冬氨酰磷酸、L-天冬氨酸-P-半醛、L-2，3-二氢吡。定二羧酸、L-V-哌啶-2,6-二羧酸、N-琥珀酰-2-氨基-6-酮-L-庚二酸、N-琥珀酰-2,6-L,L-二氨基庚二酸、L,L-二氨基庚二酸、D,L-二氨基庚二酸、L-赖氨酸、高丝氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、胱硫醚、L-高半胱氨酸、L-甲硫氨酸、S-腺苷-L-曱硫氨酸(S-腺苷曱硫氨酸)、O-磷酸-L-高丝氨酸、苏氨酸、2-丁酮酸、(S)-2-乙酰-2-羟基丁酸、(S)-2-鞋基-3-曱基-3-氧代戊酸((S)-2-hydroxy-3-methyl-3-oxopentanoate)、(R)-2,3-二羟基-3-曱基戊酸、(R)-2-氧代-3-曱基戊酸、L-异亮氨酸和L-天冬酰胺，以及这些化合物的其它构象异构体。在多种实施方式中，天冬氨酸家族的氨基酸和相关代谢物包含天冬氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸、曱硫氨酸、异亮氨酸S-腺苷曱硫氨酸。具有"降低的反馈抑制"的多肽或其功能性变体包括以下多肽与其野生型形式相比较少被抑制因子的存在所抑制的多肽；或者与已经引入该变体的生物体中表达的相应内源多肽相比较少被抑制因子的存在所抑制的多肽。例如，来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的野生型天冬氨酸激酶，分别在特定浓度的赖氨酸或赖氨g臾力n苏氨酸的存在下，可能具有十分之一的活性(10-foldlessactivity)。在相同浓度赖氨酸的存在下，具有降低的反馈抑制的变体可能具有例如五分之一、二分之一或野生型水平的活性。异源蛋白可由除宿主细菌物种之外的任何细菌生物体的基因编码。异源基因可以是来自以下非限定性列表中的细菌的基因耻垢分枝杆菌；地中海拟无枝酸菌；天蓝色链霉菌；T77^wo6诉^/twca;菊欧文氏菌；胡萝卜软腐欧文氏菌；天蓝色链霉菌；57zevra"e〃fl;植物乳杆菌；长双歧杆菌(8折cfoZacfer/wm/o"gwm);3求形芽孑包^干菌(5a"7/ws5//zaen,cw力；牙口菊果月交冲干菌(户ecto6oc&n'wmc/z^ysaw^zew/);丙酉同丁醇冲炎菌；Sac/〃ws/za/ot/wrara;大肠^干菌；白。侯才奉牙干菌(Co^"eZ)acteWM附(izj^/^n'ae);禾口皮i若卡氏菌。当然，对于肠杆菌科宿主菌抹而言的异源基因也包括来自棒状杆菌型细菌的基因。同样，对于棒状杆菌型细菌宿主菌株而言的异源基因也包括来自肠杆菌科成员的基因。在特定实施方式中，宿主菌株是大肠杆菌，并且异源基因是除棒状杆菌型细菌之外的物种的基因。在特定实施方式中，宿主菌抹是棒状杆菌型细菌，并且异源基因是除大肠杆菌之外的物种的基因。在特定实施方式中，宿主菌抹是大肠杆菌，并且异源基因是除谷氨酸棒杆菌之外的物种的基因。在特定实施方式中，宿主菌林是谷氨酸棒杆菌，并且异源基因是除大肠杆菌之外的物种的基因。在多种实施方式中，多肽由获得自放线菌目(orderActinomycetales)生物体的基因编码。在多种实施方式中，核酸分子获得自耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌、77zermo6i/^a/^ca、地中海拟无枝酸菌、皮诺卡氏菌或棒状杆菌型细菌如谷氨酸棒杆菌或白喉棒杆菌。在多种实施方式中，核酸分子获得自耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌或7T^ww6诉^/wc"。在多种实施方式中，蛋白质由获自肠杆菌科生物体的基因编码。在多种实施方式中，核酸分子获自菊欧文氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌或大肠杆菌。在多种实施方式中，宿主细菌(例如，棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌)除了含有编码异源多肽的核酸分子，还具有增加的由来自宿主细菌(例如，来自棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌如大肠杆菌细菌)的基因编码的多肽的水平。在多种实施方式中，增加的由宿主细菌基因编码的多肽的水平可从以下的一种或多种产生引入受天然相关的启动子调节的宿主细菌基因的额外拷贝；引入在来自所述宿主、异源生物体或非天然存在的核酸序列的启动子控制下，例如与天然存在的启动子相比对于氨基酸产生更理想的启动子控制下的宿主细菌基因的额外拷贝；或者用来自所述宿主、异源生物体或非天然存在的核酸序列的对于氨基酸产生更理想的启动子取代宿主细菌基因中天然存在的启动子。包括同源或异源多肽编码序列的核酸分子(例如，编码一种或多种多肽的载体)可以整合到宿主基因组中或作为附加型质粒存在。在多种实施方式中，宿主细菌具有减少的多肽表达或活性。涉及氨基酸合成的特定多肽的表达或活性的减少能够促进特定氨基酸和相关代谢物的产生的增强。表达或活性的减少可以由编码序列或调节序列中的改变所引起。在一个实施方式中，细菌中二氢吡啶二羧酸合酶多肽的表达减少(例如，细菌中的内源tfo;^基因突变或缺失)。在多种实施方式中，以下多肽中的一种或多种的表达是缺陷的mcbR基因产物、高丝氨酸脱氢酶、高丝氨酸激酶、曱硫氨酸腺苷转移酶、高丝氨酸O-乙酰转移酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、腺苷转移酶多肽、二氨基庚二酸脱氢酶多肽、ABC转运系统ATP-结合蛋白多肽、ABC转运系统通透酶蛋白多肽、葡糖-6-磷酸异构酶多肽、NCgl2640多肽和ABC转运系统底物结合蛋白多肽。在多种实施方式中，核酸分子包含启动子，包括例如来自大肠杆菌(或其衍生物)的/"c、加、的朋6"、//zo4、toc或WzA^w启动子，或来自棒状杆菌型细菌的//zoJ、g;x/、rp/M或r戸J启动子。在多种实施方式中，多肽是具有降低的反馈抑制(例如，相对于多肽的野生型形式)的变体多肽。在多种实施方式中，细菌进一步包含额外的涉及氨基酸产生的细菌基因产物。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码本文所述细菌多肽的核酸分子(例如，编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽的核酸分子)。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码同源细菌多肽，例如本文所述的细菌多肽(即，宿主物种固有的细菌多肽或其功能性变体)的核酸分子。同源细菌多肽可以高水平地表达和/或有条件地表达。例如，编码同源细菌多肽的核酸可以与使得该多肽的表达超过野生型水平的启动子可操作地连接；和/或所述核酸可以以多拷贝存在于细菌中。22在多种实施方式中，细菌天冬氨酸激酶或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(d)77ze，o6折^/wca天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，(e)菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体，和(f)57zeMW2e〃ao"e^fe"w's天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸激酶多肽是大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸激酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体，(b)地中海拟无枝酸菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体，(c)天蓝色链霉菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体，和(d)T7ze，o6诉^/kscfl天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽是大肠杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽是谷氨酸棒杆菌天冬氨酸半醛脱氢酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，(b)天蓝色链霉菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，(c)r/zwmo&y^a/wca磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，和(d)菊欧文氏菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽是大肠杆菌磷酸烯醇丙酮S吏羧化酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽是谷氨酸棒杆菌磷酸烯醇丙酮S吏羧化酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体选自(a)耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，(b)天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体，和(c)r/zwmo^y^a/ksca丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌丙酮S吏羧化酶多肽是谷氨酸棒杆菌丙酮酸羧化酶或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌选自棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌如大肠杆菌细菌。棒状杆菌型细菌包括但不限于谷氨酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、Co^y"e6acfen'wmme/ayseco/a、Cor_ywe6acfen'w/wf/zer附oaw/wogewas1、乳发酵#豆杆菌、乳短杆菌和黄色短杆菌。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为第l组氨基酸残基；位置301的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置311的苏氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置345的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；耻垢分枝杆菌天冬氨酸激酶包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为脯氨酸，位置301的丝氨酸改变为酪氨酸，位置311的苏氨酸改变为异亮氨酸和位置345的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置301的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置311的苏氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置345的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，地中海拟无枝酸菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为脯氨酸；位置301的丝氨酸改变为酪氨酸；位置311的苏氨酸改变为异亮氨酸；和位置345的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置282的丙氨酸改变为第l组氨基酸残基；位置304的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置314的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置348的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置282的丙氨酸改变为脯氨酸；位置304的丝氨酸改变为酪氨酸；位置314的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置348的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置328的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置330的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置350的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置352的缬氨酸改变为除缬氨酸之外的第2组氨基酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置328的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置330的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置350的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置352的缬氨酸改变为曱硫氨酸。在多种实施方式中，幼emz"e〃ao"e^m^天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置325的亮氨酸改变为6组氨基酸残基；位置345的丝氨酸改变为2组氨基酸残基；和位置347的缬氨酸改变为除缬氨酸之外的第2组氨基酸残基。在多种实施方式中，67zenw7e〃ao"e/dm^天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置325的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置345的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置347的缬氨酸改变为曱硫氨酸。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为除丙氨酸之外的第1组氨基酸；位置301的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置311的苏氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置345的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置279的丙氨酸改变为脯氨酸；位置301的丝氨酸改变为酪氨酸；位置311的苏氨酸改变为异亮氨酸；和位置345的甘氨酸改变为天冬氨酸。在多种实施方式中，大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置325的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置345的丝氨酸改变为第2组氨基酸残基；和位置347的缬氨酸改变为除缬氨酸之外的第2组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌天冬氨酸激酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置323的甘氨酸改变为天冬氨酸；位置325的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置345的丝氨酸改变为异亮氨酸；和位置347的缬氨酸改变为曱硫氨酸。在多种实施方式中，谷氨酸;f奉杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置458的脯氨酸改变为第4组氨基酸残基。在多种实施方式中，谷氨S吏棒杆25菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置458的脯氨酸改变为丝氨酸。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置448的脯氨酸改变为第4组氨基酸残基。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置448的脯氨酸改变为丝氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置449的脯氨酸改变为第4组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌丙酮酸羧化酶多肽或其变体包含位置449的脯氨酸改变为丝氨酸。在多种实施方式中，细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体选自耻垢分枝杆菌二氬吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；7Tzermo6折^3/^ca二氢吡咬二羧酸合酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，具有降低的反馈抑制的细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体是大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为第2组氨基酸残基；位置88的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；和位置118的组氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为异亮氨酸；位置88的亮氨酸改变为苯丙氨酸；和位置118的组氨酸改变为酪氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧S吏合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置89的天冬酰胺改变为第2组氨基酸残基；位置97的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；和位置127的组氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置89的天冬酰胺改变为异亮氨酸；位置97的亮氨酸改变为苯丙氨酸；和位置127的组氨酸改变为酪氨酸。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧S吏合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自相应于酪氨酸90的氨基酸残基改变为第2组氨基酸残基;相应于亮氨酸98的氨基酸残基改变为第6组氨基酸残基；和相应于组氨酸128的氨基酸残基改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自相应于酪氨酸90的氨基酸残基改变为异亮氨酸；相应于亮氨酸98的氨基酸残基改变为苯丙氨酸；和相应于组氨酸128的氨基酸残基改变为组氨酸。在多种实施方式中，大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为第2组氨基酸残基；位置81的丙氨酸改变为第2组氨基酸残基；位置84的谷氨酸改变为第5组氨基酸残基；位置88的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；和位置118的组氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置80的天冬酰胺改变为异亮氨酸；位置81的丙氨酸改变为缬氨酸；位置84的谷氨酸改变为赖氨酸；位置88的亮氨酸改变为苯丙氨酸；和位置118的组氨酸改变为酪氨酸。在多种实施方式中，细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自(a)耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；(b)天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；(c)77ze，o^y^ayk^fl高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；和(d)菊欧文氏菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌高丝氨酸脱氢酶多肽是来自棒状杆菌型细菌的高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体(例如，谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体，或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体)。在特定实施方式中，高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体是大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，异源高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置23的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置59的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置104的缬氨酸改变为另一种第2组氨基酸残基；位置378的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基;和在位置428的赖氨酸氨基酸残基之后截短高丝氨酸脱氢酶蛋白的改变。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌或乳发酵短杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置23的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置59的缬氨酸改变为丙氨酸；位置104的缬氨酸改变异亮氨酸；位置378的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的缬氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置46的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；和位置364的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的缬氨酸改变为苯丙氨酸；位置46的缬氨酸改变为丙氨酸；和位置378的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置10的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置46的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置362的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；在位置412的精氨酸氨基酸残基之后截短高丝氨酸脱氢酶蛋白的改变。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置IO的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置46的缬氨酸改变为丙氨酸；位置362的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，T7zew7oZ)诉^/ksca高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置192的亮氨酸改变为第6组氨基酸残基；位置228的缬氨酸改变为第1组氨基酸残基；位置545的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，将7T^rmo^y^a/z^ca高丝氨酸脱氢酶多肽在位置595的精氨酸氨基酸残基之后截短。在多种实施方式中，T7zem2oZ)诉t/a/wca高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置192的亮氨酸改变为苯丙氨酸；位置228的缬氨酸改变为丙氨酸；位置545的甘氨酸改变为谷氨酸。在多种实施方式中，大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个在SEQIDNO:211中的氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置330的甘氨酸改变为第3组氨基酸残基；位置352的丝氨酸改变为第6组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽包含至少一个在SEQIDNO:211中的氨基酸改变，所述氨基酸改变选自位置330的甘氨酸改变28为天冬氨酸；位置352的丝氨酸改变为苯丙氨酸。在多种实施方式中，细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽选自耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；77^m2o6诉^/wcaO-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽是77zermoZ^^a/wcaO-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；772wmo6诉^/^caO-高丝氨酸乙酰转移酶多肽包含SEQIDNO:24或其变体序列；细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽是谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽包含SEQIDNO:212或其变体序歹'J;或细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽是大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽包含SEQIDNO:213或其变体序列。在多种实施方式中，细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽选自(a)耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体；(b)天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体；和(c)T7^mo6折^/^caO-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽选自耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；77ze，oZ)诉^/^ca曱硫氨酸腺香转移酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽是来自大肠杆菌的曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置196的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，耻垢分枝杆菌甲硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置196的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌曱硫氨酸腺香转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，天蓝色链霉菌甲硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，J7ze，o6折^7/^ca曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，T7ze/7w^诉^/wca曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置195的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置200的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，谷氨酸棒杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置200的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为第3组氨基酸残基。在多种实施方式中，大肠杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽包含位置185的缬氨酸改变为谷氨酸残基。在多种实施方式中，钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽(MetH)是耻垢分枝杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌钴胺素依赖性甲硫氨酸合成多肽或其功能性变体；T7ze削o6折^/ksca钴胺素依赖性曱硫氨S吏合成多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；大肠杆菌钴胺素依赖性曱硫氨S臾合成多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽(MetE)是耻垢分枝杆菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌钴胺素非依赖性曱硫氨S臾合成多肽或其功能性变体；T7^mo6折^/wca钴胺素非依赖性甲硫氨S吏合成多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；大肠杆菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌钴胺素非依赖性甲硫氨酸合成多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体的核酸分子。在多种实施方式中，细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体选自耻垢分枝杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌二氬吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；TT^mw^y^a/w"a二氢吡咬二羧酸合酶多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体；和谷氨酸棒杆菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌进一步包含以下中的至少一种(a)编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的核酸分子(例如，重组核酸分子)；(b)编码细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体的核酸分子(例如，重组核酸分子)；(c)编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在特定实施方式中，一种或多种的所述多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌高丝氨酸脱氢酶多肽选自耻垢分枝杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；777e，o&yWa/wca高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体；和菊欧文氏菌高丝氨酸脱氬酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽选自耻垢分枝杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；777^mo^:/^a/tcaO-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体；和谷氨酸棒杆菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌O-乙酰高丝氨S吏硫化氢解酶多肽选自耻垢分枝杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶或其功能性变体；天蓝色链霉菌O-乙酰高丝氨酸石危化氢解酶多肽或其功能性变体；7T7e，oZ)诉da/kscaO-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体；和谷氨S臾棒杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码细菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽(例如，耻垢分枝杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；r/zemw&y^fa/ksca曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；大肠杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌曱硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体)的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码钴胺素依赖性曱硫氨S吏合成多肽(MetH)(例如，耻垢分枝杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；7T^moZ)诉^/^ca钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；大肠杆菌曱硫氨酸钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体)的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在多种实施方式中，细菌进一步包含编码钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽(MetE)(例如，耻垢分枝杆菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；天蓝色链霉菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；T7^mo&;/^aykyca钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；菊欧文氏菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；大肠杆菌曱硫氨酸钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体；或谷氨酸棒杆菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合成多肽或其功能性变体)的核酸分子(例如，重组核酸分子)。在多种实施方式中，细菌甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽选自(a)大肠杆菌甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽或其功能性变体；(b)及/7a/o甴ra"s甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽或其功能性变体；(c)rykyca甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽或其功能性变体；(d)胡萝卜软腐欧文氏菌甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽或其功能性变体；和(e)天蓝色链霉菌甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌H多肽(涉及甘氨酸裂解系统)选自(a)大肠杆菌H多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体；(b)及te/o^raraH多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体；(c)r/kscaH多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体；(d)胡萝卜软腐欧文氏菌H多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体；和(e)天蓝色链霉菌H多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌氨基曱基转移酶多肽选自(a)大肠杆菌氨基曱基转移酶多肽或其功能性变体；(b)5./7"fo甴rara氨基曱基转移酶多肽或其功能性变体；(c)i:/t^^氨基曱基转移酶多肽或其功能性变体；(d)胡萝卜软腐欧文氏菌氨基曱基转移酶多肽或其功能性变体；和(e)天蓝色链霉菌氨基甲基转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌氨基曱基转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的氨基曱基转移酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌二氢辟u辛酰胺脱氢酶多肽选自(a)大肠杆菌二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体；(b)及/za/o^rara二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体；(c)7:/usca二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体；(d)胡萝卜软腐欧文氏菌二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体；和(e)天蓝色链霉菌二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌硫辛酸合酶多肽选自(a)大肠杆菌硫辛酸合酶多肽或其功能性变体；(b)及/wfo^ra似硫辛酸合酶多肽或其功能性变体；(c)7:/^ca硫辛酸合酶多肽或其功能性变体；(d)胡萝卜软腐欧文氏菌硫辛S吏合酶多肽或其功能性变体；和(e)天蓝色链霉菌硫辛酸合酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌硫辛酸合酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的硫辛酸合酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽选自(a)大肠杆菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体；(b)r/^cfl硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体；(c)胡萝卜软腐欧文氏菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体；和(d)天蓝色链霉菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌硫辛酸-蛋白连接酶A多肽选自(a)大肠杆菌硫辛酸-蛋白连接酶A多肽或其功能性变体；(b)S./w/o^rara硫辛酸-蛋白连接酶A多肽或其功能性变体；和(c)天蓝色链霉菌硫辛酸-蛋白连接酶A多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌硫辛酸-蛋白连接酶A多肽是来自谷氨酸棒杆菌的硫辛酸-蛋白连接酶A多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌果糖-1,6-二磷酸酶多肽选自(a)大肠杆菌果糖-1,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体；(b)5./za/^/wrara果糖-l,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体；(c)天蓝色链霉菌果糖-l，6-二磷酸酶多肽或其功能性变体，(d)丙酮丁醇梭菌丙酮丁醇梭菌果糖-l,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体，(e)胡萝卜软腐欧文氏菌果糖-l,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体，(f)耻垢分枝杆菌果糖-l,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体，和(g)r果糖-l,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌果糖-l，6-二磷酸酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的果糖-l，6-二磷酸酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽选自(3)大肠杆菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体；(b)天蓝色链霉菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体，(c)胡萝卜软腐欧文氏菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体，(d)耻垢分枝杆菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体，和(e)7:/wca葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽选自(a)大肠杆菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体；(b)及/^fo^raw葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体；(c)天蓝色链霉菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体，(d)丙酮丁醇梭菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体，(e)胡萝卜软腐欧文氏菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体，(f)耻垢分枝杆菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体，和(g)7:/ksca葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌葡糖-6-磷酸异构酶多肽是来自谷氨酸棒杆菌的葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体。在多种实施方式中，细菌NCgl2640多肽选自(a)大肠杆菌NCgl2640多肽或其功能性变体；(b)天蓝色链霉菌NCgl2640多肽或其功能性变体，和(c)r/kscaNCg12640多肽或其功能性变体。在特定实施方式中，细菌NCgl2640多肽是来自谷氨酸棒杆菌的NCgl2640多肽或其功能性变体。还描述了棒状杆菌型细菌或肠杆菌科细菌如大肠杆菌细菌，所述细菌包含以下核酸分子中的至少两种(a)编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的核酸分子；(b)编码细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体的核酸分子；和(c)编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体的核酸分子。在特定实施方式中，一种或多种所述细菌多肽或其功能性变体具有降低的反馈抑制。在多种实施方式中，细菌中以下多肽的一种或多种相对于对照具有减少的活性(a)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽；和(b)mcbR基因产物多肽，例如，所述细菌在内源pdt基因或内源mcW基因中包含突变，例如，所述细菌在内源/cA基因和内源mcW基因中包含突变。还描述了产生氨基酸或相关代谢物的方法，所述方法包括在允许所述氨基酸、代谢物产生的条件下培育(cultivating)(即，在培养基中培养)细菌(例如本文所述的细菌)，和从培养物中收集包含氨基酸或相关代谢物的组合物(所述组合物可以是曾用来培养过细胞的、基本上不含细胞的培养基；或可以含有细胞；或可以含有细胞碎片，例如，溶解的细胞；或可以基本上是细胞)。所述方法可进一步包括对至少一部分所收集的组合物(或培养物)进行分级以获得富含氨基酸或代谢物的级分。可进一步处理所述级分以使组合物:绘重量计包含至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的氨基酸或相关代谢物。还描述用于产生氨基酸(例如，甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、S-腺苦曱硫氨酸)的方法，所述方法包括在允许所述氨基酸产生的条件下培养本文所述的细菌，和收集培养物。可对所述培养物进行分级(例如，以去除细胞和/或以获得富含氨基酸的级分)。还描述了对制备氨基酸或代谢物或含有氨基酸或代谢物的产品的方法，所述方法包括以下步骤中的两个或更多个(a)在允许氨基酸或代谢物产生的条件下培育细菌(例如，本文所述的细菌)；35(b)收集包含至少一部分氨基酸或代谢物的组合物；(c)浓缩收集的组合物以富集氨基酸或代谢物；(d)任选地，添加一种或多种物质以获得期望的产品。在含有氨基酸或代谢物的动物饲料产品的情况下，可添加的物质包括但不限于，例如，常规有机或无机辅助物质或载体，如明胶、纤维素衍生物(例如，纤维素醚)、二氧化硅类(silicas)、硅酸盐/酯类(silicates)、硬脂酸盐/酯类(stearates)、砂、石乐(grits)、4康，夫类(brans)、4分类(meals)、淀4分类(starches)、月交类(gums)、海藻酸盐/酯类(alginates)、糖类(sugars)或其它，和/或与常规增稠剂或粘合剂混合并且用常规增稠剂或粘合剂稳定化。在多种实施方式中，收集的组合物缺少细菌细胞。在多种实施方式中，收集的组合物包含少于10%、5%、1%、0.5%的由培育细菌产生的细菌细胞。在多种实施方式中，组合物包含至少1%(例如，至少1%、5%、10%、20%、40%、50%、75%、80%、90%、95%或达100%)的由培育细菌产生的细菌细胞。本文描述了肠杆菌科或棒状杆菌型细菌，其包含至少一种选自下组的分离的核酸分子(a)包含编码细菌硫酸盐ABC转运蛋白ATP-结合多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(b)包含编码细菌^5危酸盐转运系统通透酶W多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(c)包含编码细菌硫酸盐、硫代硫酸盐转运系统通透酶T多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(d)包含编码细菌硫酸腺苷酰转移酶亚基1多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(e)包含编码细菌硫酸腺苷酰转移酶亚基2多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(f)包含编码细菌硫酸腺苷酰硫酸激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(g)包含编码细菌石粦酸&泉苦石辟酸石克酸(phosphoadenosinephosphosulfate)还原酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(h)包含编码细菌亚硫酸盐还原酶a亚基多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(i)包含编码细菌亚硫酸盐还原酶血多肽(hemopolypeptide)(3-组分多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(j)包含编码细菌亚硫酸盐还原酶(NADPH)，黄素多肽(flavopolypeptide)卩亚基多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(k)包含编码细菌腺苷l辟Ji臾还原酶(x亚基多力线其功能法变体的序列的核酸分子；(l)包含编码细菌磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(m)包含编码细菌磷酸丝氨酸转氨酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(n)包含编码细菌磷酸丝氨酸磷酸酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(o)包含编码细菌丝氨酸0-乙酰转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(p)包含编码细菌半胱氨酸合酶A多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(q)包含编码细菌半胱氨酸合酶B多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(r)包含编码细菌ABC-型维生素B12转运蛋白通透酶组分多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(s)包含编码细菌ABC-型维生素B12转运蛋白腺苷三磷酸酶组分多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(t)包含编码细菌ABC-型钴胺素/Fe3+4失载体转运系统多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(u)包含编码细菌腺芬转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(v)包含编码细菌GTP环化水解酶I多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(w)包含编码细菌phoA、psiA或psiF基因产物多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(x)包含编码细菌二氢新蝶呤醛缩酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(y)包含编码细菌7,8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(z)包含编码细菌二氢蝶酸合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(aa)包含编码细菌二氬叶酸合成酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ab)包含编码细菌二氬叶酸还原酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ac)包含编码细菌叶酰聚谷氨酸合成酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ad)包含编码推定的细菌曱硫氨酸(APC转运蛋白超家族)通透酶(YjeH)多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ae)包含编码细菌MetE/H的转录激活物多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(af)包含编码细菌6-磷酸葡糖酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ag)包含编码细菌S-曱基甲硫氨酸高半胱氨酸曱基转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ah)包含编码细菌S-腺苷高半胱氨酸水解酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ai)包含编码细菌位点特异性DNA曱基化酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(aj)包含编码细菌曱硫氨酸输出系统蛋白1多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ak)包含编码细菌曱硫氨酸输出系统蛋白2多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(al)包含编码细菌ABC转运系统ATP-结合蛋白(MetN)多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(am)包含编码细菌ABC转运系统通透酶蛋白(MetP)多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(an)包含编码细菌ABC转运系统底物结合蛋白(MetQ)多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ao)包含编码细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ap)包含编码细菌天冬氨酸半醛脱氢酶或其功能性变体的序列的核酸分子；(aq)包含编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ar)包含编码细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(as)包含编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(at)包含编码细菌钴胺素依赖性曱硫氨酸合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(au)包含编码细菌钴胺素非依赖性曱硫氨酸合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(av)包含编码细菌高丝氨酸激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(aw)包含编码细菌曱硫氨酸腺苦转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ax)包含编码细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫)-裂合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ay)包含编码细菌胱硫醚P-裂合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(az)包含编码细菌5，10-亚曱基四氢叶酸还原酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(ba)包含编码细菌二氬吡咬二羧酸合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bb)包含编码细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bc)包含编码细菌谷氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bd)包含编码细菌二氨基庚二酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(be)包含编码细菌曱硫氨酸和半胱氨酸生物合成阻抑物(McbR)多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；39(bf)包含编码细菌赖氨酸输出蛋白多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bg)包含编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bh)包含编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bi)包含编码细菌甘氨酸脱氢酶(脱羧性)多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bj)包含编码细菌H多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体的序列的核酸分子；(bk)包含编码细菌氨基曱基转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bl)包含编码细菌二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bm)包含编码细菌硫辛酸-蛋白连接酶A多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bn)包含编码细菌硫辛酸合酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bo)包含编码细菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bp)包含编码细菌果糖-l,6-二磷酸酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(bq)包含编码细菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；(br)包含编码葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；和(bs)包含编码细菌NCgl2640多肽或其功能性变体的序列的核酸分子；和(a)-(bs)的全部组合和亚组合。本文还描述下述细菌，其中所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少两种；所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少三种；所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少四种；所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少五种；至少一种所述多肽对于该细菌是异源的；至少两种所述多肽对于该细菌是异源的；所述细菌是大肠杆菌细菌；所述细菌是谷氨酸棒杆菌细菌；所述多肽(即，(a)-(bs)中的任何多肽)选自肠杆菌科多肽、放线菌多肽或它们的变体；所述多肽(即，(a)-(bs)中的任何多肽)是以下放线菌物种之一的多肽耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌、r/zwwohy^a/wca、地中海拟无枝酸菌、皮诺卡氏菌和棒状杆菌型细菌包括谷氨酸棒杆菌和白喉棒杆菌；所述多肽(即，(a)-(bs)中的任何多肽)来自耻垢分枝杆菌、天蓝色链霉菌和7T^rmoZ)诉da/^cfl中的一种或多种；包含所述核酸分子的肠杆菌科或棒状杆菌型细菌(宿主菌林)是谷氨酸棒杆菌；包含所述核酸分子的肠杆菌科或棒状杆菌型细菌(宿主菌抹)是菊欧文氏菌或大肠杆菌。还描述了任何前述细菌，其中以下多肽中的一种或多种相对于该细菌在任何遗传修饰之前具有减少的活性或表达二氢吡，定二羧酸合酶多肽；mcbR基因产物多肽；高丝氨酸脱氢酶多肽，高丝氨酸激酶多肽，曱硫氨酸腺苷转移酶多肽，高丝氨酸O-乙酰转移酶多肽，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽，腺香转移酶多肽，二氨基庚二酸脱氢酶多肽，ABC转运系统ATP-结合蛋白多肽，ABC转运系统通透酶蛋白多肽，葡糖-6-磷酸异构酶，NCgl2640多肽，和ABC转运系统底物结合蛋白多肽。细菌中这些多肽的各种组合和亚组合中的任一种均可具有减少的活性。还描述任何前述细菌，其中所述细菌包含(a)和下列中的至少一种(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(i)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(b)和下列中的至少一种(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(c)和下列中的至少一种(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(d)和下列中的至少一种(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(>z)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(e)和下列中的至少一种(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、Cac)、(ad)、(>e)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(證)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(f)和下列中的至少一种(g)、(h)、(i)、①、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(g)和下列中的至少一种(h)、(i)、(i)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(h)和下列中的至少一种(i)、①、(k)、(1)、(m)、(n)、(0)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(n)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(i)和下列中的至少一种(j)、(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、42(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(證)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(j)和下列中的至少一种(k)、(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(k)和下列中的至少一种(1)、(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(l)和下列中的至少一种(m)、(n)、(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(m)和下列中的至少一种(n)、(0)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(的、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(n)和下列中的至少一种(o)、(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);细菌包含(o)和下列中的至少一种(p)、(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(p)和下列中的至少一种(q)、(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(q)和下列中的至少一种(r)、(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(r)和下列中的至少一种(s)、(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(證)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(s)和下列中的至少一种(t)、(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(t)和下列中的至少一种(u)、(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(u)和下列中的至少一种(v)、(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(v)和下列中的至少一种(w)、(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、44(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(w)和下列中的至少一种(x)、(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(x)和下列中的至少一种(y)、(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(y)和下列中的至少一种(z)、(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(z)和下列中的至少一种(aa)、(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(aa)和下列中的至少一种(ab)、(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ab)和下列中的至少一种(ac)、(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、關、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ac)和下列中的至少一种(ad)、(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ad)和下列中的至少一种(ae)、(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ae)和下列中的至少一种(af)、(ag)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(af)和下列中的至少一种Og)、(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ag)和下列中的至少一种(ah)、(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ah)和下列中的至少一种(ai)、(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ai)和下列中的至少一种(aj)、(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(aj)和下列中的至少一种(ak)、(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ak)和下列中的至少一种(al)、(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(al)和下列中的至少一种(am)、(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(am)和下列中的至少一种(an)、(ao)、(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(an)和下列中的至少一种(ao)、Op)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ao)和下列中的至少一种(ap)、(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ap)和下列中的至少一种(aq)、(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(aq)和下列中的至少一种(ar)、(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ar)和下列中的至少一种(as)、(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(as)和下列中的至少一种(at)、(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(at)和下列中的至少一种(au)、(av)、(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(b0、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(au)和下列中的至少一种(av)、Caw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(av)和下列中的至少一种(aw)、(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(aw)和下列中的至少一种(ax)、(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ax)和下列中的至少一种(ay)、(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ay)和下列中的至少一种(az)、(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(>i)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(az)和下列中的至少一种(ba)、(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(ba)和下列中的至少一种(bb)、(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bb)和下列中的至少一种(bc)、(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bc)和下列中的至少一种(bd)、(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bd)和下列中的至少一种(be)、(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(be)和下列中的至少一种(bf)、(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、.(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bf)和下列中的至少一种(bg)、(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bg)和下列中的至少一种(bh)、(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bh)和下列中的至少一种(bi)、(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bi)和下列中的至少一种(bj)、(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bj)和下列中的至少一种(bk)、(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bk)和下列中的至少一种(bl)、(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bl)和下列中的至少一种(bm)、(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bm)和下列中的至少一种(bn)、(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bn)和下列中的至少一种(bo)、(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bo)和下列中的至少一种.'(bp)、(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bp)和下列中的至少一种(bq)、(br)和(bs);所述细菌包含(bq)和下列中的至少一种(br)和(bs);所述细菌包含(br)和(bs);所述细菌包含(aj)和(ak)。还描述这样的细菌，其中所述细菌包含(r)、(s)和(t);所述细菌包含(a)、(b)和(c);所述细菌包含(d)和(e);所述细菌包含(i)和(j);所述细菌包含(l)和(o);所述细菌包含(p)和(q);所述细菌包含(bi)、(bj)和(bk);所述细菌包含(bi)、(bj)、(bk)和(bl);所述细菌包含(bi)、(bj)、(bk)和下列中的至少一种(1)(bm)或(2)(bn)和(o);和所述细菌包含(bi)、(bj)、(bk)、(bl)和下列中的至少一种(1)(bm)或(2)(bn)和(bo)。还描述了其包含至少一种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少一种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子的细菌，；包含至少一种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少两种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子的细菌；包含至少两种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少一种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子的细菌；包含至少两种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少两种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子的细菌；和包含编码具有降低的反馈抑制的变体天冬氨酸激酶、具有降低的反馈抑制的变体高丝氨酸脱氢酶和/或具有降低的反馈抑制的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的分离核酸分子的细菌。本文还描述用于产生氨基酸或相关代谢物的方法，包括在允许所述氨基酸或所述代谢物产生的条件下培育(培养)任何前述细菌；和从培养物中收集包含所述氨基酸或相关代谢物的组合物(培养基、细胞或细胞和培养基的组合)。所述方法可进一步包括对至少部分培养物进行分级，以获得与未经分级的培养物相比富含所述氨基酸或所述代谢物的级分。还描述用于产生S-腺苷曱硫氨酸的方法，所述方法包括在允许S-腺普曱硫氨酸产生的条件下培养本文所述的细菌；和从培养物中收集包含S-腺苷曱硫氨酸的组合物。所述方法可包括对至少部分培养物进行分级以获得富含S-腺苦曱硫氨酸的级分。还描述用于产生曱硫氨酸的方法，所述方法包括在允许曱硫氨酸产生的条件下培育本文所述的细菌；和从培养物中收集包含曱硫氨酸的组合物。所述方法可包括对至少部分培养物进行分级以获得富含曱硫氨酸的级分。还描述用于产生半胱氨酸的方法，所述方法包括在允许半胱氨酸产生的条件下培养本文所述的细菌；和从培养物中收集包含半胱氨酸的组合物。所述方法可包括对至少部分培养物进行分级以获得富含半胱氨酸的级分。还描述用于产生赖氨酸的方法，所述方法包括在允许赖氨酸产生的条件下培养本文所述的细菌；和从培养物中收集包含赖氨酸的组合物。所述方法可包括对至少部分培养物进行分级以获得富含赖氨酸的级分。还描述用于产生苏氨酸或相关代谢物的方法，所述方法包括在允许苏氨酸或相关代谢物产生的条件下培养本文所述的细菌；和从培养物中收集包含苏氨酸或相关代谢物的组合物。所述方法可包括对至少部分培养物进行分级以获得富含苏氨酸或相关代谢物的级分。还描述用于产生异亮氨酸或相关代谢物的方法，所述方法包括在允许异亮氨酸或相关代谢物产生的条件下培养本文所述的细菌；和从培养物中收49集包含异亮氨酸或相关代谢物的组合物。所述方法可包括对至少部分培养物进行分级以获得富含异亮氨酸或相关代谢物的级分。还描述用于制备动物饲料添加剂的方法，所述动物飼料添加剂含有选自甲硫氨酸、s-腺苷甲硫氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸的一种或多种氨基酸，所述方法包括(a)在允许所选氨基酸产生的条件下培育本文所述的细菌；(b)收集包含至少一部分由培育该细菌而产生的所选氨基酸的组合物；(c)浓缩所收集的组合物以富集所选氨基酸；和(d)任选地，添加一种或多种物质以获得期望的饲料(例如，动物饲料)添加剂。在多种情况下所述细菌是大肠杆菌或棒状杆菌型细菌；所述细菌是谷氨酸棒杆菌；所选氨基酸是曱硫氨酸。还公开下述肠杆菌科或棒状杆菌型细菌其包含至少一种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少一种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子；包含至少一种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少两种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子；包含至少两种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少一种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子；包含至少两种选自(a)-(an)的分离核酸分子和至少两种选自(ao)-(bs)的分离核酸分子。还描述这样的细菌，其包含编码以下酶的分离核酸分子具有降低的反馈抑制的变体天冬氨酸激酶、具有降低的反馈抑制的变体高丝氨酸脱氢酶或具有降低的反馈抑制的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(例如，一种细菌，其中具有降低的反馈抑制的变体天冬氨酸激酶、具有降低的反馈抑制的变体高丝氨酸脱氢酶或具有降低的反馈抑制的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶对于该宿主细胞是异源的)。其它实例包括在高丝氨酸脱氢酶中具有突变，该突变减少或消除该酶的表达或活性的细菌；在曱硫氨酸/半胱氨酸生物合成阻抑中具有突变，该突变减少或消除该阻抑的表达或活性的细菌(例如，在曱硫氨酸和半胱氨酸生物合成阻抑物(McbR)中具有突变的细菌)；在曱硫氨酸腺苷转移酶中具有突变，该突变减少该酶的表达或活性的细菌；包含(aj)和(ak)的细菌；包含(r)、(s)和(t)的细菌；和包含(a)、(b)和(c)的细菌。"功能性变体"蛋白是这样的蛋白当野生型蛋白是酶时，其能够催化由野生型蛋白催化的生物合成反应；或当野生型蛋白为非催化性时，其能够提供与野生型蛋白相同的生物学功能。例如，正常情况下调节一种或多种基因转录的蛋白，它的功能性变体在转化至细菌中时，仍将调节相同基因的转录。功能性变体可与野生型蛋白具有相同水平的活性，或者可具有增加或减少的活性。在特定实施方式中，功能性变体蛋白对于氨基酸生物合成途径的产物或中间物所致的反^t抑制具有至少部分的抗性或完全的抗性。在特定实施方式中，变体与野生型蛋白相比具有少于20、15、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸改变。在特定实施方式中，所述氨基酸改变是保守改变。变体序列是相应于变体多肽如功能性变体多肽的核苷酸或氨基酸序列。"相应"于参照序列中某个氨基酸的氨基酸占据与参照序列中该位点同源的位点。相应的氨基酸可以通过相关序列的比对来鉴定。可使用如BLAST、FASTA、ClustalW等本领域技术人员熟知的算法，将氨基S吏序列与公开数据库中可用的蛋白序列进行比较。使用在本文中时，"异源"核酸或蛋白的意思涵盖这样的生物体(种)的核酸或蛋白，或核酸或蛋白的功能性变体该生物体不同于用以产生天冬氨酸家族的氨基酸和相关代谢物中成员的宿主生物体(种)。在特定实施方式中，当宿主生物体是棒状杆菌型细菌时，异源基因将不从大肠杆菌获得。在其它实施方式中，当宿主生物体是大肠杆菌时，异源基因将不从棒状杆菌型细菌获得。本文使用的"基因"包括与具体编码序列相关的编码序列、启动子序列、操纵基因序列、增强子序列、终止子序列、共转录的序列(例如，来自一个操纵子的多个序列)和其它调节序列。使用在本文中时，"同源"核酸或蛋白的意思涵盖这样的生物体的核酸或蛋白，或核酸或蛋白的功能性变体所述生物体与用于产生天冬氨酸家族的氨基酸和相关代谢物中成员的宿主生物体是相同的物种。"重组核酸分子"是不处在其天然环境中的核酸分子。例如，将精确编码大肠杆菌多肽的核酸分子插入大肠杆菌基因组时，若插入的位置不同于所述多肽编码基因的野生型位置，则所述核酸分子是重组的。重组核酸分子也包括由非野生型启动子和野生型多肽编码序列组成的核酸分子，其插入在细菌基因组中所述多肽编码基因的野生型位置或某些其它位置。如本领域技术人员已知的，在野生型酶的一个或多个氨基酸残基处可以容许特定的一个氨基酸对另一个氨基酸的取代，而不消除该酶的活性或功能。使用在本文中时，术语"保守取代"指在蛋白序列中用同一保守取代组中的一种氨基酸交换另一种氨基酸。保守氨基酸取代是本领域已知的，并且通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。在一个实施方式中，保守取代典型地包括下述组内的取代第l组甘氨酸、丙氨酸和脯氨酸；第2组缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和曱硫氨酸；第3组天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；第4组丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸；第5组赖氨酸、精氨酸和组氨酸；第6组苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。每个组提供了一系列氨基酸，在蛋白序列中这些氨基酸可用该组内任一其它氨基酸取代。用于确立保守取代的氨基酸分组的标准有若干种。例如，亲水氨基酸指标对于赋予蛋白质相互作用的生物学功能而言的重要性是本领域公知的(KyteandDoolittle,Mo/.说W.157:105-132(1982》。已知可以用特定氨基酸取代具有相似亲水指标或分数的氨基酸，并且仍保持相似的生物学活性。氨基酸亲水性也被用作建立保守氨基酸分组的标准(参见，例如，U.S.PatentNo.4,554,101)。涉及一种氨基酸对另一种的取代的信息是本领域公知的(参见，例如，IntroductiontoProteinArchitecture:TheStructuralBiologyofProteins,Lesk,A.M.,OxfordUniversityPress;ISBN:0198504748;IntroductiontoProteinStructure,Branden,C.-I"Tooze,J.，KarolinskaInstitute,Stockholm,Sweden(January15,1999》和ProteinStructurePrediction:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology),Webster,D.M.(Editor),August2000，HumanaPress,ISBN:0896036375)。在某些实施方式中，将对异源序列和/或宿主菌林基因的核酸和/或蛋白序列进行比较，并且可确定同源性。同源性比较可用来，例如，鉴定相应的氨基酸。两个序列之间的百分比同一性是多个序列共有的相同位置数目的函数，同时考虑到为两个序列的最优排列而需引入的缺口数和各缺口的长度。两个序列之间序列的比较和百分比同一性的测定可使用数学算法完成。例如，两个核苷酸序列之间的百分比同一性可使用NeedlemanandWunsch算法((1970)JMo/.说o/.48:444-453)的算法来测定，所述算法已包含在GCG软件包的GAP程序中，使用任一Blosum62矩阵，以及缺口加权(gapweight)12、缺口延伸罚分(gapextensionpenalty)4和移框击夹口罚分(fmmeshiftgappenalty)5。通常而言，为了测定两个核酸或蛋白序列之间的百分比同一性，按最优比较的目的将序列进行排列(例如，为了最优排列，可在第一和第二核酸或氨基酸序列中之一或两者中引入缺口，并且为了比较的目的可忽略非同源序30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%。随后对相应的核香酸或氨基酸位置上的核苷酸或氨基酸进行比较。当占据第一序列中某个位置的核苷酸或氨基酸与第二序列中相应位置上的相同时，则分子在该位置是同一的(在本文中使用时，"同一性"等同于"同源性")。例如，可将本文所述的蛋白序列用作"查询序列"以针对非冗余序列的数据库来进行搜索。这些搜索可使用Altschul,&a/.(1990)Mo/.历o/.215:403-10中的BLASTP和TBLASTN程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白搜索可用BLASTP程序进行，使用例如Blosum62矩阵，字长(wordlength)3，缺口存在损失(gapexistencecost)11和缺口延伸罚分1。用于进行BLAST分析的4K牛是通过NationalCenterforBiotechnologyInformation只于7>众开》支的，并且可以使用默认参数。也可使用本文所述序列作为TBLASTN搜索中的查询序列，使用特定的或默认的参数。例如，可将本文所述的核酸序列用作"查询序列"以针对非冗余序列的数据库进行搜索。这些搜索可使用Altschul,"a/.(19卯)JMo/.S/o/.215:403-10中的BLASTN和BLASTX程序(2.0版本)进行。BLAST核苦酸搜索可使用BLASTN程序进行，分数400，字长=11,以评估核酸水平上的同一性。BLAST蛋白搜索可使用BLASTX程序进行，分数=50，字长=3，以评估蛋白水平上的同一性。为了获得用于对照的带有缺口的排列，可如Altschul"a/.,(1997)7Vwc/ez'c^c/Aie义25:3389-3402中所述使用GappedBLAST。在应用BLAST和GappedBLAST程序时，可使用各个程序(例如，BLASTX和BLASTN)的默认参数。进行对照用核苷酸序列的排列也可通过例如Smith&Waterman,Jt/v.2:482(1981)的局部同源性算法(localhomologyalgorithm),通过Needleman&Wunsch,Mo/.祝o/.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson&Lipman,尸rac.A^7.5W.t/SJ85:2444(1988)的相似性搜索方法，通过计算才几执4亍这些算法(WisconsinGeneticsSoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI)或通过手动比7于禾口目测才企查(参见，例3口Cwre加尸ratoco/s/"M/ecw/w所o/ogy(Ausubelefa/.,eds.1995supplement))。可分析核酸序列的杂交性质。使用在本文中时，术语"在低严紧性、中严紧性、高严紧性或非常高严紧性条件下杂交"描述的是用于杂交和洗涤的条4牛。进4亍杂交反应的指导可参见CwreWiVotoco/sAfo/ecw/arJohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。该参考文献中描述了含水方法和无水方法，可使用二者中的任一种。本文中所指的特异性杂交条件如下l)低严紧性杂交条件，在6X氯化钠〃宁檬酸钠(SSC)中，于大约45。C，其后在0.2XSSC、0.1%SDS中至少于50。C洗涤两次(对于低严紧性条件可将洗涤的温度增加至55。C);2)中严紧性杂交条件，在6XSSC中，于大约45。C，其后在0.2XSSC、0.1%SDS中于60。C洗涤一次或多次；3)高严紧性杂交条件，在6XSSC中，于大约45。C,其后在0.2XSSC、0.1%SDS中于65。C洗涤一次、两次、三次、四次或更多次；4)非常高严紧性杂交添加是0.5M磷酸钠、7%SDS,于65。C,其后在0.2XSSC、1%SDS中于65。C洗涤一次或多次。非常高严紧性条件(至少4次或更多次洗涤)是优选的条件，并且除非另外指明，是应该使用的条件。在下文的附图和说明书中将对本发明的一个或多个实施方式的细节进行阐述。通过说明书和附图以及权利要求书，本发明的其它特征、目的和优势将显而易见。图l是细菌中曱硫氨酸生物合成途径的图解。图2是细菌中半胱氨酸和丝氨酸生物合成途径的图解。图3是细菌中硫酸盐(sulfate)同化途径的图解。图4a是细菌中叶酸生物合成途径的图解。图4b是细菌中甘氨酸裂解系统的图解。图5是质粒MB3961(载体骨架质粒)的限制性酶切图。图6是质粒MB4094(载体骨架质粒)的限制性酶切图。图7是质粒MB4083(/zom-^^缺失构建体)的限制性酶切图。图8是质粒MB4084缺失构建体)的限制性酶切图。图9是质粒MB4165(wcW缺失构建体)的限制性酶切图。图10是质粒MB4169(/wm-^^缺失/gpd-耻垢分枝杆菌/>wC(T3L^)-a^取代构建体)的限制性酶切图。图11是质粒MB4192(/wm-^^缺失/g;^-天蓝色链霉菌/zow(^562^取代构建体)的限制性酶切图。图12是质粒MB4276(pdt缺失/g^-耻垢分枝杆菌(^QT3〃"-o^取代构54建体)的限制性酶切图。图13是质粒MB4286(wcW缺失/加i5S-7:/kscame"取代构建体)的限制性酶切图。图是质粒MB"87(mcW缺失/^r朋5"-谷氨酸棒杆菌we"(K233A)-me/5取代构建体)的限制性酶切图。图14B是对MB4278Or朋S-谷氨酸棒杆菌附e"177)中从^W5S启动子至me必基因终止的DNA序列的核苷酸序列的图示。图15的图示描述在存在IPTG和无IPTG时，测定谷氨酸棒杆菌MetA体外O-乙酰转移酶活性的试验的结果，所述谷氨酸棒杆菌MetA来自两种谷氨酸棒杆菌菌抹MA-442和MA-449。图16是谷氨酸棒杆菌菌抹MA-442中MetA对曱硫氨酸和S-AM抑制的敏感性的测定结果的图示。图17是谷氨酸棒杆菌菌抹MA-456、MA570、MA-578和MA-479中表达的r/wcflMetA的体外0-乙酰转移酶活性测定结果的图示。比率是每纳克蛋白的OD412变化除以时间所得的量度。图18是谷氨酸棒杆菌菌株MA-456和MA-570中表达的7:/twcaMetA的体外O-乙酰转移酶活性测定结果的图示。将比率定义为OD412的变化除以时间每纳克蛋白。图19是表达异源野生型和突变变体的谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌菌抹中赖氨酸产生的测定结果的图示。图20是在天蓝色链霉菌/zowG362E变体存在和不存在的条件下，谷氨酸棒杆菌菌抹MA-0331中赖氨酸和高丝氨酸产生的测定结果的图示。图21是在菊欧文氏菌，c的存在或无不存在的条件下谷氨酸棒杆菌菌株MA-0331和MA-0463中天冬氨酸浓度的测定结果的图示。图22是用异源野生型dapA基因转化的谷氨酸棒杆菌菌林MA-0331和MA-0463中赖氨酸产生的测定结果的图示。图23是谷氨酸棒杆菌菌抹MA-1378及其亲本菌抹中代谢物水平的测定结果的图示。图24是在IPTG的存在和不存在的条件下培养的谷氨酸棒杆菌菌抹MA-0428,MA-0579,MA-1351,MA-1559中高丝氨酸和O-乙酰高丝氨酸水平的测定结果的图示。IPTG诱导附加型质粒携带的7:/^came"基因的表达。图25是谷氨酸棒杆菌菌抹MA-1559及其亲本菌株中代谢物水平的测定结果的图示。图26是两种表达MetAK233A突变多肽的谷氨酸棒杆菌菌林MA-622和MA-699的发酵液中的曱硫氨酸浓度的图示。图示了存在和缺失IPTG的条件下所培养细胞的产量。图27是表达MetYD231A突变多肽的两种谷氨酸棒杆菌菌抹MA-622和MA-699的发酵液中的曱硫氨酸浓度的图示。描述在存在和缺失IPTG的条件下所培养细胞的产量。图28是表达MetYG232A突变多肽的两种谷氨酸棒杆菌菌抹MA-622和MA-699的发酵液中的甲硫氨酸浓度的图示。描述在存在和缺失IPTG的条件下所培养细胞的产量。图29图示培养在IPTG存在和不存在的条件下的谷氨酸棒杆菌菌株MA-1906、MA-2028、MA-1907和MA-2025中代谢物水平的测定结果。图30图示培养在IPTG存在和不存在的条件下的谷氨酸棒杆菌菌抹MA-1667和MA-1743中代谢物水平的测定结果。图31的图示描述培养在IPTG存在和/或缺失的条件下的谷氨酸才奉杆菌菌林MA-0569、MA-1688、MA-1421和MA-1790中代谢物水平的测定结果。图32的图示描述谷氨酸棒杆菌菌抹MA-1668及其亲本菌株中代谢物水平的测定结果。图33的表提供了某些有用的多肽和核酸分子的序列。图34的表提供了某些其它有用的多肽和核酸分子的序列。详述本文描述含有下述核酸序列的遗传修饰的细菌，所述核酸序列编码的蛋白改善曱硫氨酸和甲硫氨酸相关的中间物化合物以及其它氨基酸和代谢物的发酵产生。具体而言，本文描述与曱硫氨酸、S-腺苷-曱硫氨酸、高丝氨酸、O-乙酰高丝氨酸、高半胱氨酸和胱硫醚以及其它化合物的产生有关的核酸分子、多肽和细菌。所述核酸编码代谢途径蛋白，这些蛋白直接(例如，通过酶促转化中间物)或间接(例如，通过转录调节酶表达、调节氨基酸输出或调节代谢物摄取)调节这些氨基酸、中间物和相关代谢物的生物合成。编码所述的蛋白的核酸序列可源自不同于宿主生物体的细菌物种，称这些序列和蛋白"与56宿主异源"。其它核酸和编码的蛋白源自与宿主生物体相同的物种，称这些序列和蛋白"与宿主同源"。在某些情况下，宿主生物体经遗传修饰而同时含有同源和异源的核酸序列。本文描述了用于产生遗传修饰的细菌的方法，以及产生氨基酸和代谢物的方法，包括产生在动物饲料添加剂中使用的氨基酸的方法。引入编码异源或同源多肽的核酸序列可导致一种或多种氨基酸和/或中间物的产率增加。此外，修饰涉及氨基酸产生的特定细菌蛋白序列可导致氨基酸和/或中间物的产率增加。例如，在多肽编码序列中的突变可导致多肽活性的减少或增加(例如，酶活性的减少或增加)。经^修饰的或未^^饰的(例如，野生型)细菌蛋白的受调节的(例如，降低的或增加的)表达同样能够增强氨基酸产生。本文描述的方法和组合物适用于调节氨基酸和相关代谢物产生的细菌蛋白(例如，涉及曱硫氨酸、丝氨酸、高丝氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、叶酸、维生素B12、高半胱氨酸和硫的代谢或输出的蛋白质)和编码这些蛋白的核酸。这些蛋白包括催化氨基酸生物合成途径中的中间物转化成其它中间物和/或终产物的酶，直接调节这些酶的表达和/或功能的蛋白，和调节所述生物合成途径中所利用代谢物的摄取的蛋白。适合于操作的靶蛋白包括受到多种类型的调节的酶，所述调节类型如阻抑、衰减(attenuation)或反馈抑制。本文所述的关于细菌物种中的氨基酸生物合成途径、这些途径中涉及的蛋白、这些蛋白的序列的链接和用于鉴定蛋白的操作和/或表达的其它相关资源的信息，在Bonoie化arc/z，8:203-210,1998中有所描述。商业生产中操作氨基酸生物合成效率的策略包括但不限于，过量表达(例如，基因剂量的增加、表达调控序列的修饰(包括取代)或调节蛋白的变化所导致的)、表达不足(例如，由于基因破坏或取代或反义技术的使用)和特定基因的条件表达，以及优化蛋白活性的遗传修饰。可如下造成所选多肽的表达不足或活性降低产生更少的编码所选多肽的mRNA(转录降低)；产生更少的多肽，甚至当mRNA产生不降低时(例如，翻译降低)；或者变更编码多肽的序列从而使活性多肽失活或产生活性更低的多肽。降低多肽对抑制性刺激一一例如由于生物合成途径终产物和中间物的存在而产生的反馈抑制一一的敏感性，是可能的。例如，源自棒状杆菌型细菌或大肠杆菌的商业生产用赖氨酸的菌抹通常对赖氨酸的反馈抑制呈现出相对的不敏感性。有用的棒状杆菌型细菌菌抹还对苏氨酸所致的抑制有相对的抗性。本文描述的新方法和组合物导致氨基酸的产生增强。甲减歲酸的生物合成在图1图示说明从天冬氨酸的转化开始的曱硫氨酸和其它天冬氨酸家族氨基酸(和中间物)的生物合成。表1提供曱硫氨酸生物合成途径中的酶的列表。这些酶中每一个的过量表达和/或脱调节(deregulation)能够增强曱硫氨酸的产生。生物合成酶的过量表达能够如下实现例如增加感兴趣的基因的拷贝数，和/或将所述基因可操作地连接至对表达最理想的启动子，例如强启动子或条件性启动子。表l:曱硫氨酸生物合成途径中的基因和酶<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>曱石危氨酸生物合成前体和辅因子产生曱硫氨酸途径中所用前体和辅因子的生化途径对于曱硫氨酸产生水平的决定同样重要，如图1中所示。前体途径包括，例如丝氨酸和半胱氨酸生物合成(图2)、硫酸盐同化(图3)、叶酸生物合成(图4)和维生素B12摄取。丝氨酸和半胱氨酸生物合成半胱氨酸是胱硫醚，合酶(MetB)将O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸转化为胱硫醚的过程中的辅因子，如图1中所示。表2列出在将D-3-磷酸甘油酸转化为半胱氨酸的途径中发挥作用的蛋白和它们催化的反应(参见图2)。表2:D-3-磷酸甘油酸至半胱氨酸的转化<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>磷酸甘油酸脱氢酶磷酸甘油酸脱氢酶(SerA)将3-磷酸甘油酸转化为半胱氨酸生物合成途径中的前体3-磷酸羟基丙酮酸。半胱氨酸能够被转化为甲硫氨酸的前体胱硫醚。因此，SerA的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。此外，磷酸羟基丙酮酸是丝氨酸的前体，丝氨酸是再生曱基四氢叶酸所必需，曱基四氢叶酸是高半胱氨酸转化为曱硫氨酸所必需。因此，增加的SerA的表达或活性可通过产生曱基四氢叶酸来增加曱硫氨酸的产生。磷酸丝氨酸转氨酶磷酸丝氨酸转氨酶(SerC)将磷酸羟基丙酮酸转化为半胱氨酸生物合成途径中的前体3-磷酸丝氨酸。半胱氨酸能够被转化为曱硫氨酸的前体胱硫醚。因此，增加的SerC的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。此外，磷酸羟基丙酮酸是丝氨酸的前体，丝氨酸是再生曱基四氪叶酸所必需，而曱基四氢叶酸是高半胱氨酸转化为曱硫氨酸所必需。因此，增加的SerC的表达或活性可通过产生曱基四氢叶酸来增加曱硫氨酸或S-腺香L-曱硫氨酸的产生。磷酸丝氨酸磷酸酶磷酸丝氨酸磷酸酶(SerB)将磷酸丝氨酸转化为半胱氨酸生物合成途径的前体——氨基酸丝氨酸。半胱氨酸能够被转化为曱硫氨酸的前体胱硫醚。因此，增加的SerB的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。此外，磷酸羟基丙酮酸是丝氨酸的前体，丝氨酸是再生曱基四氢叶酸所必需，曱基四氢叶酸是将高半胱氨酸转化为甲硫氨酸所必需。因此，增加的SerB的表达或活性可通过产生曱基四氬叶酸来增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。丝氨酸O-乙酰转移酶丝氨酸O-乙酰转移酶(CysE)催化丝氨酸转化为半胱氨酸生物合成途径的前体O-乙酰丝氨酸。半胱氨酸能够被转化为曱硫氨酸的前体胱硫醚。因此，增加的CysE的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺香L-曱硫氨酸的产生。半胱氨酸合酶A和半胱氨酸合酶B半胱氨S臾合酶A(CysK)和半胱氨酸合酶B(CysM)催化0-乙酰丝氨酸转化为半胱氨酸。半胱氨酸能够被转化为曱硫氨酸的前体胱硫醚。因此，增加的CysK和/或CysM的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苦L-曱硫氨酸的产生。^琉酸盐同化硫酸盐(S04)同化对于硫化物(S"的产生是重要的，硫化物在将o-乙酰高丝氨酸转化为半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用(参见图1)。表3列出在S04同化作用中发挥功能的蛋白和向硫化物的转化步骤(参见图3)。表3:S04的同化及其向S-2的转化<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>硫酸盐ABC转运蛋白ATP-结合蛋白(通透酶A蛋白；EC3.6.3.25);胞外S04的转运，『硫酸盐转运系统通透酶W蛋白；和c，硫酸盐、硫代硫酸盐转运系统通透酶T蛋白，tV硫酸腺苦酰转移酶亚基1(EC2.7.7.4);将S04转化为腺苷酰石克酸，D硫酸腺苷酰转移酶亚基2(EC2.7.7.4)，C腺苷酰硫酸激酶(EC2.7.1.25)将腺苦酰硫酸转化为3'-磷酸腺普酰-S04(PAPS)，//腺苷酰硫酸还原酶，(EC1.8.99.2)将腺苷酰硫酸转化为so32-，//磷酸腺苦磷酰硫酸还原酶(EC1.8.4.8)将3，-磷酸腺苷酰-S04(PAPS)转化为so32—，/亚碌u酸盐还原酶a亚基或血红素蛋白P-组分(EC1.8.1.2);so,至s:的转化，《/亚石危酸盐还原酶(NADPH),黄素蛋白卩亚基(EC1.8.1.2)硫酸盐同化ABC转运蛋白ATP-结合蛋白(通透酶A蛋白)硫酸盐转运系统通透酶W蛋白硫酸盐、硫代硫酸盐转运系统通透酶T蛋白碌u酸盐ABC转运蛋白ATP-结合蛋白(CysA)、辟^酸盐转运系统通透酶W蛋白(CysW)和硫酸盐、硫代硫酸盐转运系统通透酶T蛋白(CysT)在将胞外S04向细胞内的转运中发挥功能。S04是SS的前体，S^在MetY将0-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用。增加高半胱氨酸的产生能61够导致曱硫氨酸产生的增加。因此，增加的CysA、CysW和/或CysT的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸的产生。硫酸腺香酰转移酶亚基1和2硫酸腺苷酰转移酶亚基1(CysN)和硫酸腺苷酰转移酶亚基2(CysD)将S04转化为腺苷酰硫酸，腺苷酰硫酸在S^的产生中发挥前体的作用。S^在MetY将O-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用。增加高半胱氨酸的产生能够导致曱硫氨酸产生的增加。因此，增加的CysN和/或CysD的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苷-L-甲硫氨酸的产生。腺香酰硫酸激酶腺苷酰硫酸激酶(CysC)将腺苷酰硫S吏磷酸化，由此将其转化为3，-磷酸腺苦酰硫酸，3，-磷酸腺香酰硫酸在S^的产生过程中充当前体，S:在MetY将O-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用。因此，增加的CysC的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生。腺香酰>5克酸还原酶(同化型)腺苷酰硫酸还原酶(CysH)的作用是通过还原腺苷酰硫酸来产生S032-。SO,在S^的形成中发挥前体的作用，而S、在MetY将O-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用。因此，增加的CysH的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺香-L-曱硫氨酸的产生。磷酸腺苷磷酸硫酸还原酶磷酸腺苷磷酸硫酸还原酶(CysH)活性通过NADPH还原3，-磷酸腺苷酰画硫酸来产生S032-。SO^充当S、的形成的前体，而S^在MetY将0-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用。因此，增加的CysH的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺香-L-曱硫氨酸的产生。亚石克酸盐还原酶(a亚基或血蛋白P-组分，Cysl)和亚硫酸盐还原酶(NADPH)、黄素蛋白卩亚基，CysJ)亚碌u酸盐还原酶Cysl和CysJ将转化S03-2为S2-，S^在MetY将O-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸的过程中发挥氧化剂的作用。因此，增加的Cysl和/或CysJ的表达或活性能够增加曱硫氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生。叶酸生物合成在肠细菌中，叶酸生物合成途径中产生的5-曱基四氢叶酸充当高半胱氨酸的曱基供体，由此将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸(参见图1)。表4列出在叶酸生物合成途径中发挥功能的蛋白(参见图4)。表4:叶酸生物合成途径<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>叶酸生物合成GTP环化水解酶IGTP环化水解酶I(FolE)催化GTP转化为二氢新蝶呤三磷酸，二氢新蝶呤三石粦酸是四氢叶酸(THF)和四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)的生物合成中的前体。THF和THFPG3分别是MetH或Meffi将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中关4建的辅因子。因此，FolE的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。磷酸酶(PhoA、PsiA、PsiF)磷酸酶(PhoA、PsiA、PsiF)将二氢新蝶呤三磷酸转化为二氢新蝶呤，二氲新蝶呤是四氢叶酸(THF)和四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)生物合成中的前体。THF和THFPG3分别是MetH或MetE将高半胱氨酸转化为曱疏氨酸的过程中关^t的辅因子。因此，PhoA、PsiA和/或PsiF的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。二氢新蝶呤醛缩酶二氢新蝶呤醛缩酶(Fo旧)催化二氢新蝶呤转化为6-羟曱基二氲蝶呤，6-羟曱基二氢蝶呤是四氢叶酸(THF)和四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)生物合成中的前体。THF和THFPG3分别是MetH或Meffi将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中关键的辅因子。因此，Fo旧的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-甲硫氨酸的产生。7,8-二氢-6-羟曱基蝶呤-焦磷酸激酶7,8-二氢-6-羟曱基蝶呤-焦磷酸激酶(FolK)催化6-轻曱基-二氢蝶呤转化为6-羟曱基-二氪蝶呤焦磷酸，6-羟曱基-二氬蝶呤焦磷酸是四氬叶酸(THF)和四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)生物合成中的前体。THF和THFPG3分别是MetH或MetE将高半胱氨酸转化为甲硫氨酸的过程中关键的辅因子。因此，FolK的表达或活性的增加能够增加甲硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。二氬蝶酸合酶二氢蝶S臾合酶(FolP)将6-羟甲基-二氢蝶呤焦磷酸转化为二氬蝶酸，二氢蝶酸是生物合成四氢叶酸(THF)和四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)过程中的前体。THF和THFPG3分别是MetH或MetE将高半胱氨酸转化为甲硫氨酸的过程中64关键的辅因子。因此，FolP的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺芬L-甲硫氨酸的产生。二氢叶酸合酶二氢叶酸合酶(FolC)催化二氢蝶酸转化为二氢叶酸，二氬叶酸是生物合成四氢叶酸(THF)和四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)过程中的前体。THF和THFPG3分别是MetH或MetE将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中关键的辅因子。因此，FolC的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺香L-甲硫氨酸的产生。二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶还原酶(FolA)催化二氢叶酸转化为THFPG3的前体四氬叶酸(THF)。THF和THFPG3分别是MetH或Meffi将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中关键的辅因子。因此，FolA的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。叶酰聚谷氨酸合成酶叶酰聚谷氨酸合成酶(FolC)也是一种二氢叶酸合酶(如上所述)，它催化四氢叶酸转化为四氢蝶酰三谷氨酸(THFPG3)，四氢蝶酰三谷氨酸是MetE将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中关键的辅因子。因此，FolC的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的产生。B12摄取和代谢维生素B12(氰钴胺素)起曱基钴胺素前体的作用，曱基钴胺素是MetH将高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中所需的关键辅因子。B12摄取途径中的蛋白包括表5a中所列的&m基因。PduO催化产生腺苷钴胺素的腺苷转移酶反应，腺苷钴胺素是某些其它维生素B12依赖性的酶所必需的，而非MetH所必需。PduO的水平或活性的P争低可提高细胞内曱基钴胺素的水平，从而使过量表达的MetH可用的曱基钴胺素增加，从而也增强曱硫氨酸产生。BtuC、BtuD和BtuF中一个或多个的表达的增力口(例如，BtuC、BtuD和BtuF的产生的增加)可增加曱石克氨酸产生。表5a:B12摄取和代谢基因蛋白ABC-型维生素B12转运蛋白通透酶(BtuC)ABC-型维生素B12转运蛋白腺苷三磷酸酶(BtuD)EC3.6.3.33ABC-型钴胺素/Fe"铁载体转运蛋白(BtuF)腺苷转移酶(PduO)EC4.2.1.28维生素B12摄取维生素B12(氰钴胺素)发挥甲基钴胺素前体的功能，曱基钴胺素是MetH催化高半胱氨酸的曱基化产生曱硫氨酸的过程中所需的关键辅因子。以下酶在从细菌环境摄取维生素B12和相关化合物时发挥功能。ABC-型维生素B12转运蛋白，通透酶组分(BtuC)ABC-型维生素B12转运蛋白，腺苷三磷酸酶组分(BtuD)ABC-型维生素B12转运蛋白/Fe^铁载体转运系统(BtuF)BtuC、BtuD和BtuF在B12和相关化合物的细胞内输入中发挥功能。维生素B12发挥曱基钴胺素前体的作用，曱基钴胺素是MetH催化高半胱氨酸曱基化产生曱硫氨酸的过程中所需的辅因子。因此，BtuC、BtuD和/或BtuF的表达或活性的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺普L-曱硫氨酸的产生。钴胺素腺苷转移酶PduO催化从维生素B12(氰钴胺素)产生腺苦钴胺素所需的腺苷转移酶反应。腺苷钴胺素是某些维生素B12依赖性的酶所必需，而非MetH所必需(其需要曱基钴胺素)。PduO的水平或活性的降低可增加曱基钴胺素的水平，原因是曱基钴胺素的前体维生素B12的可用性的增力口。由于曱基钴胺素在MetH催化高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程中是至关重要的，曱基谷氨酸的水平的增加可增强曱硫氨酸或S-腺芬L-曱硫氨酸的产生。甘氨酸裂解系统曱基四氢叶酸为MetH或MetE催化的高半胱氨酸转化为曱硫氨酸的过程提供曱基。曱基四氢叶酸的再生涉及丝氨酸羟曱基转移酶(GlyA)、四氢叶酸和丝氨酸，并且产生亚曱基四氢叶酸和甘氨酸。在谷氨酸棒杆菌发酵中，甘66氨酸以接近与曱硫氨酸等摩尔数的水平积累。然而，在大肠杆菌和许多其它细菌(和植物和动物)中，甘氨酸可以作为底物通过多酶甘氨酸裂解系统用于其它曱基四氢叶酸再生过程。因此，表达/过量表达甘氨酸裂解系统所需基因中的一种或多种，可促进使用过量的甘氨酸再生曱基四氢叶酸，并且因此可增强曱硫氨酸的产生。甘氨酸裂解系统的蛋白包括表5b中所列的蛋白。表5b.甘氨酸裂解系统基因酵步骤GcvP甘氨酸脱氢酶(脱羧性)吡口多醛磷酸依赖性的甘氨酸脱羧作用并且将氨基曱基转移至gcvHGcvHH-蛋白；含有共价连接的硫辛酰辅因子，发挥氨基曱基部分的载体的功能氨基曱基中间物的载体GcvT氨基甲基转移酶将氨基甲基Cl转移至四氢叶酸并且释》tNH3LpdA二氢硫辛酰胺脱氢酶再氧化GcvH硫辛酰辅基LplA硫辛酸-蛋白连接酶AGcvH(和其它蛋白)的硫辛酰化LipA硫辛酸合酶硫辛酸的合成LipB硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛将^^辛酸转移至GcvH(和其酰转移酶它蛋白)甘氨酸裂解(GCV)系统是多酶复合体，其催化甘氨酸的可逆氧化，产生二氧化碳、亚曱基四氢叶酸、氨和还原的吡啶核苷酸。所述系统由P-(gcvP)、H-(gcvH)、T-(gcvT)和L-(lpdA)蛋白组成。H-蛋白含有共价连接的硫辛酰辅因子，所述辅因子发挥甘氨酸衍生的氨基曱基部分的载体的功能。硫辛酰辅因子的产生和对GcvH的连接受到表5B中所列LplA或LipA，以及LipB的促进。尽管谷氨酸棒杆菌缺乏gcvP、gcvH和gcvT同源物(homolog),但是其含有可能在硫辛酰辅因子的再氧化、产生和对GcvH的连接中起作用的蛋白的同源物。其它多肽能够与上述多肽组合使用的其它生物合成、调节和转运多肽将在下文中67进行详细描述。含有编码这些多种多肽的核酸分子的组合的遗传工程菌抹可表现一种或多种的氨基酸或中间物的产生的改进。如上所述，与曱硫氨酸生物合成中的前体和辅因子有关的途径对于曱硫氨酸产生水平的决定是重要的，因此增加影响曱硫氨酸途径中的前体或辅因子供应的任何多肽在表达和/或活性，就能够导致曱硫氨酸和相关氨基S吏及代谢物的产生的增加。表6中示例性地给出能够用于增强曱硫氨酸产生、其它天冬氨酸家族氨基酸和代谢物的多肽及其相应的SEQIDNOs。能够在宿主菌抹中表达的序列不限于与表6中的SEQIDNOs相应的那些序列。因此，可以-使用来自其它物种的具有相同活性的蛋白(即，同源物)，也可使用所列多肽的变体和它们的同源物。表6:涉及曱硫氨酸、其它天冬氨酸家族氨基酸和代谢物产生的多肽的实例多肽细菌基因EC号SEQIDNOs:硫酸盐ABC转运蛋白ATP-结合蛋白(通透酶A蛋白)，j3.6.3.25硫酸盐转运系统通透酶W蛋白，『硫酸盐转运系统通透酶T蛋白，r硫酸腺苷酰转移酶亚基1，iV2.7.7.4硫酸腺苷酰转移酶亚基2，Z)2.7.7.4腺苷酰硫酸激酶，c2.7.1.25磷酸腺苷磷酸硫酸还原酶，//1.8.1.48亚石克酸盐还原酶(a亚基或血蛋白(3-组分)，/1.8.1.2亚石危酸盐还原酶(NADPH),Ec中的黄素蛋白卩亚基(不存在于Cg)，《/1.8.1.2腺苷酰硫酸还原酶(同化型)，//1.8.99.2磷酸甘油酸脱氢酶1.1.1.95磷酸丝氨酸转氨酶化厂G2.6.1.52磷酸丝氨酸磷酸酶化rS3.1.3.3<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>天冬氨酸半醛脱氢酶2.7.2.4高丝氨酸脱氢酶/zow1.2.1.11o-高丝氨酸乙酰转移酶脚M1.1.1.30-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶2.3.1,31钴胺素依赖性曱硫氨酸合酶舰很2.5.1.49钴胺素非依赖性曱硫氨酸合酶附6迅2.1.1.13高丝氨酸激酶歸2.1.1.14曱硫氨酸腺苷转移酶2.7.1.39o-琥珀酰(曱基)高丝氨酸(石克)-裂合酶2.5.1,6胱碌L醚卩-裂合酶2.5.1.485，10-亚曱基四氢叶酸还原酶4.4.1.8二氢吡啶二羧酸合酶1.7.99.5丙酮酸羧化酶4.2,1.52谷氨酸脱氢酶二氨基庚二酸脱氢酶曱硫氨酸和半胱氨酸生物合成阻抑物膨6A1.4.1.16赖氨酸输出蛋白一五磷酸烯醇丙酮S吏狻激酶磷酸烯醇丙酮酸羧化酶4.1.1,49ABC转运系统ATP-结合蛋白膨W4.1,1.31ABC转运系统通透酶蛋白ABC转运系统底物-结合蛋白甘氨酸脱氢酶(脱羧性)GcvP1,4.4.2H-蛋白；含有共价连接的硫辛酰辅因子，其发挥氨基曱基部分的载体功能GcvH氨基甲基转移酶GcvT2.1.2,10二氬^危辛酰胺脱氢酶LpdA1.8.1,4硫辛酸-蛋白连接酶ALplA6.3.2.画硫辛酸合酶LipA2.8,l.-硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛LipB2.3.1.-70<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>曱硫氨酸生物合成途径曱硫氨酸生物合成途径中的酶和它们催化的步骤如下所述(又见图1)。增加这些酶的活性或表达的可导致曱硫氨酸产生的增加。如下文中详细描述的，可使所述途径中的某些酶突变，以降低反馈抑制并由此增加它们的活性。高丝氨酸脱氢酶高丝氨酸脱氢酶(Hom)催化天冬氨酸半醛转化为高丝氨酸。在棒状杆菌型细菌中，Hom受到苏氨酸的反馈抑制，并且受到曱硫氨酸的阻抑。认为相比于赖氨酸分支中竟争性的二氢吡啶二羧S臾合酶(DapA)反应，该酶对天冬氨酸半醛具有更强的亲和性，但是沿着苏氨酸途径下游发生的轻微碳"溢出"(spillage)仍可能阻断Hom活性。Hom的反馈抗性变体、/zom的过量表达和/或/zow的脱调节的转录，或这些手段的任何组合，能够增强曱硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生。Hom活性的减少能够增强赖氨酸产生。具有高丝氨酸脱氢酶活性的双功能酶，如大肠杆菌metL编码的酶(天冬氨酸激酶II-高丝氨酸脱氢酶II)和thrA编码的酶(天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I)，也能够用以增强氨基酸的产生。高丝氨酸O-乙酰转移酶高丝氨酸O-乙酰转移酶(MetA)在曱硫氨酸生物合成中的第一个关键步骤中发挥作用(Park,S.etal.，Mo/.8:286-294，1998)。MetA酶催化高丝氨酸转化为O-乙酰-高丝氨酸。MetA受到曱硫氨酸生物合成途径终产物的强烈调节。在大肠杆菌中，S-AM和曱硫氨酸二者均产生别构调节，表观上发生在两个单独的别构部位。此外，MetJ和S-AM引起we"的转录阻抑。在棒状杆菌型细菌中，MetA可由曱硫氨酸和S-AM别构抑制，与大肠杆菌相似。MetA合成可以只受到曱硫氨酸的阻抑。此外，在之前的研究中已将三氟曱硫氨酸抗性与me"关联。降低由S-AM和曱硫氨酸所致的负调节，能够增强曱硫氨酸或S-腺香-L-曱硫氨酸的产生。增加的MetA活性能够增强天冬氨酸衍生的氨基酸如曱硫氨酸和S-AM的产生，而减少的MetA活性能够推进氨基酸如苏氨酸和异亮氨酸的形成。O-乙酰高丝氨酸辟b化氩解酶(O-acetylhomoserinesulfhydrylase)O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)催化O-乙酰高丝氨酸转化为高半胱氨酸。在棒状杆菌型细菌中MetY可受到曱硫氨酸的阻抑，在0.5mM曱硫氨酸存在下培养时，酶活性减少99%。此外，酶活性受到曱硫氨酸、高丝氨酸和O-乙酰丝氨酸的抑制。S-AM也可能调节MetY活性。脱调节的MetY能够增强曱硫氨酸或S-AM的产生。高丝氨酸激酶高丝氨酸激酶由^^基因编码，f/z;^基因是/zow-^^操纵子的一部分。ThrB使高丝氨酸磷酸化。已在若干物种中观察到苏氨酸对高丝氨酸激酶的抑制。某些研究提出，高丝氨酸激酶对高丝氨酸的磷酸化作用可能在某些情况下限制苏氨酸生物合成。增加的ThrB活性能够增强天冬氨酸衍生的氨基酸如异亮氨酸和苏氨酸的产生，而减少的ThrB活性能够促进包括但不限于赖氨酸和曱硫氨酸的氨基酸形成。曱硫氨酸腺芬转移酶曱硫氨酸腺苷转移酶将曱硫氨酸转化为S-腺苷-L-曱硫氨酸(S-AM)。下调曱硫氨S吏腺苷转移酶(MetK)能够通过抑制S-AM的转化来增强曱硫氨酸的产生。增强的表达或MetK的活性能够使S-AM的产生最大化。O-琥珀酰高丝氨酸(硫)-裂合酶/0-乙酰高丝氨酸(硫)-裂合酶O-琥珀酰高丝氨酸(硫)-裂合酶(MetB;也称为胱硫醚y合酶)催化O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸转化为胱硫醚。MetB的表达或活性的增加能够导致曱硫氨酸或S-AM的增加。胱硫醚(3-裂合酶72胱硫醚(3-裂合酶(MetC)能够将胱硫醚转化为高半胱氨酸。增加高半胱氨酸的产生能够导致曱硫氨酸产生的增加。因此，MetC表达或活性的增加能够增加甲硫氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生。5-曱基四氢叶酸高半胱氨酸曱基转移酶5-曱基四氢叶酸高半胱氨酸曱基转移酶(MetH)催化高半胱氨酸转化为曱硫氨酸。该反应依赖于钴胺素(维生素B12)。MetH的表达或活性的增加能够导致曱硫氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生的增加。5-曱基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸曱基转移酶5-曱基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸曱基转移酶(MetE)也催化高半胱氨酸转化为曱硫氨酸。MetE的表达或活性的增加能够导致曱硫氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生的增加。5,10-亚曱基四氢叶酸还原酶5,10-亚曱基四氢叶酸还原酶(MetF)催化亚曱基四氢叶酸还原为曱基四氢叶酸，曱基四氢叶酸是高半胱氨酸至曱硫氨酸的曱基化作用中的辅因子。MetF的表达或活性的增加能够导致曱硫氨酸或S-腺苷-L-曱硫氨酸的产生的增加。S-甲基曱硫氨酸:高半胱氨酸曱基转移酶S-曱基曱硫氨酸:高半胱氨酸曱基转移酶(Mmum)催化S-曱基曱硫氨酸对高半胱氨酸的转曱基作用以产生曱硫氨酸。因此Mmum的活性和/或表达的增加能够增加曱硫氨酸或S-腺苷L-曱硫氨酸的生物合成。S-腺苷高半胱氨酸水解酶S-腺普高半胱氨酸水解酶(SahH)催化将SAM介导的曱基化反应的副产物一一S-腺苷高半胱氨酸可逆地裂解为腺苷和高半胱氨酸，后者是曱硫氨酸的前体。因此SahH的活性和/或表达的增加能够增加曱硫氨酸的产生。SahH的过量表达能够导致其它天冬氨酸衍生的氨基酸如赖氨酸的积累。位点特异性DNA曱基化酶位点特异性DNA曱基化酶(CglM)将曱基从S-腺苷-L-曱硫氨酸转移至DNA,导致S-腺芬-L-高半胱氨酸的形成。依赖于遗传背景，位点特异性DNA曱基化酶的表达的增加或减少均可能增加曱硫氨酸或S-腺普-L-曱硫氨酸的产生。涉及天冬氨酸衍生氨基酸生物合成中所需的供给代谢前体和还原当量的蛋白天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶天冬氨酸激酶(aspartokinase)(也称为天冬氨酸〗敫酶(aspartatekinase))是寸崔化天冬氨酸家族氨基酸的生物合成中第一个关键步骤的酶。天冬氨酸激酶的水平和活性通常受到所述途径中的一种或多种终产物(依赖于细菌物种，是赖氨酸或赖氨酸加苏氨酸)的调节，这种调节既通过反馈抑制(也称为别构调节)也通过转录调控(也称为阻抑)。棒状杆菌型和大肠杆菌天冬氨酸激酶的细菌同源物能够用于增强氨基酸的产生。可以在异源生物体中表达棒状杆菌型和大肠杆菌天冬氨酸激酶以增强氨基酸的产生。在棒状杆菌型细菌中，天冬氨酸激酶由—C基因座编码。一C基因座含有两个重叠的基因，/wCa和^q3。/ysCa和/_ysCp分别编码天冬氨酸激酶的47-和18-kD亚基。第三个可读框与/，C基因座相邻，编码天冬氨酸半醛脱氢酶(a^/)。asd的起始密码子开始于/，C可读框末端24个石成基对的下游，其作为/，C操纵子的一部分表达。天冬氨酸激酶蛋白的一级序列(primarys叫uence)和fysC基因座的结构在放线菌目的许多成员中是保守的。同时编码与棒状杆菌型细菌的蛋白高度相近的天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的生物体的实例包括耻垢分枝杆菌、地中海拟无枝酸菌、天蓝色链霉菌爿30和77zew70&y^a/wca。在某些情况下，这些生物体包含与棒状杆菌型细菌中排列相同的/，C和a^/基因。表7显示来自这些放线菌的蛋白与谷氨酸棒杆菌天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶蛋白的百分比同一性。表7:异源天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶蛋白与谷氨酸棒杆菌蛋白的百分比同一性天冬氨酸激酶天冬氨酸半醛脱氢酶(与谷氨酸棒杆菌(与谷氨酸棒杆菌Asd生物体LysC的％同一性)的％同一性)74<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>源菌林如耻垢分枝杆菌、地中海拟无枝酸菌、天蓝色链霉菌和77^mo^/^"yksc"的分离林是可以得到的。可以从由各源菌抹制备的基因组DNA扩增/^C操纵子，并可将所得PCR产物连接至大肠杆菌/谷氨酸棒杆菌穿梭载体中。随后可将来自所述源菌抹的天冬氨酸激酶的同源物引入宿主菌才朱并且表达。在棒状杆菌型细菌中，存在一致的(concerted)赖氨酸和苏氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制。这与大肠杆菌相反，在大肠杆菌中存在三种截然不同的天冬氨酸激酶，它们各自独立地受到赖氨酸、苏氨酸或曱硫氨酸的别构调节。可将大肠杆菌天冬氨酸激酶III(和其它同工酶)的同源物用作脱调节的天冬氨酸激酶蛋白的备选来源。在棒状杆菌型细菌中表达这些酶可减少途径调节的复杂性。例如，天冬氨酸激酶III基因只受到赖氨酸的反馈抑制，而非赖氨酸和苏氨酸。因此，表达天冬氨酸激酶m等位基因的反馈抗性等位基因的优势包括(l)增加完全脱调节的可能性；和(2)可能不再需要在/zom中构建"渗漏(leaky)"突变或需要补充的苏氨酸营养缺陷型。这些特性能够使赖氨酸所致的反馈抑制降低。编码天冬氨酸激酶III同工酶的基因可以从与棒杆菌的亲缘性低于与上文所述》文线菌的细菌中分离。例如，菊欧文氏菌和S.基因产物与大肠杆菌lysC蛋白分别有77%和60%同一性(而与谷氨酸棒杆菌LysC由26%和35%同一性)。可以将来自非埃希氏菌属细菌菊欧文氏菌和幼ewawe〃"oweWe"wi的编码天冬氨酸激酶III或其功能性变体的基因扩增，并且连接至适合于在谷氨酸棒杆菌中表达的穿梭载体中。二氬吡"定二羧酸合酶由c/ap4编码的二氢吡啶二羧酸合酶是分支点酶，其将碳投向赖氨酸的生物合成而非苏氨酸/甲硫氨酸的产生。DapA将天冬氨酸-P-半醛转化为2，3-二氢吡啶二羧酸。已证明在大肠杆菌和棒状杆菌型细菌二者中DapA的过量表达均导致赖氨酸产生的增加。在大肠杆菌中，DapA受到赖氨酸的别构调节，而现存证据提示谷氨酸棒杆菌调节发生在基因表达的水平。二氢吡啶二羧酸合酶蛋白在放线菌中不如LysC蛋白那样保守。与谷氨酸棒杆菌蛋白或大肠杆菌DapA蛋白同源的野生型和脱调节的DapA蛋白均可表达以增强赖氨酸的产生。可作为da^4基因来源的候选生物体示于表8。可以使用来自结核分枝杆菌(M^^wcw/o^》或麻风分枝杆菌(M/印rae)的已知序列从耻垢分枝杆菌鉴定同源基因。表8:二氢吡啶二羧酸合酶蛋白的百分比同一性生物体与谷氨酸棒杆菌DapA的。/o同一性与大肠杆菌DapA的％同一性谷氨酸棒杆菌10034结核分枝杆菌//37iv*5933天蓝色链霉菌5333Thermobifidafiisca4833菊欧文氏菌3481*能够用于克隆耻垢分枝杆菌基因。减轻赖氨酸对大肠杆菌DapA的反馈抑制的氨基S吏取代已得到描述。这些取代的实例列于表5。某些能够加以改变来减轻反馈抑制的残基在全部候选DapA蛋白中是保守的(例如Leu88、Hisl18)。这种序列保守性说明，放线菌蛋白中相似的取代可进一步增强在常规抑制水平的赖氨酸存在下的蛋白功能。可使用定点诱变来工程化产生脱调节的DapA变体。可4吏用上文所述的方法来测试DapA分离4朱中赖氨酸产生的增加。例如，可将需赖氨酸细菌的培养物分散在缺乏赖氨酸的生长培养基上。随后可以将由定点诱变获得的必^4突变体群体引入(通过转化或接合)野生型棒状杆菌型菌株中，接着涂布到含有分散的所述赖氨酸营养缺陷型的琼脂平板上。反馈抗性的d"p^突变体将过量产生赖氨酸，这些赖氨酸被分泌到生长培养基中并且满足之前分散在琼脂培养基上的营养缺陷型的生长需要。因此，在含有76突变的菌落周围的赖氨酸营养缺陷型的生长暈将指示期望的反馈抗性突变的存在。为了增加使用高丝氨酸作为生物合成中间物的天冬氨酸衍生氨基酸的产生，减少DapA活性可能是有用的。二氨基庚二酸对于包括棒杆菌在内的某些细菌的生存至关重要。因此，菌抹构建可能需要引入"渗漏"da;^等位基因，即在不允许任何多余的碳流流入赖氨酸生物合成途径的同时允许生长的等位基因。表9:二氢吡啶二羧酸合酶中减轻反馈抑制的氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>丙酮酸和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶(Pyc)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)催化草酰乙酸(OAA)的合成，草酰乙酸是直接供给至赖氨酸生物合成中的柠檬酸循环中间物。已将这些回补反应与包括赖氨酸在内的几种氨基酸的产率提高联系起来，而且这些回补反应对于OAA形成的最大化显然是重要的。此外，已证明一种含有P458S取代的谷氨酸棒杆菌Pyc蛋白的变体具有增强的活性，表现为赖氨酸产生的增加。脯氨酸458是一个在众多丙酮酸羧化酶一一包括来自放线菌天蓝色链霉菌的蛋白(氨基酸残基449)和来自耻垢分枝杆菌的蛋白(氨基酸残基448)——中高度保守的氨基酸位置。在这些蛋白中类似的氨基酸取代可增强回补活性。第三个基因——PEP羧激酶(pc&)表达催化从OAA形成磷酸烯醇丙酮酸(用于糖异生)的酶，因此在功能上与pyc和ppc竟争。增强和ppc的表达能够最大化OAA形成。减少或消除pd:活性也能够改善OAA的形成。6-磷酸葡糖酸脱氢酶(Gnd)6-磷酸葡糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡糖酸氧化并脱羧成为D-核酮糖-5-磷酸。该反应还再生NADPH，它是还原性生物合成，包括天冬氨g臾衍生氨基酸的形成所必需的。增强的表达或Gnd的活性能够改善天冬氨酸衍生氨基酸包括曱硫氨酸的产生。果糖-l，6-二磷酸酶(fbp)果糖-l,6-二磷酸酶是催化D-果糖-l,6-二磷酸十H20^D-果糖6-磷酸+磷酸的反应的水解酶。果糖-l,6-二磷酸酶活性能够增强通过戊糖磷酸途径的通量(flux)，戊糖磷酸途径是产生NADPH的主要代谢途径。如上所述，NADPH为多种还原性生物合成，包括天冬氨酸衍生氨基酸的形成所必需。已报导谷氨酸棒杆菌中过量表达导致赖氨酸产生的增加(Becker"W.ApplEnvironMicrbiol.200571:8587-96)。因此，增强的表达或果糖-l，6-二磷酸酶的活性能够改善天冬氨酸衍生氨基酸包括曱硫氨酸的产生。葡糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)葡糖-6-磷酸脱氢酶作为戊糖磷酸途径的一部分发挥功能，催化D-葡糖-6-磷酸+NADP+D-葡糖酸-l,5-内酯-6-磷酸+NADPH+fT的反应。因此，增强g6;d的表达或葡糖-6-磷酸脱氢酶的活性使NADPH水平增加，并且能够改善天冬氨酸衍生氨基酸包括曱硫氨酸的产生。葡糖-6-磷酸异构酶(pgi)葡糖-6-磷酸异构酶在糖酵解中发挥功能，将D-葡糖-6-磷酸转化为D-果糖-6-磷酸。因此，pgi活性的降低或消除抑制经由Embden-Meyerhof途径(糖酵解)的葡萄糖分解代谢。谷氨酸棒杆菌中的pg/缺失突变体呈现出经过替代葡萄糖分解代谢途径(戊糖磷酸途径)的通量的增加、NADPH产生的增加和赖氨酸产生的增加(Marxetal.2003JBiotechnol104:185-97)。因此，降低或消除pg/的表达或葡糖-6-磷酸异构酶的活性使NADPH水平增加，并且能够改善天冬氨酸衍生氨基酸包括曱硫氨酸的产生。谷氨酸脱氬酶谷氨酸脱氢酶由^//2基因编码，催化a-酮戊二酸还原胺化以产生谷氨酸。在棒状杆菌型细菌中，这种反应需要NADPH。在某些情况下，增加谷氨酸脱氢酶的表达或活性能够导致赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸或色氨酸的增加。在其它情况下，降低的活性能够导致天冬氨酸衍生氨基酸产生的增加，这或者是NADPH还原性等同物可用性的增加，或者是由于三羧酸途径中间物的碳排出(carbondrain)的减少。二氨基庚二酸脱氢酶二氨基庚二酸脱氢酶在棒状杆菌型细菌中由A伪基因编码，催化氨和L-2-氨基A-氧代庚二酸(Hamino吒-oxopimelate)的NADPH依赖性还原形成内消旋-2,6-二氨基庚二酸——赖氨酸生物合成的替代途径中L-赖氨酸的直接前体。二氨基庚二酸脱氢酶的过量表达能够增加赖氨酸的产生。减少的活性能够导致高丝氨酸衍生氨基酸如甲硫氨酸的产生的增强。调节蛋白McbR基因产物谷氨酸棒杆菌的膨W基因产物是作为推定的TetR家族转录阻抑物被鉴定的，它可能涉及对谷氨酸棒杆菌中指导曱硫氨酸产生的代谢网络的调节(Rey"a/"J5/otec/2"o/,103(1):51-65，2003)。mcZi基因产物阻抑meJ、me^:、c>^《、qy^、/7om、/yA:、mwD的表达，也可能阻抑其它基因的表达。McbR可能与小分子如S-腺苷高半胱氨酸、S-AM或曱硫氨酸结合来阻抑表达。迄今为止，尚未鉴定出阻止S-腺苷高半胱氨酸、S-AM或甲硫氨酸结合的具体McbR等位基因。降低McbR的表达，和/或阻止S-腺苷高半胱氨酸、S-AM或曱硫氨酸对McbR调节，能够增强氨基酸产生。McbR涉及对含硫氨基酸(例如，半胱氨酸、曱硫氨酸)的调节。McbR表达或活性的降低也能够增强任何源自高丝氨酸的天冬氨酸家族氨基酸(例如，高丝氨酸、O-乙酰-L-高丝氨酸、O-琥珀酰-L-高丝氨酸、胱硫醚、L-高半胱氨酸、L-曱硫氨酸、S-腺苦-L-曱硫氨酸(S-AM)、O-磷酸-L-高丝氨酸、苏氨酸、2-氧代丁酸(2-oxobutanoate)、(S)-2-乙酰-2-羟基丁酸、(S)-2-羟基-3-曱基-3-氧代戊酸、(R)-2,3-二羟基-3-曱基戊酸、(R)-2-氧代-3-曱基戊酸和L-异亮氨酸)79的产生。MetR基因产物MetR基因产物是大肠杆菌中Meffi和MetH基因的转录激活物。MetR基因产物表达的增加能够导致MetE和MetH基因产物表达的增加，并且因此增加甲硫氨酸生物合成。Ncgl2640基因产物Ncgl2640基因产物与谷氨酸-半胱氨酸连接酶家族2显示出某些同源性。该家族的原始型酶催化谷胱甘肽从头(denovo)生物合成中的第一步。Mampeletal.(ApplMicrobiolBiotechnol.200568:228-36.)观察到谷氨酸棒杆菌中NCgl2640的转座子插入失活与曱硫氨酸产生的增加以及L-曱硫氨酸对半胱氨酸合酶、o-乙酰高丝氨酸石克化氬解酶(o-acetylhomoserinesulfhydrolase)(metY)和亚硫酸盐还原酶的阻抑的减轻相互关联。因此，减少或消除7Vcg/2似0的表达或7Vcg/2似基因产物的活性能够改进天冬氨S交衍生氨基酸包括曱硫氨酸的产生。流出蛋白大量细菌基因编码膜转运蛋白。这些膜转运蛋白中的一个亚类介导氨基酸从细胞流出。例如，谷氨酸棒杆菌表达一种苏氨酸流出蛋白(effluxprotein)。这种蛋白活性的损失导致苏氨酸在细胞内大量积累(Simicetal.,JBacteriol.183(18):5317-5324，2001)。对流出蛋白的表达和活性的调解能够导致多种氨基酸和相关代谢物的产生的增加。有用的流出蛋白包括药物/代谢物转运蛋白家力矣的蛋白。洗涤剂^:感性拯救子洗涤剂每文感性拯救子(detergentsensitivityrescuer)(tfci^)是一种表面活性剂抗性基因，编码与乙酰CoA羧化酶的a亚基相关的蛋白。增加DtsRl的表达或活性能够导致赖氨酸产生的增加。增加的活性也可导致其它天冬氨酸衍生氨基酸的产生的增加。80赖氨酸输出蛋白赖氨酸输出蛋白(LysE)是一种特异性赖氨酸易位蛋白，其介导赖氨酸从细胞流出。在lysE基因中具有缺失的谷氨酸棒杆菌中，L-赖氨酸的细胞内浓度能够达到高于1M(Erdmann,A.,etal./GWzM/cra&b/.139,:3115-3122,1993)。这种输出蛋白的过量表达或活性的增加能够增强赖氨酸的产生。减少的LysE活性能够增强非赖氨酸的天冬氨酸衍生氨基酸的产生。YjeHj^/Z编码一种涉及曱硫氨酸转运的大肠杆菌蛋白。YjeH表达的增加能够增强曱硫氨酸产生。YjeH表达的增加也能够导致曱硫氨酸途径中间物的产生增强。BrnFEBrnFE是一种双组分输出系统，由BrnF(AzlC)和BrnE(AzlD)多肽组成。BrnFE的过量表达(即，BrnF和BrnE的过量表达)能够导致支链氨基酸包括异亮氨酸的输出增强。BrnFE表达的增加也能够增强曱硫氨酸产生。MetDMetD是ABC型转运蛋白家族的高亲和性曱碌u氨酸摄取系统，由MetNPQ构成。MetN是ATP结合蛋白，MetP是通透酶蛋白(metl很可能是功能性等同物)，而MetQ是底物结合蛋白。MetD摄取系统表达的降低或失活能够降低甲硫氨酸摄取，进而导致曱硫氨酸产生的增加。细菌宿主菌林用于产生氨基酸的合适宿主物种包括肠杆菌科细菌如大肠杆菌细菌和棒杆菌属菌抹。下文的列表包含的种和菌抹的实例能够作为宿主菌抹用于表达异源和/或同源基因和用于产生氨基酸和相关中间物和代谢物。大肠杆菌W3110FIN(rrnD-rrnE)lX-(￡.co//GeneticStockCenter)谷氨酸棒杆菌ATCC(AmericanTypeCultureCollection)13032谷氨酸棒杆菌ATCC21526谷氨酸棒杆菌ATCC21543谷氨酸棒杆菌ATCC21608醋谷棒杆菌ATCC15806醋谷棒軒菌ATCC21491醋谷棒杆菌NRRLB-11473醋谷棒杆菌NRRLB-11475嗜乙醜乙酸棒軒菌(Co^ywe6acfen-讀<acetoa"V/op/z//wm)ATCC13870C0/3^7e6acteWwwweAxweco/aATCC17965Co^MeZjacfer/Mmf/ze，oam/朋ge/7es1FERMBP-1539乳短杆菌乳发酵短杆菌ATCC13869乳发酵短杆菌NRRLB-11470乳发酵短杆菌NRRLB-11471乳发酵短杆菌ATCC21799乳发酵短杆菌ATCC31269黄色短杆菌ATCC14067黄色短杆菌ATCC21269黄色短杆菌NRRLB-l1472黄色短杆菌NRRLB-11474黄色短杆菌ATCC214755revz'6acfen'ww<izV"n'C(^wmATCC14020用作基因来源的细菌菌株能够从中获得核酸序列的合适的物种和菌株包括但不限于以下所列:地中海拟无枝酸菌球形芽孢杆菌丙酮丁醇4炎菌白喉棒杆菌谷氨酸棒杆菌大肠杆菌菊欧文氏菌(例如，ATCC11663)胡萝卜软腐欧文氏菌植物乳杆菌(例如ATCC8014)鸟分枝軒菌(Afyco6acten'調(xW訓)牛分枝軒菌(Afyco6acteW簡6ov&)麻风分枝杆菌耻垢分枝杆菌(例如ATCC700084)结核分枝杆菌(例如结核分枝杆菌//37iv)皮诺卡氏菌天蓝色链霉菌(例如天蓝色链霉菌A3(2))772ermo6折&yksca(例如ATCC27730)细菌基因的分离用于在宿主菌抹中表达的细菌基因可以通过本领域已知的方法分离。重组核酸的构建方法参见，例如，Sambrook，J.,andRussell,D.W.(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001)。可以使用已知方法从来源菌株制备基因组DNA(参见，例如，Saito，H.and,Miura，K.S/op/y^Jcto.72:619—629,1963),并且可以使用PCR从基因组DNA扩增基因(U.S.Pats.4,683,195和4，683，202,Saiki，etal.5We"ce230:350-1354,1985)。用于扩增反应的DNA引物是与含有感兴趣基因的完整区域或部分区域的双链DNA的两个3'末端互补的那些引物。当仅扩增基因的部分区域时，有必要使用这些DNA片段作为引物以从染色体DNA文库中筛选包含完整区域的DNA片段。在扩增完整区域基因时，对包含DNA片段(含有扩增的基因)的PCR反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，随后提取DNA片段并且克隆到适合于在细菌体系表达的载体中。用于PCR的DNA引物可基于例如来源菌抹^^口的序列来充分地制备(Richaud,Retal.,Barfen'o/.297,1986)。例如，可以使用这样的引物，它能够扩增包含编码感兴趣的异源基因的核苷酸碱基的区域。引物的合成可以通过常规方法来进行，例如通过使用可以商业方法获得的DNA合成仪(例如，由AppliedBioSystemsInc.制造的DNASynthesizerModel380B)的phosphoamidite方法(参见refra/7^/丄幼.22:1859,1981)。此外，PCR可以通过使用商业上可获得的PCR设备和TaqDNA聚合酶，或其它呈现较高保真度的聚合酶，根据供应商指定的方法来进行。变体等位基因的构建许多调节氨基酸产生的酶受到生物合成途径中间物或终产物的别构反馈抑制。可以通过对造成反馈抑制的残基进行取代来产生这些酶的有用的变体。可以使用标准的定点诱变技术来构建对别构调节较不敏感的变体。将PCR扩增的一个或多个基因克隆至合适的穿梭载体中之后，使用寡核苷酸介导的定点诱变来提供编码特定氨基酸取代的经修饰的等位基因。可将含有野生型基因或经修饰的等位基因的载体与对照载体(controlvector)—起，转化到谷氨酸棒杆菌中，或转化到其它合适的宿主菌抹中。可对得到的转化体进行篩选，例如，针对氨基酸生产力、酶对反馈抑制的抗性的增加或本领域技术人员已知的其它标准进行筛选，以鉴定最感兴趣的变体等位基因。可使用测量氨基酸生产力和/或酶活性的测定法来确认筛选结果和选择有用的变体等位基因。用以定量甲硫氨酸和相关代谢物水平的技术如高压液相层析(HPLC)和HPLC-质谱(MS)试验是本领域技术人员已知的。可使用在编码序列内产生随机氨基S吏取代的方法，如通过诱变PCR等方法(例如，由此产生变体用于筛选降低的反馈抑制，或用于在增强的变体序列中31入其它变异)。例如，可使用GeneMorphPCR诱变试剂盒(Stratagene,LaJolla，Ca)根据制造商的说明来进行PCR,以获得中范围和高范围的突变频率。其它方法也是本领域已知的。对酶的评估可在其它对于宿主细胞是内源性的酶的存在下进行。在特定情况下，对生物体中非内源性生物合成蛋白(例如，附加型表达的蛋白)的功能性进行特异性评定的试剂将有所助益。可使用反馈抑制的表型测定或酶测定以确认生物合成的酶的变体和野生型的功能。克隆的基因的功能可通过对宿主细胞(例如，宿主大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌细菌)的已经过遗传表征的变体的互补作用来确认。许多大肠杆菌菌4朱可7>开从Aco//GeneticStockCenter获得，该机构在其万维网的站点上提供了可用菌株的列表。谷氨酸棒杆菌突变体也已有描述。84基因的表达细菌基因可以使用本领域已知的方法在宿主细菌菌抹中表达。在某些情况下，细菌基因(例如，异源和/或变体基因)的过量表达将增强宿主细胞的氨基酸产生。基因的过量表达可以通过多种方式实现。例如，可表达基因的多个拷贝，或者可对基因(例如，基因的变体等位基因或内源基因)上游的启动子、调节元件和/或核糖体结合位点进行修饰以优化在宿主菌林中的表达。此外，甚至基因的一个额外拷贝的存在也能够实现表达的增加，甚至在宿主菌抹已经含有宿主菌种天然具有的相应基因的一个或多个拷贝时也是如此。可将基因可操作地与强组成型启动子或诱导型启动子(例如，&c、/ac)连接，并且在促使氨基酸产量最高的条件下进行诱导。增强mRNA稳定性的方法是本领域技术人员已知的，可将其用来确保连续、高水平地表达蛋白。参见，例如，Keasling，J.,7>ewcfe/"历ofec/mo/ogy17:452-460，1999。对培养基和培养条件的优化也可增强基因的表达。已经存在对促进细菌中基因表达的方法的描述。参见，例如，Guerrero,C,etal.，Ge"e138(1-2):35-41,1994;Eikmanns,B丄，etal,102(1):93-8,1991;Schwarzer,A.，andPuhler,A.9(l):84-7，1991;Labarre,J.,etal.,J5acfer/o/.175(4):1001-7,1993;Malumbres，M.,etal.134(l):15-24，1993;Jensen,RR,，andHammer,K.B/oe"g.158(2-3):191-5,1998;Makrides,S.C.Mz'cra&o/iev.60(3):512-38，1996;Tsuchiyaetal.S/o/rec/mo/ogy6:428隱431，1988;美国专利5，965，931;美国专利4,601,893和美国专利5,175,108。感兴趣的基因(例如，异源基因或变体基因)应当与合适的启动子可操作地连接，所述启动子例如天然的或宿主菌林衍生的启动子、噬菌体启动子、充分表征的大肠杆菌启动子之一(例如toc、^p、//zo4、araBJD或它们的变体等)。其它合适的启动子也是可用的。在一个实施方式中，将异源基因与这样的启动子可操作地连接，所述启动子能够使得异源基因的表达水平至少2倍、5倍或IO倍地高于宿主菌林中内源同源物的水平。也可使用通过整合到染色体中来帮助基因扩增过程的质粒载体。参见，例如，Reinscheidetal.Em^rawM/cra^W.60:126-132,1994)。在这种方法中，将完整的基因克隆到质粒载体中，所述质粒载体能够在宿主(通常是大肠杆菌)中复制，但不在谷氨酸棒杆菌中复制。这些载体包括，例如，pSUP301(Simonetal.，Bio/Technol.1,85784-79,1983)、pK18mob或pK19mob(Schferetal.,145:69-73，1994)、PGEM-T(PromegaCorp.,Madison，Wisc.，USA)、pCR2.1國TOPO(ShumanJ历o/C/ze附.269:32678-84,1994;U.S.Pat.5,487,993)、pCR.RTM.Blunt(Invitrogen，Groningen,Holland;Bernardetal.,tWo/234:534-541,1993)、pEMl(Schmmpfetal.J^cten》/.173:4510-4516，1991)或pBGS8(Sprattetal.，G置41:337-342，1996)。随后将含有待扩增基因的质粒载体通过接合或转化转移至期望的谷氨酸棒杆菌菌抹中。接合的方法由例如Schferetal.五"v/ra"M/cro6/o/.60:756-759,1994)进4亍描述。转化的方法由例如Thierbachetal.(^c;p/Af/cro6/o/S/ofec/mo/.29:356-362,1988)、DunicanandShivnan(S/o/T^c/zwo/.7:1067-1070,1989)和Tauchetal.(F￡MSM/cra&o/123:343-347，1994)进行描述。依靠遗传交换发生同源重组事件之后，所得菌抹含有整合到宿主基因组中的期望基因。合适的表达质粒也可含有至少一个选择标记。选4奪标记可以是在宿主细胞中赋予抗生素抗性的核苷酸序列。这些选择标记包括氨千青霉素、头孢唑啉、奥格门汀(augmentin)、头孢西丁、头孢他咬、头孢漆吹、头孢p塞吩、恩诺沙星、卡那霉素、大观霉素、链霉素、四环素、替卡西林、替米考星或氯霉素抗性基因。其它选择性记包括能够补全存在于特定宿主菌抹中的营养缺陷型(例如亮氨酸、丙氨酸或高丝氨酸营养缺陷型)的基因。在一个实施方式中，将复制型载体用于表达异源基因。示例性复制型载体可包括以下载体a)选4奪标记，例如，抗生素标记，如kanR(来自pACYC184);b)大肠杆菌中的复制起点，如P15aon'(来自pACYC184);c)谷氨酸棒杆菌中的复制原点如pBLl中存在的复制起点；d)启动子片段，其带有或不带有伴随的阻抑物基因；和e)终止子片段。启动子片段可以是/ac、^c、^c朋S、toc或UVJ^(来自大肠杆菌)，或p/zo4、gpd、r;/M、r戸J(来自谷氨酸棒杆菌)。阻抑物基因可以是分别对于/ac、加、加iAS、toc和？JVJ^的/ac/或c/857。终止子片,殳可以来自大肠杆菌rm5(来自ptrc99a)、T7终止子(来自pET26)，或可以是来自谷氨酸棒杆菌的终止子片段。在另外的实施方式中，将整合性载体用于表达异源基因。示例性的整合载体可包括a)选择标记，例如，抗生素标记，如kanR(来自pACYC184);b)大肠杆菌中的复制起点，如P15aon'(来自pACYC184);c)和d)位于待取代片段例如pA或/w附基因之侧翼的两个谷氨酸棒杆菌基因组片段，；e)来自枯草芽孢杆菌CS.wZ^fe)的^c^基因；f)控制异源基因表达的启动子片段，其带有或不带有伴随的阻抑物基因；和g)终止子片段。启动子片段可以是/ac、^r、^ci^S、toc或？JVJ^(来自大肠杆菌)，或//zo」、gp么r//M、r戸J(来自谷氨酸棒杆菌)。阻抑物基因可以是分别对于/ac、加、加朋S、toc和W/APw的/ac/或c/。终止子片^:可以来自大肠杆菌(来自ptrc99a)、T7终止子(来自pET26)，或可以是来自谷氨S吏棒杆菌的终止子片段。可能的整合或复制型质粒，或用于构建这些质粒的反应物不限于本文所述。其它质粒是本领域技术人员熟知的质粒。关于来自谷氨酸棒杆菌的终止子片段的使用，终止子和侧翼序列可由单一的基因片段提供。在这种情况下，将上述元件按以下顺序排列在质粒上标记；复制起点；连接于待取代片段侧翼的谷氨酸棒杆菌基因组片段；启动子；谷氨酸棒杆菌终止子；mcS基因。也可将Mc5基因置于复制其点和谷氨酸棒杆菌侧翼片段之间。整合和切除仅导致启动子、终止子和感兴趣的基因的插入。可将多克隆位点置于上述质粒元件之间的几个可能的位置之一中，以促进具体的感兴趣的基因(例如，—C等)插入质粒。对于复制型载体和整合性载体二者，添加接合转移的起点如RP4wo6都能够促进大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌之间的基因转移。在一个实施方式中，用附加型质粒在宿主菌抹中表达细菌基因。合适的质粒包括在所选宿主菌抹例如棒状杆菌型细菌中复制的质粒。许多已知的质粒载体，例如pZl(Menkeletal.，v4p///ed￡"v/ra"M/cra^o/.64:549-554,1989)、pEKExl(Eikma應etal"G騰102:93隱98,1991)或pHS2-l(So画netal"G認107:69-74,1991)是以隐蔽性质粒pHM1519、pBLl或pGAl为基础。其它能够使用的质粒载体包括基于pCG4(美国专利4,489,160)或pNG2(Serwold-Davisetal.,F￡MS丄e仏66:119-124,1990)或pAGl(美国专利5,158,891)的质粒。可供选择的是，可通过使用转导、转座子(Berg,D.E.andBerg，C.M"肠/rec/7"o/.1:417,1983)、Mu噬菌体(日本专利公布2-109985)或同源或非同源重组(ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLab.，1972)的方法，将一个或多个基因整合到宿主微生物的染色体中。此外，对氨基酸产生可能有利的是，使用多于一个基因，或将基因与其它生物合成途径基因组合使用，以增强具体生物合成途径中、糖酵解中、回87补(anaplerosis)中或氨基酸输出中的一种或多种酶。还可能有利的是同时衰减特定基因产物的表达以最大化具体氨基酸的产生。例如，对meW表达或Met活性的弱化，可通过阻止曱辟L氨酸转化为S-AM来增强甲硫氨酸产生。将核酸引入宿主细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，Sambrook，J.,andRussell,D.W.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY，2001。合适的方法包4舌〈吏用氯化4丐(Mandel，M.andHiga,A.J.Afo/历o/.53:159,1970)和电穿孔(Rest,M.E.vander，etal.jp;/M/craZ^o/.5/ofec/z"o/.52:541-545,1999)的转化，或者接合。细菌的培育可对含有感兴趣的基因(例如，异源基因、编码具有降低的反馈抑制的酶的变体基因)的细菌进行连续培养或通过分批发酵过程进行培养(分批培养)。或重复补料分批方法(重复进料方法)。对已知培养方法的总结在Chmiel(Bioprozesstechnik1.EinflihrungindieBioverfahrenstechnik(GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))的教科书中或在Storhas(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen(ViewegVerlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))的教科书中有所描述。使用的培养基满足具体宿主菌抹需求。对适合于各种微生物的培养基的才既述可参见AmericanSocietyforBacteriology(WashingtonD.C.，USA,198l)的手册"ManualofMethodsforGeneralBacteriology",尽管本领域技术人员将认识到，为了使产物的形成最大化，在单纯的培养需求之外，通常可对培养基的成分进行改变。可将以下物质单独地或作为混合物用作碳源糖和碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素；油脂，例如大豆油、葵花油、花生油和椰子油；脂肪酸，例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸；醇类，例如甘油和乙醇；以及有才几酸类，例如乙酸。能够作为氮源使用的有有机含氮化合物，例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆蛋白水解产物、大豆粉和尿素；或无机化合物，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。所述氮源可单独使用或作为混合物使用。磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾或相应的钠盐能够用作磷源。有机和无机的含硫化合物，例如硫酸盐或酯、硫代硫酸盐或酯、亚硫酸盐或酯、还原的来源如H2S、硫化物、硫化物的衍生物、曱硫醇、硫代乙酸盐或酯(thioglycolytes)、硫氰酸盐或酯和硫脲可用作硫源以制备含硫氨基酸。培养基也可包含生长必需的金属盐，例如硫酸镁或硫酸铁。除上述物质外，还可使用必需生长物质如氨基酸和维生素(例如钴胺素)。此外可向培养基添加合适的前体。可将提到的起始物质添加至培养基作为单一的批次，或者可在培养期间的多个时间点进料。可以适当的方式使用碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸4丐、氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸来控制pH。消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫的发生。可向培养基添加合适的具有选择性作用的物质如抗生素以保持质粒的稳定性。为了保持有氧条件，将氧气或含氧气体混合物如空气引入培养物中。培养的温度通常在20-45。C,优选25-40。C。使培养持续到期望的产物已经最大限度地形成，通常在IO小时至160小时之内。以这种方式获得的发酵液可含有2.5-25重量％干重的感兴趣的氨基酸。同样可能有利的是如下进行发酵在发酵循环中的某些部分，优选至少在30%的发酵时间中，生产微生物的生长和代谢受到糖的添加速率的限制。例如，在这段时期内将发酵培养基中可利用的糖的浓度保持在^3g/1。随后可对发酵液进行进一步加工。可通过任何固-液分离方法将全部或部分的生物质从发酵液中去除，所述方法例如离心、过滤、倾析或它们的组合，或者可将生物质完全留在发酵液中。随后通过已知的方法将水从发酵液中去除，所述方法例如在多效蒸发器、薄膜式蒸发器、降膜蒸发器的帮助下的方法，或通过反渗透方法。随后可通过冷冻干燥、喷雾干燥、流化床干燥或通过其它方法来处理(workup)浓缩的发酵培养液，以产生优选是自由流动、细碎的粉末。然后可将所述自由流动、细碎的粉末通过适当的压实或制粒过程依次转化成粗粒、易自由流动、耐贮存和基本上无尘的产品。在制粒或压实中，可能有利的是使用常规有机或无机辅料或载体，例如淀粉、明胶、纤维素衍生物或相似物质，例如在食品或饲料加工中常规用作黏合剂、凝胶剂或增稠剂，或其它物质如二氧化硅类、硅酸盐/S旨类或硬脂酸盐/酯类。然而可供选择的是，可将所述产品吸附于饲料加工中已知的、常规的有机或无机载体物质上，例如二氧化硅类、硅酸盐/酯类、砂砾、糠麸、粉、淀粉、糖或其它，和/或与常规增稠剂或黏合剂混合并且用常规增稠剂或黏合剂稳定化。最后，通过使用成膜剂例如金属碳酸盐、二氧化硅类、硅酸盐/酯类、藻酸盐/酯类、硬脂酸盐/酯类、淀粉、胶和纤维素醚的包覆方法，如DE-C-4100920中所述，可将产品制成对于动物胃的消化，具体是对于反刍动物胃的消化稳定的状态。如果在所述过程中分离生物质，则另外的无机固体，例如在发酵期间添加的无机固体，通常被去除。在本发明的一个方面，可生物质以多至70%的程度被分离，优选以多至80%，优选以多至90%,优选以多至95%，并且尤其优选以多至100%的程度被分离。在本发明的另一个方面，多至20%的生物质，优选多至15%，优选多至10%，优选多至5%的生物质被分离，尤其优选的是无生物质被分离。存在于发酵培养液溶液中的形成或添加的有机物质，可加以保留或通过适当的方法分离。这些有机物质，包括除期望的氨基酸或代谢物之外任选产生的有机副产物，和发酵中采用的微生物任选放出的有机副产物。这些包括选自下组的L-氨基酸L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-曱硫氨酸、L-异亮氨酸或L-色氨酸。它们包括选自下组的维生素维生素Bl(硫胺素)、维生素B2(核黄素)、维生素B5(泛酸)、维生素B6(吡哆醇)、维生素B12(氰钴胺素)、烟酸/烟酰胺和维生素E(生育酚)。它们还包括含一至三个羧基的有机酸，例如乙酸、乳酸、柠檬酸、苹果酸或延胡索酸。最后，它们还包括糖类，例如海藻糖。这些化合物任选是理想的，如果它们改进了产品的营养价值的话。也可根据需要，在合适的加工步骤期间，将这些有机物质，包括L-和/或D-氨基酸和/或D,L-氨基酸的外消旋混合物，以固体或液体形式作为浓缩物或纯物质添加。提到的这些有机物质可单独添加或作为混合物添加至产生的或浓缩的发酵培养液中，或者也可在干燥或制粒处理期间添加。同样可能的是向发酵培养液添加有机物质或几种有机物质的混合物，并且在其后的加工步骤例如制粒中添加更多的有机物质或更多的几种有机物质的混合物。上述产品可用作饲料添加剂，即用于动物营养的祠料添加剂。用作饲料添加剂的氨基酸的制备方法参见例如WO02/18613,将其内容作为参考并入本文。变体多肽变体多肽，例如具有一个或多个降低或消除反馈抑制的氨基酸改变的多肽，对于氨基酸或其它代谢物的产生是有用的，将在下文中对此进行更加详细的描述。下文将对变体多肽的实例进行描述。6-磷酸葡糖酸脱氢酶(gnd)6-磷酸葡糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡糖酸氧化并且脱羧为D-核酮糖-5-磷酸。该反应还再生NADPH，NADPH是多种还原性生物合成，包括天冬氨酸衍生氨基酸的形成所需要的。Gnd受到细胞内代谢物如ATP的别构抑制的反馈抑制。多种细菌物种中对于降低反馈抑制有效的Gnd点突变的实例列于表10。表10:6-磷酸葡糖酸脱氢酶基因(gnd)中减轻别构调节的氨基酸取代生物体絲酸取代谷氨酸棒杆菌大肠杆菌S340F天蓝色链霉菌S348^F菊欧文氏菌S344">F耻垢分枝杆菌S355^F*在Ohnishietal.FEMSMicrobiologyLetters242:265中有所描述。高丝氨酸脱氬酶(Hom)可产生靶定的氨基酸取代以减少(但并不消除)Hom活性或减轻苏氨酸对Hom的反馈抑制。导致Hom活性减少的突变称作"渗漏"Horn突变。在谷氨酸棒杆菌高丝氨酸脱氢酶中已鉴定出这样的氨基酸残基，可以对它们加以突变来增强或减少Hom活性。这些特定氨基酸中的几种在其它放线菌的Hom蛋白中相当保守(参见表11)。表ll:导致"渗漏"Hom等位基因或受到的苏氨酸反馈抑制减轻的Hom蛋白的氨基酸取代91<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>Ahom^突变在WO93/09225的第11页有所描述。这种突变是在1964bp处的单碱基对缺失，其在密码子429处破坏了homdr的读码框。这导致移码突变，诱使大约十个氨基酸发生改变和过早地终止或截短，即，导致多肽中最后大约七个氨基酸残基的缺失。认为homdr基因在羧基末端的这种单一碱基缺失根本上改变了酶羧基末端的蛋白序列，使酶的构型产生变化，由此阻止苏氨酸与结合位点的相互作用。天冬氨酸激酶(lysC)可以使用赖氨酸类似物(例如S-(2-氨乙基)半胱氨酸(AEC))或高浓度的赖氨酸(和/或苏氨酸)来鉴定赖氨酸产生增强的菌抹。来自谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌的已知的赖氨酸抗性菌抹中很大一部分在/，C座位含有突变。重要的是，赋予增加的AEC抗性的特异性氨基酸取代已经被鉴定，并且这些取代被定位在相当保守的残基处。导致氨基酸生产力增加的特异性氨基S吏取代(至少在野生型菌抹中)包括但不限于表12所列。在许多实例中，已经鉴定出几种在具体残基处的有用取代。此外，在多个实例中，已鉴定出含有多于一个/，C突变的菌抹。序列比对确认，先前认为与反馈抗性(即AEC抗性)相关的残基在来自远缘细菌的多种天冬氨酸激酶蛋白中是保守的。表12:减轻天冬氨酸激酶反馈抑制的氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>可使用标准定点诱变技术构建不受别构调节的天冬氨酸激酶变体。将PCR扩增的或天冬氨酸激酶III基因克隆到合适的穿梭载体中后，使用寡核苷酸介导的定点诱变来提供修饰的等位基因，它们编码取代。可将含有野生型基因或修饰的等位基因的载体同对照载体一起转化到谷氨酸棒杆菌中。对所得转化体进行筛选，例如，针对赖氨酸生产力、对AEC抗性的增加、相对赖氨酸营养缺陷型的互养等进行筛选，或通过其它本领域技术人员已知的方法来进行筛选，从而鉴定最感兴趣的突变等位基因。可使用测量赖氨酸生产力和/或酶活性的测定法来确认筛选结果和选择有用的突变等位基因。用以定量天冬氨酸家族氨基酸和相关代谢物水平的技术如高压液相层析(HPLC)和HPLC-质谱(MS)测定法是本领域技术人员已知的。可使用在^C编码序列内产生随机氨基酸取代的方法，如通过诱变PCR等方法。这些方法是本领域技术人员熟知的；例如，可使用GeneMorphPCR诱变试剂盒(Stratagene，LaJolla,Ca)根据制造商的说明来进行PCR,以获得中范围和高范围的突变频率。对异源酶的评估可在宿主细胞内源蛋白的存在下进行。在特定情况下，特异性评定异源生物合成蛋白的功能的试剂将是有用的。可使用对于AEC抗性的表型测定或酶测定来确认异源天冬氨酸激酶的经修饰变体和野生型的功能。克隆的异源基因的功能性可通过对已被遗传表征的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌变体的补全作用来确认。许多大肠杆菌菌抹可公开从E.coliGeneticStockCenter获得(http:〃cgsc.biology.yale.edu/top.html)。也对谷氨酸棒杆菌突变体进行了描述。曱硫氨酸腺芬转移酶可产生靶定的氨基酸取代以减少(但不消除)MetK活性。导致MetK活性减少的突变称作"渗漏"MetK突变。在谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌MetK多肽中已鉴定出这样的氨基酸残基，可以将它们突变来减少MetK活性。这些特定氨基酸中在其它放线菌和菊欧文氏菌的MetK蛋白中相当保守(参见表13)。表13:导致"渗漏"MetK等位基因的氨基酸取代渗漏MetK等位基因来自异源MetK的相应氨基酸残基谷氨酸棒杆菌残基耻垢分枝杆菌菊欧文氏菌天蓝色链霉菌大肠杆菌V200EV196EV185EV195EV195EV185E实施例下文将对表达本文所述多肽的载体的构建方法以及变体多肽的构建方法进行描述。实施例1.构建载体用于表达使天冬氨酸衍生氨基酸的产生增强的基因产生质粒，将其用于表达与天冬氨酸衍生氨基酸的产生相关的基因。许多靶基因示于图1。这些质粒可以是自主复制的质粒，或者也可以是整合到宿主谷氨酸棒杆菌染色体中的质粒，将这些质粒通过记载的电穿孔法(参见Follettie，M.T.，etal.J5acten'o/.167:695-702,1993)引入棒杆菌菌抹。全部质粒均含有&"i基因，其赋予对抗生素卡那霉素的抗性。在含有卡那霉素(25mg/L)94的培养基上筛选转化体。为了通过附加型质粒进行表达，使用隐蔽性谷氨酸棒杆菌低拷贝pBLl质粒的衍生物来构建载体(参见Santamariaetal./Ge".M/craZ)/o/.130:2237-2246,1984)。附加型质粒含有编码复制酶的序列，该序列使得质粒能够在谷氨S吏棒杆菌内复制；因此，这些质粒能够在不整合到染色体中的情况下增殖。质粒MB3961和MB4094是用于构建本文所述附加型表达质粒的载体骨架(参见图5和6)。质粒MB4094含有相对于MB3961有所改进的用于棒杆菌中的复制起点，因此，多数研究使用这种骨架。MB3961和MB4094二者均含有来自pTrc99A的调节序列(参见Amannetal.，69:301-315,1988)。/ac勿-^IPTG-诱导型启动子盒的3'部分位于多聚接头内，由此使得感兴趣的基因能够作为含有与7VcoI-iVWI匹配的突出端的片段插入，并且iVcoI位点与感兴趣的基因的起始位点相邻(也可使用其它多聚接头位点如代替A^I位点)。此外，可将有用的启动子例如经修饰的加启动子Oci^5)和谷氨酸棒杆菌gp丄^/M和r;^/启动子置于便利的限制片段上，包括MzeI-AAco[片段上，插入MB3961和MB4094骨架中。启动子含有被证明增强表达蛋白的水平的修饰核糖体结合位点。这些研究中基因表达采用的启动子序列示于表14。表14:用以控制棒杆菌中基因表达的启动子启动子序列SEqIDNO:Laclq-trcctagctacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagcgcgaattgatctggtttgacagcttatcatcgactgcacggtgcaccaatgcttctggcgtcaggcagccatcggaagctgtggtatggctgtgcaggtcgtaaatcactgcataattcgtgtcgctcaaggcgcactcccgttctggataatgttttttgcgccgacatcataacggttctggcaaatattctgaaatgagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagacLacIq-trcRBSctagctacgttgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtgg<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>还设计了通过基因缺失来使天然谷氨酸棒杆菌基因失活的质粒。在某些情况下，这些构建体使天然基因缺失，并同时将异源基因插入到宿主染色体中发生所述缺失事件的座位处。表14列出被缺失的内源基因和被引入的异源基因(如果存在)。缺失质粒含有与缺失事件的靶基因的上游区和下游区同源的核苷酸序列；在某些情况下，这些序列包括待失活基因的小部分编码序列。这些侧翼序列用于促进同源重组。单交换事件将质粒靶向至宿主染色体中待缺失基因的上游或下游的位点处。缺失质粒还包含rac5基因，其编码来自枯草芽孢杆菌的果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因。将含有整合质粒的转化体划线接种到不含卡那霉素的BHI培养基上。l天之后，将菌落划线接种到含有10%蔗糖的BHI培养基上。这种方法选择^cB基因被切除的菌抹，因为sacB基因使蔗糖聚合形成对谷氨酸棒杆菌具有毒性的果聚糖(参见Jager,W.,etal./BacfeWo/.174:5462-5465,1992)。将转化体培养在含有蔗糖的培养基上时，sacB使得阳性选择重组事件成为可能，导致彻底的缺失事件(cleandeletionevent),或导致整合质粒中除调节感兴趣的具体基因诱导型表达的盒之外的所有部分去除(参见Jager，W.,etal./Sacten'o/.174:5462-5465,1992)。利用PCR和在鉴别培养基上的生长验证了蔗糖抗性菌落中发生的预期的重组事件。图7-14A展示了本文所述的缺失质粒。表15:用于缺失谷氨酸棒杆菌基因的质粒，某些情况下缺失与表达盒的插入相结合质粒缺失的天然基因位点处插入的元件MB4083无MB4084*5无MB4165无MB4169S^-耻垢分枝杆菌/j^C(T3〃"-a^MB4192gpd-天蓝色链霉菌/zom(T^62"MB4276gpd-耻垢分枝杆菌/^QTW7"-a^MB4286膨W加朋S-Z1舰MMB4287膨W^ri55"-谷氨酸棒杆菌me"(K233A)-meW实施例2.用于增强天冬氨酸衍生氨基酸产生的基因的分离使用从各自相应的生物体分离的基因组DNA进行PCR扩增来获得以下基因来自耻垢分枝杆菌的天冬氨酸激酶aC-a)和卩(/^C-y)的野生型等位基因和天冬氨酸半醛脱氢酶的野生型等位基因(osJ)(谷氨S吏棒杆菌中^C/aW的同源物)；来自天蓝色链霉菌的编码天冬氨酸激酶-asd的基因(—C-w力、详口/z。w;来自T7zer附oZnyM3的we"和w"E4;和来自菊欧文氏菌的^^4和p;c。此外，在某些情况下，从谷氨酸棒杆菌中分离与每种基因相应的野生型等位基因。然后将扩增子克隆到pBluescriptSKir中用于序列鉴定；在特定情况下，还在这些载体中进行定点诱变以生成活化等位基因。将耻垢分支杆菌在BHI培养基中于37°C培养72小时，使用QIAGENGenomic-tips根据制造商试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)中的建议从中分离基因组DNA。为了从天蓝色链霉菌分离基因组DNA,将细胞在TYE培养基(ATCC培养基1877ISPMediuml)中于25。C培养7天，再使用盐析方法(SaltingOutProcedure)(^口PracticalStreptomycesGenetics,pp.169-170,Kieser,T.,et.al"JohnInnes97Foundation,Norwich,England2000中所述)从细胞中分离基因组DNA。为了从7:/ksca分离基因组DNA，将细胞在TYG培养基(ATCC培养基741)上于50。C培养5天。对100ml培养物进行离心沉降(于4。C，以5000rpm离心10分钟)，并且用40ml10mMTris、20mMEDTApH8.0洗涤两次。将细胞离心沉淀悬浮(bringup)在终体积40ml的10mMTris、20mMEDTApH8.0中。使该悬液经过Microfluidizer(MicrofluidicsCorporation,NewtonMA)10个循环并加以收集。用额外的20ml緩冲液清洗设备并且进行收集。溶解的细胞的终体积是60ml。用异丙醇沉淀法从被溶解细胞的悬液中沉淀DNA,并且将离心沉淀重悬在2mlTEpH8.0中。用苯酚/氯仿抽提样品，并且再次用异丙醇沉淀DNA。对于菊欧文氏菌的DNA分离，使用GenomicTip500/G与对大肠杆菌所用的方法(Qiagen基因组方法)一样从中分离基因组DNA。耻垢分枝杆菌/，C-"W操纵子的PCR扩增根据/，C基因的上游序列和接近终止处的序列来设计引物。上游引物是5'画CCGTGAGCTGCTCGGATGTGACG-3，(SEQIDNO:—)，下游引物是5，-TCAGAGGTCGGCGGCCAACAGTTCTGC-3，(SEQIDNO:_)。使用PfuTurbo(Stratagene,LaJolla，CA)扩增基因，其中反应混合物含有10jxl10XClonedPfli緩冲液、8|ildNTP混合物(每种2.5mM)、2(il每种引物(20jiM)、1(ilPftiTurbo、10ng基因组DNA,加水至100的反应终体积。反应条件是94°C2分钟；之后是28个循环的94°C30秒，60。C30秒，72°C9分钟。在72°C进行4分钟的最终延伸来完成反应，然后将反应冷却至4°C。用Qiagen凝胶提取方案纯化所得产物，之后平端连接至pBluescriptSKII-的Smal位点中。将连接体转化到大肠杆菌DH5ot中并且通过蓝/白斑筛选进行选择。通过Qiagen方法处理阳性转化体以分离质粒DNA并且测序。MB3902即所得质粒，其含有预期的插入序列。用于扩增天蓝色链霉菌基因的引物对是5，-ACCGCACTTTCCCGAGTGAC-3'(SEQIDNO:J和5，-TCATCGTCCGCTCTTCCCCT-3，(一C-asd)(SEQIDNO:」；5，-ATGGCTCCGACCTCCACTCC-3，(SEQIDNO:J和5'醫CGTGCAGAAGCAGTTGTCGT-3，(t/—)(SEQIDNO:—);和5，画TGAGGTCCGAGGGAGGGAAA-3，(SEQIDNO:—)和5，-TTACTCTCCTTCAACCCGCA-3，(Zz簡)(SEQIDNO:—)。98用于从7:/wca扩增m"Z4才喿纵子的引物对是5，画CATCGACTACGCCCGTGTGA-3，(SEQIDNO:—)和5，誦TGGCTGTTCTTCACCGCACC-3，(SEQIDNO:J。用于扩增菊欧文氏菌的引物对是5，-TTGACCTGACGCTTATAGCG-3，(SEQIDNO:—)和5，画CCTGTACAAAATGTTGGGAG-3，(d—)(SEQIDNO:—);和5，画ATGAATGAACAATATTCCGCCA-3，(SEQIDNO:J和5，-TTAGCCGGTATTGCGCATCC-3，(p/c)(SEQIDNO:—)。.通过与上述类似的方法来进行基因的扩增，或使用Eppendorf的TripleMasterPCR体系(Eppendorf,Hamburg,Germany)来进行基因的扩增。进行平端连接以将扩增子克隆到pBluescriptSKII-的5"mal位点中。所得质粒是MB3947(天蓝色链霉菌(ysC-a0、MB3950(天蓝色链霉菌cb/W)、MB4066(天蓝色链霉菌/zom)、MB4062(r/Mscaw^K4)、MB3"5(菊欧文氏菌c/a;^)和MB4077(菊欧文氏菌ppc)。将这些质粒用于插入序列的序列验证以及随后到表达载体中的克隆；同样对这些载体的一个亚群进行定点诱变以产生特定基因的脱调节(deregulated)等位基因。实施例3.增强天冬氨酸衍生氨基酸产生中涉及的基因的活性的靶向取代对实施例2中所述含有异源基因的几种pBluescriptSKII-质粒进行定点i秀变。4吏用Stratagene的QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit进4亍定点"i秀变。就异源天冬氨酸激酶(/^C7o^)基因而言，构建相应于谷氨酸棒杆菌蛋白中T3111、S301Y、A279P和G345D氨基酸取代的取代突变。这些取代可降低由赖氨酸和苏氨酸联合产生的反馈抑制。在所有情况下，突变的^C/aW等位基因在与异源"W基因形成的操纵子中表达。用以构建耻垢分枝杆菌反馈抗性/，C等位基因的寡核普酸是5，陽GGCAAGACCGACATCATATTCACGTGTGCGCGTG-3，(SEQIDNO:—)和5，-CACGCGCACACGTGAATATGATGTCGGTCTTGCC-3，(T311I)(SEQIDNO:」；5，-GGTGCTGCAGAACATCTACAAGATCGAGGACGGCAA-3，(SEQIDNO:J和5'画TTGCCGTCCTCGATCTTGTAGATGTTCTGCAGCACC-3'(S301Y)(SEQIDNO:—);5'-GACGTTCCCGGCTACGCCGCCAAGGTGTTCCGC-3，(SEQIDNO:—)和5,-GCGGAACACCTTGGCGGCGTAGCCGGGAACGTC-3，(A279P)(SEQIDNO:」；和5，-GTACGACGACCACATCGACAAGGTGTCGCTGATCG-3，和5'-CGATCAGCGACACCTTGTCGATGTGGTCGTCGTAC-3，(G345D)(SEQIDNO:—)。用于构建天蓝色链霉菌反馈抗性/"C等位基因的寡核苷酸是5，-CGGGCCTGACGGACATCRTCTTCACGCTCCCCAAG-3，(SEQIDNO:」和5，-CTTGGGGAGCGTGAAGAYGATGTCCGTCAGGCCCG-3，(S314I/S314V)(SEQIDNO:—);和5，-GTCGTGCAGAACGTGTACGCCGCCTCCACGGGC-3，(SEQIDNO:J和5，-GCCCGTGGAGGCGGCGTACACGTTCTGCACGAC-3，(S304Y)(SEQIDNO:J。可进行定点诱变以产生与天冬氨酸衍生氨基酸的产生有关的其它蛋白的脱调节等位基因。例如，可以产生相应于谷氨酸棒杆菌/zo附基因中的V59A、G378E或羧基末端截短的突变。使用TransformerSite-DirectedMutagenesisKit(BDBiosciencesClontech)来产生天蓝色链霉菌/zom(G362E)取代。使用寡核香酸5，-GTCGACGCGTCTTAAGGCATGCAAGC-3，(SEQIDNO:J和5，-CGACAAACCGGAAGTGCTCGCCC-3，(SEQIDNO:—)来构建突变。定点诱变也被用来产生7:/wc"和谷氨酸棒杆菌me"和meJ基因的特定等位基因(参见本说明书的实施例5和6)。可使用相似的策略构建其它途径蛋白的脱调节等位基因。例如，在天蓝色链霉菌户F基因中可使用寡核苷酸5，-TTCATCGAACAGCGCTCGCACCTGCTGACCGCC-3，(SEQIDNO:—)和5'-GGCGGTCAGCAGGTGCGAGCGCTGTTCGATGAA陽3'(SEQIDNO:—)来产生相应于谷氨酸棒杆菌pycP458S突变的取代。还可以使用定点诱变来引入相应于上述脱调节的等位基因的取代。然后将异源(和谷氨酸棒杆菌)基因的野生型和脱调节等位基因克隆到适合于表达的载体中。通常，使用有助于基因作为7VcoI-Mrt片段克隆的寡核苷酸来进行PCR。进行DNA序列分析以确证在各轮扩增中没有引入突变。在某些情况下，构建合成操纵子以通过相同的启动子表达两种或更多种异源或内源的基因。例如，产生了质粒MB4278以通过&ci^S启动子表达谷氨酸棒杆菌me"、m"y和m&7/基因。图14B展示了MB4278中从^c朋S启动子直到mdi/基因终止的DNA序列；在这种构建体中的基因顺序是me"r//。图14B中的可读框以大写字母显示。注意，该构建体被这样改造，使得每个可读框之前都存在同样的一段DNA序列。这种保守序列发挥核糖体结合序列的作用，促进谷氨酸棒杆菌蛋白的高效翻译。使用类似的基因间序列构建其它合成操纵子。实施例4:其它高丝氨酸脱氢酶的苏氨酸不敏感性突变体的分离对实施例2中从天蓝色链霉菌克隆的/zom基因使用从Stratagene获得的GeneMorphRandomMutagenesis试剂盒进行易错PCR。在这种试剂盒指定的条件下，使用寡核苷酸引物5，-CACACGAAGACACCATGATGCGTACGCGTCCGCT-3，(含有S&I位点并且切割产生TVcoI匹酉己突出端)(SEQIDNO:_)和5，-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTCTCCTTCAACCCGCA-3'(含有位点)(SEQIDNO:—)从质粒MB4066扩增/ww基因。将产生的突变群体用和消化，连接至TVcoIM^I消化的附加型质粒中，所述质粒含有MB4094质粒骨架中的^riSS启动子，并且转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中。将转化的细胞涂布到含有用于棒杆菌的确定成分培养基(参见Guillouet,S.,etal.y^p/.￡"v/ra".M/cra^o/.65:3100-3107，1999)的琼脂平板上，所述培养基包含卡那霉素(25mg/L)、20mg/LAHV(a-氨基，P-羟基戊酸；一种苏氨酸类似物)和0.01mMIPTG。在30。C72小时之后，如下筛选分泌高丝氨酸的所得转化体影印铺板到补充了苏氨酸的确定成分培养基琼脂平板上，后者先前已用1(^的指示物谷氨酸棒杆菌菌林MA-331(/wm-AWz0的细胞涂覆。通过被影印铺板的转化体周围环绕的指示物菌抹的生长暈鉴定出推定的反馈抗性突变体。使用上述引物对从这些菌落中的每一个PCR扩增/zom基因，如上对扩增子进行消化，并且连接到上述附加型质粒中。然后将每一个这样的推定突变体再转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，并且铺板到含有25mg/L卡那霉素和0.01mMIPTG的基本培养基琼脂平板上。将来自每次转化的一个菌落影印铺板到用于棒杆菌的确定成分培养基上，所述培养基含有10、20、50和100mg/L的AHV，并且根据对苏氨酸类似物抗性的最高水平进行分选。将来自每个组的代表菌株培养在基本培养基中，直到OD为2.0,离心收获细胞，然后在存在和缺乏20mM苏氨酸的条件下对高丝氨酸脱氢酶活性进行测101定，如Chassagnole，C.，etal.，/356:415-423,2001述及的。从这些显示反馈抗性的培养物中PCR扩增/wm基因并进行测序。使用所得质粒来生成增强氨基酸产生的表达质粒。实施例5.高丝氨酸(9-乙酰转移酶(me")和<9-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(m^T)反馈抗性突变体的分离对从7:/^ca克隆的异源me"基因使用获得自Stratagene的GeneMorphRandomMutagenesis试剂盒进行易错PCR。在这种试剂盒指定的条件下，使用寡核苦酸引物5'-CACACACCTGCCACACATGAGTCACGACACCACCCCTCC-3，(含有fo/MI位点并且切割产生TVcoI匹配突出端)(SEQIDNO:_)和5，-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGCGCCAGCAGTTCTT-3，(含有7VM位点)(SEQIDNO:—)从质粒MB4062扩增me"基因。对所得突变扩增子进行消化并且连接到实施例4中所述的经M7oIM^1消化的附加型质粒中，然后转化到谷氨酸棒杆菌菌抹MA-428中。MA-428是ATCC13032的衍生物，已用整合性质粒MB4192对其进行了转化。对重组事件进行选择之后，以这样的方式从所得的菌抹MA-428缺失/zom-Ar5，使得脱调节的天蓝色霉菌/zom基因被插入。将所述经转化的MA-428细胞铺板到基本培养基琼脂平板上，该平板含有卡那霉素(25mg/L)、0.01mMIPTG和100|ig/ml或500吗/ml的三氟曱硫氨酸(TFM;—种曱硫氨酸类似物)。在30。C72小时之后，如下筛选分泌O-乙酰高丝氨酸的所得转化体影印铺板到基本琼脂平板上，该平板先前用~106得自ATCC(存204524)的指示物菌抹酿酒酵母CS.cev^ae)B-7588(M4Tawra3-5入wra3-5S、/ew2-丄/ew2-"2、^p7-2S9、me^、7KS3+)的细胞涂覆。通过O-乙酰高丝氨酸(OAH)的分泌鉴定推定的反馈抗性突变体，OAH的分泌维持着影印铺板的转化体周围的指示菌株生长晕。使用上述引物对从这些互养菌落中的每一个中PCR扩增we"基因，用fo;MI和消化，再连接到实施例4中所述的经TVof/M^o/消化的附加型质粒中。然后将这些推定的謝"突变体等位基因各自再转化到谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，并且铺板到含有25mg/L卡那霉素的基本培养基琼脂平板上。将来自每次转化的一个菌落影印铺板到基本培养基上，所述基本培养基含有100、200、500和1000昭/ml的TFM以及0.01mMIPTG,在根据对曱硫氨102酸类似物的最高抗性进行分选。将来自每个组的代表菌林培养在基本培养基中，直到OD为2.0,离心收获细胞，然后在存在和缺乏20mM曱碌u氨酸或S誦AM的条件下，通过Kredich和Tomkins描述的方法C/&'o/.Ozew.241:4955-4965,1966)，对高丝氨酸0-乙酰转移酶活性进4亍测定。,人这些显示反馈抗性的培养物中PCR扩增膨"基因并进行测序。使用所得质粒来制备增强氨基酸产生的表达质粒。以相似的方式，对来自r/wca的基因进行诱变PCR。使用寡核苦酸引物5，-CACAGGTCTCCCATGGCACTGCGTCCTGACAGGAG-3'(含有foal位点并且切割产生TVcoI匹酉己突出端)(SEQIDNO:_)和5，-ATAAGAATGCGGCCGCTCACTGGTATGCCTTGGCTG-3，(含有Md位点)(SEQIDNO:_),如上所述进行向附加型质粒中的克隆，并根据从Stratagene获得的GeneMorphRandomMutagenesis试剂盒的说明书进行诱变反应。主要的区别在于，将突变的we^群体转化到一种本已高水平产生O-乙酰高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌菌林中。该菌抹名为MlCmet2，是通过用一种修饰型的质粒MB4286转化MA-428构建而成，其中所述质粒含有在^ci^S启动子控制下的如上所述的脱调节的7:ykycame"等位基因。转化之后，可利用选择系统使内源mcW座位缺失，并代之以脱调节的异源me"等位基因。将用7:/wcam"y变体转化的MlCmet2菌抹涂布到基本琼脂平板上，所述平板含有25mg/L卡那霉素、0.25mMIPTG和抑制浓度的毒性曱硫氨酸类似物(例如，乙碌u氨酸、硒代曱石克氨酸、TFM;可将转化体在这3种不同曱碌^氨酸类似物的单独一种、两种的组合或三种的组合存在下进行培养)。从选择平板上生长的菌落中扩增me"基因，将扩增子消化并连接到实施例4描述的附加型质粒中，再将所得质粒转化至MlCmet2中。将转化体培养在包含25mg/L卡那霉素的基本培养基琼脂平板上。将所得菌落影印铺板到琼脂平板上，该平板含有10倍范围的毒性曱硫氨酸类似物乙硫氨酸、TFM和硒代曱硫氨酸(另加0.01mMIPTG);并且根据对类似物的敏感性加以分选。将来自每个组的代表菌抹培养在基本培养基中，直到OD为2.0，离心收获细胞，然后使用Kredich和Tomkins(J说o/.C/zem.241:4955-4965,1966)(参见实施例9)的方法的修改版本，在存在和缺乏20mM曱硫氨酸的条件下，对O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶酶活性进行测定。从显示反馈抗性的培养物中PCR扩增膨"基因并进行测序。使用所得质粒制备增强氨基酸产生的表达质粒。如下构建含有来自r/kyca的反馈抗性和me"变体的表达质粒。使用寡核苷酸5，-CACACACATGTCACTGCGTCCTGACAGGAGC-3，(含有尸c/I位点并且切割产生TVcoI匹配突出端(同时使第二个密码子从Ala变为Ser))(SEQIDNO:J和5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTGCGCCAGCAGTTCTT—3，C含有位点)(SEQIDNO:—)扩增7:/^cam"Z4操纵子。用尸c/1和iVort消化扩增子，再将片段连接到之前已依次用Md、/foel11曱基化酶和WcoI处理的上述附力口型质粒中。使用Stratagene的QuikChangeSite-DirectedMutagenesisKit，用定点诱变将所述的7Y船came"和m"y中的取代突变引入单一质粒中，该质粒以操纵子的形式表达脱调节的等位基因。使用所得的质粒增强氨基酸的产生。基本培养基:每升去离子水(pH7.2)10g葡萄糖、1gNH4H2P04、0.2gKC1、0.2gMgS04_7H20、30吗生物素和1mlTE。痕量元素溶液(TE)包含每升去离子水88mgNa2B4O7-10H2O、37mg(NH4)6Mo7027-4H20、8.8mgZnS04-7H20、270mgCuS04-5H20、7.2mgMnCl2-4H20和970mgFeCl3-6H20。(当需要供应营养缺陷需求时，补充氨基酸和嘌呤至终浓度30mg/L。)实施例6.细菌氨基酸序列中S-AM-结合残基的鉴定许多调节氨基酸产生的酶受到S-AM的别构反馈抑制。我们假设对S-AM调节具有抗性(例如，通过对S-AM结合的抗性或对S-AM诱导的别构效应的抗性)的这些酶的变体应该对反馈抑制有抗性。已在细菌DNA曱基转移酶中鉴定出S-AM结合模体(motif)(Roth"a/.,/说W.CTzew.,273:17333-17342,1998)。Roth&a/.在五coRVa-腺噪呤-N6-DNA曱基转移酶中鉴定出一种高度保守的氨基酸模体，其对于S-AM对该酶的结合似乎至关重要。我们在以下谷氨酸棒杆菌蛋白的氨基酸序列中对相关的模体进行了搜索MetA、MetY、McbR、LysC、MetB、MetC、MetE、MetH和MetK。在MetA、MetY、McbR、LysC、MetB、MetC、MetH和MetK中鉴定出推定的S-AM结合模体。我们还在metY中鉴定与酵母蛋白中的S-AM结合模体类似的其它残基(Pintarda/.,Mo/,Ce〃5/o/.，20(4):1370-1381，2000)。每种蛋白中可能涉及S-AM结合的残基列于表16。表16:谷氨酸棒杆菌蛋白中推定的涉及S-AM结合的残基蛋白推定的涉及S-AM结合的残基<table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table>D382D383MetAG81谷氨酸棒杆菌中无类似残基D287D269F269F251MetA大肠杆菌E252D269MetA麻风分枝杆菌G73谷氨酸棒杆菌中无类似残基D278D269Y260D269MetA结核分枝杆菌G73谷氨S吏棒杆菌中无类似残基Y260F251D278D269如实施例2中所述从谷氨酸棒杆菌和r/Mca中克隆Afe"和MeJ基因。表11列出用于表达Me"和MeJ基因的野生型和突变等位基因的质粒和菌株。表18和19列出用于表达的质粒，和用于定点诱变以产生MetA和MetY变体的寡核苷酸。实施例7.用于MetA和MetY测定的蛋白提取物的制备将谷氨酸棒杆菌的单菌落接种到种子培养基中(参见下文的实施例10),在33°C搅拌下培养24小时。将种子培养物在生产大豆培养基(40mL)(实施例IO)中以1:20进行稀释，再培养8小时。离心收集之后，将离心沉淀在1倍体积水中洗涤lx。将离心沉淀重悬于250fxl溶解緩冲液(lmlHEPES緩冲液pH7.5、0.5ml1MK0H、lO[il0.5MEDTA、加水至5ml)，30|^1蛋白酶抑制剂合剂(proteaseinhibitorcocktail)和1倍体积的0.1mm经酸洗涤的玻璃i朱中。对混合物进行漩涡振荡(vortex)，再于冰上保持15秒，交替进行，各重107复8次。在4,000rpm离心5分钟之后，移出上清，于10,000rpm再离心20分钟。使用Bradford测定确定澄清上清液中的蛋白浓度。实施例8.包含附加型质粒的谷氨酸棒杆菌菌林中MetA活性的定量对表达内源和附加型we"基因的谷氨酸棒杆菌中MetA的活性进行测定。使用Kredich和Tomkins(J祝o/.C/ze附.241(21):4955-4965,1966)描述的方案来测定粗蛋白提取物中的MetA活性。实施例7中描述了蛋白提取物的制备。筒而言之，将1iig蛋白提取物加入微量滴定板。向微量滴定板的每个孔中添加反应混合物(250pl;100mMtris-HClpH7.5、2mM5，5'-二硫双(2-二硝基苯曱酸)(DTN)、2mMEDTA钠、2mM乙酰CoA、2mM高丝氨酸)。在反应期间，MetA活性从乙酰CoA中释放CoA。在CoA和DTN之间发生二硫键(disulfide)交换，产生碌u代硝基苯曱酸(thionitrobenzoicacid)。用分光光度法追踪硝基苯曱酸的产生。在30分钟的时间内，每5分钟测量一次412nm的吸光度。将不含蛋白提取物的孔包含在内作为对照。通过添加S-腺苷甲硫氨酸(S-AM;.02mM、.2mM、2mM)和曱硫氨酸(.5mM、5mM、50mM)来测定对MetA活性的抑制。在将反应混合物添加至蛋白提耳又物之前，向反应混合物中直接添加抑制剂。在源自谷氨酸棒杆菌菌抹MA-442和MA-449的粗蛋白提取物中测量体外O-乙酰转移酶活性，所述菌抹同时含有内源和附加型谷氨酸棒杆菌MetA和MetY基因。附加型weL4和me"基因作为合成操纵子表达；me"F操纵子的核酸序列如图12B中所示的me"I7/操纵子，只是缺乏m"i/序列。在这些附加型质粒中使用frci^S启动子。MA-442以me"-weJ的顺序表达附加型基因。MA-449以的顺序表达附加型基因。在存在和缺失IPTG的条件下进行实验，IPTG诱导质粒所携带的MetA和MetY基因的表达。图13显示MetA活性的经时过程。仅当基因处于MetA-MetY(MA-442)构型时，在来自8小时和20小时培养物的样品中观察到MetA活性。与之相反，在菌株MA-449(MetY-MetA)的提取物中，MetA活性在8小时和20小时的时间点处相对于缺乏蛋白的对照样品均无显著提高，无论是否存在诱导。这种数据与Northern印迹分析显示的一致Northern印迹分析显示当两个基因的方向为m"F-me"日于，meL4j氐表达。接下来，测试菌抹MA-442的提取物对反馈抑制的敏感性。MA-442提取物的测定在5mM曱硫氨酸、0.2mMS-AM的存在下进行，或在缺乏额外曱硫氨酸或S-AM的条件下进行；并且如上所述测试MetA活性。如图14中所示，在5mM曱硫氨酸和0.2mMS-AM存在时，MetA活性降低。由此，降低MetA的别构阻抑可能增强MetA活性，使得曱硫氨酸能够以更高的水平产生。在低得多的曱硫氨酸或S-AM水平也有可能观察到别构阻抑。无论如何，测试的水平是针对氨基酸如曱硫氨酸的产生进行了工程改造的菌抹中的生理相关水平。构建了表达附加型rMetA的谷氨酸棒杆菌菌抹(菌抹MA-578和MA-579)或同时表达附加型Z/wcaMetA和MetY的谷氨Si棒杆菌菌抹(菌抹MA-456和MA-570),并且从这些菌抹中制备提取物，测定MetA活性。与每种附加型基因相关联的调节元件列于表18。通过计算每ng蛋白OD4u的变化除以时间，求出每种菌抹的提取物中MetA活性的比率。这些试验的结果示于图17，该图显示菌株MA-578在诱导条件下呈现出大约2.75单位的比率(rate)(OD412变化/时间/ng蛋白)；而在非诱导条件下的比率大约是1。菌抹MA-579在诱导条件下呈现出大约2.5的比率，而在非诱导条件下呈现出大约0.4的比率。在组成型启动子的控制下表达me"和we^的菌抹MA-456呈现出大约2.2的速率。菌抹MA-570在诱导条件下呈现大约1的速率，而在非诱导条件下呈现出0.3的比率。阴性对照样品(无蛋白)呈现出大约0.1的比率。这些数据说明，在谷氨酸棒杆菌中7:/kycawe"的附加型表达使MetA活性的比率增加。这种增加与在谷氨酸棒杆菌中附加型表达谷氨酸棒杆菌MetA时观察到的增加类似。实施例9:包含附加型质粒的谷氨酸棒杆菌菌株中MetY活性的定量在几种谷氨酸棒杆菌菌抹中测定附加型r/wcaMetY的体外活性。使用经4务改的Kredich和Tomkins(/历o/.C/zem.241(21):4955-4965,1966)描述的方案来测定谷氨酸棒杆菌粗蛋白提取物中的MetY活性。如所述制备粗蛋白提取物。筒而言之，将900|al反应混合物(50mMTrispH7.5、ImMEDTA、ImM无水硫化钠(Na2S)、(UmM吡。多醛-5-磷酸(PLP))与45吗蛋白提取物混合。在时间零点，添加O-乙酰高丝氨酸(OAH;TorontoResearchChemicalsInc)至终浓度0.625mM。立即移出200|al反应物作为零时间点。将剩余的反应物在30。C温育。以10分钟的间隔移出三个200|il的样品。从30°C进行移出之后，立即通过添加125jilImM亚硝酸终止反应，亚硝酸使高半胱氨酸的硫醇基亚硝基化成S-亚硝基硫醇。五分钟之后，添加30pl的0.5%氨基磺酸铵(去除过量的亚硝酸)，并且涡旋振荡样品。两分钟之后，添力口400pl的检测溶液(l份含1%HgC12的0.4NHC1、4份含3.44%磺胺的0.4NHC1、2份含0.1%1-萘基乙二胺二盐酸盐(l-naphthylethylenediaminedihydrochloride)的0.4NHC1)，并且涡旋振荡溶液。在汞离子的存在下，S-亚硝基硫醇迅速分解产生亚硝酸，重氮化磺胺，其随后与萘基乙二胺偶联产生稳定的偶氮染料作为生色物质(chromaphore)。5分钟之后，将溶液转移到微量滴定皿，测量540nm处的吸光度。将不含蛋白提取物的反应包括在内作为对照。所述试验的结果示于图18。在组成型启动子的控制下表达附加型野生型r/wcame"和等位基因的菌抹MA-456呈现出0.04的比率。在诱导型启动子的控制下表达附加型野生型r/wcawe"和附eJ等位基因的菌抹MA-570在诱导条件下呈现出大约0.038的比率，而在非诱导条件下的比率低于0.01。由此，异源MetY的表达导致酶活性相对于内源MetY表达时有显著提高。表18:用以测定MetA和MetY蛋白活性的谷氨酸棒杆菌菌抹，和过量表达对产生天冬氨酸衍生氨基酸的影响菌抹名称相关菌抹基因型附加型质粒相关质外立调节序列附加型metY种类附加型metA种类MA誦2(ATCC13032)n/an/an/an/an/aMA-422MA-2的乙硫氨酸抗性变体n/an/an/an/aMA-428具有Ahom-AthrB::谷氨酸棒杆菌g/^启动子-天蓝色链霉菌/zow(G362E)a的MA-2书f生物n/an/an/an/aMA-442MA-428衍生物MB-4135blacIQ-TrcRBSCg野生型Cg野生型MA-449MA-428衍生物MB-4138lacIQ-TrcRBSCg野生型Cg野生型110<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>缩写-Cg(谷氨酸棒杆菌)，Tf(77^raw6诉(iaykyca),lacIQ-TrcRBS(见上)(来自pTrc99A的lacIQ-Trc调节序列(Amannetal"Gene(1988)69:301-315));gpd(谷氨酸棒杆菌a^启动子)a将内源基因座用谷氨酸棒杆菌gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)启动子调控下的蓝色链霉菌torn(G362E)序列取代b这种质粒中的基因顺序是MetA-MetY。除非另行说明，其它质粒中的基因顺序是MetY-MetA。表19:用于定点诱变产生MetA和MetY变体的质粒和寡核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage111</column></row><table>MB4239MO4059MO楊OmstYG232A谷氨酸棒杆菌n/aMO4043MO4044mstYG240An/aMO4037MO4038metAG81AMB4236MO4051MO4052m6tAK233A谷氨酸棒杆菌MB4135n/ari/am6tA野生型谷氨酸棒杆菌MB4135n/an/am6tY野生型谷氨酸棒杆菌MB4210ri/an/amstY野生型MB4210n/an/ametA野生型73yksca表20:用于定点诱变产生MetA和MetY变体的寡核苷酸的序列寡核香酸名称寡核香酸序列SEQIDNO:MO40375，GTAGGCCCGGAAGGCCCCGCGCACCCCAGCCCAGGCTGG3'MO40385，CCAGCCTGGGCTGGGGTGCGCGGGGCCTTCCGGGCCTAC3'MO40395，CCGATGGCCGGGGGCCGGGCCGCTGTCGAGTCGTACCTG3'MO40405，CAGGTACGACTCGACAGCGGCCCGGCCCCCGGCCATCGG3'MO40415，AAACTCGCCCGCCGGTTCGCCGCGGGCAGCTACGTCGTG3'MO40425,CACGACGTAGCTGCCCGCGGCGAACCGGCGGGCGAGTTT3'MO40435，CACGGCACCACGATCGCGGCCATCGTGGTGGACGCCGGC3'MO40445，GCCGGCGTCCACCACGATGGCCGCGATCGTGGTGCCGTG3'MO40455，ATCGCGGGCATCGTGGTGGCCGCCGGCACCTTCGACTTC3'MO40465，GAAGTCGAAGGTGCCGGCGGCCACCACGATGCCCGCGAT3'MO40475，ATCGAGGCCGGACGCGCCGCCGTGGACGGCACCGAACTG3'MO40485，CAGTTCGGTGCCGTCCACGGCGGCGCGTCCGGCCTCGAT3'MO40495，CAGCTCGTCAACATCGGTGCCGTGCGCAGCCTCATCGTC3'MO40505，GACGATGAGGCTGCGCACGGCACCGATGTTGACGAGCTG3'MO40515，GACGAACGCTTCGGCACCGCAGCCCAAAAGAACGAAAAC3，MO40525，GTTTTCGTTCTTTTGGGCTGCGGTGCCGAAGCGTTCGTC3'MO40575，CTGGGCGGCGTGCTTATCGCCGGCGGAAAGTTCGATTGG3'MO40585，CCAATCGAACTTTCCGCCGGCGATAAGCACGCCGCCCAG3'MO40595,GGCGGCGTGCTTATCGACGCCGGAAAGTTCGATTGGACT3'112MO40605'AGTCCAATCGAACTTTCCGGCGTCGATAAGCACGCCGCC3'实施例10:产生和检测天冬氨酸衍生氨基酸的方法为摇瓶制备天冬氨酸衍生氨基酸，将每种菌林从琼脂平板接种到125mlErlenmeyer摇瓶内的10ml种子培养基中。将种子培养物于31。C在摇床上以250rpm温育16小时。将种子培养物以1:20稀释至125mlErlenmeyer摇瓶内的10ml分批生产培养基(BatchProductionMedium)中，由此制备用来监测氨基酸产生的培养物。适当的时候，向一系列培养物添加IPTG以诱导受IPTG调节的基因的表达(终浓度0.25mM)。在31°C搅拌下(250rpm)进行曱硫氨酸发酵60-66个小时。就本文报道的研究而言，在几乎全部情况下平行进行多个转化体的发酵，并且通常将每种转化体以一式两份重复进行培养。多数报道的数据点反映的是用代表性转化体进行至少两次发酵的平均值，以及同时培养的对照菌株。培育之后，使用液相层析-质谱(LCMS)测定所得培养液中的氨基酸水平。收获大约lml的培养物，离心沉淀细胞和颗粒状细胞碎片。将部分所得上清液以1:5000稀释至0.1%曱酸水溶液中，并且分成10fxL的部分注入反相HPLC柱(WatersAtlantisC18,2.1x150mm)。使用含0.1%甲酸的乙腈("B")和含0.1%曱酸的水("A")的梯度混合物，(1%B^50%B历时4分钟，在50%B保持0.2分钟，50%B^1%历时1分钟，在1%保持1.8分钟)，以0.350mLmin"的流速洗脱化合物。通过三级-四才及质i普(triple-quadropolemassspectrometer)^吏用正电喷雾电离(positiveelectrosprayionization)斥全测洗脱的4t合物。以MRM模式操作所述设备以检测氨基酸(赖氨酸147今84(15eV);曱硫氨酸150^104(12eV);苏氨酸/高丝氨酸120^74(10eV);天冬氨酸134^88(15eV);谷氨酸148^84(15eV);O-乙酰高丝氨酸162102(12eV);和高半胱氨酸136^90(15eV))。有时，使用类似方法定量其它的氨基酸(例如高胱氨酸、甘氨酸、S-腺苷甲硫氨酸)。通过与在相同条件下注入的氨基酸标准品进行比较来定量各个氨基酸。使用这种质谱方法无法区分高丝氨酸和苏氨酸。因此，有必要时，还将样品用荧光标记进行衍生化，在液相层析之后再进行荧光检测。这种方法既用来解析高丝氨酸和苏氨酸，又用来确证使用LCMS方法所测定的浓度。用于产生测定的种子培养基葡萄糖100g/L乙酸铵3g/LKH2P04lg/LMgS04-7H200.4g/LFeS04-7H20lOmg/LMnS04-4H20lOmg/L生物素50jig/L硫胺素-HCl200吗/L大豆蛋白水解产物(总氮7%)15ml/L酵母提取物5g/LpH7.5用于产生测定的分批生产培养基葡萄糖50g/L(NH4)2S0445g/LKH2P04lg/LMgS04-7H200.4g/LFeS04-7H20lOmg/LMnS04-4H20lOmg/L生物素50jig/L碌u胺素-HCl200吗/L大豆蛋白水解产物(总氮7%)15ml/LCaC0350g/L钴胺素1(ig/mlpH7.5(当目标天冬氨酸衍生氨基酸是赖氨酸时，无需添加钴胺素)实施例11:异源野生型和突变/ycC变体增加谷氨酸棒杆菌和乳发酵短杆菌中的赖氨酸的产生天冬氨酸激酶通常是棒杆菌中赖氨酸产生的限速活性。调节天冬氨酸激酶活性的主要机制是赖氨酸和苏氨酸联合进行的别构调节。如实施例2中所述从耻垢分枝杆菌和天蓝色链霉菌中克隆编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的异源操纵子。使用定点诱变产生脱调节的等位基因(参见实施例3),并将这些经修饰的基因插入适合于棒杆菌中表达的载体(实施例1)。将所得质粒和它们相应的野生型转化到包括野生型谷氨酸棒杆菌菌抹ATCC13032和野生型乳发酵短杆菌菌抹ATCC13869在内的菌抹中，分析所述菌株的赖氨酸产生(图19)。菌株MA-0014、MA-0025、MA-0022、MA-0016、MA-0008和MA-0019包含具有MB3961骨架的质粒(参见实施例1)。通过添加IPTG至生产培养基，野生型或脱调节的异源/"C-o^操纵子的表达增加，促进了赖氨酸的产生。菌抹ATCC13869是这些菌抹的未转化对照。包含耻垢分枝杆菌S301Y、T311I和G345D等位基因的质粒对于增强赖氨酸产生而言最有效；选择这些等位基因利用改进载体进行表达。将包含脱调节的耻垢分枝杆菌等位基因的改进载体转化到谷氨酸棒杆菌(ATCC13032)中以产生菌抹MA-0333、MA-0334、MA-0336、MA-0361和MA-0362(含有^ri55"或gw/启动子、MB4094骨架的质粒；参见实施例1)。菌林ATCC13032(A)是菌抹MA-0333、MA-0334和MA-0336的未转化对照。菌抹ATCC13032(B)是菌抹MA-0361和MA-0362的未转化对照。菌抹MA-0333、MA-0334、MA-0336、MA-0361和MA-0362全部呈现出赖氨酸产生上的改进。例如，菌抹MA-0334从50g/L葡萄糖产生过量的20g/L赖氨酸。另外，T311I和G345D等位基因显示在从加朋5"或gpd启动子表达时是有效的。实施例12:天蓝色链霉菌/7omG362E变体使谷氨酸棒杆菌菌株MA-0331中流向高丝氨酸的碳流增加如实施例11中所示，天冬氨酸激酶的脱调节使流向天冬氨酸衍生氨基酸的碳流增加。理论上，通过使用脱调节的/^C等位基因，和/或通过消除介导别构调节的小分子(赖氨酸或苏氨酸)，可以增加天冬氨酸激酶的活性。图20(菌林MA-0331)显示，在使/zom-^^基因座失活时，培养液中积累了高水平的赖氨酸。/zom和AM分别编码苏氨酸产生必需的两种蛋白——高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶。在仅缺失^^基因的情况下，也观察到了赖氨酸的积累(参见图23的菌抹MA-0933(MA-0933是一个实例，尽管不适于直接将MA-0933与MA-0331进行比较，因为这些菌抹来自不同的遗传背景))。为了增加流向曱硫氨酸途径中间物的碳流，将天蓝色链霉菌/7om基因的推定脱调节变体转化到MA-0331中。使用相似的策略对仅含有AW缺失的菌林进行工程改造。菌抹MA-0384、MA-0386和MA-0389分别含有在rp/M、gpd和^r朋S启动子控制下的天蓝色链霉菌/zomG362E变体。这些质粒还含有作为定点诱变策略的一部分而引入的额外取代(G43S);后续实验提示G43S取代并不增强Hom活性。图18显示使用菌才朱MA-0331、MA-0384、MA-0386和MA-0389进行的摇瓶实验的结果，其中对培养液的天冬氨酸衍生氨基酸，包括赖氨酸和高丝氨酸进行分析。表达天蓝色链霉菌/wmG362E基因的菌林呈现出赖氨酸产生的急剧减少以及高丝氨酸水平的显著增加。高丝氨酸的培养液水平在例如MA-0389等菌抹中超过5g/L。有可能在细胞内仍保留高水平的高丝氨酸，或某些高丝氨酸已经转化为其它产物。脱调节的(ycC和/zom下游其它基因以及/ww的过量表达可使包括甲硫氨酸在内的基于高丝氨酸的氨基酸的产生增加(见下文)。实施例13:异源磷酸烯醇丙酮g吏羧化酶(Ppc)使流向天冬氨酸衍生氨基酸的碳流增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(Ppc)与丙酮酸羧化酶(Pyc)—起催化草酰乙酸(OAA)的合成，草酰乙酸是直接供给到天冬氨酸衍生氨基酸的产生中的柠檬酸循环中间物。将野生型菊欧文氏菌基因克隆到表达载体中，使其处于IPTG诱导型化c朋S启动子的控制下。将这种质粒转化到高赖氨酸菌抹MA-0331和MA-0463中(图21)。在缺乏或存在IPTG的条件下培养菌抹，并且分析天冬氨酸衍生氨基酸包括天冬氨酸的产生。菌抹MA-0331含有/wm-^^zl突变，而MA-0463含有整合在缺失的/zom-基因座上的耻垢分枝杆菌(T311I)-o^/操纵子；ow/操纵子在谷氨酸棒杆菌g^Z启动子的控制之下。图21显示菊欧文氏菌；;c基因使天冬氨酸的积累增加。这种差异甚至在将大多数可用天冬氨酸转化成赖氨酸的菌株中也能够检测到。实施例14:异源二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)增加赖氨酸的产生二氢吡啶二羧酸合酶是分支点酶，它将碳投向赖氨酸生物合成而非投向基于高丝氨酸的氨基酸的产生。DapA使天冬氨酸-B-半醛转化为2，3-二氢吡啶二羧酸。将野生型菊欧文氏菌和天蓝色链霉菌基因克隆到表达质粒中，置于加i^S和砂d启动子的控制之下。将所得质粒转化到菌抹MA-0331和MA-0463中，它们是两种已通过工程改造而产生高水平赖氨酸的菌抹(参见实施例13)。对MA-0463进行工程改造以使耻垢分枝杆菌/^C(T311I)-aW操纵子的表达增加。预期这种操作将驱动天冬氨酸-B-半醛的产生，天冬氨酸-B-半醛是DapA所催化的反应的底物。将菌抹MA-0481、MA-0482、MA-0472、MA-0501、MA-0502、MA-0492、MA-0497培养在摇并瓦中，并分牙斤培养液中的天冬氨酸衍生氨基酸，包括赖氨酸。如图22中所示，在MA-0331和MA-0463背景下菊欧文氏菌或天蓝色链霉菌基因的表达的增加使赖氨酸的产生增加。菌抹MA-0502在一个50g/L葡萄糖过程中几乎产生了35g/L赖氨酸。有可能通过构建这些异源基因的脱调节变体来工程改造得到进一步的赖氨酸改进。实施例15:构建产生高水平高丝氨酸的菌抹可通过将遗传工程和诱变策略相结合来制备产生高水平的基于高丝氨酸的氨基酸的菌林。作为实例，进行了五种不同的遗传操作以构建MA-1378,一种产生〉10g/L高丝氨酸的菌抹(图23)。为了产生MA-1378,首先使用亚硝基胍(NTG)i秀变对野生型谷氨酸一奉杆菌进行突变(基于"Ashortcourseinbacterialgenetics."J.H.Miller,ColdSpringHarborLaboratoryPress.1992,page143中描述的方案)，然后选择在含有高水平毒性曱硫氨酸类似物一一乙硫氨酸的基本平板上生长的菌落。随后使用质粒MB4154将所得的乙硫氨酸抗性菌抹之一(MA-0422)的内源mcbR基因座缺失，从而产生菌抹MA-0622。McbR是转录阻抑物，其调节产生含硫氨基酸如曱硫氨酸所需的几种基因的表达(参见Rey，D.A.，Puhler，A.,andKalinowski,J"/5/ofec/z"o/ogy103:51-65,2003)。在几种情况下，我们观察到McbR的失活产生了具有高水平的基于高丝氨酸的氨基酸的菌抹。使用质粒MB4084缺失了MA-0622中的AW基因座，引起赖氨酸和高丝氨酸的积累；曱硫氨酸和曱硫氨酸途径中间物也以低一些的程度积累。通过该操作得到了MA-0933。如上所述，赖氨酸和高丝氨酸的积累是被认为是由于lysC脱调节，藉由苏氨酸产生的缺乏而造成的结果。为了进一步优化流向天冬氨酸-B-半醛和下游氨基酸的碳流，用表达耻垢分枝杆菌/，C(T311I)-a^/操纵子的附加型质粒转化MA-0933(菌抹MA-1162)。然后用NTG诱变高丝氨酸高产菌林MA-1162,并且在含有一定水平的曱硫氨酸曱基性)的基本培养基平板上选择菌落。MA-1378是一个这样的MMSC-抗性菌株。实施例16:异源高丝氨酸乙酰转移酶(MetA)使流向基于高丝氨酸的氨基酸的碳流增加MetA是曱硫氨酸生物合成中的关键步骤。将野生型r./^cawe"基因克隆到表达载体中，置于&c朋S启动子的控制下。将这种质粒转化到高丝氨酸高产菌抹中以测试MetA活性的提高(图24和25)。MA-0428、MA-0933和MA-1514是高丝氨酸高产菌抹的实例。MA-0428是野生型ATCC13032的衍生物，接受了质粒MB4192(参见实施例l)的工程改造而缺失了/zoK/z^基因座，并且整合了s^-天蓝色链霉菌/zow(G362E)表达盒。为了考虑菌抹MA-1378丧失耻垢分枝杆菌^C(T311I)-a^/操纵子质粒的情况，MA-1514是通过使用新生霉素来构建的。进行这种操作，为使用含r./kycame"基因和选择性标记的附加型质粒进行转化提供了可能。菌抹MA-1559是用trcRBS启动子控制下的r./kscame"基因转化菌抹MA-1514获得的。MA-0933在实施例15中有所描述。在这些高产高丝氨酸菌林的每一种中诱导r./w"ame"的表达导致培养液中O-乙酰高丝氨酸的积累。例如，菌抹MA-1559呈现出9g/L的过量OAH水平。可进行额外的操作以引起OAH向其它产物包括曱硫氨酸的转化。实施例17A'.wet4变体对谷氨酸棒杆菌中曱硫氨酸产生的影响通过对MetA编码DNA定点诱变产生了谷氨酸棒杆菌高丝氨酸乙酰转移酶(MetA)变体(实施例6)。用高拷贝质粒]VIB4236转化谷氨酸棒杆菌菌株MA-0622和MA-0699,所述质粒编码位置233上赖氨酸突变为丙氨酸(MetA(K233A))的MetA。这种质粒还包含谷氨酸棒杆菌m"7基因的野生型拷贝。通过用质粒MB4192转化MA-0622以缺失/20m-^w"S基因座并且整合g;d-天蓝色链霉菌/wm(G362E)表达盒，构建了菌林MA-0699。we"和we化是作为合成me"y操纵子在修饰型启动子的控制下表达的。在存在和没有IPTG诱导的条件下培养所述菌株，并且测定曱硫氨酸生产力。对这些菌林的曱硫氨酸的产量作图，示于图26。如图所示，MA-622和MA-699的各个转化体，118在培养于诱导条件下时，分别产生超过3000pM的曱石克氨酸。在组成型启动子控制下表达天蓝色链霉菌/wwG362E变体的MA-699菌抹，在缺乏IPTG的条件下产生了超过3000pM曱硫氨酸。IPTG诱导导致曱硫氨酸的产量增加了1000-2500|iM。这些数据说明MetA(K233A)的表达使曱硫氨酸的产量提高。在多个点上对曱硫氨酸生物合成进行操作能够进一步提高产量。实施例17B:m"r变体对谷氨酸棒杆菌中曱硫氨酸产生的影响通过对MetY编码DNA加以定点诱变产生了谷氨酸棒杆菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶(MetY)变体(实施例6)。用高拷贝质粒MB4238转化谷氨酸棒杆菌菌株MA-622和MA-699，所述质粒编码在位置231上天冬氨酸突变为丙氨酸的MetY(MetY(D231A))。这种质粒还包含谷氨酸棒杆菌me"基因的野生型拷贝，其表达如实施例16中所述。在存在和缺少IPTG诱导的条件下培养所述菌抹，并且测定曱硫氨酸生产力。对这些菌抹的曱硫氨酸产量进行作图，示于图27。如图所示，MA-622的各个转化体，在培养于MetY(D231A)的表达被诱导的条件下时，分别产生了超过1800jiM的曱硫氨酸。MA-622菌抹在各个转化体产生的曱硫氨酸的水平上显示出不同(即，转化体1和2在诱导时产生大约1800曱硫氨酸，而转化体3和4在诱导时产生超过4000jiM曱硫氨酸)。表达天蓝色链霉菌Hom变体的MA-699菌株在缺少IPTG时产生了大约3000(iM曱硫氨酸。IPTG诱导使曱硫氨酸产量增加1500-2000^M。这些数据说明MetY(D231A)的表达使曱硫氨酸产量提高。在菌株MA-699中的曱硫氨酸产量相对于MA-622同样得到提高。菌株MA-699中MetY(D231A)的表达进一步使该菌株中曱硫氨酸的产量提高。在谷氨酸棒杆菌中表达了m"y的另一个突变等位基因，并且测定了其对曱硫氨酸产生的影响。用高拷贝质粒MB4239转化谷氨S臾棒杆菌菌抹MA-622和MA-699,所述质粒编码位置232上甘氨酸突变为丙氨酸的MetY(MetY(G232A))。在存在和缺少IPTG诱导的条件下培养所述菌抹，并且测定曱硫氨酸生产力。对这些菌林的曱硫氨酸产量进行作图，示于图26。如图所示，MA-622的各个转化体在培养于MetY(G232A)的表达被诱导的条件下时分别产生了超过1700)iM的曱硫氨酸。MA-699菌林在缺少IPTG时产生大约3000liM曱硫氨酸。IPTG诱导导致曱硫氨酸产量增加了2000-3000[iM。这些数据说明MetY(G232A)的表达使曱硫氨酸产量提高。在菌林MA-699中的曱硫氨酸产量相对于MA-622同样得到提高。菌抹MA-699中MetY(G232A)的表达进一步使该菌抹中的甲硫氨酸产量提高。实施例18:表达me"和m^T的野生型和突变等位基因的谷氨酸棒杆菌菌株中的曱硫氨酸产生在五种不同的谷氨酸棒杆菌菌林中测定曱硫氨酸的产生。这些菌抹中的四种表达附加型谷氨酸棒杆菌me"和me化等位基因的独特组合，如表14中所列。第五种菌抹MA-622不含附加型me"或me^等位基因。各菌抹产生的曱硫氨酸量(g/L)列于表21。在表达野生型me"和变体的组合，或野生型m"r和变体we"的组合的菌抹中观察到最高水平的曱硫氨酸产生。表21.表达谷氨酸棒杆菌we"和的野生型和突变等位基因的菌株中的曱硫氨酸产生<table>tableseeoriginaldocumentpage120</column></row><table>实施例19:同时使用异源和天然基因的遗传操作组合引起天冬氨酸衍生氨基酸的产生如上所述，基因组合可以优化棒杆菌的天冬氨酸衍生氨基酸的产生。下面将对多重操作如何能够增加曱硫氨酸的产量进行说明。图29分别显示菌株MA-2028和MA-2025的几种天冬氨酸衍生氨基酸的产生，以及来自它们的亲本菌抹MA-1906和MA-1907的效价(titers)。使用质粒MB4276缺失MA-0622中的天然pc&基因座，并用組成型表达耻垢分枝杆菌(ysC(T311I)-cm/操纵子的盒取代/ch由此构建MA-1906。通过将MB4276类似地转化到MA-0933中来产生MA-1907。MA-2028和MA-2025的构建是通过用MB4278转化各自的相应亲本来进行，其中MB4278是用于诱导表达合成谷氨酸棒杆菌me"17/操纵子的附加型质粒(参见实施例3)。亲本菌株MA-1906和MA-1907分别产生赖氨酸或赖氨酸和高丝氨酸；这些菌株也产生曱硫氨酸和曱硫氨酸途径中间物。赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边的y轴上；甲硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边的y轴上。IPTG诱导时，MA-2028显示赖氨酸水平的减少和曱硫氨酸水平的增加。MA-2025也呈现出IPTG依赖性的赖氨酸产生减少，以及曱硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸产生的增加。菌抹MA-1743是如何能够将组合型工程化用于制备产曱硫氨酸菌株的另一个实例。通过用me"H/表达质粒MB4278转化MA-1667来产生MA-1743。如下构建MA-1667:首先用质粒MB4084对菌抹MA-0422(参见实施例15)进行工程化以缺失再使用质粒MB4286以同时缺失mcW基因座并用含有^c朋S-r./wsrame"的表达盒取代mcZ)i。在这个实例和其它^ciSS以单拷贝整合的实例中，表达受到的调节似乎不如用附加型质粒时观察到的那样严紧(如通过氨基酸产量所判断的)。这可能是因为laclq抑制蛋白水平的减少。对菌林MA-1743的IPTG诱导引起曱硫氨酸和途径中间物包括O-乙酰高丝氨酸的产生(图30;赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边的y轴上；曱硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边的y轴上)。菌抹MA-1688和MA-1790是另外两种用多个基因进行工程改造的菌林，所述基因包括MB4278we"I7/表达质粒(参见图31;赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边的y轴上；曱硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边的y轴上)。用MB4278转化MA-0569产生MA-1688。通过依次使用MB4192和MB4165,首先将/zom-^^基因座缺失并整合忍W-天蓝色链霉菌/zom(G362E)表达盒，然后再缺失mcW，构建MA-0569。MA-1790的构建需要几步。首先，基于其允许沙门氏菌CSa/mw2e〃a)me必突变体生长的能力，鉴定了MA-0428的一种NTG突变衍生物。简而言之，将经诱变的MA-0428细胞群铺板到含有苏氨酸和菌莒(>106沙门氏菌we活突变体的细胞)的基本培养基上。沙门氏菌me迅突变体的生长需要曱硫氨酸。在目测检查后，将由沙门氏菌的生长暈围绕的棒杆菌菌落(例如MA-0600)分离，对之进行摇瓶分析。接着如上所述将菌林MA-600诱变为乙硫氨酸抗性，并且将一个所得菌株指定为MA-0993。随后使用质粒MB4165将mcM基因座从MA-0993中缺失，该操作的产物是MA-142L用MB4278转化MA-1421产生MA-1790。图31显示，IPTG诱导在MA-1688和MA-1790二者中均刺激曱硫氨酸产生，并且减少赖氨酸和高丝氨酸的效价。图32显示菌抹MA-1668及其亲本菌抹的代谢物水平。赖氨酸和高丝氨酸的标度在左边的y轴上；曱硫氨酸和O-乙酰高丝氨酸的标度在右边的y轴上。通过用质粒MB4287转化MA-0993来产生菌才朱MA-1668。使用MB4287的操作导致mcW基因座的缺失并以谷氨酸棒杆菌we"(K233A)-we^取代。菌林MA-1668产生大约2g/L曱硫氨酸，相对于其祖先菌林具有减少的赖氨酸和高丝氨酸水平。菌抹MA-1668仍可进行更多轮次的分子操作。表22列出用于这些研究的菌林。'::，命名法说明'::，之后的表达构建体整合到'::，之前的被命名基因座处。EthR6和EthRlO代表独立分离的乙硫氨酸抗性突变体。Mcf3突变赋予使沙门氏菌膨伍突变体能够生长的能力(参见实施例19)。Mmsl3突变赋予氯化曱硫氨酸曱基鑰抗性(参见实施例15)。表22用于研究的菌抹名称菌抹基因型MA-0002为ATCC13032MA-0003为ATCC13869MA-0008/ac/《-加-天蓝色链霉菌/^C-aW(AlWV)(附加型)MA-0014/ac勿-^c-耻垢分枝杆菌—C-aW(附加型)MA掘6/ac/《4rc-耻垢分枝杆菌(G345D)-aw/(附加型)MA掘9/ac/《-加-天蓝色链霉菌/，C(S314I)-a^(A191V)(附加型)MA-0022/ac/《々c-耻垢分枝杆菌/"C(T31lI)-aW(附加型)MA-0025/ac/《々c-耻垢分枝杆菌(S301Y)-aW(附加型)MA-0331122<table>tableseeoriginaldocumentpage123</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage124</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage125</column></row><table>MA-2025^/柳^^+￡^^6+4<^::.《;^-耻垢分枝杆菌/pC(T311I)-o^/+toc勿-^^aS-谷氨酸棒杆菌附e"-iAS-谷氨酸棒杆菌w^r-^S6"-谷氨酸棒杆菌m"/7(附加型)MA-2028^^cZ^+^/zi^+z^d'a^-耻垢分枝杆菌/ye(T311I)-wd+/ac々-^ciBS-谷氨酸棒杆菌me"-i5S-谷氨酸棒杆菌m&I^i^-谷氨酸棒杆菌m"Z/(附加型)本发明已对许多实施方式进行了描述。尽管如此，应该理解可在不背离本发明的宗旨和范围的前提下进行多种修改。因此，其它实施方式也在权利要求的范围之内。权利要求1.一种肠杆菌科或棒状杆菌型细菌，其包含至少一种选自下组的分离的核酸分子(a)核酸分子，其包含编码细菌硫酸盐ABC转运蛋白ATP-结合多肽或其功能性变体的序列；(b)核酸分子，其包含编码细菌硫酸盐转运系统通透酶W多肽或其功能性变体的序列；(c)核酸分子，其包含编码细菌硫酸盐、硫代硫酸盐转运系统通透酶T多肽或其功能性变体的序列；(d)核酸分子，其包含编码细菌硫酸腺苷酰转移酶亚基1多肽或其功能性变体的序列；(e)核酸分子，其包含编码细菌硫酸腺苷酰转移酶亚基2多肽或其功能性变体的序列；(f)核酸分子，其包含编码细菌腺苷酰硫酸激酶多肽或其功能性变体的序列；(g)核酸分子，其包含编码细菌磷酸腺苷磷酸硫酸还原酶多肽或其功能性变体的序列；(h)核酸分子，其包含编码细菌亚硫酸盐还原酶α亚基多肽或其功能性变体的序列；(i)核酸分子，其包含编码细菌亚硫酸盐还原酶血多肽β-组分多肽或其功能性变体的序列；(j)核酸分子，其包含编码细菌亚硫酸盐还原酶(NADPH)，黄素多肽β亚基多肽或其功能性变体的序列；(k)核酸分子，其包含编码细菌腺苷酰-硫酸还原酶α亚基多肽或其功能性变体的序列；(l)核酸分子，其包含编码细菌磷酸甘油酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(m)核酸分子，其包含编码细菌磷酸丝氨酸转氨酶多肽或其功能性变体的序列；(n)核酸分子，其包含编码细菌磷酸丝氨酸磷酸酶多肽或其功能性变体的序列；(o)核酸分子，其包含编码细菌丝氨酸O-乙酰转移酶多肽或其功能性变体的序列；(p)核酸分子，其包含编码细菌半胱氨酸合酶A多肽或其功能性变体的序列；(q)核酸分子，其包含编码细菌半胱氨酸合酶B多肽或其功能性变体的序列；(r)核酸分子，其包含编码细菌ABC-型维生素B12转运蛋白通透酶组分多肽或其功能性变体的序列；(s)核酸分子，其包含编码细菌ABC-型维生素B12转运蛋白腺苷三磷酸酶组分多肽或其功能性变体的序列；(t)核酸分子，其包含编码细菌ABC-型钴胺素/Fe3+-铁载体转运系统多肽或其功能性变体的序列；(u)核酸分子，其包含编码细菌腺苷转移酶多肽或其功能性变体的序列；(v)核酸分子，其包含编码细菌GTP环化水解酶I多肽或其功能性变体的序列；(w)核酸分子，其包含编码细菌phoA、psiA或psiF基因产物多肽或其功能性变体的序列；(x)核酸分子，其包含编码细菌二氢新蝶呤醛缩酶多肽或其功能性变体的序列；(y)核酸分子，其包含编码细菌7，8-二氢-6-羟甲基蝶呤-焦磷酸激酶多肽或其功能性变体的序列；(z)核酸分子，其包含编码细菌二氢蝶酸合酶多肽或其功能性变体的序列；(aa)核酸分子，其包含编码细菌二氢叶酸合成酶多肽或其功能性变体的序列；(ab)核酸分子，其包含编码细菌二氢叶酸还原酶多肽或其功能性变体的序列；(ac)核酸分子，其包含编码细菌叶酰聚谷氨酸合成酶多肽或其功能性变体的序列；(ad)核酸分子，其包含编码推定的细菌甲硫氨酸(APC转运蛋白超家族)通透酶(YjeH)多肽或其功能性变体的序列；(ae)核酸分子，其包含编码细菌MetE/H的转录激活物多肽或其功能性变体的序列；(af)核酸分子，其包含编码细菌6-磷酸葡糖酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(ag)核酸分子，其包含编码细菌S-甲基甲硫氨酸高半胱氨酸甲基转移酶多肽或其功能性变体的序列；(ah)核酸分子，其包含编码细菌S-腺苷高半胱氨酸水解酶多肽或其功能性变体的序列；(ai)核酸分子，其包含编码细菌位点特异性DNA甲基化酶多肽或其功能性变体的序列；(aj)核酸分子，其包含编码细菌甲硫氨酸输出系统蛋白1多肽或其功能性变体的序列；(ak)核酸分子，其包含编码细菌甲硫氨酸输出系统蛋白2多肽或其功能性变体的序列；(al)核酸分子，其包含编码细菌ABC转运系统ATP-结合蛋白(MetN)多肽或其功能性变体的序列；(am)核酸分子，其包含编码细菌ABC转运系统通透酶蛋白(MetP)多肽或其功能性变体的序列；(an)核酸分子，其包含编码细菌ABC转运系统底物结合蛋白(MetQ)多肽或其功能性变体的序列；(ao)核酸分子，其包含编码细菌天冬氨酸激酶多肽或其功能性变体的序列；(ap)核酸分子，其包含编码细菌天冬氨酸半醛脱氢酶或其功能性变体的序列；(aq)核酸分子，其包含编码细菌高丝氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(ar)核酸分子，其包含编码细菌O-高丝氨酸乙酰转移酶多肽或其功能性变体的序列；(as)核酸分子，其包含编码细菌O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶多肽或其功能性变体的序列；(at)核酸分子，其包含编码细菌钴胺素依赖性甲硫氨酸合酶多肽或其功能性变体的序列；(au)核酸分子，其包含编码细菌钴胺素非依赖性甲硫氨酸合酶多肽或其功能性变体的序列；(av)核酸分子，其包含编码细菌高丝氨酸激酶多肽或其功能性变体的序列；(aw)核酸分子，其包含编码细菌甲硫氨酸腺苷转移酶多肽或其功能性变体的序列；(ax)核酸分子，其包含编码细菌O-琥珀酰高丝氨酸(硫)-裂合酶多肽或其功能性变体的序列；(ay)核酸分子，其包含编码细菌胱硫醚β-裂合酶多肽或其功能性变体的序列；(az)核酸分子，其包含编码细菌5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶多肽或其功能性变体的序列；(ba)核酸分子，其包含编码细菌二氢吡啶二羧酸合酶多肽或其功能性变体的序列；(bb)核酸分子，其包含编码细菌丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体的序列；(bc)核酸分子，其包含编码细菌谷氨酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(bd)核酸分子，其包含编码细菌二氨基庚二酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(be)核酸分子，其包含编码细菌甲硫氨酸和半胱氨酸生物合成阻抑物(McbR)多肽或其功能性变体的序列；(bf)核酸分子，其包含编码细菌赖氨酸输出蛋白多肽或其功能性变体的序列；(bg)核酸分子，其包含编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧激酶多肽或其功能性变体的序列；(bh)核酸分子，其包含编码细菌磷酸烯醇丙酮酸羧化酶多肽或其功能性变体的序列；(bi)核酸分子，其包含编码细菌甘氨酸脱氢酶(脱羧)多肽或其功能性变体的序列；(bj)核酸分子，其包含编码细菌H多肽(涉及甘氨酸裂解系统)或其功能性变体的序列；(bk)核酸分子，其包含编码细菌氨基甲基转移酶多肽或其功能性变体的序列；(bl)核酸分子，其包含编码细菌二氢硫辛酰胺脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(bm)核酸分子，其包含编码细菌硫辛酸-蛋白连接酶A多肽或其功能性变体的序列；(bn)核酸分子，其包含编码细菌硫辛酸合酶多肽或其功能性变体的序列；(bo)核酸分子，其包含编码细菌硫辛酰-[酰基载体蛋白]-蛋白-N-硫辛酰转移酶多肽或其功能性变体的序列；(bp)核酸分子，其包含编码细菌果糖-1，6-二磷酸酶多肽或其功能性变体的序列；(bq)核酸分子，其包含编码细菌葡糖-6-磷酸脱氢酶多肽或其功能性变体的序列；(br)核酸分子，其包含编码葡糖-6-磷酸异构酶多肽或其功能性变体的序列；和(bs)核酸分子，其包含编码细菌NCgl2640多肽或其功能性变体的序列。2.权利要求l的细菌，其中所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少两种。3.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少三种。4.权利要求l的细菌，其中所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少四种。5.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含核酸分子(a)-(bs)中的至少五种。6.权利要求l的细菌，其中至少一种多肽对于所述细菌是异源的。7.权利要求l的细菌，其中至少两种多肽对于所述细菌是异源的。8.权利要求l的细菌，其中所述细菌是谷氨酸棒杆菌细菌。9.权利要求l的细菌，其中所述细菌包含(aj)和(ak)。10.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(r)、(s)和(t)。11.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(a)、(b)和(c)。12.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(d)和(e)。13.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(i)和(j)。14.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(l)和(o)。15.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(p)和(q)。16.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(bi)、(bj)和(bk)。17.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(bi)、(bj)、(bk)和(bl)。18.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(bi)、(bj)、(bk)，和以至少一种(1)(bm)或(2)(bn)和(Q)。19.权利要求1的细菌，其中所述细菌包含(bi)、(bj)、(bk)、(bl)，和以下中的至少一种(1)(bm)或(2)(bn)和(bo)。20.—种产生氨基酸或相关代谢物的方法，所述方法包括将权利要求1的细菌培养在允许氨基酸或相关代谢物产生的条件下，和从培养物中收集包含所述氨基酸或相关代谢物的组合物。21.权利要求l的方法，其中所述氨基酸选自甲硫氨酸、S-腺苷曱硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸和半胱氨酸。22.权利要求1的细菌，其包含至少一种选自(a)-(an)的分离的核酸分子和至少一种选自(ao)—(bs)的分离的核酸分子。23.权利要求1的细菌，其包含至少一种选自(a)-(an)的分离的核酸分子和至少两种选自(ao)-(bs)的分离的核酸分子。24.权利要求1的细菌，其包含至少两种选自(a)-(an)的分离的核酸分子和至少一种选自(ao)—(bs)的分离的核酸分子。25.权利要求1的细菌，其包含至少两种选自(a)-(an)的分离的核酸分子和至少两种选自(ao)-(bs)的分离的核酸分子。26.权利要求1的细菌，其包含编码具有降低的反馈抑制的变体天冬氨酸激酶、具有降低的反馈抑制的变体高丝氨酸脱氢酶或具有降低的反馈抑制的变体O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的核酸分子。全文摘要本发明描述经工程改造而使氨基酸和相关代谢物的产生增加的细菌菌株，所述氨基酸包括天冬氨酸衍生氨基酸(例如，甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和S-腺苷甲硫氨酸(S-AM))和半胱氨酸。可对所述菌株进行遗传工程改造以使其含有编码多肽(例如，对于宿主细胞是异源或同源的多肽)的一种或多种核酸分子(例如，重组核酸分子)，和/或可对它们进行工程改造以增加或减少多肽的表达和/或活性(例如，通过内源核酸序列的突变)。文档编号C12N1/21GK101578361SQ200680030034公开日2009年11月11日申请日期2006年6月19日优先权日2005年6月17日发明者凯文·T·马登,彼得·S·约吉,迈克尔·J·沃尔布里奇,里德·多滕申请人:米克罗比亚精密工程股份有限公司