专利名称：一种固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及固定化细胞载体及其制备方法，特别是涉及一种用于固定微生物细胞的聚丙烯酰胺大孔凝胶固定化材料及其制备方法。
背景技术：
固定化酶技术是通过物理或化学的方法将酶连接在一定的固相载体上成为固定化酶的技术，而固定化细胞技术是在固定化酶技术的基础上发展起来的一种生物固定化技术，是将完整的细胞连接在固相载体上，既免去了破碎细胞提取酶的程序，又保持了酶的完整性和活性的稳定。相比固定化酶技术，固定化细胞技术不但能够保持酶的原始状态，加强稳定性，而且本身是多酶系统，无需辅酶再生，因而也节省了酶分离费用；此外，固定化细胞技术还具有细胞浓度高、流失少，菌体细胞易于分离，可多次重复使用，操作简单和浪费少等优点，在生物工程、环境工程等领域具有良好的应用前景。目前，常用的细胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、交联法和截留法等，可根据不同的固定对象和应用需求选取不同的固定化方法，其中吸附法和包埋法是固定细菌(如纤维素降解菌等)的主要方法。表面吸附固定法的优点是能有效的保持产酶微生物(主要是真菌)的生长和产酶活性，并且载体可以重复利用。然而，用吸附法固定微生物细胞时，pH值、细胞壁的组分、载体的性质等均可影响细胞与载体之间的相互作用，只有当细胞的性质、载体的特征及细胞与载体间的作用等参数配合恰当时，才能形成稳定的微生物细胞-载体复合物，此外，细胞与载体之间的结合力较弱，操作的稳定性也较差，因而吸附法在实际应用当中仍存在一定的技术问题。包埋法是将微生物封闭在天然高分子多糖类或合成高分子凝胶的网络中。细菌、酵母等完整细胞的固定化一般采用聚丙烯酰胺、海藻酸钠和卡拉胶或聚合物凝胶作为载体，其中聚丙烯酰胺由于传质性能和化学稳定性均相对较优，成为最为常用的固定化材料。然而传统化学交联聚合法由于聚合过程放热，从而对菌体的活性有较大的影响，并且交联剂和残留的单体如丙烯酰胺，对包埋的菌体具有毒性作用，因而也将影响到菌体的活性。因此，在传统常温聚丙烯酰胺载体制备法的基础上发展了冷冻聚丙烯酰胺载体制备技术，可以明显降低底物和氧的传质扩散阻力，使微生物受丙烯酰胺单体的毒害作用降低，具有更高的产酶活性。但是，冷冻聚丙烯酰胺载体制备技术中的聚合和交联过程在空间上存在不均匀性，由此导致形成的凝胶孔隙大小和孔隙度的不均匀，并且该技术对温度条件要求严格，聚合反应温度越低，孔径就越小，传质效率就越低；反之聚合反应温度越高，孔径就越大，载体的强度就越低。因此，利用冷冻技术制备固定化细胞载体的操作相对困难，难以进行大规模制备和应用。基于目前的研究，丙烯酰胺单体用化学聚合或辐照聚合后得到的凝胶，孔径一般在0.5μm以下，而具有纤维素降解能力的细菌直径在1μm以上，真菌菌丝体则更长，并且大多分泌的是胞内酶，而细菌的纤维素酶位于细胞膜上，细菌需要附着到纤维素上方能对其进行降解，因此按照传统方法制备的固定化细菌无法直接降解纤维素。因此，现有的固定化细胞载体的制备方法对菌体活性存在抑制作用、操作过程难以精确控制、且因载体孔径过小还会阻碍菌体与底物接触等技术问题，特别是对纤维素降解菌的细胞固定化技术尚不成熟。
发明内容
本发明的目的是一种既能够使部分菌体扩散与底物充分接触又能够使部分菌体固定于载体，且能重复利用的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
本发明所提供的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体，是先制备含丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)单体的混合溶液，然后向该混合溶液中加入NaCl至饱和，再将上述溶液移至凝胶载体制备容器中，均匀加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm，随后排除溶液和容器中的氧气，密封容器，再用放射线辐照使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合，最后将经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴后得到的既可用于液相接种又可用于固相接种的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
所述溶液中丙烯酰胺单体的浓度为90-100g/L，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的浓度为4-6g/L。
所述NaCl粉末的粒径可根据所要固定的目的微生物细胞随意选择，如10-1000μm。
所述放射线可为Co60源γ射线或X射线等，优选为Co60源γ射线。
本发明的第二个目的是提供一种上述固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的制备方法。
本发明所提供的制备方法，包括以下步骤1)制备含90-100g/L丙烯酰胺单体和4-6g/L N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，再向该混合溶液中加入NaCl至饱和，以NaCl不再溶解为止；2)将步骤1)的NaCl饱和溶液移至凝胶载体制备容器中，均匀加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm；3)排除溶液和容器中的氧气，然后密封容器，以防止空气进入；
4)用放射线辐照，以使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合；5)将步骤4)经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴，以溶去未交联聚合的丙烯酰胺单体和/或N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体及盐颗粒模板，得到既可用于液相接种又可用于固相接种的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
在上述制备方法中，步骤1)中用于制备丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体混合溶液的溶剂可为去离子水或蒸馏水等极性溶剂，优选为去离子水。
步骤2)中所用的NaCl粉末的粒径可根据所要固定的目的微生物细胞随意选择，如10-1000μm。所述NaCl颗粒可通过均匀研磨和过筛等常规方法控制粒径大小。
步骤3)中可用通入氮气的方法排除溶液和容器中的氧气，具体方法为将氮气瓶接上橡胶管一端，所述橡胶管另一端与玻璃管一端连接(如需批量制备，可先将氮气瓶接上气排，再通过橡胶管将气排与若干根玻璃管子连接)，再将玻璃管另一端插入所述凝胶载体制备容器中，伸入所述丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体混合溶液液面下的靠近NaCl粉末处，然后打开气阀并缓慢调节氮气流速，使氮气压力不致于过大喷出溶液，同时又能起到排除氧气的作用；所述通氮除氧时间可为20-30min，通氮之后关闭气阀。
步骤4)中所述放射线可为Co60源γ射线或X射线等，优选为Co60源γ射线；所述辐照剂量可为20-30KGy，放射线辐照处理后凝胶载体的机械性能得到有效提高。
步骤5)中将步骤4)经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴，水浴温度优选为65-85℃，水浴时间优选为60-72小时。
本发明提供了一种固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体及其制备方法。本发明是从保持固定菌体活性和菌体与底物有效接触相结合的角度，提出的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的常温制备技术，具有以下特点1)采用聚丙烯酰胺水凝胶作为基材，并添加BIS作为改性物质，能够有效提高载体的机械强度；2)针对化学聚合中聚合程度不均匀的缺点，本发明采用辐照聚合的方法，从而可以在体系中均匀产生自由基，并且不受所添加的NaCl粉末制孔剂的影响；3)针对传统方法制备的聚丙烯酰胺载体表面光滑致密，没有多孔结构存在的缺点，本发明采用盐颗粒-饱和盐溶液作为制孔模板，通过控制NaCl粉末制孔剂的粒径，可以随意调节聚丙烯酰胺凝胶载体的孔径(几十-几百μm)，从而可以得到大孔凝胶载体，非常适合于需要协同作用的复合纤维素分解菌群，尤其是细菌-真菌复合体的定殖和生长；4)针对化学聚合中残留杂质影响载体性质的缺点，在本发明的制备过程中聚丙烯酰胺凝胶经致孔、交联、辐照聚合后，洗涤除去所有致孔剂和未交联的丙烯酰胺和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体，再放入菌液中吸附菌体，从而能够完全克服传统聚丙烯酰胺包埋处理对细菌产生的毒性影响，同时又能够充分发挥聚丙烯酰胺凝胶优良的生物兼容性；5)本发明载体的机械性能易于通过辐照剂量控制，提高辐照剂量不仅能够提高载体的弹性模量，还可增强其机械强度；但辐照剂量过高，弹性模量增加并不明显，反而会因产生的气体量增多而影响其强度，因此，辐照剂量优选为5-20KGy；6)本发明的聚丙烯酰胺大孔凝胶载体对生物体的亲和性和兼容性好，又具有多孔结构和通透性，能够使部分菌体吸附生长在载体上，另一部分扩散到液态底物中，并吸附到固态底物表面，不仅能够弥补传统固定化细胞载体制备的不足，使载体性质均匀，孔径大小适宜菌体的吸附生长和扩散，可实现固态底物、液态底物和载体的三相平衡，既能充分发挥菌体降解作用，又能使固定化菌体重复利用，扩散出载体的部分菌体起到真菌的胞外酶作用，能够对底物进行降解，而附着在载体上或者内部的菌体即为固定化菌体，可以进行移植重复使用；7)本发明的大孔凝胶载体适合于各种微生物，特别是对能够以酶作用加速纤维素降解的纤维素降解菌的固定，扩散出载体的部分菌体起到真菌胞外纤维素酶的作用，附着在载体上或者内部的菌体即为固定化真菌菌体，释放出的游离细菌可起到纤维素降解作用，吸附在载体上的部分菌体可随载体移入其它培养体系重复使用；8)本发明固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的常温制备技术操作简单、实用，成本低廉，制备条件易于控制，产品机械强度适宜，对菌体无毒性，应用方便。本发明的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体及其制备方法将在固定化微生物(特别是细菌，如纤维素降解菌)的制备中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的制备及其微生物固定化效果的检测一、制备固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体本发明固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的制备方法，包括以下步骤1)在200mL去离子水中溶解19g丙烯酰胺(分析纯)，再加入1g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(分析纯)，待充分溶解后，得到含95g/L丙烯酰胺单体和5g/L N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，再向该混合溶液中加入NaCl颗粒(分析纯)至饱和，以NaCl不再溶解为止；2)将步骤1)的NaCl饱和溶液移入辐照管(20mm×200mm玻璃试管)中，用小勺缓慢向辐照管中均匀加入用研钵研磨均匀的NaCl粉末(粒径约为180-300μm)，NaCl密度较大会沉到管底，添加NaCl粉末直至高度约5cm；
3)用通入氮气的方法排除溶液和容器中的氧气，具体方法为将氮气瓶接上橡胶管一端，所述橡胶管另一端与玻璃管一端连接，再将玻璃管另一端插入所述辐照管中，伸入所述丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体混合溶液液面下的靠近NaCl粉末处，然后打开气阀并缓慢调节氮气流速，使氮气压力不致于过大喷出溶液，同时又能起到排除氧气的作用，通氮除氧20min后关闭气阀，然后立即用硅胶塞封住所述辐照管口，以防止空气进入；4)将所述辐照管置于Co60源γ辐照场进行辐照，辐照剂量为10KGy(5-20Kgy均可)，使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合；5)辐照完毕后，将所述辐照管包上厚纸，用铁锤隔纸敲碎玻璃，同时又保障不会损伤里边的凝胶，取出凝胶，将已制孔凝胶分离开，置于去离子水中，在80℃(65-85℃均可)下水浴72小时，以溶去未交联聚合的丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体及盐颗粒模板，得到固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
二、检测本发明固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的微生物固定化效果以以产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)中国科学院微生物所No.1.1002为例，检测步骤一制备的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的微生物固定化效果，具体方法为首先配制LB液体培养基，并将步骤一制备的固定化细胞大孔凝胶载体剪裁成合适大小，置于LB液体培养基中，封口后一同灭菌，然后向经灭菌的LB液体培养基中接种复壮后的产黄纤维单胞菌，在30℃下恒温振荡(振荡频率120rpm)培养20小时，即可完成产黄纤维单胞菌在所述聚丙烯酰胺大孔凝胶载体上的固定，菌体密度可达4.4×107cfu/cm2，表明产黄纤维单胞菌可以本发明的聚丙烯酰胺大孔凝胶载体为支持物密集附着生长，并可达到一定的动态平衡。用上述相同的方法还对大肠杆菌(Escherichia coli)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、绿色木霉(Trichodermaviride)和里氏木霉(Trichoderma reesei)进行了固定化效果检测，结果均获得了较好的固定效果，菌体密度可达107cfu/cm2以上，表明本发明的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体具有较好的生物兼容性。
此外，还对上述聚丙烯酰胺大孔凝胶载体进行了压缩强度试验和电镜扫描观察，检测结果表明，该载体具有较好的机械性能，抗压强度大。
实施例2、固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的制备及其微生物固定化效果的检测一、制备固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体本发明固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的制备方法，包括以下步骤
1)在200mL去离子水中溶解20g丙烯酰胺(分析纯)，再加入1.2g N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(分析纯)，待充分溶解后，得到含100g/L丙烯酰胺单体和6g/L N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，再向该混合溶液中加入NaCl颗粒(分析纯)至饱和，以NaCl不再溶解为止；2)将步骤1)的NaCl饱和溶液移入辐照管(20mm×200mm玻璃试管)中，用小勺缓慢向辐照管中均匀加入用研钵研磨均匀的NaCl粉末(粒径约为180-300μm)，NaCl密度较大会沉到管底，添加NaCl粉末直至高度约5cm；3)用通入氮气的方法排除溶液和容器中的氧气，具体方法为将氮气瓶接上橡胶管一端，所述橡胶管另一端与玻璃管一端连接，再将玻璃管另一端插入所述辐照管中，伸入所述丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体混合溶液液面下的靠近NaCl粉末处，然后打开气阀并缓慢调节氮气流速，使氮气压力不致于过大喷出溶液，同时又能起到排除氧气的作用，通氮除氧30min后关闭气阀，然后立即用硅胶塞封住所述辐照管口，以防止空气进入；4)将所述辐照管置于Co60源γ辐照场进行辐照，辐照剂量为20KGy(5-20Kgy均可)，使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合；5)辐照完毕后，将所述辐照管包上厚纸，用铁锤隔纸敲碎玻璃，同时又保障不会损伤里边的凝胶，取出凝胶，将已制孔凝胶分离开，置于去离子水中，在70℃(65-85℃均可)下水浴85小时，以溶去未交联聚合的丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体及盐颗粒模板，得到固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
二、检测本发明固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的微生物固定化效果以产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)中国科学院微生物所No.1.1002为例，检测步骤一制备的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的微生物固定化效果，具体方法为首先配制LB液体培养基，并将步骤一制备的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体剪裁成合适大小，置于LB液体培养基中，封口后一同灭菌，然后向经灭菌的LB液体培养基中接种复壮后的产黄纤维单胞菌，在30℃下恒温振荡(振荡频率120rpm)培养20小时，即可完成产黄纤维单胞菌在所述聚丙烯酰胺大孔凝胶载体上的固定，菌体密度可达4.4×107cfu/cm2，表明产黄纤维单胞菌可以本发明的聚丙烯酰胺大孔凝胶载体为支持物密集附着生长，并可达到一定的动态平衡。用上述相同的方法还对大肠杆菌(Escherichia coli)、腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、绿色木霉(Trichoderma viride)和里氏木霉(Trichoderma reesei)进行了固定化效果检测，结果均获得了较好的固定效果，菌体密度可达107cfu/cm2以上，表明本发明的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体具有较好的生物兼容性。
此外，还对上述聚丙烯酰胺大孔凝胶载体进行了压缩强度试验和电镜扫描观察，检测结果表明，该载体具有较好的机械性能，抗压强度大。
权利要求
1.一种固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体，是先制备含丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，然后向该混合溶液中加入NaCl至饱和，再将上述溶液移至凝胶载体制备容器中，均匀加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm，随后排除溶液和容器中的氧气，密封容器，再用放射线辐照使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合，最后将经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴后得到的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
2.根据权利要求1所述的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体，其特征在于所述混合溶液中丙烯酰胺单体的浓度为90-100g/L，N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的浓度为4-6g/L。
3.根据权利要求1所述的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体，其特征在于所述NaCl粉末的粒径为10-1000μm。
4.根据权利要求1或2或3所述的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体，其特征在于所述放射线为Co60源γ射线或X射线。
5.一种制备权利要求1所述的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体的方法，包括以下步骤1)制备含90-100g/L丙烯酰胺单体和4-6g/L N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，再向该混合溶液中加入NaCl至饱和；2)将步骤1)的NaCl饱和溶液移至凝胶载体制备容器中，均匀加入NaCl粉末直至高出液面2-5cm；3)排除溶液和容器中的氧气，然后密封容器；4)用放射线辐照，以使丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体聚合；5)将步骤4)经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴，得到既可用于液相接种又可用于固相接种的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤1)中用于制备丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体混合溶液的溶剂为去离子水或蒸馏水；
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤2)中所用NaCl粉末的粒径为10-1000μm。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中用通入氮气的方法排除溶液和容器中的氧气，具体方法为将氮气瓶接上橡胶管一端，所述橡胶管另一端与玻璃管一端连接，再将玻璃管另一端插入所述凝胶载体制备容器中，伸入所述丙烯酰胺单体和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺单体混合溶液液面下的靠近NaCl粉末处，然后打开气阀并缓慢调节氮气流速，使氮气压力不致于过大喷出溶液，同时又能起到排除氧气的作用；所述通氮除氧时间可为20-30min，通氮之后关闭气阀。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中所述放射线为Co60源γ射线或X射线；所述辐照剂量为20-30KGy。
10.根据权利要求5-9任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤5)中将步骤4)经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴，水浴温度为65-85℃，水浴时间为60-72小时。
全文摘要
本发明公开了一种固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体及其制备方法。该固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体是先制备含丙烯酰胺单体和N，N’－亚甲基双丙烯酰胺单体的混合溶液，然后向该混合溶液中加入NaCl至饱和，再将上述溶液移至凝胶载体制备容器中，均匀加入NaCl粉末直至高出液面2－5cm，随后排除溶液和容器中的氧气，密封容器，再用放射线辐照使丙烯酰胺单体和N，N’－亚甲基双丙烯酰胺单体聚合，最后将经辐照聚合后获得的凝胶进行水浴后得到的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体。本发明的固定化细胞聚丙烯酰胺大孔凝胶载体及其制备方法将在固定化微生物(特别是细菌和真菌的混合菌剂，如纤维素降解复合菌)的制备中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N11/04GK101050456SQ200710065019
公开日2007年10月10日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者陆文静, 王洪涛, 赵岩, 刘晋文 申请人:清华大学