专利名称：：一种海因酶基因及其编码的氨基酸和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种海因酶基因及其编码的氨基酸和应用。
背景技术：
：D-氨基酸及其衍生物是医药及食品领域的重要原材料，被广泛地用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂和甜味剂等的中间物。其中，D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)是合成半合成广谱抗生素阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢罗奇有头孢羟胺唑等的重要原料。D-对羟基苯甘氨酸的传统生产工艺需要通过化学合成和拆分(D-对羟基苯甘氨酸的合成过程如图1所示)，该工艺存在着收率低，环境污染严重等缺点。自上世纪八十年代以来，酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究和应用得到发展，其过程如下首先利用化学手段合成D，L-对羟基苯海因(D，L-HPH)作为生物酶作用的底物，然后利用生物酶将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲缩合得到D，L-对羟基苯乙内酰苯海因(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)立体专一性水解开环生成D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在碱性条件或者存在消旋酶的条件下，未被开环的L-型对映体消旋化为D-型从而进一步被转化。通过这种酶促不对称水解反应，可使混消旋的pHPH完全转化为D-HPG。现在，在工业上已有采用固定化的D-海因酶或固定化细胞进行该反应的报道。酶法生产D-对羟基苯甘氨酸在工业上有重要的应用价值，因此对其生产所用的相关酶的研究和改造有重要意义。而D-海因酶可催化5’单替代海因或二氢尿嘧啶的开环，形成氨基甲酰类的中间物，该中间产物可被氨甲酰水解酶降解为D-对羟基苯甘氨基酸，成为半合成β-内酰胺类抗生素的重要中间体。因而，对D-海因酶的研究逐渐成为了相关行业的热点研究课题之一。近年来，人们已经从PseudomonasfluorescensDSM84，BacillusstearothermophilisNS1122A，PseudomonasputidaCCRC12857，Agrobacteriumsp.KNK712，AgrobacteriumradiobacterNRRLB11291克隆出编码海因酶的基因，并对其进行了分子生物学改造，以改进相关的酶学性质。然而，迄今为止尚未见有克隆来源于Jannaschiasp.CCS1的海因酶的报道。
发明内容本发明的目的在于，提供一种来源于Jannaschiasp.CCS1的海因酶基因。本发明的另一个目的在于，提供一种所述的海因酶基因编码的氨基酸。本发明的另一个目的在于，提供一种具有编码SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列的重组质粒。本发明的最后一个目的在于，提供一种所述的海因酶基因的应用。为实现上述目的，本发明通过PCR方法从Jannaschiasp.CCS1基因组扩增获得海因酶基因。再将扩增后获得的海因酶的DNA片段与载体pET28a连接，从而获得海因酶的重组质粒pETJ2。将所述的海因酶的重组质粒转入到E.coliBL21(DE3)中，并将所述的工程菌BL21(DE3)/pETJ2发酵培养，从而获得所述的海因酶基因编码的氨基酸。将所获得的海因酶基因的表达产物，以对羟基苯海因作为底物，制备D-对羟基苯甘氨酸，并与来源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶进行了比较。本发明提供的海因酶基因编码的氨基酸序列不同于目前已知来源的海因酶，其在以对羟基苯海因作为底物时表现出较高的酶活，明显高于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。虽然，在本发明中，构建表达载体时，使用的是pET28a，但是对本领域的工作人员而言，使用其它的载体来构建相应的表达载体，如pET系统，pSU系统，pTrc系统，pMW系统，pKK系统，RSF1010等常用的表达载体，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。同样的，对本领域的工作人员而言，将构建好的相应表达载体转化到其它的微生物，如假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷菌属(Serratia)、农杆菌属(Agrobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)等中，获得相应的转化型微生物，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。图1是D-对羟基苯甘氨酸的合成示意图。图2是新的海因酶表达载体pETJ2的构建示意图。图3是在大肠杆菌中过表达海因酶的电泳图。其中各泳道分别为1为诱导前的BL21(DE3)/pETJ2；2为诱导后的BL21(DE3)/pETJ2；3为蛋白Marker。图4是利用HPLC检测海因酶反应生成产物的曲线图。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件进行。实施例1、含有目的基因的表达载体和工程菌的构建1.1、引物设计根据Genebank公布的Jannaschiasp.CCS1的基因组序列，设计引物A和B，其序列如下引物A5’-AGGGGGATCCATGAGCAAGGTGATCAAGGG-3’；引物B5’-CTAGAAGCTTTCAAACCCCCGCCGGAATG-3’。1.2、PCR扩增用A和B为引物，以来源于Jannaschiasp.CCS1的基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因。反应体系1×PCRBufferforKODplus，2mMMgSO4，引物A和引物B各0.4μM，dJannaschiasp.CCS1基因组DNA100ng，0.2mMdNTP，1UKODplus/50μl。反应条件94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。反应结束后，按操作手册，将PCR产物用华舜公司的胶回收试剂盒回收纯化约1.5kb的产物。对回收产物进行测序，测序结果显示，扩增获得的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列，其对应的氨基酸序列如SEQIDNO2所示。以来源于Agrobacteriumsp.KNK712的D-海因酶的氨基酸序列(SEQIDNO1)作为Query，在GenBank中进行同源性检索。结果显示，该氨基酸序列(SEQIDNO2)与具有SEQIDNO1记载的氨基酸序列(Q409E0)的同源性为40％，根据NCBI的BLAST结果分析，发现其存在海因酶的保守结构域，推测其可能具有海因酶的功能。1.3、构建载体和工程菌构建过程如图2所示，具体操作如下参考操作手册，用BamHI(购自MBI公司)和HindIII(购自MBI公司)分别对PCR扩增产物和pET28a载体(购自Novagen公司)进行双酶切，采用MBI公司的双酶切缓冲液R作为酶切反应的缓冲液。酶切后，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段(PCR产物酶切后片段大小约为1.5kb，pET28a酶切后大小约为5.4kb)，然后参考操作手册，用华舜公司的胶回收试剂盒分别回收并纯化PCR产物的酶切后片段和载体pET28a的酶切后片段。取PCR产物酶切后片段和pET28a载体片段各4μl，1μlT4连接酶缓冲液和1μlT4连接酶，于16℃，连接过夜，收获连接产物，即为表达载体pETJ2。取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。挑取单菌落接入液体培养基中，于37℃，250rpm，培养6-8小时后，抽提质粒，并验证克隆。选取酶切验证正确的克隆测序，以验证序列是否突变。测序结果显示，目的基因的序列没有发生突变。将构建好的表达载体pETJ2转化宿主菌E.coliBL21(DE3)(购自Novagen公司)，得到的工程菌命名为BL21(DE3)/pETJ2。虽然，在本实施例中，构建表达载体时，使用的是pET28a，但是对本领域的工作人员而言，使用其它的载体来构建相应的表达载体，如pET系统，pSU系统，pTrc系统，pMW系统，pKK系统，RSF1010等常用的表达载体，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。同样的，对本领域的工作人员而言，将构建好的相应表达载体转化到其它的微生物，如假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷菌属(Serratia)、农杆菌属(Agrobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)等中，获得相应的转化型微生物，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。实施例2、目的基因的表达挑取E.coliBL21(DE3)/pETJ2的单菌落接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养过夜。将过夜培养的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，于20℃，诱导培养5小时。将菌液于12000rpm离心2分钟后，弃上清。用50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液将沉淀重悬，超声破碎。将破碎后的细胞，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳分析目的蛋白的表达量，结果如图3所示。根据图3的结果可见，目的蛋白的表达量约占总蛋白的30％，可通过在大肠杆菌重组过量表达J2，以利于后续的酶蛋白的固定化和连续转化的工业化生产。实施例3、目的蛋白酶活的测定将实施例2中过夜培养的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，于20℃，诱导培养5小时。收集菌液，离心，弃去上清，并于-20℃冻融一次，然后用50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液将菌体重悬。将重悬后的菌体加入到含1％对羟基苯海因、pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃反应10分钟，加入3.7％的HCl中止酶反应并混匀。将上述反应液于12000rpm离心5分钟，取上清稀释4倍后利用HPLC分析反应产物生成的量(结果如图4所示)，计算酶活，结果如表1所示。酶活计算方法表1、目的蛋白酶活测定结果<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="558">O.D.600μmol/min/ml/ODBL21/pETJ22.2±0.10.016±0.002</table></tables>实施例4、目的蛋白比活的测定将实施例2中过夜培养的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，于20℃，诱导培养5小时。收集菌液，离心，弃去上清，然后用50mMpH8.0的Tris-HCl缓冲液将菌体重悬。将重悬的菌液压榨破壁，采用GE公司NiSepharoseHighPerformance纯化目的蛋白，并用Bradford方法测定目的蛋白浓度。将目的蛋白用50mMpH8.0的Tris-HCl稀释为终浓度0.06mg/mL，加入到含1％对羟基苯海因pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃反应30分钟，加入3.7％的HCl中止酶反应并混匀。将上述反应液于12000rpm离心5分钟，取上清稀释10倍后利用HPLC分析反应产物生成的量(结果如图4所示)，计算酶比活，结果如表2所示。用同样的方法可从含有来源于Agrobacteriumsp.KNK712海因酶的工程菌(CGMCCNo.0520.2)中表达、纯化得到来源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶，并在上述同样的条件下，测定其活性和比活。表2、目的蛋白比活测定结果根据上述实施例中实验结果，可以推定具有SEQIDNO2的氨基酸序列的蛋白，具有海因酶的功能，因此是一种海因酶；且本发明的海因酶不同于目前已知来源的海因酶，其在以对羟基苯海因作为底物时，表现出较高的比活，其比活约为来源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶的4倍，因此，在运用双酶法生产对羟基苯甘氨酸的工业生产中可有较广阔的运用前景。序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>一种海因酶<130>P5071012<160>3<170>PatentInversion3.1<210>1<211>457<212>PRT<213>Agrobacteriumsp.KNK712<400>1MetAspIleIleIleLysAsnGlyThrIleValThrAlaAspGlyIle151015SerArgAlaAspLeuGlyIleLysAspGlyLysIleThrGlnIleGly202530GlyAlaLeuGlyProAlaGluArgThrIleAspAlaAlaGlyArgTyr354045ValPheProGlyGlyIleAspValHisThrHisValGluThrValSer505560PheAsnThrGlnSerAlaAspThrPheAlaThrAlaThrValAlaAla65707580AlaCysGlyGlyThrThrThrIleValAspPheCysGlnGlnAspArg859095GlyHisSerLeuAlaGluAlaValAlaLysTrpAspGlyMetAlaGly100105110GlyLysSerAlaIleAspTyrGlyTyrHisIleIleValLeuAspPro115120125ThrAspSerValIleGluGluLeuGluValLeuProAspLeuGlyIle130135140ThrSerPheLysValPheMetAlaTyrArgGIyMetAsnMetIleAsp145150155160AspValThrLeuLeuLysThrLeuAspLysAlaValLysThrGlySer165170175LeuValMetValHisAlaGluAsnGlyAspAlaAlaAspTyrLeuArg180185190AspLysPheValAlaGluGlyLysThrAlaProIleTyrHisAlaLeu195200205SerArgProProArgValGluAlaGluAlaThrAlaArgAlaLeuAla210215220LeuAlaGluIleValAsnAlaProIleTyrIleValHisValThrCys225230235240GluGluSerLeuGluGluValMetArgAlaLysSerArgGlyValArg245250255AlaLeuAlaGluThrCysThrHisTyrLeuTyrLeuThrLysGluAsp260265270LeuGluArgProAspPheGluGlyAlaLysTyrValPheThrProPro275280285AlaArgAlaLysLysAspHisAspValLeuTrpAsnAlaLeuArgAsn290295300GlyValPheGluThrValSerSerAspHisCysSerTrpLeuPheLys305310315320GlyHisLysAspArgGlyArgAsnAspPheArgAlaIleProAsnGly325330335AlaProGlyValGluGluArgLeuMetMetValTyrGlnGlyValAsn340345350GluGlyArgIleSerLeuThrGlnPheValGluLeuValAlaThrArg355360365ProAlaLysValPheGlyMetPheProGlnLysGlyThrIleAlaVal370375380GlySerAspAlaAspIleValLeuTrpAspProGluAlaGluMetVal385390395400IleGluGlnThrAlaMetHisAsnAlaMetAspTyrSerSerTyrGlu405410415GlyHisLysValLysGlyValProLysThrValLeuLeuArgGlyLys420425430ValIleValAspGluGlySerTyrValGlyGluProThrAspGlyLys435440445PheLeuLysArgArgLysTyrLysGln450455<210>2<211>487<212>PRT<213>Jannaschiasp.CCS1<400>2MetSerLysValIleLysGlyGlyThrIleValThrAlaAspArgGln151015TrpGlnAlaAspValLeuIleGluGlyGluLysIleAlaGluIleGly202530GluAsnLeuArgGlyAspGluValIleAspAlaGluGlyAlaTyrVal354045IleProGlyGlyIleAspProHisThrHisLeuGluMetProPheMet505560GlyThrThrAlaAlaGluThrPheGluThrGlyThrPheAlaAlaAla65707580AlaGlyGlyThrThrMetLeuValAspPheCysLeuProGlyGluAsp859095GlySerLeuLeuSerAlaIleAspAlaTrpAspAlaLysSerLysAsp100105110GlnIleCysValAspIleSerTyrHisMetAlaIleThrGlyTrpSer115120125GluSerIlePheAsnGluMetAlaAspValValAsnValArgGlyIle130135140AsnThrPheLysHisPheMetAlaTyrLysGlyAlaLeuMetIleGlu145150155160AspAspGluMetPheSerSerPheLysArgCysAlaGluLeuGlyAla165170175LeuProLeuValHisAlaGluAsnGlyAspIleValGlnGluLeuGln180185190GlnLysTyrMetAlaMetGlyValThrGlyProGluGlyHisAlaTyr195200205SerArgProProGluValGluGlyGluAlaAlaAsnArgAlaIleMet210215220IleAlaAspAlaAlaGlyThrProLeuTyrIleValHisValSerCys225230235240GluGlnAlaHisGluAlaIleArgArgAlaArgGlnLysGlyMetArg245250255ValPheGlyGluProLeuIleGlnHisLeuThrLeuAspGluSerGlu260265270TyrPheAsnLysAspTrpGlnTyrAlaAlaArgArgValMetSerPro275280285ProPheArgAsnLysGluHisGlnAspGlyLeuTrpAlaGlyLeuAla290295300AlaGlySerLeuGlnValValAlaThrAspHisAlaAlaPheThrAsp305310315320GluGlnLysArgMetGlyValAspAsnPheGlyMetIleProAsnGly325330335ThrGlyGlyLeuGluGluArgMetAlaMetLeuTrpThrArgGlyVal340345350GluThrGlyArgLeuThrProGluGluPheValAlaValThrSerSer355360365AsnIleAlaLysIleLeuAsnIleTyrProMetLysGlyGlyIleAsn370375380ValGlyGlyAspAlaAspIleValValTrpAspProLysLeuGlyArg385390395400ThrIleThrThrAlaThrAlaLysSerIleLeuAspTyrAsnValPhe405410415GluGlyMetGluValSerAlaSerProArgTyrThrLeuSerArgGly420425430AspValValTrpAlaAlaGlyGlnAsnSerGlnProGlnProGlyArg435440445GlyLysPheValLysArgProProAlaAlaSerAlaSerGlnAlaLeu450455460SerLysTrpLysAlaLeuAsnThrProArgLysIleGluArgAspPro465470475480MetAsnIleProAlaGlyVal485<210>3<211>1464<212>DNA<213>Jannaschiasp.CCS1<400>3atgagcaaggtgatcaagggcggcacgattgtgaccgcagaccgtcaatggcaggcggac60gtgttgatcgagggcgaaaagattgccgagatcggggagaacctgcgcggggatgaggtg120atcgacgcggaaggcgcctatgtgatcccgggcggcatagacccccacacgcatcttgag180atgcccttcatgggcaccacggcggcggagacgttcgagacgggcacctttgcggcggca240gcgggcggcaccacgatgctggtcgatttctgccttccgggcgaggatggcagccttttg300tccgccatcgatgcctgggacgccaaatcgaaggatcagatctgcgttgatatctcctac360cacatggcgatcaccggctggtcggagagcattttcaatgagatggcggacgttgttaat420gtgcgcggcatcaacacatttaagcatttcatggcctataaaggcgcgctgatgatcgag480gatgacgagatgttttcgtcgttcaagcgctgcgctgaattgggcgcgctgccgctggtc540catgccgaaaacggcgatatcgtccaggagttgcaacagaaatacatggcgatgggcgtg600acggggccggagggtcacgcatattcccgtccgcctgaggtcgaaggggaagccgccaac660cgcgcgatcatgatcgccgacgccgctggcacgccgttgtatatcgtccatgtgtcgtgt720gagcaggcccatgaggccatccgccgtgcccgtcagaaggggatgcgggtcttcggggag780ccactgatccagcacctgacgctggatgagagcgagtatttcaacaaggattggcaatat840gcggcccgccgggtcatgtccccgccgtttcgcaacaaagagcatcaggacggtctttgg900gcaggtcttgccgctgggtccttgcaggttgtggccacggaccacgccgccttcaccgac960gagcaaaagcgcatgggcgtggacaatttcggcatgatccccaacggcaccggcgggctt1020gaggagcgcatggcaatgttgtggacgcgcggcgtggaaacgggccgcctgacgccggaa1080gaattcgttgcggtgacgtcatcgaacatcgccaagatcctcaacatttacccaatgaag1140ggtggcatcaacgtcggcggcgacgcggatatcgtggtctgggacccgaaactgggccgc1200acgatcacgacggcaacggcgaaatctatccttgattacaatgtgttcgagggaatggag1260gtgagcgcctccccccgctacaccctgtcgcgcggggatgtggtgtgggcggcggggcaa1320aacagccagccgcaaccgggccgtgggaaattcgtgaaacggcccccggcggcgagtgcg1380tcccaggcgctgagcaagtggaaggcgttgaacacgccgcgcaagatcgagcgcgacccg1440atgaacattccggcgggggtttga146权利要求1.一种海因酶基因，其特征在于，所述海因酶基因来源于Jannaschiasp.CCS1。2.如权利要求1所述的海因酶基因，其特征在于，所述基因编码的氨基酸具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。3.如权利要求1或2所述的海因酶基因，其特征在于，所述的基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。4.如权利要求1-3任一项所述的海因酶基因编码的氨基酸。5.如权利要求4所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。6.如权利要求5所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸由具有SEQIDNO3所示的DNA序列的海因酶基因所编码。7.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒具有编码SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列。8.如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。9.如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括pET系统，pSU系统，pTrc系统，pMW系统，pKK系统，RSF1010。10.如权利要求9所述的重组质粒，其特征在于，载体为pET28a。11.如权利要求1-3任一项所述的海因酶基因的应用，其特征在于，用于制备海因酶。12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，包括以下步骤A、构建重组质粒；B、转化宿主菌；C、发酵培养，获得海因酶。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述重组质粒具有编码SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列。14.如权利要求13所述的重组质粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。15.如权利要求14所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括pET系统，pSU系统，pTrc系统，pMW系统，pKK系统，RSF1010。16.如权利要求15所述的重组质粒，其特征在于，载体为pET28a。17.如权利要求11或12所述的应用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。18.如权利要求1-3任一项所述的海因酶基因用于制备D-对羟基苯甘氨酸的应用。19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，包括以下步骤A、构建重组质粒；B、转化宿主菌；C、发酵培养，制备海因酶发酵液；D、利用发酵液将D，L-对羟基苯海因底物转化为D-对羟基苯甘氨酸。20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述重组质粒具有编码SEQIDNO2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列。21.如权利要求20所述的重组质粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQIDNO3所示的DNA序列。22.如权利要求21所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括pET系统，pSU系统，pTrc系统，pMW系统，pKK系统，RSF1010。23.如权利要求22所述的重组质粒，其特征在于，载体为pET28a。24.如权利要求18或19所述的应用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQIDNO2所示的氨基酸序列。全文摘要本发明提供了一种海因酶基因，以及该基因编码的氨基酸、包含该基因的重组质粒和该基因的应用。本发明提供的海因酶基因所编码的氨基酸序列不同于目前已知来源的海因酶，所述海因酶基因的表达产物在以对羟基苯海因作为底物时表现出较高的酶活，其比活明显高于目前工业生产中常用的来源于Agrobacteriumsp.KNK712的海因酶。文档编号C12N9/78GK101058818SQ200710039229公开日2007年10月24日申请日期2007年4月6日优先权日2007年4月6日发明者姜卫红,蔡渊恒,姜世民,陈军,杨蕴刘,杨晟申请人:中国科学院上海生命科学研究院