光学活性α-羟基羧酸的制造方法

专利名称：：光学活性α-羟基羧酸的制造方法
技术领域：
：本发明涉及光学活性cx-羟基羧酸或光学活性a-羟基羧酸酯的制造方法。更具体地说，本发明涉及使用微生物由a-羟基羧酸酯的外消旋混合物有效制造光学活性(x-羟基羧酸或光学活性(x-羟基羧酸酯的方法。
背景技术：
：ot-羟基羧酸或其衍生物作为各种医药和农药的制造用中间体是有用的，特别是由于在a位具有不对称中心的光学活性a-羟基羧酸或其酯衍生物可以用来制造各种生理活性化合物，因而对有效制造光学纯度高的光学活性(x-羟基羧酸或其酯衍生物的方法进行了深入研究。例如已知有可利用光学活性a-羟基羧酸酯来有效地制造氯吡格雷(cl叩idgrd:(S)-2(2-氯苯基)-2-(4，5,6,7-四氢噻吩并[3,2-。]-5-吡啶基)乙酸甲酉旨)的方法(曰本特开2001-519353号公报)，氯吡格雷在作为血小板凝聚抑制剂和抗血栓剂的有用性方面被赋予了较大的期望。该方法包括对(R)-2-氯苯乙醇酸甲酯的(x-经基进行磺酰化，并使其与4,5,6,7-四氢噻吩并[3，2-c]-5-吡啶反应的步骤。作为光学活性a-羟基羧酸或其酯的制造方法，已知有使用光学活性苏型l-(对硝基苯基)-2-氨基-l，3-丙二醇或光学活性赖氨酸经非对映异构体盐来光学分离2-氯苯乙醇酸外消旋混合物从而制造光学活性2-氯苯乙醇酸的方法(日本特开2004-530717号公报)。但是，该方法存在必须使用价格高的试剂作为用于光学分离的分离剂的缺点。此外，还提出了使用羟基腈裂解酶，由2-氯苯甲醛和氰化剂(cyanidedoner,氰化氢等)来制造光学活性氰醇(2-氯苯乙醇腈)的方法，在该方法中，通过水解由该光学活性氰醇得到光学活性2-氯苯乙醇酸(日本特开2004-57005号公报)。还提出了对由2-氯苯甲醛和氰化剂(氰化氢等)得到的氰醇(2-氯苯乙醇腈)进行不对称水解来得到光学活性2-氯苯乙醇酸的方法(日本特开平4-99496号公报)。但是，这些方法使用的氰化剂(氰化氢等)具有在处理上伴有危险性的缺点。还提出了使用对苯乙醛酸衍生物具有对a位羰基进行立体选择性还原的能力的微生物，得到光学活性的苯乙醇酸衍生物的方法(日本特开2003-199595号公报和日本特开2004-49028号公报)。但是，用作原料的ot酮酸(苯乙醛酸衍生物)的价格高，还需要辅酶的再生系统，所以该方法存在制造成本高的缺点。另外，还提出了一种方法，其中，对苯乙醇酸衍生物进行立体选择性氧化，使具有生成a羰基化物能力的微生物作用于苯乙醇酸衍生物的外消旋混合物，取出未反应物，得到光学纯度高的苯乙醇酸衍生物(日本特开平6-165695号公报)。但是，该方法存在a羰基化物和a羟基物的分离复杂，有时分离本身就困难的缺点。此外，作为涉及以(x-芳基-(x-羟基酸酯的酶的水解为特征的光学活性体的制法的技术，已知有日本特开平2-53497号公报和日本特开平2-156892号公报记载的方法，但这些专利公报所具体公开的实施例仅限于使用苯乙醇酸的方法，存在有用性低的问题。另外，CanadianJournalofChemistry,68(2)，p.314，1990中公开了对具冇各种取代基的a-芳基-a--好基酸酯进行酶水解的方法，但所使用的酶限于碳酸脱水酶，生成物的光学纯度仅为4050。/。ee左右，选择性低，所以该方法存在有用性低的问题。专利文献l:日本特开2001-519353号公报专利文献2:日本特开2004-530717号公报专利文献3:日本特开2004-57005号公报专利文献4:日本特开平4-99496号公报专利文献5:日本特开2003-199595号公报专利文献6:日本特开2004-49028号公报专利文献7:日本特开平6-165695号公报专利文献8:日本特开平2-53497号公报专利文献9:日本特开平2-156892号公报非专利文献1:CanadianJournalofChemistry,68(2),p.314,1990
发明内容本发明的课题在于提供光学活性a-羟基羧酸或光学活性a-羟基羧酸酯的有效制造方法。更具体地说，本发明的课题在于提供使用微生物由cx-羟基羧酸酯的外消旋混合物有效地制造光学活性a-羟基羧酸或光学活性a-羟基羧酸酯的方法。本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，若使用属于特定属的微生物或其提取物等对(x-羟基羧酸酯的外消旋混合物进行水解，则酯的水解是立体选择性地进行的，并且发现利用该水解反应能够非常有效地制造光学活性(x-羟基羧酸或光学活性羟基羧酸酯。本发明是基于上述认识完成的。艮口，本发明提供下述的通式(I)所示的化合物的制造方法，(式(I)中，A表示5元或6元的环状化合物的残基，该环状化合物选自芳香族化合物、部分饱和环状化合物或饱和环状化合物，成环原子可以具有1个以上的杂原子，环上可以具有取代基(该取代基是选自由卤原子、可以具有取代基的碳原子数为14的烷基、可以具有取代基的碳原子数为14的烷氧基以及可以被保护基所保护的羟基、可以被保护基所保护的氨基、硝基组成的组中的1或2个以上的取代基，在存在有2个以上的取代基的情况下，这些取代基相同或不同，并且在存在有2个以上的取代基的情况下，这些取代基可以键合形成环)，X表示氢原子或碳原子数为14的烷基，f表示具有S型或R型中的任意立体构型的碳原子)，其中，所述方法包括利用选自由属于下述属的微生物组成的组中的微生物的菌体或者培养物、其处理物或其提取物对下述通式(n)所示的化合物进行处理的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage113</formula>(II)(通式(n)中，A和X与上述的定义相同，R表示碳原子数为l4的烷基(该垸基可以被芳基所取代)，但是，从**所表示的碳原子方面出发，通式(II)所示的化合物为非光学纯)，所述属包括赖氏细菌(Ldfsonia)属、柱孢(Cylindrocarpon)属、轮枝孢(Verticillium)属、分枝杆菌(Mycobacterium)属、红球菌(Rhodococcus)属、外瓶霉(Exophiala)属、红酵母(Rhodotorula)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、短波单胞菌(Brevundimonas)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、根瘤菌(Rhizobium)属、曲霉(Aspergillus)属、白j畺菌(Beauveria)属、青霉菌(Penicillium)属、i若卡氏菌(Nocardia)属、-戈登氏—菌—(Gordonia)属、卩彖丰支包(Rhinocladiella)属、丰支氯-霉(Ramichloridium)属以及产卟啉杆菌(Porphyrobacter)属。根据上述发明的优选方式，提供其中A是氯苯基、R是碳原子数为14的垸基或苄基、X是氢原子的上述方法。另外，根据本发明的另一个优选方式，提供包括对通式(II)所示的化合物中"所表示的碳原子是R构型的化合物的酯基进行水解来得到通式(1)所示的化合物中*所表示的碳原子是R构型的化合物的步骤的上述方法。另外，根据本发明进一步优选的其它方式，提供包括对通式(n)所示的化合物中"所表示的碳原子是S构型的化合物的酯基进行水解来得到通式(I)所示的化合物'f^所表小的碳原子是S构型的化合物的步骤的上述方法。从另一个角度出发，本发明提供下述通式(III)所示的化合物的制造方法，其中，所述方法包括利用选自由属于下述属的微生物组成的组中的微生物的菌体或者培养物、其处理物或其提取物对上述通式(II)所示的化合物进行处理从而对通式(n)(式(n)中，a、r、x以及"与上述定义相同)所示的化合物中**所表示的碳原子是S构型或R构型的化合物的酯基进行水解并分离反应液中残留的光学纯的未反应酯化合物的步骤，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(式(III)中，A、R、X以及+与上述定义相同)，所述属包括赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属、红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、喙枝孢属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属。根据上述发明的优选方式，提供其中A是氯苯基、R是碳原子数为14的烷基或苄基、X是氢原子的上述方法。具体实施方式通式(I)所示的化合物中，A表示5元或6元的环状化合物的残基。所谓残基是指将键合在环状化合物的成环原子上的氢除去一个所得到的l价基团。该环状化合物可以是芳香族化合物、部分饱和环状化合物、或者饱和环状化合物中的任一个，成环原子可以具有1个以上的杂原子。对杂原子的种类没有特别的限制，例如可以使用氮原子、氧原子或者硫原子等，在存在有2个以上的成环杂原子的情况下，这些杂原子相同或不同。作为环状化合物，更具体地说，可以举出苯；5元或6元的芳香族杂环化合物(例如呋喃、噻吩、吡啶、嘧啶等)；5元或6元的脂肪族环状化合物(例如环戊烷、环己烷、环己烯等)或者5元或6元的杂环化合物(例如吡咯垸、哌啶、哌嗪、吗啉、二氢呋喃、四氢呋喃等)等。这些之中，环状化合物优选为苯。环状化合物可以具有取代基，该取代基是选自由卤原子、可以具有取代基的碳原子数为14的烷基、卩了以具有取代基的碳原子数为14的烷氧基以及可以被保护基所保护的羟基、可以被保护基所保护的氨基、硝基组成的组中的1或2个以上的取代基。环状化合物具有取代基的情况下，对取代基的个数和取代位置没有特别限定。具有2个以上的取代基的情况下，这些取代基相同或不同。上述烷基或烷氧基具有取代基的情况下，对取代基的种类、个数以及取代位置没有特别限定，具有2个以上的取代基的情况下，这些取代基可以相同或不同。作为上述烷基或烷氧基的取代基，可以举出例如羟基、卤原子或者氨基等，但不限于这些。环状化合物具有2个以上的取代基的情况下，这些取代基可以相互键合而构成环。这种情况下，环结构可以为芳香族、部分饱和或者完全饱和的任一情况。例如，可以举出2个烷基键合形成碳环的情况、l个垸氧基与羟基键合形成二氧化亚烷基的环结构的情况等，但不限于这些。作为保护基，可以举出例如ProtectiveGroupsinOrganicChemistry(J.F.W.McOmieetal.,PlenumPress;ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,Edition(TheodoraW.Green，PeterG.M.Wuts，JohnWily&Sons,Inc.(ISBNO-471-16019-9),April1999)中记载的保护基，具体地说，可以举出甲基、乙基、异丙基、叔丁基、甲氧基甲基、苄氧基甲基、甲氧基乙氧基甲基、甲硫基甲基、苯硫基甲基、四氢吡喃基、对溴苯甲酰FP基、烯丙基、环己基等醚型保护基；苄基、2，6-二甲基苄基、4-甲氧基苄基、2,6-二氯苄基、9-蒽甲基、二苯基甲基、苯乙基、三苯基甲基等苄基型保护基；三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、二甲基乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基等甲硅烷基型保护基；乙酰基、氯乙酰基、三氟乙酰基、新戊酰基等酰基型保护基；苯甲酰基、对甲基苯甲酰基、对氯苯甲酰基、邻氯苯甲酰基、对硝基苯甲酰基等芳酰基型保护基；甲氧基羰基、乙氧基羰基、叔丁氧基羰基、苄氧基羰基、对甲基苄氧基羰基等碳酸酯型保护基；二甲基膦基、二乙基膦基等次膦酸酯型保护基；甲烷磺酰基、乙垸磺酰基、氯甲烷磺酰基、氯乙烷磺酰基、三氯甲垸磺酰基、三氟甲烷基磺酰基、苯磺酰基、对甲苯磺酰基、邻硝基苯磺酰基、间硝基苯磺酰基、对硝基苯磺酰基、邻氯苯磺酰基、间氯苯磺酰基、对氯苯磺酰基等磺酰基型保护基等。通式(i)、(n)以及(ni)所示的化合物中，X表示碳原T数为14的烷基。该烷基可以是直链状，也可以是支链状。通式(II)所示的化合物中，R表示碳原子数为14的烷基。该垸基可以被1个或2个以上的芳基所取代，作为芳基，优选苯基等。作为该烷基被苯基等芳基所取代的情况的例子，可以举出苄基、二苯甲基、苯乙基等。本发明的方法是上述通式(i)所示的化合物的制造方法，其特征在于，所述方法包括将上述通式(ii)所示的化合物用属于下述属的微生物的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物进行处理的步骤。通式(i)中，*表示具有S型或R型中的任意立体构型的碳原子，从该不对称碳原子方面出发，通式(i)所示的化合物实质上为光学纯的化合物。通式(i)所示的化合物具有其他的不对称碳原子的情况下，对其立体构型没有特别限定。另外，通式(n)所示的化合物中，**表示从该碳原子出发，通式(n)所示的化合物实质上为非光学纯。例如，可以使用该碳原子为s型和该碳原子为r型的任意比例的混合物或外消旋体等。本发明的方法中所使用的微生物是属于下述属的微生物赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属、红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、喙枝孢属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属。作为本发明的方法所用的微生物，更具体地说，可以举出水生雷弗森菌(Ldfsoniaaquatica)、柱孢菌(Cylindrocarponsp.)、细杆轮枝孢菌(Verticilli匿leptobactmm)、耳止堀分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)、牛匕牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)、马红球菌(Rhodococcusequi)、香豌豆带化红球菌(Rhodococcusfascians)、拉提斯拉韦红球菌(Rhodococcuswmtislaviensis)、顿氏夕卜并瓦霄(Exophialajeanselmei)、皮炎外瓶霉(Exophialadermatitidis)、橙红酵母(Rhodotomlaaumntiaca)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、梭形芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、缺陷短波单胞菌(Brevundimonasdiminuta)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、方夂射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)、赭曲霉(Aspergillusochraceus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、小朿IJ青霉菌(Penicilliumspinulosum)、星形诺卡氏菌(Nocardiaasteroides)、小球诺卡氏菌(Nocardiagloberula)、分支戈登氏菌(Gordoniabronchialis)、痰液戈登氏菌(Gordoniasputi)、红核戈登氏菌(Gordoniarubripertincta)、红球菌(Rhodococcussp.)、玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)、红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)、爱丽丝喙枝孢(Rhinocladiellaellisii)、暗绿喙枝孢(Rhinocladiellaatrovirens)、剑形枝氯霉(Ramichloridiumanceps)以及血素产卩卜啉杆菌(Porphyrobactersanguineus)等，但并不限于这些。作为上述方法的优选方式之一，可以举出包括对上述通式(II)所示的化合物中**所表示的碳原子是R构型的化合物的酯基进行水解并分离提纯上述通式(1)所示的化合物中*所表示的碳原子是R构型的化合物的步骤的方法。该方式中，作为微生物，可以使用例如属于下述属的微生物赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属以及喙枝孢属。作为属于这些属的微生物，更具体地说，可以举出下述的微生物，但不限于这些。水生雷弗森菌、柱孢菌、细杆轮枝孢菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、马红球菌、香豌豆带化红球菌、拉提斯拉韦红球菌、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、爱丽丝喙枝孢以及暗绿喙枝孢。此外，作为上述方法的其他优选方式，可以举出包括对上述通式(n)所示的化合物中**所表示的碳原子是s构型的化合物的酯基进行水解来得到上述通式(I)所示的化合物中a所表示的碳原子是S构型的化合物的歩骤的方法。该方式中，作为微生物，可以使用例属于如—F述属的微生物红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、红球菌属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属。作为属于这些属的微生物，更具体地说，可以举出下述的微生物，但不限于这些。橙红酵母、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、绿脓假单胞菌、放射型根瘤菌、赭曲霉、米曲霉、球孢白僵菌、小刺青霉菌、星形诺卡氏菌、小球诺卡氏菌、分支戈登氏菌、痰液戈登氏菌、红核戈登氏菌、红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌、剑形枝氯霉以及血素产卟啉杆菌。从另一个角度出发所提供的本发明的方法是上述通式(ni)所示的化合物的制造方法，其特征在于，所述方法包括将上述通式(n)所示的化合物用属于下述属的微生物的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物进行处理，对通式(II)所示的化合物中"所表示的碳原子是S构型或R构型的化合物的酯基进行水解，分离反应液中残留的光学纯的未反应酯化合物的步骤。该方法中，可以使用属于下述属的微生物赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属、红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、喙枝孢属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属。作为该方法的优选方式之一，其包括对通式(II)所示的化合物中"所表不的碳原子是R构型的化合物的酯基进行水解的步骤。该优选方式中，可以使用属于下述属的微生物赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属以及喙枝孢属。作为属于这些属的微生物，更具体地说，可以举出下述的微生物，但不限于这些。水生雷弗森菌、柱孢菌、细杆轮枝孢菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、马红球菌、香豌豆带化红球菌、拉提斯拉韦红球菌、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、爱丽丝喙枝孢以及暗绿喙枝孢。此外，该方法的优选方式中，包括对通式(11)所示的化合物中**所表示的碳原子是S构型的化合物的酯基进行水解的步骤。该优选方式中，可以使用属于下述属的微生物红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、红球菌属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属。作为属于这些属的微生物，更具体地说，可以举出下述的微生物，但不限于这些。橙红酵母、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、绿脓假单胞菌、放射型根瘤菌、赭曲霉、米曲霉、球孢白僵菌、小剌青霉菌、星形诺-氏菌、小球诺卡氏菌、分支戈登氏菌、痰液戈登氏菌、红核戈登氏菌、红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌、剑形枝氯霉以及血素产卟啉杆菌。不过，上述的微生物是为了举例而给出的，对于属于同一属的2种微生物株，有时在上述水解反应中表现出相反的立体选择性。根据本说明书的实施例具体所示的方法，本领域技术人员可以容易地辨认出作为水解的产物的通式(i)所示的化合物是否具有所期望的立体构型或者是否具有与所期望的立体构型相反的立体构型，能够容易地判定所使用的微生物株是具有哪种立体选择性的微生物。使用具有后者的立体选择性的微生物的情况下，如上述说明的那样，可以从反应液中分离、提纯未反应的原料化合物，进行水解反应，来得到具有所期望的立体构型的通式(i)化合物。另外，通过使用具有这样的选择性的微生物，可以由通式(in)所示的酯化合物中仅对具有与所期望的立体构型相反的立体构型的酯进行立体选择性水解，从反应液中分离、提纯未反应的原料化合物，通过进一步进行水解反应，来得到具有所期望的立体构型的通式(in)的酯化合'具有与所期望的立体构型相反的立体构型的通式(i)化合物经酯化而得到的化合物、或者具有与所期望的立体构型相反的立体构型的通式(m)化合物可以通过通常的方法转换成非光学纯的通式(ni)化合物。例如，在溶液中，通过在强碱性物质的存在下进行加热，可以使其外消旋化。通过将如此得到的非光学纯的通式(ni)化合物用于与上述相同的微生物反应，可以无需废弃具有与所期望的立体构型相反的立体构型的化合物而将其再次利用。本发明的方法所使用的上述的微生物可以是野生株、变异株、或利用细胞融合等细胞工程的方法或者dna克隆、基因操作等基因工程的方法诱导产生的重组株等。这些微生物可以由各种微生物保藏机构得到。例如，可以由东京大学应用微生物研究所(iam)、独立行政法人制品评价技术基础机构(nbrc)(原名称财团法人发酵研究所(ifo))、独立行政法人理化学研究所(jcm)等获得。本发明的方法中，可以使用上述的微生物的菌体。作为菌体，可以举出由培养液收取上述微生物而得到的菌体、或者由培养液集菌后进行清洗而得到的菌体、经干燥或丙酮粉体处理而得到的菌体等，这些中任意的菌体均可优选使用。另外，还可以利用适当的方法对菌体固定化后进行使用。固定化可通过本领域技术人员公知的方法(例如交联法、物理吸附法、包埋法等)来进行。作为固定化载体，只要是通常使用的载体，则均可以使用，例如可以举出纤维素、琼脂糖、葡聚糖、K-角叉菜胶、藻酸、明胶、醋酸纤维素等多糖类；例如谷蛋白等天然高分子；例如活性炭、玻璃、白土、高岭土、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙等无机物；例如聚丙烯酰胺、聚醋酸乙烯酯、聚丙二醇、聚氨酯等合成吸附剂等。菌体还可以以封入微囊中的形式使用。当然，菌体的使用方式并不限于上述方式，本领域技术人员可从本领域可利用的方法中适当选择使用。本发明的方法中，还可以使用上述的微生物的培养物。作为培养物，可以举出利用适当的培养基对上述微生物进行培养而得到的培养物。另外，本发明的方法中，可以使用上述的微生物的处理物或提取物。作为处理物，可以使用菌体或培养物自身消化的消化物(根据需要使菌体或培养物悬浮于缓冲液中)、菌体或培养物经研钵、珠磨机(DYNO-MILL)、法式压滤壶、超声波、匀化器等物理的方法破碎得到的破碎物、或者菌体或培养物经组合溶菌酶等酶的方法进行破碎而得到的破碎物等。另外，作为提取物，除了利用水或者适当的缓冲液由菌体或者培养物或这些的处理物进行提取而得到的提取液之外，还可以举出下述物质利用硫酸铵进行盐析而从该提取液中得到的沉淀物、利用醇等由该提取物中得到的沉淀物、以及采用下述方法对该提取液或该沉淀物进行提纯而得到的物质，例如可以举出含有酶的提取物等，所述方法为利用交联葡聚糖等的凝胶过滤；使用带有丁基、辛基、苯基等疏水性基团的载体等的疏水层析法；使用带有二乙基氨基乙基或羧基甲基的载体等的离子交换层析法；色素凝胶层析法、电泳、透析、超滤、亲和层析法、高速液相色谱法等。本说明书中所用的"提取物"这一术语有必要被最广义地解释为包括酶溶液、分离和/或提纯的酶等的含义。作为酶，具体地说，可以采用脂肪酶、(x-淀粉酶、酰基转移酶等。作为这些酶，可以使用来自上述微生物的提纯酶(例如市售的酶)。对于上述微生物的培养中的各种条件没有特别限制，可以适当选择适合微生物的培养的通常的培养条件。对于培养基的种类也没有特别限定，可以适当选择分别适合细菌、真菌或者酵母的培养基。作为培养基，通常可以使用含有碳源、氮源及其他营养素的液体培养基。培养基的碳源只要为上述微生物可利用的碳源即可，对其种类没有特别限定，可以使用任意的碳源。更具体地说，作为碳源，可以举出具有同化作用的碳源，例如可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糊精、淀粉、山梨糖醇等糖类;甲醇、乙醇、甘油等醇类；富马酸、柠檬酸、醋酸、丙酸等有机酸类及其盐类；烷烃等烃类；糖蜜；或者这些的混合物等。作为氮源，只要是上述微生物可利用的氮源即可，对其种类没有特别限定，可以使用任意的氮源。具体地说，可以举出具有同化作用的氮源，例如可以使用氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵等无机酸的铵盐；富马酸铵、柠檬酸铵等有机酸的铵盐；硝酸钠、硝酸钾等硝酸盐；肉汁、酵母浸膏、麦芽浸膏、蛋白胨、玉米浆、大豆蛋白水解物等无机或有机含氮化合物；或者这些的混合物等。另外，培养基中可以适当添加磷酸钾、硫酸铁、硫酸锌、硫酸锰等无机物；微量金属盐、维生素类等通常用于培养的营养源。根据需要，还可以在培养基中添加诱发微生物活性的物质、有效保持培养基的pH的缓冲物质、消泡剂、硅、ADEKANOL(为一类增稠剂)、普卢兰尼克(pluronic)等。微生物的培养可以在适合各个微生物的生长的条件下进行，对于-这种条件，本领域技术人员可适当选择。例如，可以在培养基的pH为310、优选49，温度05(TC、优选204(TC的条件下进行培养。微生物的培养可以对应各个微生物的性质在好氧或厌氧的条件下进行。培养时间为1300小时，优选为10150小时，可根据各个微生物来适当确定。本发明的方法中，对将通式(II)所示的化合物用上述微生物的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物进行处理的条件没有特别限定，只要上述的化合物与菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物充分接触结果使得酯部位进行水解反应即可，可以选择任意的条件。例如，只需在通式(n)所示的化合物的溶液中混合经缓冲液或水等清洗的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物即可。上述的步骤可以在水性的均一系中进行，或者在实质不溶于水或难溶于水的有机溶剂和水的二相系中进行，通常优选在水性的均一系中进行。作为形成水性的均一系的溶剂，可以仅以水作溶剂，也可以使用与水混和的适当的有机溶剂例如乙醇、甲醇、二氧六环、二甲亚砜等和水的混合物D可以将通式(II)所示的化合物溶解到上述的有机溶剂中，将所得到的溶液添加到含有上述微生物的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物的水溶液或水中悬浮液中后进行使用。此外，作为该微生物和提取物，可以是根据需要对菌体或培养物进行了热处理的热处理物、或者对该热处理物进一步实施了1种或2种以上的适当处理的处理物等。热处理可通过本领域可利用的任意方法进行，热处理条件可结合目的来通过实验等适当决定。作为热处理的温度，可以举出例如约37。C以上的温度，优选约4070。C，更优选约4560。C。热处理的时间可根据处理温度适当选择，例如约5分钟约24小时，优选约30分钟10小时，更优选约1小时5小时。代表性的热处理包括在例如约45"C、约50'C、或者约55。C左右的温度处理约24小时的步骤，更优选包括在约4555。C处理约3小时左右的步骤。通过使用经热处理的菌体或培养物，有时能够得到包括选择性、转化率等在内的良好结果。处理条件只要是能进行酯的不对称水解反应的条件，则没有特别限定。对于作为干燥菌体的菌体的用量、或者使用提取物等的情况下的使用添加量没有特别的限制，例如为通式(II)所示化合物的百分之一1000倍、优选十分之一100倍左右。另外，作为基质的通式(II)所示的化合物的浓度为反应体系总重量的0.0120重量％，优选0.110重量％。另外，反应液的pH为49，优选58，反应温度为1050°C，优选2040°C。还可以使用缓冲液来稳定pH。作为缓冲液，可以使用磷酸缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液等。另外，为了调整pH，也可以使用酸、碱进行调整。另外，反应时间为1小时200小时，优选5小时150小时，可根据各个微生物适当选择。根据需要，也可以将基质和/或微生物的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物一次性添加、逐次添加或连续添加至反应体系内。还可以连续取出作为生成物的水解物同时提高反应速度。由反应得到的通式(i)所示的光学活性a-羟基羧酸或通式(in)所示的光学活性(X-羟基羧酸酯可通过常用的分离提纯方法进行分离提纯。例如，根据需要从反应液分离菌体后，可以利用膜分离、有机溶剂(例如甲苯、三氯甲烷等)提取、柱色谱、减压浓缩、蒸馏、晶析、重结晶等通常的提纯方法对培养物进行提纯，来得到通式(I)所示的光学活性(x-羟基羧酸或通式(m)所示的光学活性(x-羟基羧酸酯。另外，例如，反应结束后，可以利用乙酸丁酯、乙酸乙酯、甲苯、三氯甲烷等有机溶剂从反应液提取生成物，蒸馏除去溶剂，来得到粗生成物，根据需要，可通过硅胶层析法、重结晶(正己烷、乙酸乙酯等)、减压蒸馏等对该粗生成物进行提纯。此外，通过进行不对称水解反应，反应液中除了存在通式(I)所示的光学活性(x-羟基羧酸之外，还存在没有被水解的残存在反应液中的光学纯的未反应酯化合物(光学活性(x-羟基羧酸酯)。在对该光学活性ot-羟基羧酸酯进行分离提纯后，对酯基进行水解，由此可以制造出通式(I)所示的光学活性(x-羟基羧酸。作为水解中使用的酸或碱，只要是在常规反应中作为酸或碱使用的物质，则没有特别限制，可以举出例如盐酸、硫酸等无机酸类；氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、氢化钠、氢化锂或者氨水等碱，可以优选使用氢氧化钠或氢氧化钾等。利用碱进行水解时，优选选择适当的条件，以使通式(I)所示的化合物不产生立体反转。作为用于水解的反应溶剂，只要该溶剂不妨碍反应的进行，并且能充分溶解原料，则没有特别限制，可以举出例如醇类(甲醇、乙醇等)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMAc)、二乙醚、四氢呋喃、二氧六环、水、丙酮或者这些的混合物等，优选使用醇类、水或者这些的混合物。反应温度通常为-2015(TC，优选为1030°C。反应时间根据所使用的原料、溶剂、反应温度等的不同而不同，但通常为5分钟36小时，优选为10分钟16小时。基质可以利用常规方法由低成本供给的非光学纯的ot-羟基羧酸和醇进行制造。实施例下文通过实施例更具体地说明本发明，但本发明的范围并不受这些实施例的限制。实施例1利用5mL含有P/。葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。在该菌体中添加适量的水、50pL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg(20Q/。乙醇溶液50nL)外消旋体2-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取1mL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,Inertsil0DS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.92mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-2-氯苯乙醇酸。将上述微生物换成表1所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示结果。[表1]<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。在其中添加适量的水、50pL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg(20。/c乙醇溶液50^iL)外消旋体2-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取1mL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.71mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-2-氯苯乙醇酸。将上述微生物换成表2所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。[表2]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例3利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25t:对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。在其中添加适量的水、50(iL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg(20。/。乙醇溶液50)iL)外消旋体2-氯苯乙醇酸甲酉旨，混合后，取1mL的反应液，在3(TC振荡反应72小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,Inertsil0DS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到残留了5.04mg/mL未反应的2-氯苯乙醇酸甲酯。为了确认残存物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(CHIRALCELOJDAICEL社制造，直径4.6mm，长度250mm，洗脱液正己烷/IPA-9/1，流速L0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-2-氯苯乙醇酸甲酯。将上述微生物换成表3所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。[表3J<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25T:对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。在其中添加适量的水、50i^L1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg(20%乙醇溶液50pL)外消旋体2-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取1mL的反应液，在3(TC振荡反应72小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到残留了4.27mg/mL未反应的2-氯苯乙醇酸甲酯。为了确认残存物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(CHIRALCELOJDAICEL社制造，直径4,6mm，长度250mm，洗脱液正己烷/IPA-9/1，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确汄到生成物为(S)-2-氯苯乙醇酸甲酯。将上述微生物换成表4所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。[表4]<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>实施例5-1利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25i:对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。在该菌体中添加适量的水、50|iL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体4-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液，pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了2.25mg/mL的4-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-4-氯苯乙醇酸。[表5]OHOH一rr^Ar。HCIJ0CI"0菌名菌编号生成量绝对构型光学纯度属种机构No.(mg/mL)(%e.e.)外瓶霉皮炎外瓶霉NBRC81932.25R64.6实施例5-2利用5mL含有l。/。葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50jiL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体4-三氟甲基苯乙醇酸甲酯，混合后，取lmL的反应液，在30。C振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液.-25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了2.62mg/mL的4-三氟甲基苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm,长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuSO4、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-4-三氟甲基-氯苯乙醇酸。[表6]OHOH菌名菌编号生成量(mg/mL)绝对构型光学纯度(%e.e,)属种机构No.外瓶霉皮炎外瓶霉NBRC81932.62R53.2实施例5-3利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25"C对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50)iL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体4-甲氧基苯乙醇酸甲酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了2.01mg/mL的4-甲氧基苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuSO4、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-4-甲氧基-苯乙醇酸。将上述菌株换成表7所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。[表7]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例5-4利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50(iL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体2-氯苯乙醇酸乙酯，混合后，取lmL的反应液，在30。C振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了2.03mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-2-氯苯乙醇酸。[表8]<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>实施例5-5利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25'C对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50(iL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体2-氯苯乙醇酸异丙酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.53mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-2-氯苯乙醇酸。将上述菌株换成表9所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>实施例5-6利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对皮炎外瓶霉NBRC8193振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50jliL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体2-氯苯乙醇酸苄酯，混合后，取lmL的反应液，在30。C振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速L0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.42mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-2-氯苯乙醇酸。将上述菌株换成表10所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表IO所示的结果。[表IO]ClOHACIOHUoWo菌名菌编号生成量(mg/mL)绝对构型光学纯度(%e.e.)属种机构No.外瓶霉皮炎外瓶霉NBRC81931.42R83.8柱孢柱孢菌NBRC318550.53R54.1实施例5-7利用含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于251:对甄氏外瓶霉NBRC6857振荡培养3天。培养后，离心分离0.28mL培养液，得到菌体。向其中加入适量的水、100|iL0.5M-MES缓冲液(pH6.5)、5mg外消旋体苯基乳酸甲酯，混合后，取0.5mL反应液，在3(TC振荡反应30分钟。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了0.11mg/mL的苯基乳酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MCI社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液卯％0.2mMCuS04、10%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-苯基乳酸。光学纯度为100%ee。[化4]H3C,》OH(R)苯基乳酸实施例5-8利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对甄氏外瓶霉NBRC6857振荡培养3天。离心分离0.28mL培养液，得到菌体。向其中加入适量的水、1(X)iiLlM-MES缓冲液(pH6.5)、5mg外消旋体4-氟苯乙醇酸甲酯，混合后，取0.5mL反应液，在30°C振荡反应30分钟。反应结束后，离心分离反应液，对上清进行HPLC分析(InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了0.19mg/mL的4-氟苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MCI社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液90%2mMCuSO4、10%乙腈，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-4-氟苯乙醇酸。光学纯度为77%ee。[化5](R)4-氟苯乙醇酸实施例5-9利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对甄氏外瓶霉NBRC6857振荡培养3天。通过对0.28mL培养液进行离心分离得到菌体。向其中加入适量的水、lOO(iL0.5M-MES缓冲液(pH6.5)、5mg3-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取0.5mL反应液，在30°C振荡反应30分钟。反应结束后，离心分离反应液，对上清进行HPLC分析(Inertsil0DS-3,直径4.6mm,长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了0.094mg/mL的3-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MCI社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液90%0.2mMCuS04、10%乙腈，流速l.OmL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(R)-3-氯苯乙醇酸。光学纯度为67.7%ee。h"hhohoo(R)3-氯苯乙醇酸实施例6-1利用5mL含有m葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50(xL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体4-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.46mg/mL的4-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-4-氯苯乙醇酸。[表ll]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage31</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>实施例6-2利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25r对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50nL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体4-三氟甲基苯乙醇酸甲酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.21mg/mL的4-三氟甲基苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuSO4、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-4-三氟甲基苯乙醇酸。表12OH<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>实施例6-3利用5mL含有l。/。葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25'C对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50(iL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体4-甲氧基苯乙醇酸甲酯，混合后，取lmL的反应液，在30。C振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,Inertsil0DS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.08mg/mL的4-甲氧基苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuSO4、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-4-甲氧基苯乙醇酸。[表13]h3co"oh3c0'菌名菌编号生成量(mg/mL)绝对构型光学纯度(%e.e.)属种机构No.根瘤菌放射型根瘤菌NBRC132631.08S43.1实施例6-4利用5mL含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25。C对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50pL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体2-氯苯乙醇酸乙酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.96mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-2-氯苯乙醇酸。[表14]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例6-5利用5mL含有"/。葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25i:对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50pL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体2-氯苯乙醇酸异丙酯，混合后，取lmL的反应液，在30。C振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.91mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，三菱化学社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuS04、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-2-氯苯乙醇酸。将上述菌株换成表15所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。[表15]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage33</formula><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>实施例6-6利用5mL含有l。/。葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25i:对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养6天。通过离心分离或过滤得到菌体。向其中加入适量的水、50pL1M-MES缓冲液(pH6.5)、10mg外消旋体2-氯苯乙醇酸苄酯，混合后，取lmL的反应液，在3(TC振荡反应20小时。反应结束后，对反应液进行离心分离或过滤，对上清进行HPLC分析(GLSciences,InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75。/。0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了1.62mg/mL的2-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MC1社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液85%0.2mMCuSO4、15%乙腈，流速2.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-2-氯苯乙醇酸。将上述菌株换成表16所示的微生物，与上述同样地进行反应，得到表中所示的结果。表16<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例6-7利用含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25°〇对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养3天。培养后，由9.1mL培养液进行离心分离得到菌体。向其中加入适量的水、lOO^L0.5M-MES缓冲液(pH6.5)、5mg苯基乳酸甲酯，混合后，取0.5mL反应液，在30。C振荡反应30分钟。对反应结束液进行离心分离，对上清进行HPLC分析(InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5,流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了0.15mg/mL的苯基乳酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MCI社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液90%2mMCuSO4、10%乙腈，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-苯基乳酸。光学纯度为55%eeH3C、/OH实施例6-8禾拥含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于25°C对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养3天。培养后，由9.1mL培养液进行离心分离得到菌体。向其中加入适量的水、100|iL0.5M-MES缓冲液(pH6.5)、5mg4-氟苯乙醇酸甲酯，混合后，取0.5mL反应液，在30°C振荡反应30分钟。对反应结束液进行离心分离，对上清进行HPLC分析(InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了0.22mg/mL的4-氟苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MCI社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液90%2mMCuSO4、10%乙腈，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-4-氟苯乙醇酸。光学纯度为100%ee。(S)-氟苯乙醇酸实施例6-9利用含有1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.3%酵母提取物的培养基于251:对放射型根瘤菌NBRC13263振荡培养3天。培养后，对9.1mL培养液进行离心分离，得到菌体。向其中加入适量的水、100pL0.5M-MES缓冲液(pH6.5)、5mg3-氯苯乙醇酸甲酯，混合后，取0.5mL，在3(TC振(S)-苯基乳酸荡反应30分钟。对反应结束液进行离心分离，对上清进行HPLC分析(InertsilODS-3，直径4.6mm，长度75mm，洗脱液25%乙腈、75%0.05M磷酸钠缓冲液、pH2.5，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成了0.23mg/mL的3-氯苯乙醇酸。为了确认生成物的光学纯度，对试样进行HPLC分析(GELPACKEDCOLUMNCRS10W，MCI社制造，直径4.6mm，长度50mm，洗脱液90%2mMCuSO4、10%乙腈，流速1.0mL/分钟，检测波长UV254nm)。结果确认到生成物为(S)-3-氯苯乙醇酸。光学纯度为76.9%ee。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage36</formula>(S)-3-氯苯乙醇酸产业上的可利用性根据本发明的方法，能够简便且低成本地制造光学纯度极高的光学活性ot-羟基羧酸或光学活性(x-羟基羧酸酯，因而本发明的方法在光学活性a-羟基羧酸或光学活性a-羟基羧酸酯的工业制造方面是有用的。使用由本发明的方法制造的光学活性a-羟基羧酸或其酯衍生物可以制造各种生理活性化合物。权利要求1、下述通式(I)所示的化合物的制造方法，式(I)中，A表示5元或6元的环状化合物的残基，该环状化合物选自芳香族化合物、部分饱和环状化合物或饱和环状化合物，成环原子可以具有1个以上的杂原子，环上可以具有取代基，该取代基是选自由卤原子、可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基、可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷氧基以及可以被保护基所保护的羟基、可以被保护基所保护的氨基、硝基组成的组中的1个或2个以上的取代基，在存在有2个以上的取代基的情况下，所述2个以上的取代基相同或不同，并且在存在有2个以上的取代基的情况下，所述2个以上的取代基可以键合形成环；X表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基；*表示具有S型或R型中的任意立体构型的碳原子；其中，所述方法包括利用选自由属于赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属、红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、喙枝孢属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属的微生物组成的组中的微生物的菌体或者培养物、其处理物或其提取物对下述通式(II)所示的化合物进行处理的步骤，通式(II)中，A和X与上述的定义相同，R表示碳原子数为1～4的烷基，该烷基可以被芳基所取代；从**所示的碳原子方面出发，通式(II)所示的化合物为非光学纯。2、如权利要求l所述的方法，其中，A是氯苯基，R是碳原子数为14的烷基或,基，X是氢原子。3、如权利要求l所述的方法，其中，A是邻氯苯基，R是甲基，X是氢原子。4、如权利要求13任意一项所述的方法，其中，所述微生物为选自由水生雷弗森菌、柱孢菌、细杆轮枝孢菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、马红球菌、香豌豆带化红球菌、拉提斯拉韦红球菌、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、橙红酵母、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、绿脓假单胞菌、放射型根瘤菌、赭曲霉、米曲霉、球孢白僵菌、小刺青霉菌、星形诺卡氏菌、小球诺卡氏菌、分支戈登氏菌、痰液戈登氏菌、红核戈登氏菌、红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌、爱丽丝喙枝孢、暗绿喙枝孢、剑形枝氯霉以及血素产卟啉杆菌组成的组中的微生物。5、如权利要求13任意一项所述的方法，其中，所述方法包括对通式(11)所示的化合物中**所表示的碳原子是11构型的化合物的酯基进行水解来得到通式(1)所示的化合物中*所表示的碳原子是R构型的化合物的步骤，所述微生物是选自由属于赖氏细菌属属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属以及喙枝孢属的微生物组成的组中的微生物。6、如权利要求5所述的方法，其中，所述微生物是选自由水生雷弗森菌、柱孢菌、细杆轮枝孢菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、马红球菌、香豌豆带化红球菌、拉提斯拉韦红球菌、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、爱丽丝喙枝孢以及暗绿喙枝孢组成的组中的微生物。7、如权利要求13任意一项所述的方法，其中，所述方法包括对通式(II)所示的化合物中"所表示的碳原子是S构型的化合物的酯基进行水解来得到通式(I)所示的化合物中+所表示的碳原子是S构型的化合物的步骤，所述微生物是选自由属于红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、红球菌属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属的微生物组成的组中的微生物。8、如权利要求7所述的方法，其中，所述微生物是选自由橙红酵母、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、绿脓假单胞菌、放射型根瘤菌、赭曲霉、米曲霉、球孢白僵菌、小刺青霉菌、星形诺卡氏菌、小球诺卡氏菌、分支戈登氏菌、痰液戈登氏菌、红核戈登氏菌、红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌、剑形枝氯霉以及血素产。卜啉杆菌组成的组中的微生物。9、下述通式(in)所示的化合物的制造方法，式(m)中，a、R、x以及+与上述定义相同，所述制造方法的特征在于，其包括利用选自由属于赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属、红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、喙枝孢属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属的微生物组成的组中的微生物的菌体或者培养物、或其处理物或者其提取物对上述通式(n)所示的化合物进行处理从而对通式(n)所示的化合物中**所表示的碳原子是s构型或r构型的化合物的酯基进行水解并分离反应液中残留的光学纯的未反应酯化合物的步骤。10、如权利要求9所述的方法，其中，A是氯苯基，R是碳原子数为14的烷基或苄基，X是氢原子。11、如权利要求9所述的方法，其中，A是邻氯苯基，r是屮基，X是氢原子。12、如权利要求911任意一项所述的方法，其中，微生物是选A由水生雷弗森菌、柱孢菌、细杆轮枝孢菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、马红球菌、香豌豆带化红球菌、拉提斯拉韦红球菌、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、橙红酵母、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、绿脓假单胞菌、放射型根瘤菌、赭曲霉、米曲霉、球孢白僵菌、小刺青霉菌、星形诺卡氏菌、小球诺卡氏菌、分支戈登氏菌、痰液戈登氏菌、红核戈登氏菌、红串红球菌、红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌、爱丽丝喙枝孢、暗绿喙枝孢、剑形枝氯霉以及血素产卟啉杆菌组成的组中的微生物。13、如权利要求911任意一项所述的方法，其中，所述方法包括对通式(II)所示的化合物中"所表示的碳原子是s构型的化合物的酯基进行水解的步骤，所述微生物是选自由属于红酵母属、芽孢杆菌属、短波单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、曲霉属、白僵菌属、青霉菌属、诺卡氏菌属、戈登氏菌属、红球菌属、枝氯霉属以及产卟啉杆菌属的微生物组成的组中的微生物。14、如权利要求13所述的方法，其中，所述微生物是选自由橙红酵母、蜡样芽孢杆菌、梭形芽孢杆菌、缺陷短波单胞菌、绿脓假单胞菌、放射型根瘤菌、赭曲霉、米曲霉、球孢白僵菌、小刺青霉菌、星形诺卡氏菌、小球诺卡氏菌、分支戈登氏菌、痰液戈登氏菌、红核戈登氏菌、红球菌、玫瑰色红球菌、红串红球菌、剑形枝氯霉以及血素产卟啉杆菌组成的组中的微生物。15、如权利要求911任意一项所述的方法，其中，所述方法包括对通式(II)所示的化合物中"所表示的碳原子是R构型的化合物的酯基进行水解的步骤，所述微生物是选自由属于赖氏细菌属、柱孢属、轮枝孢属、分枝杆菌属、红球菌属、外瓶霉属以及喙枝孢属的微生物组成的组中的微生物。16、如权利要求15所述的方法，其中，所述微生物是选自由水生雷弗森菌、柱孢菌、细杆轮枝孢菌、耻垢分枝杆菌、草分枝杆菌、牝牛分枝杆菌、马红球菌、香豌豆带化红球菌、拉提斯拉韦红球菌、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、爱丽丝喙枝孢以及暗绿喙枝孢组成的组中的微生物。17、氯吡格雷或其制造方法，其是使用由权利要求13或权利要求911任意---项所述的方法得到的光学活性化合物来制造的。全文摘要本发明涉及光学活性α-羟基羧酸的制造方法，所述光学活性α-羟基羧酸为右述的通式(I)所示的化合物，式(I)中，A表示5元或6元的环状化合物的残基，*表示具有S型或R型中的任意立体构型的碳原子，X表示氢原子或碳原子数为1～4的烷基，其中，所述方法包括将对应的酯化合物(非光学纯)用赖氏细菌属(Leifsonia)、柱孢属(Cylindrocarpon)、轮枝孢属(Verticillium)等的微生物的菌体或者培养物、其处理物或其提取物进行处理的步骤。文档编号C12P41/00GK101253271SQ200680031900公开日2008年8月27日申请日期2006年9月1日优先权日2005年9月2日发明者北伸二,坂本惠司,森井亮博申请人:第一精密化学株式会社