专利名称：脑突触体的分离方法
技术领域：
本发明涉及一种脑突触体的分离方法。
背景技术：
脑突触体是通过细胞分离技术得到的中枢神经系统神经末梢的膨大部 分。体内神经原与神经原的连接与信号传递是通过神经末梢的突触实现的， 突触末梢含有神经递质。当神经冲动到达神经末梢，突触体释放神经递质作 用于次一级神经原，使之产生效应。不同的神经末梢含有不同的神经递质， 单胺类、谷氨酸、甘氨酸等神经递质释放后是通过突触前膜再摄取后使其作 用消失的。因此脑突触体是生理和药理工作者研究的重要部位之一，可用于 与这些神经递质的摄取活动相关的研究，例如可用于这些神经递质的抑制剂
和兴奋剂的药理研究。其中，脑突触体用于单胺类神经递质，如5-羟色胺 (5-HT)、去甲肾上腺素(NA)和多巴胺(DA)摄取作用的研究，并作为 作用于单胺类递质再摄取环节的抗精神病药的筛选模型，是国际公认的、先 进的研究方法。
本发明人曾在文献报道的方法上，对脑突触体分离方法进行了研究和改 进(董文心，李建其，倪湘莲，黄成均.脑突触体摄取5-羟色胺研究方法的 建立及应用.中国医药工业杂志.2001. 31 (3): 118-120)，其主要步骤为1) 将大鼠断头后迅速取出大脑，在低温条件(4"C的生理盐水)下去除软脑膜 及血管组织，取大脑皮层2ml于0.32M(30ml)的蔗糖溶液中匀浆后，以1500g 平衡离心(4°C) 10min，目的是去除大的细胞碎片；2)取上清液于17000g 再次平衡离心(4°C) 30min，目的是收集此液体中的所有组织，进行下面的梯度离心，以分离脑突触体；3)随后将沉淀悬浮后置于0.32M、0.8M和1.2M 的蔗糖梯度离心管中以38000g的离心力进行梯度离心60min，用穿刺针小 心收集位于0.8M和1.2M界面之间的悬浮液，此悬浮液即含有脑突触体；4) 对收集的脑突触体悬液再次进行离心以20000g的速度(4°C) 30min，所得 沉淀物即精制的脑突触体。该方法所制备的突触体悬液中的蛋白含量稳定在 5.6~6.8g/L(6.18±0.36g/L， n=14)，其组间变异为5.8%，在选定300nmol 'I/V 管的3H-单胺作为底物浓度时，突触体的含量在120-220yg蛋白滑之间， 突触体摄取单胺的效力无差异，不需每次进行蛋白测定，大大简化了实验程 序；而且可以同时进行对5-HT、 NA和DA的再摄取研究。采用该方法对一 些已知单胺再摄取抑制剂的代表药进行研究，测得的IC50值与文献报道非常 吻合，而且还筛选出了具有很强的双重再摄取抑制(5-HT、 NA)作用的新 药(CNZL02111934.1、 US 10/516,205)。然而此方法操作步骤还较烦琐，特 别是用穿刺针小心收集位于0.8M和1.2M界面之间的悬浮液的步骤操作难度 较大，若操作不当，则会造成突触体含量的变化；而且分离时间也较长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种较上述现有方法步骤简化、时间縮 短而突触体悬液中的蛋白含量无明显变化的、改进的脑突触体的分离方法。
本发明人通过诸多试验后发现，将现有方法步骤重新组合，通过控制离 心速度和时间，将含有脑突触体的离体脑组织(大脑皮层)首先置于0.32M 和1.2M的蔗糖溶液中进行离心，首先去除在1.2M的蔗糖溶液中可沉淀的大 的细胞碎片与沉渣；接着将含有脑突触体的0.32M的蔗糖溶液置于0.8M的 蔗糖溶液中再次离心，将原来位于0.8M和1.2M界面的突触体悬浮液直接离 心沉淀于管底，取沉淀物即为精制的脑突触体。
因此，本发明的技术方案为 一种脑突触体的分离方法，其包括下列步① 将离体大脑皮层组织于0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接置于1.2M 的蔗糖溶液中以至少20000g平衡离心20-60分钟后，用吸管吸去下层的 1.2M的蔗糖溶液；
② 将步骤①得到的上清液置于0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡离 心20 60分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。
其中，离心速度越快，相同时间内沉淀更充分；换言之，为达到同样的 离心效果，所需时间可縮短。当然，考虑到常用的离心设备及能耗，本发明 步骤①中的离心速度一般优选在20000 40000g范围，而步骤②中的离心速 度优选在30000 40000g范围。
更佳地，步骤①中的离心速度为20000g，离心时间为30分钟。 步骤②中的离心速度为30000g，离心时间为30分钟。 同常规，本发明的两个离心步骤在低温(4'C)条件下进行；而0.32M 的蔗糖溶液用量只要能使离体大脑皮层组织匀浆完全即可，通常与离体大脑 皮层组织的体积比至少为10:1，较佳地为15 20:1; 1.2M或0.8M的蔗糖溶
液的用量只要能与0.32M的蔗糖溶液清楚分界，并能接纳其中沉淀物即可， 通常其与离体大脑皮层组织的体积比至少为5:1。
根据本发明，所说的脑突触体通常来源于试验动物，故本发明以常用的 试验大鼠为例来说明。
本发明分离方法的步骤，特别是离心步骤由4步改为2步，简化了操作 程序；离心时间由130min可以縮短为60min左右，缩短了跨度一整天的脑 突触体摄取单胺实验的整个实验进程；省略了操作难度较大、对突触体含量 影响较大的用穿刺针小心收集位于0.8M和1.2M界面的悬浮液的步骤;所制 备的突触体的蛋白含量非常稳定，较现有方法无明显降低，稳定在4.5 5g/L， 符合在选定300nM/管的3H-单胺作为底物浓度时，突触体的含量在120-220 Ug蛋白/管之间的标准，提供了足量的突触小体(突触体)以供再摄取所需 (如表l所示)。表l在定量的SH-5-HT底物浓度下，每管所需突触小体的作用量
0=4, x±s)
蛋白含量(突触体)3H-5-HT计数(cpm)
120ug/管300画1.L-1/管678.5 ±4.95
220U e/管300應ol.L-1 /管695.5 ±86.9
图1为氟西汀对脑突触体摄取SH-5-HT抑制作用的量效关系图(r^4， x ±s)。
具体实施例方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
首先根据常规方法，将Wistar或SD大鼠(上海斯莱克实验动物责任有 限公司)断头后迅速取出大脑，在低温条件(4"的生理盐水)下去除软脑 膜及血管组织，取大脑皮层进行下列实施例的试验。
其中，突触体悬液(悬浮于lml人工脑脊液中)中突触体的含量以每升 溶液中所含的蛋白量来定量，采用上海申索试剂有限公司的总蛋白试剂盒 (双縮脲比色法)来进行蛋白测定。离心机为(德国Sigma公司，3K30型 高速冷冻离心机)。
实施例1
① 将离体大脑皮层组织2ml于20ml、 0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以20000g平衡离心30分钟后，用吸管吸去 下层的1.2M的蔗糖溶液；
② 将步骤①得到的上清液置于10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以30000g平衡 离心30分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。
突触体悬液中突触体的含量为4.8g蛋白/L。 实施例2① 将离体大脑皮层组织2ml于20ml、 0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以40000g平衡离心20分钟后，用吸管吸去 下层的1.2M的蔗糖溶液；
② 将步骤①得到的上清液置于10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以30000g平衡 离心60分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。
突触体悬液中突触体的含量为4.9g蛋白/L。 实施例3
① 将离体大脑皮层组织2ml于30ml、 0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以20000g平衡离心60分钟后，用吸管吸去 下层的1.2M的蔗糖溶液；
② 将步骤①得到的上清液置于10ml、0.8M的蔗糖溶液中以40000g平衡 离心20分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。
突触体悬液中突触体的含量为4.6g蛋白/L。 实施例4
① 将离体大脑皮层组织2ml于20ml、 0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接 置于10ml、 1.2M的蔗糖溶液中以30000g平衡离心40分钟后，用吸管吸去 下层的1.2M的蔗糖溶液；
② 将步骤①得到的上清液置于10ml、 0.8M的蔗糖溶液中以40000g平衡 离心40分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。
突触体悬液中突触体的含量为5.0g蛋白/L。 应用实施例1
采用本发明方法制备脑突触体，并进行氟西汀对脑突触体摄取5-HT抑 制试验(试验步骤参照现有技术如CNZL02111934.1)。试管中先加入l.Oml Tris-Krebs缓冲液，随后加入20 " 1突触小体悬液(实施例1的脑突触体用 人工脑脊液悬浮)，继之加入O.lmM的氟西汀10tU，混合均匀，37'C水浴 中温浴5min。再加入10"1底物(3H-5-HT)，混匀，37°(:温浴5min。将试管迅速放入4"C冰水中终止反应，真空抽滤，并洗涤2次。取下滤膜，60-70
'c烘干，将滤膜放入闪烁瓶内，加入甲苯闪烁液，于e-液闪计数器计数。
突触体的净摄取量37。C的cpm值(主动再摄取)减去0。C的cpm值(非特 异性聚集)，其量效关系图如图1所示。
测得的5-HT再摄取抑制剂的代表药氟西汀的ICs。值为0.04 ix mol，U1/ 管，与文献报道非常吻合(0.049umoH/1)。
权利要求
1、一种脑突触体的分离方法，其包括下列步骤①将离体大脑皮层组织于0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接置于1.2M的蔗糖溶液中以至少20000g平衡离心20～60分钟后，用吸管吸去下层的1.2M的蔗糖溶液；②将步骤①得到的上清液置于0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡离心20～60分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。
2、 如权利要求1所述的分离方法，其特征在于步骤①中的离心速度为 20000~40000g，步骤②中的离心速度为30000~40000g。
3、 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于步骤①中的离心速度为 20000g，离心时间为30分钟。
4、 如权利要求2所述的分离方法，其特征在于步骤②中的离心速度为 30000g，离心时间为30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种脑突触体的分离方法，其包括下列步骤①将含有脑突触体的脑组织于0.32M的蔗糖溶液中匀浆后，直接置于1.2M的蔗糖溶液中以至少20000g平衡离心20～60分钟后，用吸管吸去下层的1.2M的蔗糖溶液；②将步骤①得到的上清液置于0.8M的蔗糖溶液中以至少30000g平衡离心20～60分钟后，取沉淀物即为精制的脑突触体。本发明分离方法较现有技术简化了操作步骤、缩短了分离时间，而且所分离的脑突触体的蛋白含量非常稳定，在用于单胺类神经递质的摄取试验时，具有准确性高、重复性好、效率高和操作简单的特点。
文档编号C12N5/06GK101294145SQ20071003987
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月24日 优先权日2007年4月24日
发明者倪湘莲, 董文心, 顾丰华 申请人:上海医药工业研究院