用于生产重组促性腺激素的无血清培养基的制作方法

专利名称：：用于生产重组促性腺激素的无血清培养基的制作方法用于生产重组促性腺激素的无血清培养基发明领域本发明属于重组蛋白制造领域。更具体说，本发明涉及含抗氧化剂的无血清培养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用途。所述抗氧化剂可选自L-谷胱苷肽、2-巯基乙醇、L-甲硫氨酸、及抗坏血酸和(+)-a-生育酚的组合。发明背景本发明涉及重组促卵泡激素(FSH)的生产。FSH属于促性腺激素类。可用FSH来治疗男性和女性患者的不育和生殖疾病。采用FSH诱导女性患者排卵(OI)和受控性超排卵(COH)，例如辅助生殖技术(ART)。在诱导排卵的典型治疗方案中，患者每日注射给予FSH或其衍生物(每日约75-300IU的RFSH),时间约为6-12天。在受控性超排卵的典型治疗方案中，患者每日注射给予FSH或其衍生物(每日约150-600IU的RFSH)，时间约为6-12天。还采用FSH诱导患有少精液症男性产生精子。采用每周3次150IU的FSH联合每周2次2500IUhCG的治疗方案己成功使患有低促性腺激素性性腺功能减退的男性精子数量得到提高。鉴于FSH在治疗生育疾病中的重要性，提供高稳定性和高比活性的FSH成为当务之需。FSH天然由脑垂体腺产生。为了药学应用，可用重组方法产生FSH(rFSH)或可从绝经期后的女性尿液中分离获得(uFSH)。制备rFSH的过程必然有二个主要步骤:培养基因工程改造的表达FSH的细胞，和纯化该蛋白质。然后将该蛋白与药物学上可接受的运载体一起配制而获得药物组合物。为了培养细胞，过去通常在培养基中添加作为所有哺乳动物细胞系生长和维持的通用营养物的血清。但是，潜伏期或培育期长的传染性牛神经变性疾病一牛海绵样脑病(BSE)的出现引起了监管方(regulatory)对生物学活性产品生产中使用动物来源血清的关注。因此，目前优先采用无血清培养基来生产重组蛋白。这种培养基为本领域内所熟知，已有多家公司有商品供应，例如Sigma(西格马)、BioWhittaker(百欧怀塔克)、GibcoBRL(吉比蔻)、Cambrex(凯布莱克司)和JRH。在贮藏rFSH时所遭遇的问题之一是存在FSH的氧化形式。为部分地解决这个问题，可在此药物组合物中添加抗氧化剂使FSH蛋白在将其给予需要治疗的患者之前稳定贮藏。例如，欧盟专禾UEP0853945(Skrabanja和VandenOetelaar,1998)描述了将含促性腺激素的液体制剂与稳定剂(例如，25-100mM的柠檬酸钠和l-10mM的L-甲硫氨酸)相混合的方法。已证明这种剂型使FSH制剂得以长期贮藏。专利WO92/15614(TakruriH,1992)也提及抑制液体或半液体药物组合物(例如贮存培养基或眼用水性溶液)中多肽氧化的方法。更具体说，WO92/15614显示含浓度10mg/L的L-甲硫氨酸的眼药水或眼用软膏能稳定人表皮生长因子。然而上述文献只公开了抗氧化剂在药物制剂中的应用，没有提及在培养基中的应用。也可在培养基中加入具有抗氧化活性的氨基酸和化合物，作为营养成分或可保护细胞系防止细胞死亡。例如美国专利N0.4,560,655公开了一种含浓度约30mg/L的L-甲硫氨酸的无血清培养基，可用这种培养基培养猪睾丸细胞、AG14骨髓瘤细胞和鼠脾细胞。专利WO95/12664描述了一种在特定细胞系中克服由于各种生长限制因子量不足所致危害的方法，这些生长限制因子之一为氨基酸甲硫氨酸。更具体说，W095/12664描述了一种使表达人M-CSF的CHOE5F3G细胞系适应细胞高密度生长的方法。在此法中，CHOE5F3G细胞在含有104mg/L的L-甲硫氨酸的培养基中生长(参见实施例和表2)。Yun等描述了在培养基中加入谷胱苷肽和铁螯合剂的组合能减少CHO细胞的细胞死亡(Yun等，2003)。Saito等也描述了培养基中可采用多种抗氧化剂以保护细胞系防止细胞死亡(Saito等，2003)。然而，WO95/12664、美国专利NO.4,560,655、Yun等和Saito等都没有提到氨基酸、谷胱苷肽和铁螯合剂对细胞系所产生的重组蛋白氧化状态的潜在影响(如果有任何影响的话)。总之，这些文献只公开了采用L-甲硫氨酸或谷胱苷肽与铁螯合剂组合来促进培养细胞的生长和/或活力。WO99/50390涉及用于由白细胞生产干扰素-ot的培养基，所述培养基含甲硫氨酸。HPLC证明了由于培养基中加入了甲硫氨酸，纯化后的干扰素-a蛋白质量得到提高。WO99/50390的发明人假定这种提高可能是由于减少了干扰素-a蛋白的氧化。WO99/50390还说明了甲硫氨酸用量太低导致效力降低，而用量太高可导致干扰素产率降低。具体说，WO99/50390教导了用白细胞生产干扰素-oc时，浓度范围约为50-100mg/L是特别优选的范围。另外，WO99/50390只考虑了生产单体蛋白质干扰素-a的培养基。WO99/503卯既没有提及也没有提出生产二聚体激素(例如只在二聚体化后才能分泌的FSH)的培养基(Matzuk等，综上所述，上述文献都没有涉及在无血清培养基中采用抗氧化剂来减少二聚体促性腺激素的氧化。发明概述本发明依据在制备rFSH过程中意外发现细胞培养上清液中出现氧化形式的rFSH。而且，用无血清培养基生产rFSH可导致比用含血清培养基生产rFSH更高水平的氧化形式。在本发明的框架中，我们惊奇地发现不仅可在贮藏过程中而且可在培养步骤中降低氧化形式rFSH水平。实现这种降低不会损害产量。可通过在培养基中加入抗氧化剂来实现这种降低。具体说，已发现在培养表达rFSH的细胞过程中在无血清培养基中添加(i)2-巯基乙醇、(ii)抗坏血酸和(+)-a-生育酚的组合，(iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-谷胱苷肽中的任一种可以降低氧化形式rFSH水平。因此，本发明第一方面涉及无血清培养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用途，其特征在于，所述培养基包含一种选自以下的抗氧化剂-浓度范围约l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-浓度范围约5-15mg/L的2-巯基乙醇；-浓度范围约200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-a-生育酚的组合。本发明第二方面涉及在重组二聚体促性腺激素的制备过程中减少氧化形式重组二聚体促性腺激素水平的方法，其特征在于，用含抗氧化剂的无血清培养基培养表达所述重组二聚体促性腺激素的细胞。本发明第三方面涉及一种用于生产重组二聚体促性腺激素的无血清培养基，其特征在于，所述培养基包含一种选自以下的抗氧化剂-浓度范围约l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-浓度范围约5-15mg/L的2-巯基乙醇；-浓度范围约200-500mg/L的L-甲硫氨酸；和-浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-a-生育酚的组合。发明详述本发明源自发现在含有抗氧化剂的无血清培养基中培养表达rFSH的细胞能显著减少氧化形式rFSH水平。如实施例3中所示，在培养过程中(i)2-巯基乙醇、(ii)抗坏血酸和(+)-a-生育酚的组合物，(iii)L-甲硫氨酸，或(iv)L-谷胱苷肽中的任何一种都特别有利于减少氧化形式的rFSH水平。重要的是实现这种减少并不损害细胞的活力和代谢，也不破坏rFSH的滴度。因此，本发明第一方面涉及无血清培养基在生产重组二聚体促性腺激素中的用途，其特征在于，所述培养基包括选自以下的抗氧化剂-浓度范围约l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-浓度范围约5-1511^/1^的2-巯基乙醇；-浓度范围约200-50011^1的1^甲硫氨酸；和-浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-ot-生育酚的组合。本发明的无血清培养基优选包含浓度范围约1、1.5、2-至约4、5、6、7、8、9、10、15或20mg/L的L-谷胱苷肽。此无血清培养基最优选包含浓度约2.5或3mg/L的L-谷胱苷肽。本文中的"谷胱苷肽"与"L-谷胱苷肽"可互换使用。本发明的无血清培养基优选包含浓度范围约5、6、7、8、9-至约11、12、13、14或15mg/L的2-巯基乙醇。此无血清培养基最优选包含浓度约10mg/L的2-巯基乙醇。本发明的无血清培养基优选包含浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-a-生育酚的组合。这种培养基更优选包含浓度范围约为5、8、10或12至约16、18、20、22或25mg/L的(+)-a-生育酚和浓度范围约为15、20或25至约35、40或45mg/L的抗坏血酸。这种无血清培养基最优选包含浓度约14mg/L的(+)-a-生育酚和浓度约30mg/L的抗坏血酸。本文中的"(+)-a-生育酚"可与"维生素A"互换使用，"抗坏血酸"可与"L-抗坏血酸"互换使用。本发明的无血清培养基优选包含浓度范围约200、205、210、215、220、225、230、235、240或245至约300、325、350、375、400、425、450、475或500mg/L的甲硫氨酸。此无血清培养基最优选包含浓度约250mg/L的L-甲硫氨酸。本文中，"甲硫氨酸"可以与"L-甲硫氨酸"互换使用。任何无血清培养基中都可以添加本发明的抗氧化剂。本发明可采用可购得的商品化无血清培养基，例如，SFM90(JRH,67350)、SFM90.1(JRH,67350)、Supmed3007或改良的Supmed300(JRH,67350)、DMEM(吉比蔻,Gibco,7490571)、DMEM/F12(吉比蔻,Gibco,99.5043)、SFMCHO3a(百欧怀塔克,BioWhittaker)、CHOPFM(西格马,Sigma,C6970)、ProCH05;EX-CELL培养基例如EX-CELL302(JRH,产品目录号14312-1000M)或EX-CELL325(JRH,产品目录号14335-1000M);CHO-CD3(西格马,Sigma,产品目录号:C-1490)、CHOIIIPFM(吉比蔻，Gibco,产品目录号96-0334SA)、CHO-S-SFMII(吉比蔻，Gibco，产品目录号12052-098)、CHO-DHFR(西格马,Sigma，产品目录号:C-8862)、ProCHO5(凯布莱克司,Cambrex,产品目录号:BE12-766Q)、SFM4CHO(海克隆，HyClone,产品目录号:SH30549.01)、UltraCHO(凯布莱克司,Cambrex,产品目录号12-724Q)、HyQPFCHO(海克隆,HyClone，产品目录号:SH30220.01)、HyQSFXCHO(海克隆,HyClone,产品目录号:SH30187.01)、HyQCDM4CHO(海克隆，HyClone,产品目录号:SH30558.01)、ISCHO-CD(欧文科学,IrvineScientific,产品目录号:#91119)、ISCHO-V(欧文科学,IrvineScientific,产品目录号:#9197)和它们的衍生物。SFM90、SFM90.1、S叩Med300、DMEM、DMEM/F12、SFMCHO3a和CHPPFM的组合物也可以用于本发明，见下表l中所示。表l:本发明框架内可使用的五种可购得商品化无血清培养基的组成<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在本发明的一优选实施方案中，此无血清培养基为化学成分明确的培养基，即以纯化的成分配制的培养基，因此知道其确切的成分组成。具体说，此化学成分明确的培养基既不含有动物源成分也不含有不明确的水解产物。可用本发明生产的促性腺激素包括促黄体生成素(LH;OMIM登录号152780)、促卵泡素(FSH;OMIM登录号136530)、绒毛膜促性腺激素，(CG;OMIM登录号118860)和促甲状腺激素(TSH;OMIM登录号188540)。促性腺激素是二聚体激素。这些激素中的每一种都是由a和P亚基构成的非共价二聚体。所有四种激素的a亚基相同(OMIM登录号118850)，而P亚基则决定了二聚体的内分泌功能(Talmadge等1983)。在本发明的最优选实施方案中，所述促性腺激素为人FSH。本说明书中所用术语"EM"指一种包含与SwissProt登录号P01215相对应的a亚基和与SwissProt登录号P01225相对应的P亚基组成的二聚体蛋白质。由于FSH是可溶性分泌蛋白，可通过其天然信号肽或通过异源信号肽(即源自另一种分泌蛋白的信号肽，其在所用的特定表达系统中可能更有效)而释放到细胞培养上清液中。术语"FSH"还包括由与SwissProt登录号P01215相对应的a亚基和与SwissProt登录号P01225相对应的3亚基构成的二聚体蛋白质的剪接变体、等位变体、突变体、功能衍生物、活性片段、融合蛋白和环状可取代蛋白(circularlypermutedprotein)。本说明书中所用术语"突变体"指天然FSH或病毒FSH中的一个或多个氨基酸被不同氨基酸所替换、或发生缺失，或在FSH的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基后产生的产物与野生FSH相比活性无显著改变的FSH类似物。可采用已知的合成和/或通过定点突变技术或任何其它适用于此的技术来制备这些突变蛋白。本发明的突变体包括由能在严紧条件下与编码FSH的DNA或RNA杂交的核酸(例如DNA或RNA)编码的蛋白质。术语"严紧条件"指本领域普通技术人员通常称为"严紧性"的那些杂交和随后的洗涤条件(参见，例如Ausubel等，分子生物学的当前亲i方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology)同上，Interscience,N.Y.，6.3禾n6.4巻，1987,1992)。不受限制，严紧性条件的实例包括洗涤条件为在低于计算的所研究杂交体Tm值12-20°C下，用例如2xSSC和0.5°/。SDS洗涤5分钟，用2xSSC禾fl0.1%SDS洗涤15分钟；在37°C用0.1xSSC和0.5%SDS洗涤30-60分钟，在68°C用0.1xSSC和0.5%SDS洗涤30-60分钟。本领域普通技术人员知道严紧性条件还取决于DNA序列、寡核苷酸探针(例如10-40碱基)或混合寡核苷酸探针的长度。如果采用混合探针，优选采用氯化四甲铵(TMAC)替代SSC。参见Ausubel，同上。在一个优选实施方案中，所述FSH突变蛋白与天然产生FSH的序列至少有40%的相同性。更优选其具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%的相同性，最优选至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的相同性。相同性是通过序列对比反映两条或多条多肽序列或两条或多条聚核苷酸序列之间的关系。一般说来，相同性指两条聚核苷酸或两条多肽序列分别就做比对的序列长度而言，精确的核苷酸与核苷酸，氨基酸与氨基酸的对应性。对于那些没有精确对应的序列，可检测其"相同性百分比"。一般说来，通过排列两条需对比的序列以获得序列之间的最大关联度。这可能包括要在一条或两条序列中插入"缺口缺口(gap)"以提高排列对齐程度。可检测要比较的各序列的全长(所谓"总体对比")相同性百分比，这尤其适合于长度相同或非常相似的序列，或较短而长度明确的序列(所谓"局部对比")，更适合于不等长的序列。在本发明的框架内，相同性百分比指检测要比较的各序列全长的相同性总体百分比。可采用已知的电脑程序来检测任何具体多肽是否与本发明的序列有一定百分比的相同性。这种计算机算法和程序包括例如有TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA禾PCLUSTALW(Altschul等，1990;Altschul等，1997;Higgins等，1996;Pearson和Lipman，1988;Thompson等，1994)。蛋白和核酸序列同源性优选用本领域众所周知的局部比对检索基础工具(BasicLocalAlignmentSearchTool("BLAST"))进行评价(Altschul等.，19卯；Altschul等.，1997;Karlin和Altschul,1990)。BLAST程序通过鉴定査询氨基或核酸序列与优选从蛋白质或核酸序列数据库获得的测试序列之间的相似区段(本文称为"高评分区段配对")来鉴定同源序列。高评分区段配对优选通过评分矩阵方法(即比对)来鉴定，这些方法中的许多为本领域所熟知。可采用的评分矩阵可以是BLOSUM62矩阵(Gonnet等，1992;Henikoff和Henikoff,1993)。也可采用PAM或PAM250矩阵(参见例如Schwartz和Dayhoff，编，(1978)检测距离相关性矩阵蛋白质序列和结构的图表集(MatricesforDetectingDistanceRelationships:AtlasofProteinSequenceandStructure)，Washington:NationalBiomedicalResearchFoundation)。可用BLAST程序评价所鉴定的所有高评分区段配对的统计学显著性，和优选那些能满足用户的特定显著性阈值，例如用户特定的同源性百分比的区段。优选用Karlin统计学显著性公式评价高评分区段配对的统计学显著性(Karlin和Altschul,1990)。可在BLAST程序中利用默认参数或用户提供的修改参数。优选的检测查询序列(本发明序列)与目标序列之间最佳全长匹配的方法也称为全序列比对法，可采用基于Brutlag算法的FASTDB电脑程序检测(Brutlag等，1990)。在序列比对中查询序列和目标序列皆为氨基酸序列。所述全长序列比对的结果为相同性百分比。在FASTDB氨基酸比对中所用的优选参数为矩阵二PAMO、k-元组(k-tuple^2、错配罚分=1、连接罚分=20、随机化群=25、长度=0、截取分数=1、窗口大小=序列长度、缺口罚分=5、缺口大小罚分=0.05、窗口大小=247或任何更短的目标氨基酸序列长度。如果目标序列因为N-或C-末端缺失而非内部缺失导致其比查询序列为短，由fFASTDB程序在计算总长相同性百分比时没有将目标序列N-和C-末端的截取计算在内，必须人工校正其相同性百分比结果。对于N-和C-末端截短的目标序列相对于查询序列，可通过计算查询序列与所对应目标序列的N-和C-末端不与对应的目标残基匹配/对齐的残基数，作为查询序列总碱基的百分数，以校正其相同性百分比。某一残基是否匹配/对齐取决于FASTDB序列比对的结果。然后从上述用特定参数的FASTDB程序计算出的相同性百分比中减去此百分数，从而获得最终百分比相同性评分。此最终百分比相同性评分即为用于本发明目的的评分。只有当目标序列的N-和C-末端残基不与查询序列匹配/对齐时，即只有当查询氨基酸残基超出目标序列最远端N-和C-末端残基时，才考虑人工调整此百分比相同性评分。例如，将一条90个氨基酸残基的目标序列与一条100个残基的査询序列作比对检测相同性百分比。因目标序列的N-末端有缺失，用FASTDB排列比对时N-末端的前几个残基不匹配/对齐。这样10个没配对的残基代表了此序列的10%(N-和C-末端没有配对的残基数/査询序列的残基总数)，故从FASTDB程序所计算出的相同性百分比评分中减去10%。如果其余90个残基完全匹配，那么最终相同性百分比为90%。本发明突变蛋白中的优选变异是称为"保守性"的替换。FSH的保守性氨基酸替换包括具有充分相似理化性质的同组中成员之间的同义氨基酸替换，因而可保留该分子的生物学功能(Grantham，1974)。已明确还可在上述序列中进行氨基酸的插入和缺失而不会改变其功能，尤其是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸，例如少于30个，优选少于IO个氨基酸，而不去除或替换对功能构象具有关键作用的氨基酸(例如半胱氨酸)时。通过这种插入和/或缺失所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围之内。术语FSH的"融合蛋白"指包含与其它(例如)能延长在体液内存留时间的蛋白相融合的FSH、FSH的突变体或片段的多肽。例如，FSH可与免疫球蛋白或其片段(例如免疫球蛋白Fc部分)融合。成熟FSH的序列也可与能增强分泌的信号肽和/或引导序列融合。在本发明的一个优选实施方案中，FSHP亚基或其片段与hCGe亚基的羧基-末端肽(CTP)融合。获得的蛋白在体外具有与FSH相同的受体结合和生物学活性，但循环半衰期更长(LaPolt等，1992)。在本发明中，FSH的"活性片段"或其突变蛋白，包括此蛋白分子本身多肽序列的任何片段或前体，或与缔合分子结合的或接连有(例如)糖或磷酸残基的此蛋fl，或此蛋白分子或糖基的自身聚集物，只要所述片段的活性与FSH充分相似。本说明书中所用的FSH"功能衍生物"包括FSH或其突变蛋白的衍生物，这些衍生物可通过本领域已知的方法利用氨基酸残基支链的功能基团或N-或C-末端基团来制备，只要它们仍是药物学上可接受的，即它们基本上不会破坏此蛋白质基本上类似于促性腺激素的活性，并且不会使包含它的组合物具有毒性，都包括在本发明范围内。这些衍生物例如可包含能遮蔽抗原位点和延长FSH在体液中存留时间的聚乙二醇支链。其它衍生物包括含羧基的脂肪族酯、通过与铵或伯胺或仲胺反应形成的羧基的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与乙酰部分(如垸酰基或碳环芳酰基)形成的N-乙酰衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与乙酰基部分形成的O-乙酰衍生物。在一优选实施方案中，对应于FSH分子的功能衍生物显示有额外的葡糖基化。本说明书中所用的术语"FSH的盐"指FSH的羧酸盐和氨基的酸加成盐。可用该领域已知方法形成的羧基的盐包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等；与有机碱，例如胺，如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等形成的盐。酸加成盐包括，例如与无机酸，如盐酸或硫酸形成的盐，与有机酸，如乙酸或草酸形成的盐。当然，任何这种盐都必须保留促性腺激素的生物学活性。本说明书中所用术语"重组二聚体促性腺激素"指培养经基因工程改造的细胞产生的促性腺激素。可用任何来源的细胞生产促性腺激素。表达二聚体促性腺激素的基因工程改造细胞能表达所述二聚体促性腺激素的二种亚基。本说明书中所用的术语"基因工程改造细胞"指通过导入外源DNA而能表达所需促性腺激素二种亚基的细胞。此外源DNA可包含编码所需促性腺激素的亚基的序列。或者，此外源DNA可包含能活化编码所需促性腺激素亚基的内源序列表达的序列(参见例如WO91/09955)。所述细胞可以是例如动物、昆虫或微生物来源。本说明书中所用术语"动物细胞"包括人和非人哺乳动物细胞、非哺乳动物细胞和杂交瘤细胞。能产生重组二聚体促性腺激素的哺乳动物细胞例子包括例如3T3细胞、COS细胞、人骨肉瘤细胞、MRC-5细胞、BHK细胞、VERO细胞、CHO细胞、rCHO-tPA细胞、rCHO-HepB表面抗原细胞、HEK293细胞、rHEK293细胞、rC127-HepB表面抗原细胞、正常人成纤维细胞、基底细胞、肝细胞、？￡11(6细胞和人永久性羊膜细胞。能产生重组二聚体促性腺激素的杂交瘤细胞例子包括例如DA4.4细胞、123A细胞、127A细胞、GAMMA细胞和67-9-B细胞。在本发明的框架内，优选培养中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。本发明的第二方面涉及降低制备过程中氧化形式重组二聚体促性腺激素水平的方法，其特征在于，用含抗氧化剂的无血清培养基培养表达所述重组二聚体促性腺激素的细胞。本说明书中所用术语"氧化形式(产物)"指因氧化剂导致其一个或多个氨基酸残基被氧化的多肽。可通过例如实施例2.1中所述的HPLC检测来检测此种FSH形式。所述培养可在任何合适的环境中进行，例如在陪替培养皿、T型瓶或转瓶中培养，但优选在具有较大体积的容器中例如生物反应器中培养。培养步骤包括以下几步一在所述无血清培养基中接种所述细胞，一生长期培养；和一生产期培养。生产期是细胞培养程序的一部分，在此期中设定程序参数以支持细胞生长。一旦达到理想的细胞密度，通常将细胞培养物转换到生产期，此期中设定的程序参数可支持细胞生产。生长期间和生产期间的程序参数可以相同。在生产期，细胞浓度优选范围为每mL包含l.x106—5.xl()7个细胞，例如约1x.106、5x.106、1()7或5xl07个细胞/mL。最优选所述细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，在接种细胞前将抗氧化剂加入无血清培养基中。在另一实施方案中，在接种细胞后即刻(如接种后不超过24小时)将抗氧化剂加入无血清培养基中。此制备过程优选包括收集含有重组二聚体促性腺激素的培养液步骤。在本发明的一个优选实施方案中，此制备过程还包括纯化重组二聚体促性腺激素。纯化促性腺激素的方法是本领域所熟知。例如可按专利EP04105639.1、WO98/20039、WO00/63248或WO88/10270所述方法纯化FSH。在本发明另一优选实施方案中，此制备过程还包括配制重组二聚体促性腺激素和药学上可接受的运载体而获得药物组合物。本说明书中所用术语"药学上可接受的运载体"指包括不会干扰活性成分的生物学活性作用，且对给予其的宿主没有毒性的任何运载体。例如，对于肠胃外给药，可采用运载体，如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格(Ringer's)溶液将一种或多种活性蛋白质配制成用于注射用的单位剂量形式。然后可通过多种途径将根据本发明配制的药物组合物给予个体。给药途径包括皮内、经皮(如以缓释制剂形式)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、颅内、硬膜外、局部、直肠和鼻内途径。可采用任何其它治疗上有效的途径，例如通过上皮或内皮组织吸收，或通过将编码活性成分的DNA分子给予患者(如通过载体)作基因治疗，使该活性成分在体内表达和分泌。另外，本发明的蛋白质也可与生物学活性剂的其它组分，例如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、运载体、稀释液和媒介物一起给药。对于肠胃外给药(如静脉内、皮下、肌肉内)给药，可将一种或多种活性蛋白质与药学上可接受的肠胃外媒介物(如水、盐水、葡萄糖溶液)和能维持等渗性(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。可采用常规技术对制剂进行灭菌。在本发明一个优选实施方案中，降低制备过程中氧化形式重组二聚体促性腺激素水平的方法的特征在于，所述制备过程至少在2、3、4、5或6个步骤中存在抗氧化剂。优选实施此制备过程的所有步骤中都存在抗氧化剂，例如，整个制造过程都在抗氧化剂存在下实施。例如，降低制备过程中氧化形式重组二聚体促性腺激素水平的方法可包括以下步骤一用含抗氧化剂的无血清培养基培养表达所述重组二聚体促性腺激素的细胞；一收集含有所述重组二聚体促性腺激素的培养液；和一在抗氧化剂存在下纯化所述重组二聚体促性腺激素。降低制备过程中氧化形式重组二聚体促性腺激素水平的方法优选还包括将所述重组二聚体促性腺激素配制成含抗氧化剂的药物组合物的步骤。制备过程所有步骤中使用的抗氧化剂可以相同，其中采用一种抗氧化剂。或者，培养步骤、纯化步骤和/或配制步骤中可采用不同的抗氧化剂。本领域知道众多具有抗氧化作用的化合物。这些化合物包括例如半胱氨酸、抗坏血酸、L-甲硫氨酸、L-谷胱苷肽、2-巯基乙醇、a-生育酚及其衍生物、BO-653、叔丁酰-4-甲氧基-酚、2，6-双(1,1-二甲基乙基)-4-甲基酚、双金属重亚硫酸氢钾或钠、亚硫酸氢钠、组氨酸、牛磺酸、甘氨酸、丙氨酸、肌肽、鹅肌肽、1-甲基组氨酸。本发明第三方面涉及用于生产重组二聚体促性腺激素的无血清培养基，其特征在于，所述培养基包含的抗氧化剂选自-浓度范围约l-20mg/L的L-谷胱苷肽；-浓度范围约5-15mg/L的2-巯基乙醇；-浓度范围约200-5001^凡的1^-甲硫氨酸；和-浓度范围约10-50mg/L的抗坏血酸和浓度范围约5-25mg/L的(+)-a-生育酚的组合。无血清培养基通常包括水、渗透性调节剂、缓冲液、能源、氨基酸、无机或重组铁源、重组或合成的生长因子、和任选的非铁金属离子、维生素和辅因子。例如，可按照本发明改良以上所列出的市售无血清培养基。现已对本说明书作了完整描述，本领域技术人员知道不脱离本发明的思路和范围其无须过多实验，可采用等价的参数、浓度和条件在广泛范围内实施本发明的内容。虽然本发明已结合具体实施方案作了说明，但应理解可对其作进一步改进。本发明的应用应包括总体上遵循本发明的原理所作的任何变更，应用或调整，并且包括例如那些背离目前所披露信息但属于本发明
技术领域：
内的己知或常规实践的内容，和可应用上文确立的基本特征的内容，均属于附件权利要求书的范围之内。献，包括期刊论文或摘要、公布或未公布的美国或外国的专利申请、授权的美国或外国的专利或任何其它参考文献，包括引用文献中的所有数据、表格、图和内容都纳入本文作参考。另外，本说明书所引用的参考文献中引用的参考文献全部内容也全部纳入本文作为参考。对已知方法步骤、常规方法步骤、已知方法、或常规方法的参考引用不以任何方式承认本发明的任何方面，描述或实施方案已在相关领域公开，说明或建议过。上述具体实施方案的描述将完全公开本发明的全部性质，从而使得他人可在不背离本发明的总体思路下无须过多实验，只须通过应用本领域的知识(包括本文引用参考文献的内容)，即可很容易地修改和/或调整这些具体实施方案的各种应用。因此，认为根据本文提供的说明和指导做出的这种调整和修改也属于本文所公开的实施方案范围内。应知道本说明书中的用辞和术语目的是为了描述而不是限制，因此本领域技术人员借助本文提供的说明和指导，结合本领域普通技术人员的知识，可解释本说明书中的术语和用辞。实施例l:细胞培养程序1.1细胞系和培养基所有实验都用能表达人FSH二种亚基的CHO细胞系进行。产物蛋白质为二聚体促性腺激素，也称为rFSH。其a-亚基与SwissProt登录号P01215相对应，P-亚基与SwissProt登录号P01225相对应。细胞培养用的培养基是为培养CHO细胞而设计的基础无血清培养基(SFM)。SFM培养基添加有实施例3中详述的待测试抗氧化剂。基础SFM中待测试抗氧化剂的初始浓度如表I所示。表l.基础无血清培养基中抗氧化剂的初始浓度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>1.2.接种、生长和生产条件培养程序也称为"运作(mn)"，包括接种步骤、生长期和生产期培养。进行了5种不同的运作，称为运作l、2、3、4和5。将至少2.4.xl(^个能产生rFSH的活细胞转移到装有11升有效工作容积带有微载体的15升生物反应器(新MBR，newMBR，苏黎士)中。接种后立即进入持续2或3天的分批期(batchphase)。然后用SFM按每天1倍的稀释速率给生物反应器连续补料，灌注速率为11L/天。生长期和生产期培养用的pH和温度(37。C,pH=7)相同。在整个运作过程中维持溶氧(DO)为50%的气体饱和度。实施例2:分析方法2丄氧化形式rFSH的检测按Bassett和Driebergen(Bassett和Driebergen，2005)所述，用RP-HPLC检测粗制收获物中的氧化形式(产物)。以运作2中含280mg/LL-半胱氨酸所获得的氧化形式百分比为参照，对氧化形式百分比进行标准化(即氧化形式百分比除以23.4%)。2.2测定活细胞总浓度活细胞总浓度定义为附着于微载体的细胞浓度和悬浮活细胞浓度之和。用结晶紫细胞核计数方法检测附着于微载体的细胞浓度(福禄卡，Fluka61135)。用台盼蓝排除法检测悬浮活细胞浓度(西格马,SigmaT-8154)。按如下公式计算活细胞总比率(TVC比率)[测试结束时的活细胞总浓度]/[测试开始时的活细胞总浓度]，其中测试开始定义为培养基中加入新的抗氧化剂的那一天，测试结束定义为培养基中加入下一次抗氧化剂的那一天。2.3.rFSH滴度的测定用瓦雷斯(Wallac)-ADL的DelphiahFSH试剂盒(分类号n°A017-201)作免疫荧光检测试验检测rFSH滴度。2.4.葡萄糖消耗速率(GCR)的检测葡萄糖消耗速率(GCR)表示为克/L天，按如下公式计算GCR=(G()-Gt)Dt+(Gt-广Gt)，G表示"葡萄糖浓度"和D表示"稀释速率"。指数含义如下-0:补加SFM时；-t:在时间t时测量；和-t-l:在时间t-l时测量。实施例3:不同抗氧化剂的效果为了降低无血清方法获得的氧化形式(产物)的水平，实施了二次15L的运作(运作1和2)以测试不同抗氧化剂的效果。作为对照实施一次不加任何抗氧化剂的运作(运作3)。SFM中加入了几种抗氧化剂或氧化剂组合使其达到表n所示的最终浓度。对每种抗氧化剂或抗氧化剂组合都测试了约IO天时间。测试第一天，加入达到设定点所需体积的抗氧化剂溶液。此后每天，通过灌注从生物反应器中洗去特定量的抗氧化剂并通过一次性加入来替换更新(对于每天1倍的稀释速率，每24小时更新生物反应器体积的63.2%，这代表了每天更换抗氧化剂的量)。测试期结束时，通过灌注从生物反应器中洗去抗氧化剂，用另一待测试抗氧化剂替代。每次测试结束时检测氧化形式rFSH的百分比(表11)。标准化后其值低于1.0表明该测试抗氧化剂减少rFSH氧化形式水平比L-半胱氨酸更有效。每天检测活细胞总浓度，GCR和rFSH滴度。表II显示活细胞总比率(TVC比率)。TVC比率高于或等于l.O表明测试的抗氧化剂对细胞没有毒性效应。表II:抗氧化剂对rFSH氧化形式的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>WD60—WD70WD70L-甲硫氨酸73414.00.601.0WD70—WD80WD79L-抗坏血酸+(+)-a-生育酚301414.80.631.0运作2WDO—WD20WD20L-半胱氨酸28023.41.006.3WD20-WD30WD30半胱氨酸2HC15017.30.741.4WD30-WD40WD38N-乙酰基-L-半胱氨酸26018.10.771.3WD40-WD50WD50L-半胱氨酸35020.50.881.0WD50-WD56WD561^-半胱氨酸+乙-抗坏血酸+2-巯基乙醇280101019.00.811.0表II所示结果表明2-巯基乙醇、抗坏血酸和(+)-a-生育酚组合、L-甲硫氨酸和L-谷胱甘肽是能获得低rFSH氧化形式水平的最佳抗氧化剂。只有在加入2-巯基乙醇时，活细胞总TVC比率才低于1.0。因此运作1和2中的所有测试的抗氧化剂(除2—巯基乙醇外)都没有毒性。另外，GCR和rFSH滴度的检测表明多种抗氧化剂中没有一种对代谢和产量模式有任何重要影响(数据没有给出)。选择L-甲硫氨酸和L-谷胱甘肽进行生产程序的进一步优化。进行一次运作(运作3)测试不同浓度(l-20mg/L)的L-谷胱甘肽，和一次运作(运作4)测试不同浓度(0.25-3g/L)的L-甲硫氨酸。由于微载体受到损伤，测试L-谷胱甘肽的运作3在生产30天时就过早结束。运作3和4中L-甲硫氨酸或L-谷胱甘肽的测试浓度如表III所示。工作天O天(WDO)定义为反应器接种的那天。生产天O天(PDO)定义为细胞培养程序从生长期转为生产期的那天。另外，运作期间不改变抗氧化剂的浓度。此次运作中，从一开始就加入250mg/L的L-甲硫氨酸(运作5)。对所有的运作定期检测rFSH的氧化形式百分比(表IV)。23表III:运作3和4中的抗氧化剂浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表IV:抗氧化剂对rFSH氧化形式的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>对培养基中加入抗氧化剂后rFSH氧化形式的分析表明L-甲硫氨酸是一种很好的抗氧化剂。与运作1和运作2用L-半胱氨酸为抗氧化剂得到的结果相比，运作5中在250mg/L的L-甲硫氨酸存在下培养细胞时的氧化形式平均百分比下降约40%(参见表II和IV)。L-谷胱甘肽也是一种很好的抗氧化剂，尤其是在浓度约为2.5mg/L时。与运作1和运作2用半胱氨酸作为氧化剂相比，运作3中在浓度2.5mg/L的L-谷胱甘肽存在下培养细胞时，其氧化形式百分比下降了约35%(参见表II和IV)。在运作4中可见随着L-甲硫氨酸浓度在250-2000mg/L之间的增加，氧化形式百分比有下降趋势。然而，看来所观测到的差异没有超过此法的差异度范围，因为在L-甲硫氨酸测试浓度为250mg/L的运作5整个过程中所观测到的差异度相当。此外，可以确认L-谷胱甘肽和L-甲硫氨酸在所测试的浓度范围内对细胞活力、代谢和产量模式没有任何重要影响(数据没有给出)。参考文献1.Altschul，S.F.，Gish,W"Miller，W"Myers,E.W"和Lipman,D丄(1990)，Basiclocalalignmentsearchtool."局部排列对比的基础检索工具"J.Mol.Biol.2"，403-410。2.Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schaffer,A.A.,Zhang,J.，Zhang,Z.,Miller，W.,和Lipman，D.J.(1997)，GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms"缺口BLAST和PSI-BLAST:新一代蛋白质数据库检索程序"NucleicAcidsRes.25,3389-3402。3.Bassett,R.M.禾口Driebergen，R.(2005)，Continuedimprovementsinthequalityandconsistencyoffollitropinalfa，recombinanthumanFSH"人重组促滤泡激素aFSH质量和组成的不断改进"Reprod.Biomed.Online,/0，169-177。4.Brutlag,D丄.，Dautricourt，J.P"Maulik,S.，禾卩Relph,J.(1990)，Improvedsensitivityofbiologicalsequencedatabasesearches."生物序列数据库检索灵敏度的提高"Comput.Appl.Biosci.6,237-245。5.Gonnet,G.H.,Cohen,M.A.,禾卩Benner,S.A.(1992)，Exhaustivematchingoftheentireproteinsequencedatabase"整个蛋白质序列数据库的详尽匹配"Science256,1443-1445。6.Grantham，R.(1974)，Aminoaciddifferenceformulatohelpexplainproteinevolution."氨基酸结构的差异有助于解译蛋白质的进化"ScienceM5，862-864。7.Henikoff,S.禾卩Henikoff,J.G,(1993).Performanceevaluationofaminoacidsubstitutionmatrices"氨基酸替代矩阵的性能评价"Proteins/7,49-61。8.Higgins,D.G.,Thompson，J.D,禾口Gibson,T丄(1996)，UsingCLUSTALformultiples叫uencealignments"采用CLUSTAL排列对比多条序歹U"MethodsEnzymol.风383-402。9.Karlin,S.禾卩Altschul,S,F.(1990)，Methodsforassessingthestatisticalsignificanceofmolecularsequencefeaturesbyusinggeneralscoringschemes."采用基因评分方案评估分子序列特征的方法"Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.2264-2268。10.LaPolt,P.S"Nishimori,K.，Fares，F.A"Perlas,E.,Boime,I"和Hsueh,A.J.(1992)，Enhancedstimulationoffolliclematurationandovulatorypotentialbylongactingfollicle-stimulatinghormoneagoni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