亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品的制作方法

专利名称：亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液及血液成分病毒灭活效果的质量评价方法，及相应质控品的建立，具体涉及亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品。

背景技术：
随着医学科学的发展，血液及血液制品的安全性越来越受到重视，血液安全性不仅依赖于合理的献血员筛选，严格的病毒筛检，还有赖于安全有效的病毒灭活技术，它是安全输血的重要保障。亚甲蓝(Methylene blue，MB)光化学法被认为是非常有发展前景的临床用单人份血浆病毒灭活方法。由于病毒灭活技术受多种条件因素影响，如MB的浓度、光照强度、时间及光源波长等，因此建立病毒灭活有效性验证手段，直接而客观地评价病原体灭活的有效性是病毒灭活工作的重要组成部分，是确保灭活效果达到预期的要求，保障血液制品安全性、有效性的重要环节。
目前多采用体外培养的细胞病变法或动物模型方法来判断病毒灭活效果。细胞病变法就是通过病毒接种于细胞悬液中，观察宿主细胞变化来判定病毒感染的情况。目前除HIV已建立起成熟的实验室细胞病变方法加以检测外，HBV、HCV等都不能直接体外繁殖，必须尽可能选择理化性质相似的模型病毒作为指示病毒进行体外培养加以检测，如以辛德毕斯病毒(Sindbis Virus，SV)作为HCV模型病毒、鸭乙肝病毒(Duck Hepatitis B Virus，DHBV)作为HBV的模型病毒、水疱性口炎病毒(Vesivular Stomatitis Virus，VSV)作为RNA脂质包膜病毒的模型病毒。但是体外培养方法对实验条件有严格的要求，细胞培养、病毒保存有规范的控制，操作繁琐，实验周期长，不利于在基层单位开展此项工作。此外，虽然动物模型方法在从生物体整体水平评价病毒感染性方面具有优势，但价格昂贵，实验周期长，只适合于研究开发阶段使用，也不适合在常规工作中开展。因此，建立更简单易行、更经济、更有效的评价指标已成为病毒灭活工作中急需解决问题。
核酸检测技术是以检测感染者体内病毒核酸的有无或含量多少来进行病原学诊断的一种方法，是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断检测技术。它具有灵敏度高，特异性强，能采用定量检测的方法进行质量控制，准确性高，检测费用少，检测耗时少，适合于常规工作中推广应用。PCR是众多核酸检测技术中的经典方法，因其简便快速的特点，目前基层检验单位及血站均已具备PCR工作条件。因此发明人想到了可能可以利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果。


发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种新的利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活效果的方法。
要给出利用核酸检测技术来评价亚甲蓝光化学病毒灭活对病毒的灭活效果的方法，有几个关键 首先，因为PCR检测的是病毒特异性靶基因片段，所以必须证明亚甲蓝对病毒灭活作用位点为病毒核酸，并且病毒这种特异性扩增产物的减少或消失与病毒感染的致病性存在一定的相关性。
其次，由于常规采供血工作对环境的严格要求，引入的质控品材料必须保证对操作人员和受血者无感染性，因此，必须选择对人体不致病，但又能模拟对人体致病的HBV、HCV和HIV在处理过程中动态变化的模型病毒或相关病毒的核酸材料作为质控品的备选对象。
最后，必须筛选出与亚甲蓝光化学病毒灭活相关的，能敏感反映病毒感染性的靶基因扩增片段及其引物，以达到该方法有效推广的目的。
在证实了亚甲蓝对病毒灭活作用位点为病毒核酸，并且病毒这种特异性扩增产物的减少或消失与病毒感染的致病性存在一定的相关性后，本发明提出了以下技术方案 一方面，本发明公开了一种亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价的检测方法 在对血液或血液制品进行亚甲蓝光化学灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含有VSV病毒完整颗粒或VSV病毒基因的重组质粒或VSV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中VSV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。
VSV病毒基因的重组质粒是指VSV病毒基因组DNA片段与现有载体重组获得的重组质粒。现有载体指的是本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于pUC系列、pBluescript、pGEM和它们的衍生载体等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建VSV病毒基因的重组质粒。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)等。
VSV病毒基因体外转录的RNA片段是指经体外转录获得的VSV病毒基因组RNA片段。体外转录可以在获得VSV病毒基因组DNA片段后，用本领域熟知的技术或者试剂盒完成，例如将VSV病毒基因组DNA片段与常用载体重组，获得VSV病毒基因的重组质粒，进而在RNA聚合酶的作用下转录获得VSV病毒基因组RNA片段。
较佳的，上述特异性引物序列选自下组中的一组 1)CGGAATTCCG AAA GGC TCA GGA GAA ACT(SEQ ID NO1)及CCAAGCTTGGTTT GAG GCC TTG GTAGAC(SEQ ID NO2)； 2)CGGAATTCCG CTA CCA AGG CCT CAA ATC(SEQ ID NO3)及CCAAGCTTGGAAC CAT TTG TCA TCTGCG(SEQID NO4)； 3)CGGAATTCCG AGA ACC AGC GCA GAT GAC(SEQ ID NO5)及CCAAGCTTGGAAC ATG TCC ACT GCAGCG(SEQ ID NO6)； 4)CGGAATTCCG TCG CTG CAG TGG ACA TGT(SEQ ID NO7)及CCAAGCTTGGTTG GCC TGG AAG CATCAT(SEQ ID NO8)； 5)CGGAATTCCG CAA ATG ATG CTT CCA GGC(SEQ ID NO9)及CCAAGCTTGGAGC GTA CAA CAA ACCTGC(SEQ ID NO10) 较佳的，上述VSV病毒基因的重组质粒含有序列SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15。重组质粒由序列SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15与现有载体重组获得。上述重组质粒的载体可以是选自pUC系列、pBluescript、pGEM和它们的衍生载体。优选的，上述重组质粒的载体为pBluescript II SK(+)。
较佳的，上述VSV病毒基因体外转录的RNA片段含有序列SEQ ID NO16或SEQ ID NO17或SEQ ID NO18或SEQ ID NO19或SEQ ID NO20。
较佳的，上述PCR技术为普通PCR或实时荧光定量PCR。
另一方面，本发明公开了前述亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价检测方法中使用的质控品，质控品含有包含序列SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15的重组质粒或包含序列SEQ ID NO16或SEQ ID NO17或SEQ ID NO18或SEQ ID NO19或SEQ ID NO20的RNA，上述质粒或RNA的含量一般控制在103copies/ml-108copies/ml。
质控品是包含序列SEQ TD NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15的重组质粒或包含序列SEQ ID NO16或SEQ ID NO17或SEQ ID NO18或SEQ ID NO19或SEQ ID NO20的RNA经常用稀释液或缓冲液稀释获得的溶液，本领域熟知的常用稀释液或缓冲液包括但不限于DEPC处理水、用DEPC处理过的PBS缓冲液或代血浆(羟乙基淀粉20(HES20)氯化钠注射液，HES20)、无菌双蒸水、无菌水等。
较佳的，上述重组质粒为序列SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQID NO14或SEQ ID NO15与pBluescript II SK(+)重组获得的质粒。
较佳的，上述RNA片段的序列为SEQ ID NO16或SEQ ID NO17或SEQ ID NO18或SEQ ID NO19或SEQ ID NO20。
有益效果 本发明在大量研究的基础上将普通PCR(conventional PCR)和实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术应用于血液及血液成份病毒灭活的有效性检测中，即通过对模型病毒SV核酸特异性靶序列的扩增，作定性或定量分析，从病毒灭活前后核酸量的变化判断病毒灭活对病毒的杀伤作用。
相比现有的判断病毒灭活效果的方法，本发明操作简单，准确度好，实验周期短，需要的实验条件容易达到，更为经济有效。实时荧光定量PCR的使用还可以更进一步动态的反映MB-P处理效果。



图1.MB-P处理过程中血浆标本HCV RNA随光照时间动态变化的定量研究时间单位分钟 图2.病人血浆中的HCV与代血浆或PBS缓冲液中体外转录的RNA在MB-P处理下的降解速率比较 图3.利用引物I与引物II检测SV在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000，Marker DL2000自上而下条带分别为2000，1000，750，500，250，100bp 1Sindbis病毒加MB未光照处理标本(引物II，扩增片段大小1025bp) 2MB1.0μmol/L 30分钟(引物II) 3MB1.0μmol/L 60分钟(引物II) 4Sindbis病毒未处理标本(引物I，扩增片段大小323bp) 5MB1.0μmol/L 30分钟(引物I) 6MB1.0μmol/L 60分钟(引物I) 图4.利用引物VSV1与引物VSV2检测VSV在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000 1VSV病毒加MB未光照处理标本标本(引物VSV1，扩增片段大小213bp) 2MB1.0μmol/L 30分钟(引物VSV1) 3MB1.0μmol/L 60分钟(引物VSV1) 4VSV病毒加MB未光照处理标本标本(引物VSV2，扩增片段大小237bp) 5MB1.0μmol/L 30分钟(引物VSV2) 6MB1.0μmol/L 60分钟(引物VSV2) 图5.利用引物VSV1检测VSV质控品在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000 1加MB未光照处理标本(VSV病毒完整颗粒质控品) 2MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 3MB1.0μmol/L 60分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 4加MB未光照处理标本(含SV病毒基因的重组质粒的质控品) 5MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 6MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 7加MB未光照处理标本(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 8MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 9MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 图6.利用引物VSV2检测VSV质控品在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000 1加MB未光照处理标本(VSV病毒完整颗粒质控品) 2MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 3MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 4加MB未光照处理标本(含SV病毒基因的重组质粒的质控品) 5MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 6MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 7加MB未光照处理标本(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 8MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 9MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 图7.利用引物VSV3检测VSV质控品在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000 1加MB未光照处理标本(VSV病毒完整颗粒质控品) 2MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 3MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 4加MB未光照处理标本(含SV病毒基因的重组质粒的质控品) 5MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 6MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 7加MB未光照处理标本(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 8MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 9MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 图8.利用引物VSV4检测VSV质控品在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000 1加MB未光照处理标本(VSV病毒完整颗粒质控品) 2MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 3MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 4加MB未光照处理标本(含SV病毒基因的重组质粒的质控品) 5MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 6MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 7加MB未光照处理标本未处理(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 8MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 9MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 图9.利用引物VSV5检测VSV质控品在灭活前后PCR结果 MMarker DL 2000 1加MB未光照处理标本(VSV病毒完整颗粒质控品) 2MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 3MB1.0μmol/L 30分钟(VSV病毒完整颗粒质控品) 4加MB未光照处理标本(含SV病毒基因的重组质粒的质控品) 5MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 6MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因的重组质粒的质控品) 7加MB未光照处理标本(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 8MB1.0μmol/L 30分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 9MB1.0μmol/L 60分钟(含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品) 图10.利用引物VSV1检测VSV病毒完整颗粒质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、104copies/ml的标准品(克隆片段大小为213bp)，MB1.0μmol/L照射30分钟质控品，MB1.0μmol/L照射60分钟质控品。
图11.利用引物VSV2检测含VSV病毒基因(SEQ ID NO12)的重组质粒的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果 按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、104copies/ml的标准品(克隆片段大小为237bp)，MB1.0μmol/L照射30分钟质控品，MB1.0μmol/L照射60分钟质控品。
图12.利用引物VSV3检测含SV病毒基因体外转录的RNA片段(SEQ ID NO18)的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果 按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、104copies/ml的标准品(克隆片段大小为227bp)，MB1.0μmol/L照射30分钟质控品，MB1.0μmol/L照射60分钟质控品。
图13.利用引物VSV4检测VSV病毒完整颗粒质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、104copies/ml的标准品(克隆片段大小为215bp)，MB1.0μmol/L照射30分钟质控品，MB1.0μmol/L照射60分钟质控品。
图14.利用引物VSV5检测含VSV病毒基因(SEQ ID NO15)的重组质粒的质控品在灭活前后实时荧光定量PCR检测结果 按照出峰先后，各条曲线分别为浓度107、106、105、104copies/ml的标准品(克隆片段大小为228bp)，MB1.0μmol/L照射30分钟质控品，MB1.0μmol/L照射60分钟质控品。

具体实施例方式 本发明是为了将PCR技术运用于亚甲蓝光化学病毒灭活效果评价领域，首先必须证明病毒核酸是亚甲蓝光化学病毒灭活作用靶位点，即要证实亚甲蓝光化学灭活对病毒核酸有破坏作用，验证过程如下 1)本发明设置不同的MB-P灭活条件，将含病毒阳性血浆及体外转录获得的病毒RNA溶液同时进行灭活；灭活后，分别取样，对样品进行RNA抽提及逆转录；利用针对病毒核心片段基因序列的引物，对样品进行实时荧光定量PCR检测来测定样品中病毒RNA的浓度；结果证实，MB-P处理后，病毒RNA均发生了降解，且降解程度随着光照时间的增加而增加。
2)同时，通过对比实验，本发明还揭示了血浆中病毒降解速度大于体外转录获得的病毒RNA降解速度。
由于本发明将PCR技术运用于亚甲蓝光化学病毒灭活效果评价，即通过特异性扩增产物的减少或消失来判断灭活作用，因此还必须证明病毒核酸的降解与病毒的感染性消失存在一定的相关性，证明方法如下 1)将病毒血浆进行不同条件的MB-P处理。
2)对不同灭活条件的血浆取样，通过RT-PCR检测病毒核酸，与MB-P处理前进行比较，结果证实灭活后，PCR产物减少，即病毒核酸被降解。
3)同时，对不同灭活条件的血浆取样，用实时荧光定量PCR检测，进一步证明随着灭活过程的进行，PCR产物逐步递减，即病毒核酸逐步被降解。
4)对不同灭活条件的血浆取样，进行细胞病变检测，测定感染性滴度，结果证实灭活后，病毒感染性消失了。
本发明的方法是通过对质控品的检测来评价MB-P的效果，为了证实本发明的质控品可以起到评价MB-P的效果的作用，本发明将制备的质控品及含病毒血浆同时进行MB-P处理，结果证实，随着MB-P过程的进行，质控品中的PCR产物逐步递减，血浆中病毒感染性也消失了，结果证实质控品真实地反映了MB-P的效果。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆试验手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1亚甲蓝光化学灭活对HCV病毒核酸有破坏作用 实验步骤 1、克隆的建立 根据GenBank中HCV1b型序列(AY460204)，采用Gene runner软件设计覆盖HCV 5’-NCR及核心区片段的PCR引物，上游引物序列为5’-CGGAATTCCGACCATAGATACTCCCCT-3’(SEQID NO21)，下游引物序列为5’-CGGGATCC CGGAAGATAGAGAAAGAGCAACCG-3’(SEQ IDNO22)，扩增片段长度为844bp，引物交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用Trizol(Gibco BRL)试剂抽取抗HCV及HCV RNA均为阳性的献血员血浆(上海血液中心)中的HCV RNA后，使用RNA PCR KIT(Takara公司)进行逆转录和PCR反应。反应参数为42℃逆转录30分钟，94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，其中变性、退火和延伸循环30次。将PCR产物纯化后以EcoRI、BamHI双酶切位点克隆到pBluescript II SK(+)载体(Stratagene公司)中，再转化大肠杆菌E.coli TOP10(Promege公司)，抽提质粒进行EcoRI、BamHI双酶切鉴定和测序鉴定(由上海生工生物工程技术服务有限公司采用ABI PRISM 3730分析仪完成)。酶切产物电泳，在844bp处有电泳条带，测序结果包括SEQ ID NO23片段，结果符合预期。
片段序列(SEQ ID NO23) 5’-ACCATAGATACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTTGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCGAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCATCATGAGCACAAATCCTAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTTAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGTGGAAGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGGCCCGAGGGTAGGACCTGGGCTCAGCCCGGGTACCCTTGGCCCCTCTATGGCAACGAGGGTATGGGGTGGGCAGGATGGCTCCTGTCACCCCGTGGCTCTCGGCCTAGTTGGGGCCCCACAGACCCCCGGCGTAGGTCGCGTAATTTGGGTAAGGTCATCGATACCCTTACATGCGGCTTCGCCGACCTCATGGGGTACATTCCGCTTGTCGGCGCCCCCCTAGGGGGCGCTGCCAGGGCCCTGGCACATGGTGTCCGGGTTCTGGAGGACGGCGTGAACTATGCAACAGGGAATCTGCCGCGGTTGCTCTTTCTCTATCTTC-3’ 2、体外转录 用上述阳性质粒作为模板，Not I酶切线性化后在T7聚合酶的作用下体外转录出含目的片段的RNA，凝胶电泳检测，在844bp处有目的条带。纯化后定量，分别用DEPC处理过的PBS缓冲液和代血浆(羟乙基淀粉20氯化钠注射液，HES20)稀释为106copies/ml(与正常阳性血浆中HCV浓度相近)，-80℃保存备用。
3、病毒灭活 取含HCV RNA 106copies/ml抗HCV及HCV RNA均为阳性的献血员血浆标本(上海市血液中心)、体外转录RNA的PBS溶液和代血浆溶液各99ml，分别加入100μmol/L的注射用MB1ml(MB终浓度为1μmol/L)，混匀后在4℃用30000Lux可见光照射处理。在照射前(0min)，照射后2min、5min、10min、20min、30min、40min和60min分别取样作进一步检测，同时用未加MB的这三种溶液在同样条件下处理作为对照组，也分别在不同照射时间留样。
4、RNA抽提及逆转录 灭活后，体外转录RNA溶液100μl用75％乙醇沉淀，而血浆则取100μl加入300μlTrizol中以提取病毒RNA，在沉淀干燥的RNA中加入含随机引物(200nmol/L)，AMV逆转录酶(0.1U/μL)，dNTP(300μmol/L)的逆转录混合物30μl，在42℃条件下进行逆转录反应。
5、实时荧光定量PCR检测及实验结果 针对HCV 5’-NCR区基因序列，设计荧光定量PCR引物及Taqman探针，上游引物为5’-GAACTACTGTCTTCACGCAGAAAG-3’(SEQ ID NO24)，下游引物为5’-CTGGCAATTCCGGTGTACTCA-3’(SEQ ID NO25)，探针序列为5’-(FAM)CCGCAGACCACTATGGCTCTCCCG(Eclipse)-3’(SEQ ID NO26)。引物及探针由大连宝生物(Takara)公司合成。使用上述引物，在ABI 7500型实时荧光定量扩增仪上进行检测。循环参数为94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸34秒，72℃时收集荧光信号，共进行45个循环，用前述构建的质粒，以107copies/ml浓度起，以10倍梯度稀释作为标准品同时反应，绘制标准曲线，确定不同灭活条件处理后样品的HCV RNA浓度，结果如图1及图2所示。结果说明，MB-P处理后，HCV病毒RNA发生了降解，且降解程度随着光照时间的增加而增加。
6、体外转录HCV RNA在代血浆或PBS缓冲液中MB-P处理后的动态变化 为进一步确定HCV RNA在MB-P处理下的降解过程，同时也为了验证病毒包膜蛋白以及血浆中的蛋白成分在MB-P病毒灭活过程中所起的作用，本研究将体外转录的HCV RNA调整到106copies/ml，使之与病人血浆中HCV RNA的浓度相同，分别加入到代血浆(HES20)和PBS缓冲液中，并以病人HCV阳性血浆作为对照，按前述方法进行MB-P处理后，用步骤5中的探针及引物进行荧光定量PCR检测HCV RNA残留量。将检测到的不同处理时段HCV RNA残留量取对数，计算其所占处理前原有量的对数的百分比，并以此为纵坐标，以光照时间为横坐标，作直线回归图，直线的斜率即为MB-P处理时HCV RNA的降解速率(图2)。图中结果为三次实验的平均值。结果表明未加MB时，病人血浆中的HCV以及体外转录的HCV RNA均未发生降解；而在MB作用下，病人血浆中的HCV以及体外转录的HCV RNA均迅速降解。通过回归直线的斜率(K)比较，发现，体外转录的HCV RNA在代血浆(HES20)中和PBS缓冲液中的降解速率相似，但二者均低于病人血浆中的HCV降解的速率。
实施例2亚甲蓝光化学灭活对SV病毒核酸有破坏作用 实验步骤 1、实验用SV的制备及含病毒血浆的制备 (1)实验用SV的制备 SV由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，以BHK细胞为宿主传3代。收集上清液，测得病毒滴度＞8.51gTCID50/ml，分装，置-80℃保存，备用。
(2)含病毒血浆的制备 在含100ml抗凝血浆的PVC塑料袋内，按血浆∶病毒液＝9∶1的容量比接种病毒，混匀。
2、病毒灭活实验 在上述含病毒血浆/溶液中，加入亚甲蓝(MB)，使终浓度分别为0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.5μmol/L，随即用30000Lux可见光照射，照射时间分别为0’(不照射)，30’，60’。
3、病毒核酸检测(定性)及结果 (1)病毒RNA提取用Trizol试剂抽提血浆中的病毒RNA，方法如下 ①Trizol 300ul加血清100ul，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止15分钟；②加入80ul氯仿，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止5分钟；③在4℃下离心，12000rpm×15分钟；④离心结束后溶液分层，小心吸取上层水相200ul，加入等体积异丙醇；⑤颠倒混匀10次后，-20℃数小时；⑥在4℃下离心，14000rpm×15分钟；⑦弃上清，75％预冷酒精400ul洗涤，颠倒数次；⑧4℃离心，14000rpm×5分钟，弃上清，自然挥发干燥。
(2)引物设计根据Sindbis病毒XJ-160序列设计引物，本研究设计了2套引物，共3条，2套引物的负链相同，扩增片段产物I是323bp，II是1025bp(见下表)。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(3)病毒核酸RT-PCR用TaKaRa RNA PCR kit，购自宝生物工程有限公司。具体操作参照试剂说明书进行。热循环参数如下42℃逆转录30分钟，94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共计30个循环，最后72℃延伸5分钟。
(4)PCR产物的检测用1.5％琼脂糖凝胶电泳法进行检测，经照射后的样品均未扩增出片段，其中MB终浓度为1.0μmol/L的电泳结果见图3。
(5)结果表明MB-P处理后，SV病毒RNA发生了降解。
实施例3亚甲蓝光化学灭活对VSV病毒核酸有破坏作用 实验步骤 1、实验用VSV的制备及含病毒血浆的制备 (1)实验用VSV的制备 VSV由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，以Vero细胞为宿主传3代。收集上清液，测得病毒滴度＞8.51gTCID50/ml，分装，置-80℃保存，备用。
(2)含病毒血浆的制备 在含100ml抗凝血浆的PVC塑料袋内，按血浆∶病毒液＝9∶1的容量比接种病毒，混匀。
2、病毒灭活实验 在上述含病毒血浆/溶液中，加入亚甲蓝(MB)，使终浓度分别为0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.5μmol/L，随即用30000Lux可见光照射，照射时间分别为0’(不照射)，30’，60’。
3、病毒核酸检测(定性)及结果 (1)病毒RNA提取用Trizol试剂抽提血浆中的病毒RNA，方法如下 ①Trizol300ul加血清100ul，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止15分钟；②加入80ul氯仿，强烈振荡15秒，充分混匀，室温静止5分钟；③在4℃下离心，12000rpm×15分钟；④离心结束后溶液分层，小心吸取上层水相200ul，加入等体积异丙醇；⑤颠倒混匀10次后，-20℃数小时；⑥在4℃下离心，14000rpm×15分钟；⑦弃上清，75％预冷酒精400ul洗涤，颠倒数次；⑧4℃离心，14000rpm×5分钟，弃上清，自然挥发干燥。
(2)引物设计根据VSV病毒序列设计引物，本文设计了2套引物(见下表)。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(3)病毒核酸RT-PCR用TaKaRa RNA PCR kit，购自宝生物工程有限公司。具体操作参照试剂说明书进行。热循环参数如下42℃逆转录30分钟，94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共计30个循环，最后72℃延伸5分钟。
(4)PCR产物的检测用1.5％琼脂糖凝胶电泳法进行检测，经照射后的样品均未扩增出片段。其中MB终浓度为1.0μmol/L的电泳检验结果如图4。结果说明MB-P处理后，VSV病毒RNA发生了降解。
实施例4病毒核酸的降解与病毒的感染性消失存在一定的相关性 实验步骤 1.将实施例2中经步骤2灭活的产物分别取样，接种BHK细胞，用细胞病变法(《医用实验病毒学》，人民军医出版社(第1版)P102-109杜平)，测定感染性滴度(TCID50/ml)， 结果如下表 不同浓度、不同接触时间SV感染性灭活结果
*表示所用方法已测不到病毒滴度 结果证实灭活后，病毒感染性消失了。
2.将实施例3中经步骤2灭活的产物分别取样，接种Vero细胞，用细胞病变法测定感染性滴度(TCID50/ml)，结果如下表 不同浓度、不同接触时间VSV感染性灭活结果
*表示所用方法已测不到病毒滴度 结果证实灭活后，病毒感染性消失了。
3.结果分析由实施例2及实施例3可知，在MB-P处理下，SV病毒及VSV病毒RNA发生了降解，而本实验又证明了MB-P处理后，SV病毒及VSV病毒感染性消失了，由此证实了病毒核酸的降解与病毒的感染性消失存在一定的相关性。
实施例5质控品的制备 1.含VSV病毒完整颗粒质控品的制备 (1)实验用VSV的制备 VSV由中国预防医学科学院病毒学研究所提供，以Vero细胞为宿主传3代。收集上清液，测得病毒滴度＞8.51gTCID50/ml，分装，置-80℃保存，备用。
(2)含病毒血浆的制备 在含100ml抗凝血浆的PVC塑料袋内，按血浆∶病毒液＝9∶1的容量比接种病毒，混匀。
2.含VSV病毒基因的重组质粒的质控品的制备 (1)根据GenBank中VSV序列，采用Gene runner软件设计了5套特异性PCR引物，引物序列即下表中的VSV1-VSV5。
引物交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用Trizol(Gibco BRL)试剂抽取VSV RNA后，分别使用RNA PCR KIT(Takara公司)进行逆转录和PCR反应。反应参数为42℃逆转录30分钟，94℃预变性2分钟，94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，其中变性、退火和延伸循环30次。将PCR产物纯化后以EcoRI、HindIII双酶切位点克隆到pBluescript II SK(+)载体中，再转化大肠杆菌E.coliTOP10，抽提质粒进行EcoRI、HindIII双酶切鉴定和测序鉴定(由上海生工生物工程技术服务有限公司采用ABI PRISM 3730分析仪完成)。酶切产物电泳，各套引物对应的产物的条带大小及测序结果如下表所示 (2)质控品的配制分别抽提质粒，-20℃保存备用。临用前以灭菌双蒸水稀释，将质粒浓度分别调至103copies/ml，104copies/ml，105copies/ml，106copies/ml，107copies/ml及108copies/ml，配制成质控品。上述浓度的样品既可单独作为一个质控品使用，也可作为质控品系列联合使用。
3.含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品的制备 用上述步骤2中(1)获得的阳性质粒作为模板，Not I酶切线性化后在T7聚合酶的作用下体外转录出含目的片段的RNA，电泳结果为分别在213bp、237bp、227bp、215bp及228bp处有目的条带。
VSV1对应的RNA序列(SEQ ID NO16) 5’-CGGAAUUCCGAAAGGCUCAGGAGAAACUUUAACAGUAAUCAAAAUGUCUGUUACAGUCAAGAGAAUCAUUGACAACACAGUCAUAGUUCCAAAACUUCCUGCAAAUGAGGAUCCAGUGGAAUACCCGGCAGAUUACUUCAGAAAAUCAAAGGAGAUUCCUCUUUACAUCAAUACUACAAAAAGUUUGUCAGAUCUAAGAGGAUAUGUCUACCAAGGCCUCAAACCAAGCUUGG-3’ VSV2对应的RNA序列(SEQ ID NO17) 5’-CGGAAUUCCGCUACCAAGGCCUCAAAUCCGGAAAUGUAUCAAUCAUACAUGUCAACAGCUACUUGUAUGGAGCAUUAAAGGACAUCCGGGGUAAGUUGGAUAAAGAUUGGUCAAGUUUCGGAAUAAACAUCGGGAAAGCAGGGGAUACAAUCGGAAUAUUUGACCUUGUAUCCUUGAAAGCCCUGGACGGCGUACUUCCAGAUGGAGUAUCGGAUGCUUCCAGAACCAGCGCAGAUGACAAAUGGUUCCAAGCUUGG-3’ VSV3对应的RNA序列(SEQ ID NO18) 5’-CGGAAUUCCGAGAACCAGCGCAGAUGACAAAUGGUUGCCUUUGUAUCUACUUGGCUUAUACAGAGUGGGCAGAACACAAAUGCCUGAAUACAGAAAAAAGCUCAUGGAUGGGCUGACAAAUCAAUGCAAAAUGAUCAAUGAACAGUUUGAACCUCUUGUGCCAGAAGGUCGUGACAUUUUUGAUGUGUGGGGAAAUGACAGUAAUUACACAAAAAUUGUCGCUGCAGUGGACAUGUUCCAAGCUUGG-3’ VSV4对应的RNA序列(SEQ ID NO19) 5’-CGGAAUUCCGUCGCUGCAGUGGACAUGUUCUUCCACAUGUUCAAAAAACAUGAAUGUGCCUCGUUCAGAUACGGAACUAUUGUUUCCAGAUUCAAAGAUUGUGCUGCAUUGGCAACAUUUGGACACCUCUGCAAAAUAACCGGAAUGUCUACAGAAGAUGUAACGACCUGGAUCUUGAACCGAGAAGUUGCAGAUGAAAUGGUCCAAAUGAUGCUUCCAGGCCAACCAAGCUUGG-3’ VSV5对应的RNA序列(SEQ ID NO20) 5’-CGGAAUUCCGCAAAUGAUGCUUCCAGGCCAAGAAAUUGACAAGGCCGAUUCAUACAUGCCUUAUUUGAUCGACUUUGGAUUGUCUUCUAAGUCUCCAUAUUCUUCCGUCAAAAACCCUGCCUUCCACUUCUGGGGGCAAUUGACAGCUCUUCUGCUCAGAUCCACCAGAGCAAGGAAUGCCCGACAGCCUGAUGACAUUGAGUAUACAUCUCUUACUACAGCAGGUUUGUUGUACGCUCCAAGCUUGG-3’ 用RNA纯化试剂盒(QIAGEN，RNeasy Mini Handbook)纯化RNA，分别用DEPC处理水或用DEPC处理过的PBS缓冲液或代血浆(羟乙基淀粉20(HES20)氯化钠注射液，HES20)稀释为103copies/ml，104copies/ml，105copies/ml，106copies/ml，107copies/ml及108copies/ml，-80℃保存备用。
实施例6对MB-P病毒灭活效果的质量评价 在实施例3步骤1获得的含病毒血浆中，加入亚甲蓝(MB)，使终浓度分别为0.5μmol/L，1.0μmol/L，1.5μmol/L，随即用30000Lux可见光照射，照射时间分别为0’(不照射)，30’，60’。
在对上述血浆进行MB-P处理的同时，采用相同的条件，对实施例5获得的质控品进行灭活，灭活结束后，质控品取样。
1.普通PCR检测(结果表明经照射后的样品均未扩增出片段。其中MB终浓度为1.0μmol/L的电泳结果如图5-图9) 1)对实施例5中含VSV病毒完整颗粒质控品，用实施例3步骤3反转录后进行病毒核酸检测。照射时间为0’的质控品可以扩增出产物，其余未扩增出产物。说明MB-P处理后达到了病毒灭活的效果。
2)对实施例5中含VSV病毒基因的重组质粒的质控品，抽提质粒，EcoRI、HindIII双酶切后作为PCR模板，以实施例3步骤3的(2)中引物，对用相应引物扩增产物克隆获得的重组质粒质控品进行PCR进行病毒核酸检测。扩增系统模板5μl，10mMdNTP 0.5μl，Taq酶0.25μl，5×Buffer 5μl，Mg2+(250mM)终浓度2.5mM，引物及模板终浓度200mM，灭菌双蒸水补充体积至25μl。实时荧光定量PCR反应程序95℃预变性5分钟，94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸34秒，其中变性、退火和延伸循环35次。照射时间为0分钟(即不光照)的质控品可以扩增出产物，其余未扩增出产物。说明MB-P处理后达到了病毒灭活的效果。
3)对实施例5中含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品，用实施例3步骤3反转录后进行病毒核酸检测。以实施例3步骤3的(2)中引物，对用相应引物扩增产物克隆获得的重组质粒体外转录的RNA片段的质控品进行PCR进行病毒核酸检测。照射时间为0’的质控品可以扩增出产物，其余未扩增出产物。说明MB-P处理后达到了病毒灭活的效果。
2.实时荧光定量PCR检测及结果 1)对实施例5中含VSV病毒完整颗粒质控品，用实施例3的方法提取病毒RNA，用实施例1步骤4的方法反转录成DNA，作为PCR模板。
2)对实施例5中含VSV病毒基因的重组质粒的质控品，抽提质粒，EcoRI、HindIII双酶切后作为PCR模板。
3)对实施例5中含VSV病毒基因体外转录的RNA片段的质控品，用实施例3的方法提取病毒RNA，用实施例1步骤4的方法反转录成DNA，作为PCR模板。
针对VSV基因序列，设计荧光定量PCR引物及Taqman探针，引物序列同实施例3步骤3(2)，相应探针序列如下表 引物及探针由大连宝生物(Takara)公司合成。使用上述引物，模板5μl，10mM dNTP0.5μl，Taq酶0.25μl，5×Buffer 5μl，Mg2+(250mM)终浓度2.5mM，引物及模板终浓度200mM，灭菌双蒸水补充体积至25μl。在ABI 7500型实时荧光定量扩增仪上进行检测。循环参数为94℃变性30秒，53℃退火30秒，72℃延伸34秒，72℃时收集荧光信号，共进行45个循环，用实施例5中2(1)构建的质粒，以107copies/ml浓度起，以10倍梯度稀释作为标准品同时反应，绘制标准曲线，确定不同灭活条件处理后样品的SV浓度。其中MB终浓度为1.0μmol/L的实时荧光定量PCR电泳结果如图10-14。结果发现随着灭活过程的进行，PCR产物逐步递减，即病毒核酸逐步被降解。结果动态反映了MB-P灭活的效果。
3.MB-P处理后VSV细胞病变检测 用实施例4的方法对本例中经MB-P处理的血浆取样进行细胞病变检测，结果如下 不同浓度、不同接触时间VSV感染性灭活结果
*表示所用方法已测不到病毒滴度 本步骤的目的是以现有技术来评价MB-P的效果，结果可见，与前述质控品检测结果一样，MB-P处理后达到了病毒灭活的效果。本步骤进一步验证了可以采用本发明的方法来评价MB-P灭活效果。
SEQUENCE LISTING
<110>上海市血液中心
<120>亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价方法及其质控品
<130>PCNXY070056
<160>34
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>1
cggaattccg aaaggctcag gagaaact28
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>2
ccaagcttgg tttgaggcct tggtagac28
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>3
cggaattccg ctaccaaggc ctcaaatc28
<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>4
ccaagcttgg aaccatttgt catctgcg28
<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>5
cggaattccg agaaccagcg cagatgac28
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>6
ccaagcttgg aacatgtcca ctgcagcg28
<210>7
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>7
cggaattccg tcgctgcagt ggacatgt28
<210>8
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>8
ccaagcttgg ttggcctgga agcatcat28
<210>9
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>9
cggaattccg caaatgatgc ttccaggc28
<210>10
<211>28
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>10
ccaagcttgg agcgtacaac aaacctgc28
<210>11
<211>233
<212>DNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>11
cggaattccg aaaggctcag gagaaacttt aacagtaatc aaaatgtctg ttacagtcaa60
gagaatcatt gacaacacag tcatagttcc aaaacttcct gcaaatgagg atccagtgga120
atacccggca gattacttca gaaaatcaaa ggagattcct ctttacatca atactacaaa180
aagtttgtca gatctaagag gatatgtcta ccaaggcctc aaaccaagct tgg 233
<210>12
<211>257
<212>DNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>12
cggaattccg ctaccaaggc ctcaaatccg gaaatgtatc aatcatacat gtcaacagct60
acttgtatgg agcattaaag gacatccggg gtaagttgga taaagattgg tcaagtttcg120
gaataaacat cgggaaagca ggggatacaa tcggaatatt tgaccttgta tccttgaaag180
ccctggacgg cgtacttcca gatggagtat cggatgcttc cagaaccagc gcagatgaca240
aatggttcca agcttgg 257
<210>13
<211>247
<212>DNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>13
cggaattccg agaaccagcg cagatgacaa atggttgcct ttgtatctac ttggcttata60
cagagtgggc agaacacaaa tgcctgaata cagaaaaaag ctcatggatg ggctgacaaa120
tcaatgcaaa atgatcaatg aacagtttga acctcttgtg ccagaaggtc gtgacatttt180
tgatgtgtgg ggaaatgaca gtaattacac aaaaattgtc gctgcagtgg acatgttcca240
agcttgg 247
<210>14
<211>235
<212>DNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>14
cggaattccg tcgctgcagt ggacatgttc ttccacatgt tcaaaaaaca tgaatgtgcc60
tcgttcagat acggaactat tgtttccaga ttcaaagatt gtgctgcatt ggcaacattt120
ggacacctct gcaaaataac cggaatgtct acagaagatg taacgacctg gatcttgaac180
cgagaagttg cagatgaaat ggtccaaatg atgcttccag gccaaccaag cttgg 235
<210>15
<211>248
<212>DNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>15
cggaattccg caaatgatgc ttccaggcca agaaattgac aaggccgatt catacatgcc60
ttatttgatc gactttggat tgtcttctaa gtctccatat tcttccgtca aaaaccctgc120
cttccacttc tgggggcaat tgacagctct tctgctcaga tccaccagag caaggaatgc180
ccgacagcct gatgacattg agtatacatc tcttactaca gcaggtttgt tgtacgctcc240
aagcttgg 248
<210>16
<211>233
<212>RNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>16
cggaauuccg aaaggcucag gagaaacuuu aacaguaauc aaaaugucug uuacagucaa60
gagaaucauu gacaacacag ucauaguucc aaaacuuccu gcaaaugagg auccagugga120
auacccggca gauuacuuca gaaaaucaaa ggagauuccu cuuuacauca auacuacaaa180
aaguuuguca gaucuaagag gauaugucua ccaaggccuc aaaccaagcu ugg 233
<210>17
<211>257
<212>RNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>17
cggaauuccg cuaccaaggc cucaaauccg gaaauguauc aaucauacau gucaacagcu60
acuuguaugg agcauuaaag gacauccggg guaaguugga uaaagauugg ucaaguuucg120
gaauaaacau cgggaaagca ggggauacaa ucggaauauu ugaccuugua uccuugaaag180
cccuggacgg cguacuucca gauggaguau cggaugcuuc cagaaccagc gcagaugaca240
aaugguucca agcuugg 257
<210>18
<211>247
<212>RNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>18
cggaauuccg agaaccagcg cagaugacaa augguugccu uuguaucuac uuggcuuaua60
cagagugggc agaacacaaa ugccugaaua cagaaaaaag cucauggaug ggcugacaaa120
ucaaugcaaa augaucaaug aacaguuuga accucuugug ccagaagguc gugacauuuu180
ugaugugugg ggaaaugaca guaauuacac aaaaauuguc gcugcagugg acauguucca240
agcuugg 247
<210>19
<211>235
<212>RNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>19
cggaauuccg ucgcugcagu ggacauguuc uuccacaugu ucaaaaaaca ugaaugugcc60
ucguucagau acggaacuau uguuuccaga uucaaagauu gugcugcauu ggcaacauuu120
ggacaccucu gcaaaauaac cggaaugucu acagaagaug uaacgaccug gaucuugaac180
cgagaaguug cagaugaaau gguccaaaug augcuuccag gccaaccaag cuugg 235
<210>20
<211>248
<212>RNA
<213>Vesicular stomatitis virus
<400>20
cggaauuccg caaaugaugc uuccaggcca agaaauugac aaggccgauu cauacaugcc60
uuauuugauc gacuuuggau ugucuucuaa gucuccauau ucuuccguca aaaacccugc120
cuuccacuuc ugggggcaau ugacagcucu ucugcucaga uccaccagag caaggaaugc180
ccgacagccu gaugacauug aguauacauc ucuuacuaca gcagguuugu uguacgcucc240
aagcuugg 248
<210>21
<211>27
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>21
cggaattccg accatagata ctcccct 27
<210>22
<211>32
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>22
cgggatcccg gaagatagag aaagagcaac cg32
<210>23
<211>844
<212>DNA
<213>Hepatitis C virus
<400>23
accatagata ctcccctgtg aggaactact gtcttcacgc agaaagcgtc tagccatggc60
gttagtatga gtgttgtgca gcctccagga ccccccctcc cgggagagcc atagtggtct120
gcggaaccgg tgagtacacc ggaattgcca ggacgaccgg gtcctttctt ggatcaaccc180
gctcaatgcc tggagatttg ggcgtgcccc cgcgagactg ctagccgagt agtgttgggt240
cgcgaaaggc cttgtggtac tgcctgatag ggtgcttgcg agtgccccgg gaggtctcgt300
agaccgtgca tcatgagcac aaatcctaaa cctcaaagaa aaaccaaacg taacaccaac360
cgccgcccac aggacgttaa gttcccgggc ggtggtcaga tcgttggtgg agtttacctg420
ttgccgcgca ggggccccag gttgggtgtg cgcgcgacta ggaagacttc cgagcggtcg480
caacctcgtg gaaggcgaca acctatcccc aaggctcgcc ggcccgaggg taggacctgg540
gctcagcccg ggtacccttg gcccctctat ggcaacgagg gtatggggtg ggcaggatgg600
ctcctgtcac cccgtggctc tcggcctagt tggggcccca cagacccccg gcgtaggtcg660
cgtaatttgg gtaaggtcat cgataccctt acatgcggct tcgccgacct catggggtac720
attccgcttg tcggcgcccc cctagggggc gctgccaggg ccctggcaca tggtgtccgg780
gttctggagg acggcgtgaa ctatgcaaca gggaatctgc cgcggttgct ctttctctat840
cttc 844
<210>24
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>24
gaactactgt cttcacgcag aaag24
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>25
ctggcaattc cggtgtactc a 21
<210>26
<211>24
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>26
ccgcagacca ctatggctct cccg24
<210>27
<211>17
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>27
tgaccgctat gtcccaa 17
<210>28
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>28
gaaatgttaa aaacaaaat19
<210>29
<211>19
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>引物
<400>29
acctccttga ccagtagag19
<210>30
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>30
aggcagggtt tttgacggaa ga22
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>31
ctcatttgca ggaagttttg ga22
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>32
aacttacccc ggatgtcctt ta22
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>33
gcccatccat gagctttttt ct22
<210>34
<211>22
<212>DNA
<213>artificial sequence
<220>
<223>探针
<400>34
aaaatgtcac gaccttctgg ca2权利要求
1. 一种亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价的检测方法，包括以下步骤在对血液或血液制品进行亚甲蓝光化学灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含VSV病毒完整颗粒或VSV病毒基因的重组质粒或VSV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中VSV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。
2. 如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述特异性引物序列选自下组中的一组
1)CGGAATTCCG AAA GGC TCA GGA GAA ACT及CCAAGCTTGGTTT GAG GCC TTG GTA GAC；
2)CGGAATTCCG CTA CCA AGG CCT CAA ATC及CCAAGCTTGGAAC CAT TTG TCA TCT GCG；
3)CGGAATTCCG AGA ACC AGC GCA GAT GAC及CCAAGCTTGGAAC ATG TCC ACT GCA GCG；
4)CGGAATTCCG TCG CTG CAG TGG ACA TGT及CCAAGCTTGGTTG GCC TGG AAG CAT CAT；
5)CGGAATTCCG CAA ATG ATG CTT CCA GGC及CCAAGCTTGGAGC GTA CAA CAA ACC TGC
3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述VSV病毒基因的重组质粒含有序列SEQID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15。
4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述VSV病毒基因体外转录的RNA片段含有序列SEQ ID NO16或SEQ ID NO17或SEQ ID NO18或SEQ ID NO19或SEQ ID NO20。
5. 如权利要求1所述的检测方法，其特征为，所述PCR技术为普通PCR或实时荧光定量PCR。
6. 一种如权利要求1所述的检测方法中使用的质控品，其特征在于，质控品含有包含序列SEQ ID NO11或SEQ ID NO12或SEQ ID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15的重组质粒或包含序列SEQ ID NO16或SEQID NO17或SEQ ID NO18或SEQID NO19或SEQ ID NO20的RNA。
7. 如权利要求6所述的质控品，其特征在于，所述重组质粒为序列SEQ ID NO11或SEQID NO12或SEQID NO13或SEQ ID NO14或SEQ ID NO15与pBluescript II SK(+)重组获得的质粒。
8. 如权利要求6所述的质控品，其特征在于，所述RNA片段的序列为SEQ ID NO16或SEQ ID NO17或SEQ ID NO18或SEQ ID NO19或SEQID NO20。
全文摘要
本发明涉及血液病毒灭活效果质量评价领域。本发明解决了现有技术中MB-P灭活效果质量评价方法价格贵，周期长，不适合在常规工作中开展的问题，公开了一种新的亚甲蓝光化学病毒灭活效果质量评价检测方法，包括以下步骤在对血液或血液制品进行灭活的同时，对质控品进行相同条件的灭活，质控品含VSV病毒完整颗粒或含VSV病毒基因的重组质粒或含VSV病毒基因体外转录的RNA片段，通过特异性引物，利用PCR技术扩增质控品中VSV病毒基因的特定区域，通过对PCR结果的监测，从分子水平对亚甲蓝光化学病毒灭活效果进行质量评价。同时还公开了其质控品。本发明操作简单，准确度好，实验周期短，需要的实验条件容易达到，更为经济有效。
文档编号C12N15/63GK101285093SQ200710039360
公开日2008年10月15日 申请日期2007年4月11日 优先权日2007年4月11日
发明者岚 郑, 迅 王, 黄宇闻, 琴 莫, 刘晓颖, 钱开诚 申请人:上海市血液中心