专利名称：：改进转谷氨酰胺酶的底物特异性的制作方法
技术领域：
：本发明涉及源自于茂原链霉菌(S&e^o^yc"wo&raerae)的新型转谷氨酰胺酶变体。所述变体可以用于以提高的选择性改变肽。
背景技术：
：已知通过在蛋白质上结合能恰当改变肽的性质的基团可以改变肽的性质和特征。尤其是对于治疗用肽而言，可能希望甚至必要的是在所述肽上结^^基团，这可以延长所述肽的半衰期。通常，这些结^^基团是聚乙二醇(PEG)或脂肪酸-参见J.Biol.Chem.271，21969-21977(1996)。转谷氨酰胺酶(TGase)先前已用于改变肽的性质。在食品工业，尤其是在乳制品工业中，许多技术可供使用例如采用TGase使肽交叉结合。其他文献7>开了应用TGase改变生理活性肽的性质。EP950665,EP785276和Sato,Adv.DrugDeliveryRev.^4,487-504(2002)公开了在TGase的存在下，含有至少一个Gin的肽和胺官能化PEG或者类似配体间的直接反应，Wada在Biotech.Lett.21,1367-1372(2001)中公开了(3-乳球蛋白与脂肪酸通过TGase方法直接结合。国际专利申请WO2005070468公开了TGase可用于将官能团引入含有谷氨酰胺的肽从而形成官能化的肽，而该经过官能化的肽在随后的步骤中可与诸如能够与所述官能化的肽进行反应的PEG进行反应从而形成PEG化的肽。转谷氨酰胺酶(E.C.2.3.2.13)也已知为蛋白质-谷氨酰胺-y-谷氨酰转移酶，并催化以下一4a应<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>其中Q-C(O)-丽2可表示含有谷氨酰胺的肽，而Q'-NH2表示胺供体，在以上讨论的反应中提供将被引入到所述肽中的官能团。体内常见的胺供体是与肽结合的赖氨酸，而上述反应则提供了肽的交叉结合。凝结因子因子XIII(FactorXIII)是在受伤时能实现血液凝结的转谷氨酰胺酶。不同的TGase相互之间也存在差别，例如，对作为底物的蛋白质的Gin周围的氨基酸残基的要求不同，即根据邻近所述Gin残基的是哪些M酸残基，不同的TGase将不同的含有谷氨酰胺的肽作为底物。该方面可在待修饰的肽含有多个Gin残基时得到利用。如果仅仅希望在存在的Gin残基中的一部分上选择性地结合肽，则通iti4择仅仅接受相关Gin残基作为底物的TGase可实现该选择性。人类生长激素(hGH)含有11个谷氨酰胺残基，因此任何TGase介导的hGH的结合都潜在地受到低选择性的妨碍。已发现在某些反应条件下，上述两步结合反应中，hGH在茂原链霉菌wokzram^)TGase介导的反应中官能化，可以使hGH在两个位置被官能化，即40-Gln和141-Gln。因此需要鉴定能更特异性地介导hGH官能化的TGase的变体。
发明内容本发明人已惊奇地发现在源自于茂原链霉菌(S.moMram^)的TGase中取代某些氨基酸残基能提供更特异性地介导hGH官能化的TGase。在一种实施方式中，本发明涉及源自于茂原链霉菌(S".wo^raeme)的TGase(SEQIDNo.1),其中至多三个酸性或碱性氨基酸残基已被其他碱性或酸性氨基酸残基所取4戈。在一种实施方式中，本发明涉如在SEQIDNo.1中定义的肽，所述肽含有以下一个或多个取代Tyr-75^酸性氨基酸残基；Tyr-302^碱性氨基酸残基；以及Asp-304^碱性氨基酸戎基。在一种实施方式中，本发明涉及编码本发明的肽的核酸构建体。在一种实施方式中，本发明涉及含有编码本发明的肽的核酸的载体。在一种实施方式中，本发明涉及含有载体的宿主，所述载体含有编码本发明的肽的核酸。在一种实施方式中，本发明涉及含有本发明的肽的组合物。在一种实施方式中，本发明涉及一种结合hGH的方法，所述方法包括使hGH与胺供体在本发明的肽的存在下进行反应。图1显示了hGH与1,3-二氨基-2-丙醇的TGase催化谷氨酰胺转移的典型CE分析图。具体实施方式在本说明书中，术语"酸性氨基酸残基"是指pKa低于7的天然氨基酸残基。具体实例包括Asp和Glu。在本说明书中，术语"碱性氨基酸残基"是指pKa高于7的天然氨基酸残基。具体实例包括Tyr、Lys和Arg。在本说明书中，"转氨作用"或类似术语是指其中谷氨酰胺侧链上的氮与来自另一种化合物的氮，尤其是来自于另一含氮亲核试剂的氮进行交换的反应。术语"结合"作为名词是指经修饰的肽，即连纟妻有能改变所述肽性质的部分的肽。作为动词，该术语是指将一部分(moiety)连接到肽上以改变所述肽的性质的过程。在本说明书中，术语"特异性"和"选择性"可互换，并用于描述相比于hGH中的其他特定谷氨酰胺残基，TGase优先与一个或多个特定谷氨酰胺歹tt反应。出于本说明书的目的，相对于hGH中的Gln-141,本发明的月&tGln-40的特异性根据在实施例3中进行描述的肽测试的结果来确定。所述孩i生物茂原链霉菌(5^e/tom;/cay附o6ara^1^)也一皮归类为茂原《连轮丝菌(5^e^wwto〃zw附wMaram^)。从所述生物体中可分离出TGase,该TGase的特征在于相对较低的分子量(38kDa)以及非钙依赖性。所述源自茂原链霉菌mokzramye)的TGase相对地得到很好的描述；例如已解析出其晶体结构(US156956;Appl.Microbiol.Biotech.M,447-454(2004))。一种制备结合hGH的方法包括hGH和含有官能团的胺儉沐之间的第一步反应以提供官能化的hGH,所述第一步反应由TGase介导(即催化)。在第二步反应步骤中，所述官能化hGH进一步和能够与所述已引入的官能团进行反应的例如PEG或脂肪酸进行反应从而提供结合的hGH。所述第一步反应和克述如下。X表示官能团或者潜在的官能团(即通过进一步反应例如氧化或者水解能转变为官能团的基团)。当上述反应由源自茂原链霉菌(Xmo&rae朋e)的TGase介导时，hGH和H2N-X(所述胺供体)之间的反应主要发生在Gln-40和Gln-141。可采用上述反应用来例如PEG化hGH以获得半衰期延长的治疗性生长激素产品。由于通常希望治疗性组合物为单化合物组合物，因此以上讨论的特异性的缺乏要求再一步的纯化步骤，其中将Gln-40官能化hGH与Gln-141官能化hGH和/或Gln-40/Gln-141双官能化hGH进行分离。相比hGH的Gln-141,本发明的月;U于Gln-40具有特异性，其与具有如SEQIDNo.1所示的^J^酸序列的肽对Gln-40的特异性并不相同(如实施例3所测量的，相比于Gln-141而言)。因此，相比于采用具有SEQIDNo.1的^JJ臾序列的TGase的反应，本发明的肽可用在对hGH进4亍转谷氨酰胺化的方法中以改变在所述方法中制造的Gln-40官能化hGH或Gln-141官能化hGH的比例。以下是本发明的实施方式的非限制性列表。实施方式l:含有如SEQIDNo.1所定义的序列的分离肽，其中在选自Tyr-75、Tyr-302和Asp-304的一个或多个氨基酸残基处对所述序列进行修饰(modified)。实施方式2:如实施方式1所述的分离肽，其中在Tyr-75对所述序列进行修饰。实施方式3:如实施方式2所述的分离肽，其中Tyr-75被酸性氨基酸残基取代。实施方式4:如实施方式3所述的分离肽，其中Tyr-75被Asp或Glu取代。实施方式5:如实施方式4所述的分离肽，其中Tyr-75一皮Glu取代。实施方式6:如实施方式1~5中任一项所述的分离肽，其中在Tyr-302对所述序列进4刊f饰。实施方式7:如实施方式6所述的分离肽，其中Tyr-302被不同于Tyr的碱性氨基酸残基取代。实施方式8:如实施方式7所述的分离肽，其中Tyr-302被Arg或Lys取代。实施方式9:如实施方式8所述的分离肽，其中Tyr-302被Arg取代。实施方式10:如实施方式1~9中任一项所述的分离肽，其中在Asp-304对所述序列进4刊务饰。实施方式ll:如实施方式10所述的分离肽，其中Asp-304被碱性^J^酸絲取代。实施方式12:如实施方式11所述的分离肽，其中Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。实施方式13:如实施方式12所述的分离肽，其中Asp-304被Lys取代。实施方式14:如实施方式5所述的分离肽，具有如SEQIDNo.2所定义的序列。实施方式15:如实施方式9所述的分离肽，具有如SEQIDNo.3所定义的序列。实施方式16:如实施方式13所述的分离肽，具有如SEQIDNo.4所定义的序列。实施方式17:如实施方式2~13中任一项所述的分离肽，具有如SEQIDNo.5所定义的序列。实施方式18:具有如SEQIDNo.1所定义的序列的肽，所述肽含有以下一个或多个取代Tyr-75+酸性^^酸歹驢；Tyr-302^非Tyr的碱性^J^酸残基；以及Asp-304^碱性llJ^酸残基。实施方式19:如实施方式18所述的具有如SEQIDNo.1所定义的序列的肽，所述肽含有以下一个或多个取代Tyr-75^Asp或Glu;Tyr-302">Arg或Lys;以及Asp-304^Tyr、Lys或Arg。实施方式20:如实施方式18或实施方式19所述的具有如SEQIDNo.1所定义的序列的肽，所述肽含有一个或多个取代Tyr-75^Glu;Tyr-302^Arg;以及Asp-304今Lys。实施方式21:如实施方式18-20中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:1所定义，其中包括用Glu取代Tyr-75和用Arg取代Tyr-302。实施方式22:如实施方式18-20中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:2所定义。实施方式23:如实施方式18-20中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:3所定义。实施方式24:如实施方式18-20中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:4所定义。实施方式25:如实施方式18所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo:5所定义。实施方式26:如实施方式1~25中任一项所述的肽，所述肽具有转谷氨酰胺酶活性。实施方式27:如实施方式1~26中任一项所述的分离肽，相比hGH的Gln-141,所述肽具有对hGH的Gln-40的特异性，这与具有如SEQIDNo.1所示的絲西1^列的月;M目比hGH的Gln-141而言对hGH的Gln-40的特异性并不相同。实施方式28:如实施方式27所述的分离肽，相对于hGH的Gln-141,所述月;b^hGH的Gln-40具有特异性，所述特异性高于具有如SEQIDNo.1所示的M酸序列的肽相比hGH的Gln-141而言对hGH的Gln-40的特异性。实施方式29:相比于hGH的Gln-141,对hGH的Gln-40具有特异性的转谷氨酰胺酶，所述特异性不同于具有如SEQIDNo:1所示的M^酸序列的月i4目比hGH的Gln-141而言对hGH的Gln-40的特异性。实施方式30:如实施方式29所述的相比于hGH的Gln-141,对hGH的Gln-40具有特异性的转谷氨酰胺酶，所述特异性高于具有如SEQIDNo:1所示的#^酸序列的";M目比hGH的Gln-141而言对hGH的Gln-40的特异性。实施方式31:编码如实施方式1~30中任一项所述的肽的核酸构建体。实施方式32:含有实施方式31的核酸构建体的载体。实施方式33:含有实施方式32的载体的宿主。实施方式34:含有如实施方式1~30中任一项所述的肽的组合物。实施方式35:—种结合hGH的方法，其中所述方法包括4吏所述hGH和胺供体在如实施方式1~30中任一项所述的肽的存在下进4亍反应。实施方式36:如实施方式35所述的结合hGH的方法，其中，与在位点Gln-141结合的hGH量相比在位点Gln40结合的hGH量,和采用具有如SEQIDNo.1所示的^J^酸序列的肽替代如实施方式1~30中任一项所述的肽用于所述方法时与在位点Gln-141结合的hGH量相比在位点Gln-40结合的hGH量进行比较明显增加。实施方式37:如实施方式1~30中任一项所述的肽在制备结合hGH中的用途。实施方式38:如实施方式37所述的用途，其中所述hGH在位点Gln-40进行结合。在一种实施方式中，本发明的肽4支Gln-141而言的对Gln-40的特异性高于具有如SEQIDNo.1所示的ll^酸序列的肽较Gln-141而言的对Gln-40的特异性，结果使得在使用此处描述的TGase的转谷氨酰胺反应中较Gln-141而言的Gln-40的产量增加。在一种实施方式中，本发明的肽4支Gln-141而言的对Gln-40的特异性为具有如SEQIDNo.1所示的JlJ^交序列的肽较Gln-141而言的对Gln-40的特异性的至少1.25倍高，例如至少1.50倍高，例如至少1.75倍高，例如至少2.0倍高，例如至少2.54咅高，例如至少3.(H咅高，例如至少3.54咅高，例如至少4.0倍高，例如至少4.5倍高，例如至少5.0倍高，例如至少5.5倍高，例如至少6.0倍高，例如至少6.5倍高，例如至少7.0倍高，例如至少7.5倍高，例如至少8.0倍高，例如至少8.5倍高，例如至少9.0倍高，例如至少9.5倍高，例如至少10.0倍高。如果采用如SEQIDNo.2定义的序列，将主要得到Gln-141官能化hGH,而仅得到可忽略量的Gln-40官能化hGH或者Gin-40/Gln-141双官能化hGH。在一种实施方式中，本发明涉及含有如SEQIDNo.1定义的MJ臾序列的肽，在所述序列中，Tyr-75已被Asp或Glu取代，和/或Tyr-302已被Arg或Lys取4戈；和/或Asp-304已被Tyr、Lys或Arg取4戈。在一种实施方式中，本发明涉及含有如SEQIDNo.1定义的tt酸序列的肽，其中Tyr-75已被Glu取代；和/或Tyr-302已被Arg取代；和/或Asp-304已被Lys取代。在一种实施方式中，本发明涉及含有如SEQE)No.2定义的JlJ^酸序列的肽，所述SEQEDNo.2为具有Tyr-75^Glu取代的SEQIDNo.1。在一种实施方式中，本发明涉及含有如SEQIDNo.3定义的tt酸序列的肽，所述SEQIDNo.3为具有Tyr-302^Arg取代的SEQIDNo.1。在一种实施方式中，本发明涉及含有如SEQIDNo.4定义的M酸序列的肽，所述SEQIDNo.4为具有Asp-304^Lys取代的SEQIDNo.1。在一种实施方式中，本发明涉及含有如SEQEDNo.5定义的^J^酸序列的肽，所述SEQIDNo.5为具有Tyr-75^Glu取代，Tyr-302^Arg取代和Asp-304">Lys取代的SEQIDNo.1。根据在US5,156,956中描述的分析检验进行测定，本发明的月錄现出TGase活性。简述之，指定肽的活性测量是通过进4亍以下过程进4亍的，即在不存在Ca^的情况下采用千七-谷氨酰甘氨酸和羟胺作为底物进行反应，在三氯乙酸的存在下形成与所得羟肟酸结合的铁复合物，测量525nm下的吸光度并通过校准曲线测定羟肟酸的量从而计算所述活性。为了本说明书的目的，在所述分析检验中表现出转谷氨酰胺酶活性的肽被认为是具有转谷氨酰胺酶活性。具体而言，本发明的TGase变体表现出的活性高于源自茂原链霉菌(S.wo^ramse)的TGase的活性的30%,例如高于50%，例如高于70%,例如高于90%。在一种实施方式中，本发明涉及包含具有SEQIDNo.:2、3、4或5中任一序列的多肽的组合物。本发明的肽可按照不同方法进行制备。所述肽可通过本领域内已知的蛋白质合成方法进行制备。由于所述肽的大小，更方便的是通过合成所述肽的几个片,殳，然后将其连接形成本发明的肽。然而，在具体实施方式中，本发明的肽通过含有编码本发明的肽的核酸的适宜宿主的发酵而制备。在一种实施方式中，本发明还涉及编码本发明的肽的核酸构建体。在此处所使用的术语"核酸构建体"是指任何cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA来源的核酸分子。术语"构建体"是指可以是单链或双链的核酸片段，并且可以基于对感兴趣的蛋白质进行编码的完整或者部分天然核苷酸序列。所述构建体可以任选地含有其他核酸片段。编码本发明的肽的本发明的核酸构建体可适宜地为基因组或cDNA来源，例如通过以下过程获得，即制备基因组或cDNA库，并通过根据标准技术采用合成寡聚核苷酸探针的杂交从而对编码完整或部分蛋白质的DNA(参见J.Sambrooketal，1989，A/o/ecw/"rC7o/7z'"g，J^^""2^,，2dedition,ColdSpringHarbor,NewYork)并通过引入本领域已知的相关的突变来进行筛选。编码所述蛋白质的本发明的核酸构建体也可通过已建立的标准方法合成制备，例如Beaucage和Caruthers,TetrahedronLetters22,1859-1869(1981)所描述的phosphoamidite法，或者Matthes等，EMBOJournal》，801-805(1984)描述的方法。根据所述phosphoamidite法，在例如自动DNA合成仪中合成寡聚核苷酸，纯化，退火，连接，并在合适的载体中克隆。此外，所述核酸构建体可以是混合的合成和基因组、混合合成和cDNA或者混合基因组和cDNA来源，这是通过标准技术连接合成、基因组或cDNA来源(适当的)的片段制备而成的，所述片l殳对应于整个核酸构建体的不同部分。所述核酸构建体也可采用特定引物通过聚合酶链式反应制备，例如在US4,683,202或Saiki等,Science239，487-491(1988)中所描述。所述核酸构建体优选为DNA构建体，在下文中将唯一使用该术语。在其他方面，本发明涉及含有本发明的DNA构建体的重组载体。其中插入有本发明的DNA构建体的重组载体可以是任何能方便地进行重组DNA过程的载体，并且所述载体的选择通常取决于其将导入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自主复制载体，即以基因组外实体存在的载体，其复制独立于基因组复制，例如质粒。作为另外一种选择，所述载体可以是在导入宿主细胞时整合到宿主细胞基因组中并与其整合入的染色体一起进行复制的载体。所述载体优选为表达载体，其中所述编码本发明的蛋白质的DNA序列与DNA转录所必需的其他片段可操作地相连。通常，所迷表达载体源自于质粒或病毒DNA,或者含有二者的元件。术语"可操作地连接"指所述片段经设置使得与其预期目的相一致的发挥功能，例如转录在启动子内启始并沿编码所述蛋白质的DNA序列进4亍。所述启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，并可来源于与所述宿主细胞同源或异源的编码蛋白质的基因。的启动子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.塑，12073-12080(1980);AlberandKawasaki,J.Mol.Appl.Gen.丄，419-434(1982))或醇脱氢酶基因(Young等,inGeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals(Hollaenderetal,eds.)，PlenumPress,NewYork，1982)或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(Russell等，Nature304,652-654(1983))启动子。在丝状真菌宿主细胞中使用的适宜启动子的实例是例如ADH3启动子(McKnight等，TheEMBOJ.4,2093-2099(1985))或tpiA启动子。其他有用的启动子的实例是来自编码米曲霉他卡淀粉酶(ATAKAamylase)、米黑才艮毛霉天冬氨酸蛋白酶(A/z&o附wcor/w'e/za'asparticproteinase)、黑曲霉中性a-淀粉酶(Aneutrala-amylase)、黑曲霉酸稳定ot-淀粉酶(Aacidstablea-amylase)、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(Am'geroravramonglucoamylase)(gluA)、米黑才艮毛霉月旨肪酶(i^/zzzo-mwcor脂'e/2e"ipase)、米曲霉械性蛋白酵(爿."zaealkalineprotease)、米曲霉石舞酉臾丙if唐异计勾酶(Atriosephosphateisomerase)或才勾巢曲霉乙酰胺酶(Am血/amacetamidase)的基因的启动子。优选的是卡他淀粉酶和gluA启动子。在细菌宿主细胞中使用的适宜启动子的实例包括嗜热脂肪芽孢杆菌(5acz〃uyWeaTOAeww/^z/i^)麦芽糖淀4分酶基因，地衣芽孢杆菌(Sa"'〃ws/zc/^w/w7w;y)a-淀粉酶基因，淀粉芽孢杆菌(謹y/o/一咖czera)BAN淀粉酶基因，枯草杆菌(Sa"〃w"M"fo)碱性蛋白酶基因，或者短小芽孢杆菌(Stt"〃w/wwz7w5)木糖普酶基因的启动子，或者噬菌体LambdaPR或PL启动子或大肠4干菌(E.coli)lac、trp或tac启动子。如果必需，编码本发明的蛋白质的DNA序列也可与适宜的终止子可操作地相连，诸如人类生长激素终止子(Palmiter等，op.cit.)或(对真菌宿主而言)TPI1(AlberandKawasaki，op.cit.)或ADH3(McKnight等，op.cit.)终止子。所述载体可进一步含有元件诸如聚腺苷酸化信号(例如来自SV40或腺病毒5Elb区域)，转录增强子序列(例如SV40增强子)和翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA的翻译增强子序列)。本发明的重组载体可进一步含有能使所述载体在被讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。当所述宿主细胞是酵母细胞时，能使所述载体进行复制的适宜序列是酵母质粒2n复制基因REP1-3和复制起点。当所述宿主细胞是细菌细胞时，能使所述载体进行复制的序列是DNA聚合酶m复合体编码基因和复制起点。所述载体还可以含有可选择的标记，例如基因，其产物与宿主细胞中的缺陷互补，诸如编码二氲叶酸还原酶(DHFR)或栗酒裂殖酵母TPIgene(P.R.Russell,Gene迎，125-130(1985)所描述)，或者能赋予对药物，例如氨千青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨虫莱呤的抗性的基因。对于丝状真菌，可选择的标记包括amdS、pvrG、argB、niaD和sC。为将本发明的蛋白质导入所述宿主细胞的分泌途径，在所述重组载体中可"^供分泌信号序列(也已知为前导序列(leadersequence)、前序列(preprosequence或presequence))。所述分泌信号序列在正确的阅读框内连接到编码所述蛋白质的DNA序列上。分泌信号序列通常位于编码所述蛋白质的DNA序列的5'端。所述分泌信号序列可与所述蛋白质正常联合或者来自编码其他分泌蛋白质的基因。为从酵母细胞中分泌，所述分泌信号序列可编码任何信号肽，所述信号肽确保将所表达的蛋白质高效地导入所述细胞的分泌途径。所述信号肽可以是天然生成的信号肽，或者其功能部分，或者它可以是合成肽。已发现适宜的信号肽是ot-因子信号肽(参见US4,870,008)，小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参见O.Hagenbuchle等，Nature289,643-646(1981))，改进羧肽^[言号肽(参见L.A.Valls等，CellII,887-897(1987)),酵母BAR1信号肽(参见WO87/02670)，或者酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽(参见M.Egel-Mitani等，Yeasty127-137(1990))。为在酵母中有效分泌，编码前导肽的序列也可插入在所述信号序列的下游和编码所述蛋白质的DNA序列的上游。所述前导序列的功能是使所表达的蛋白质能从内质网进入高尔基体并^i^进入分泌嚢泡从而分泌^培养基(即所述蛋白质跨细胞壁输出或者至少通过细胞膜iiTv所述酵母细胞的细胞周质空间)。所述前导肽可以是酵母a-因子前导肽(其使用在例如US4,546,082、EP16201、EP123294、EP123544和EP163529得以描述)。作为另外一种选择，所述前导肽可以是合成前导肽，也就说未在自然界中发现的前导肽。例如，合成前导肽可按照WO89/02463或WO92/11378的描述进行构建。为在丝状真菌中使用，所述信号肽可方便地来源于编码曲霉属物种(^y/^g,〃ztfsp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码米黑根毛霉(K/^omwcw而'e/zez)月旨肪酶或蛋白酶或高温毛壳霉(//w脂'co/a/a做gz"(w")月旨肪酶的基因。所述信号肽优选来源于编码米曲霉(Awy加e)他卡淀粉酶、黑曲霉(」.中性a-淀粉酶、黑曲霉U.酸稳定淀粉酶或黑曲霉U.葡糖淀粉酶的基因。用于分别连接编码本发明的蛋白质的DNA序列、所述启动子和可选的终止子和/或分泌信号序列，并将其插入含有复制必需信息的合适载体中的过程对于本领域技术人员是/^口的(参见，例如Sambrook等，op.cit.).将本发明的DNA构建体或重组载体导入其中的宿主细胞可以是任何能制造本发明的蛋白质的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高级真核细胞。在经过培养后能制造本发明的蛋白质的细菌宿主细胞的实例是革兰氏阳性菌例如杆菌(^^7/^)林诸如枯草芽孢杆菌(S.sw^fo)、地衣芽孢杆菌(S.//c/zew/o，w)、緩慢芽孢杆菌(S./e对m)、短小芽孢杆菌(及Z^t^)、嗜热脂肪芽孢杆菌(丑WearaAermo//n7m)、嗜碱芽孢杆菌(丑a汰a/o//H7u)、水解淀4分芽孢杆菌(S.)、凝结芽孢杆菌(S.coagw/a朋)、4灸装芽孑包斗干菌"'rcw/a"s)、及/awfus、巨大芽孑包才干菌(B.meg加/zermm)或苏云金芽孢杆菌//2w〃"gwraw)的菌4朱，或者链霉菌()4朱诸如5"./h^/"ra或S.ww〃m^，或者革兰氏阴性菌诸如大肠才干菌(ic/zenc/2Z(2co/,)。按照本身已知的方式通过原生质体转化或者采用感受态细胞能实现所述细菌的转化(参见Sambrook等，supra).其他合适的宿主包括S.mo&raerae、S/zW聽和C.g/wto薩謂(Appl.Microbiol.Biotechnol.^4,447画454(2004))。当在细菌诸如大肠杆菌(EcW)中表达蛋白质时，所述蛋白质可保留在细胞质中，通常为不溶性颗粒(称之为内含体)，或者可通过细菌分泌序列导入细胞周质空间。在前一种情况下，所述细胞净支溶解并收集所述颗粒并使之变性，随后通过稀释所述变性剂使所述蛋白质重新折叠。在后一种情况下，通过例如超声波降解或渗透压冲击(osmoticshock)使细胞破裂从而释放细胞周质空间中的内容物并收集所述蛋白质，从而从所述细胞周质空间中收集所述蛋白质。合适的酵母细月包的实例包才舌iS^cc/Mfraw^cas*spp.、5b/nzaracc/2(3raw_ycesspp.,尤其是酉良酒酵母(S"cc/zara附yce《cewW&ae)或5"(2c'c/z"ra附3;casA:/z^yven.菌抹。用异源DNA转化酵母细胞并由此制造异源蛋白质的方法在US4,599,311、US4,931,373、US4，870,008、US5，037,743和US4,845,075中进行描述，将其全部在此以引用的方式引入。通过由可选择的标记，通常为耐药性或者在缺乏特定营养物例如亮氨酸的情况下生长的能力确定的表型选牙奪转化细胞。优选的用在酵母中的载体是在US4,931,373中公开的POT1载体。编码本发明的蛋白质的DNA序列之前可以有信号序列以及可选的前导序列，如上所述。合适的酵母细胞的其他实例是克鲁维酵母(A7甲eTOmyc^)菌抹诸如乳酸克鲁维酵母(〖/acto),汉逊酵母(T/朋^mi")诸如多形汉逊酵母(///70/>W0^7/z"),或毕赤酵母(尸ZC/^)诸如巴斯得毕赤酵母(尸./7^ton;y)(参见Gleeson等，J.Gen.Microbiol.巡，3459-3465(1986);US4,882,279)。其他真菌细胞的实例是丝状真菌细胞，例如曲霉属U^wgz7/^spp.)、链孑包霉属(脸wras/7oraspp..)、嫌刀霉属(Fura"'廳spp.)或木霉属(7Wc/2(%/e/77aspp.),尤其是米曲霉(vl07zae)、构巢曲霉U.mtMara)或黑曲霉(vl"&er)菌抹。采用曲霉(A^wgV/uyspp.)以表达蛋白质在例如EP2722"和EP230023中得以描述。例如，尖孢镰刀菌(Fojqwwwm)的转化可按照Malardier等Gene2^,147-156(1989)的描述进行。当采用丝状真菌作为宿主细胞时，可使用本发明的DNA构建体对其进行转化，简便地通过将所述DNA构建体整合到所述宿主染色体中以得到重组宿主细胞。所述整合通常被认作优点，这是由于所述DNA序列更可能稳定地保留在所述细胞中。可按照传统方法例如通过同源或异源重组将所述DNA构建体整合进入所述宿主染色体。以上描述的转化或者转染宿主细胞随后在合适的营养培养基中，在允许本发明的肽表达的条件下进行培养，在此之后从所述培养基中收集所得蛋白质。用于培养所述细胞的培养基可以是任何适合于生长所述宿主细胞的常规培养基，诸如含有适当补充物的最小或复合培养基。合适的培养基可由商业供应商纟是供或者纟艮据7>开的配方制备(例如在AmericanTypeCultureCollection的目录中)。然后可通过常规手段从所述培养基中回收由所述细胞制造的蛋白质，包括通过离心或过滤从所述培养基中分离所述宿主细胞，通过盐例如碌u酸4妄沉淀所述上清液或滤液中的蛋白质成分，通过各种色谱方法，例如离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲合色谱等进行纯化，取决于所讨论的蛋白质的类型。所有参考文献，包括此处引用的出版物、专利申请和专利在此以引用的方式整体引入，并达到如同每篇参考文献在此被个别地、具体地指明以引用的方式引入并阐明其全部内容的相同的程度(至法律所允许的最大范围)，在描述本发明的上下文中使用的术语"a","an"和"the"以及类似词语应解释为涵盖单数和复数，除非另外指出或者与内容明显相4氐触。例如，短语"所述化合物"应被理解为指代本发明的各种"化合物"或者具体描述的方面，除非另外指明。除非另外指明，所有在此提供的精确数值是对应的近似数值的代表(例如，关于特定因子或者测量而提供的所有精确示例性数值可被视为还提供了相应的近似测量结果，在适当时，可以用"大约，，进行修饰)。此文中，使用诸如"包含，，、"具有，，、"包括"、"含有"等术语的关于一个或多个要素的本发明的任何方面的描述旨在提供对"由该特定要素构成的"、"基本由该特定要素构成的"或"基本包含该特定要素的"本发明的相似方面的支持，除非另外说明或者明显与上下文相纟氐触(例如，此处描述为包含特定要素的组合物应当理解为描述由该要素构成的组合物，除非另外说明或者明显与上下文相^Jt虫)。实施例实施例1hGH的PEG化a)hGH溶解在磷酸盐緩冲液(50mM，pH8.0)中。该溶液与溶解在磷酸盐緩沖液(50mM,1ml，pH8.0,在溶解所述胺M之后用稀盐酸调节pH至8.0)中的胺供体例如1,3-二M-丙-2-醇的溶液相混合。最后，加入溶解在磷酸盐緩冲液(50mM,pH8.0,1ml)中的TGase(~40U)溶液，并加入磷酸盐緩冲液(50mM,pH8)调节体积为10ml。合并所得的混合物在37。C温育大约4小时。降低温度至室温并加入N-乙基-马来酰亚胺(TGase抑制剂)至1mM的最终浓度。在另外1小时^后，用10倍体积的tris緩冲液(50mM,pH8.5)稀释所述混合物。b)如果在所述胺供体中存在潜在的官能团，则由a)所得的转氨hGH可任选地进行进一步的反应以对该官能团进行活化。c)由a)或b)所得到的官能化hGH随之和能够与引入hGH的官能团进行反应的适当官能化的PEG进行反应。举例，可通过使羰基部分(醛或酮)与烷氧胺进行反应形成肟键。实施例2TGase特异性分牙斤I所描述的方法可用于测定所述hGH中的Gln残基，所述hGH已在如实施例1所描述的反应中被改变。也就是说此处所描述的方法可用于测定本发明的TGase的选择性。确定PEG化位点采用离子交换色谱和凝胶过滤的组合纯化在实施例1中得到的单PEG化hGH。为确定PEG化的位点，所纯化的化合物用二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行还原和烷J^化。随后，用非特异性蛋白酶，蛋白酶K消化所述化合物，然后使用乙腈/TFA緩沖液体系在反相C-18HPLC柱分离所得消化物。在这些条件下，PEG化肽将明显晚于非PEG化肽被洗脱出，此外所有PEG化肽(如果有多于一种时)将在同一峰中被洗脱出，这是由于PEG化肽的保留时间主要取决于所述PEG部分。收集含有PEG化肽的峰，并采用自动Edman分析进行氨基酸测序。所得结果同时4是供了关于PEG化的准确位置-PEG化氨基酸将在测序分析中形成空白循环-和存在的肽的数目以及相对量的信息，因此揭示了是否在多处位点发生PEG化。实施例3测试TGase突变体对hGH中Gln-141VSGln-40的特异性20jal1,3-二^J^-2-丙醇(180mg/ml在10mM磷酸盐緩冲液中，通iti口入浓HCl调节pH至8.3)加入到在10mM磷酸盐緩沖液pH8.1(50)中的hGH(1mg)溶液中。以使最终反应混合物体积为100|ul的量加入10mM磷酸盐緩冲液。通过加入所述酶(最终浓度0.07至7|uM)开始反应。所述反应混合物在37。C温育，反应后进行毛细管电泳(CE)。向所述反应混合物的等分试样(10)ul)中加入N-乙基马来酰亚胺100mM(l|ul)。所述混合物在环境温度下温育5分钟，然后在CE分析之前在H20中稀释IOO倍。4吏用AgilentTechnologies3D-CE系统(AgilentTechnologies)进4亍CE。使用AgilentTechnologies3DCEChemStation进行数据收集和信号处理。所述毛细管为来自安捷伦(Agilent)的长64.5cm(56.0cm有效长度)内径50|um的"ExtendedLightPathCapillary"。在200塑下进4亍UV4全测(16nmBw,参比380nm和50nmBw)。所述流动电解液是磷酸盐緩冲液50mMpH7.0。所述毛细管用0.1MNaOH处理3分钟，随后用Milli-Q水处理2分钟，用所述电解液处理3分钟。在每次运行后，用milli-Q水冲洗毛细管2分钟，然后用磷酸沖洗2分钟，用milli-Q水冲洗两分钟。液流注射在50mbar下历经4.0秒钟完成。电压为+25kV。毛细管温度为30。C。运行时间为10.5分钟。图1显示了hGH与1,3-二M-2-丙醇的TGase催化的谷氨酰胺转移的典型CE分析图。调节酶量使得单转氨产物量在5小时的反应时间内达到最大值。反应速率的指标可由半数的底物hGH已被转氨化所需的时间表示。表1显示了对于选定的TGase的结果表l<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>WT具有SEQIDNo.1的氨基酸序列的TGaseY75E具有SEQIDNo.2的氨基酸序列的TGaseY302R具有SEQIDNo.3的氨基酸序列的TGaseY75E,Y302R如SEQIDNo.1所定义的TGase,其中Tyr-75已一皮Glu取代，Tyr-302已被Arg取代权利要求1.含有SEQIDNo.1所定义的序列的分离肽，其中在选自Tyr-75、Tyr-302和Asp-304的一个或多个氨基酸残基处所述序列被修饰。2.权利要求l所述的分离肽，其中在Tyr-75处所述序列被修饰。3.权利要求2所述的分离肽，其中Tyr-75被酸性M酸歹緣取代。4.权利要求3所述的分离肽，其中Tyr-75被Asp或Glu取代。5.权利要求4所述的分离肽，其中Tyr-75被Glu取代。6.权利要求1~5中任一项所述的分离肽，其中在Tyr-302处所述序列被修朱7.权利要求6所述的分离肽，其中Tyr-302被不同于Tyr的碱性M酸歹錄取代。8.权利要求7所述的分离肽，其中Tyr-302被Arg或Lys取代。9.权利要求8所述的分离肽，其中Tyr-302被Arg取代。10.权利要求19中任一项所述的分离肽，其中在Asp-304对所述序列进行修饰。11.权利要求IO所述的分离肽，其中Asp-304被碱性氨基酸残基取代。12.权利要求ll所述的分离肽，其中Asp-304被Tyr、Lys或Arg取代。13.权利要求12所述的分离肽，其中Asp-304被Lys取代。14.权利要求5所述的分离肽，具有SEQIDNo.2所定义的序列。15.权利要求9所述的分离肽，具有SEQIDNo.3所定义的序列。16.权利要求13所述的分离肽，具有SEQIDNo.4所定义的序列。17.权利要求2~13中任一项所述的分离肽，具有SEQIDNo.5所定义的序列。18.包含SEQE)No.1所定义的序列的肽，所述肽包含以下一个或多个取代Tyr-75^酸性氨基酸残基；Tyr-302^非Tyr的碱性氨基酸残基；以及Asp-304^碱性^^酸歹镇。19.权利要求18所述的具有SEQIDNo.1所定义的序列的肽，所述肽包含以下一个或多个取代Tyr-75+Asp或Glu;Tyr-302—Arg或Lys;以及Asp-304^Tyr、Lys或Arg。20.权利要求18或权利要求19所述的具有SEQIDNo.1所定义的序列的肽，所述肽包含一个或多个取代Tyr-75^Glu;Tyr-302^Arg;以及Asp-304^Lys。21.权利要求1820中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.1所定义，其中包括用Glu取代Tyr-75和用Arg取代Tyr-302。22.权利要求1820中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.2所定义。23.权利要求18~20中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.3所定义。24.权利要求18~20中任一项所述的肽，其中所述序列如SEQIDNo.4所定义。25.权利要求18所述的肽，其中所述序列如SEQEDNo.5所定义。26.权利要求1~25中任一项所述的肽，所述肽具有转谷氨酰胺酶活性。27.4又利要求1~26中任一项所述的分离肽，相比hGH的Gln-141,所述肽具有对hGH的Gln-40的特异性，这与具有SEQIDNo.1所示的氨基酸序列的月;M目比hGH的Gln-141而言对Gln-40的特异性并不相同。28.权利要求27所述的分离肽，相对于hGH的Gln-141,所述月b于hGH的Gln-40具有特异性，所述特异性高于具有SEQIDNo.1所示的M酸序列的肽相比hGH的Gln-141而言对Gln-40的特异性。29.相比于hGH的Gln-141,对hGH的Gln-40具有特异性的转谷氨酰胺酶，所述特异性不同于具有SEQIDNo.1所示的^llJ^酸序列的肽相比hGH的Gin-141而言对Gln-40的特异性。30.权利要求29所述的相比于hGH的Gln-141,对hGH的Gln-40具有特异性的转谷氨酖胺酶，所述特异性高于具有SEQIDNo.1所示的#^@踏列的肽相比hGH的Gln-141而言对Gln-40的特异性。31.编码权利要求1~30中任一项所述的肽的核酸构建体。32.含有权利要求31的核酸构建体的载体。33.含有权利要求32的载体的宿主。34.含有权利要求1~30中任一项所述的肽的组合物。35.—种结合hGH的方法，其中所述方法包括使hGH和胺供体在权利要求1~30中任一项所述的肽的存在下进行反应。36.权利要求35所述的结合hGH的方法，其中，与在位点Gln-141结合的hGH量相比的在位点Gln-40结合的hGH量，和在所述方法中采用具有SEQIDNo.1所示的^J^酸序列的肽替代权利要求1~30中任一项所述的肽时与在位点Gln-141结合的hGH量相比的在位点Gln-40结合的hGH量相比明显增加。37.权利要求1~30中任一项所述的肽在制备结合hGH中的用途。38.权利要求37所述的用途，其中所述hGH在位点Gln-40被结合。全文摘要在位点Tyr-75、Tyr-302或Asp-304处具有一个或多个取代的源自于茂原链霉菌的转谷氨酰胺酶。文档编号C12N9/10GK101263225SQ200680030084公开日2008年9月10日申请日期2006年8月18日优先权日2005年8月18日发明者L·诺斯科夫-劳里特森,N·L·J·约翰森申请人:诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司