专利名称：一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法
技术领域：
本发明属于一种有效霉醇胺的制备方法，特别是涉及一种从有效霉素制备有效霉醇胺方法。
背景技术：
有效霉醇胺是医药中间体，是治疗糖尿病的新药伏格列波糖的中间体。新药伏格列波糖，对小肠上绒毛膜刷状缘上的双糖水解酶有非常强的抑制作用，而对α-淀粉酶几乎无抑制作用这一特点有别于另一个糖苷酶抑制剂类的降糖药阿卡波糖。对于麦芽糖酶和蔗糖酶，伏格列波糖的抑制作用分别约为阿卡波糖的20倍和30倍；另一方面，对于胰α-淀粉酶的抑制作用，伏格列波糖约为阿卡波糖的1/3000。同时肠道的副作用也相应减轻，所以现有的糖苷酶抑制剂药物中，伏格列波糖的生产应用前景最广。迄今为止，未见利用微生物法生产有效霉醇胺的研究报告和专利申请，采用化学法生产有效霉醇胺虽有报道，如日本武田制药株式会社已有少量生产，但工艺复杂，生产过程中设备腐蚀和环境污染也较为严重，工人防护和生产安全有一定难度，且产品质量不稳定。国内尚无有效霉醇胺产品的登记。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种以有效霉素为原料经过酶催化发酵、氧化、还原和纯化得到有效霉醇胺的方法。有效霉素即井冈霉素。该制备方法工艺设计合理，过程操作简单，较好地解决了环保和安全问题，且产品纯度高，产品质量稳定。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于它由下列步骤组成(a)酶催化发酵以有效霉素为原料，用细小芽孢杆菌进行催化发酵；(b)一次分离浓缩采用弱酸性树脂从步骤(a)所得发酵液中分离得到含有效霉素烯胺、有效霉素霉胺和氧基胺的混合液，并通过膜浓缩得到含有效霉素烯胺的浓缩液；(c)氧化先用保护剂对在步骤(b)所得含有效霉素烯胺的浓缩液中的氨基进行保护；再用氧化剂进行氧化，得到氧化产物；
(d)分离对步骤(c)所得氧化产物进行物理分离，去除杂质；(e)还原先用还原剂对经步骤(d)分离的氧化产物进行还原，得到还原产物；再用脱保护剂对还原产物进行脱保护，以脱除反应产物中氨基上的保护物，得到含有效霉醇胺的混合液；(f)二次分离浓缩步骤(e)所得含有效霉醇胺的混合液经膜分离浓缩，去除脱保护物，得到有效霉醇胺浓缩液；(g)结晶干燥用溶剂对步骤(f)所得有效霉醇胺浓缩液进行稀释后冷却、结晶；晶浆经过滤得到有效霉醇胺结晶品；然后在真空和加热条件下进行干燥。
步骤(a)中所述有效霉素原料为有效霉素滤液、40％A有效霉素粉剂或60％A有效霉素粉剂；当以有效霉素滤液为原料时，投料过程中需调节至pH5～6，当以40％A有效霉素粉剂为原料时，投入量为计料体积的5％，当以60％A有效霉素粉剂为原料时，投入量为计料体积的3％。
在步骤(b)中，分离时所采用的弱酸性树脂为D155、D152或H110树脂，浓缩时所采用的膜的截留分子量为2000。
在步骤(d)中所述的物理分离采用D155、D152或H110树脂。
在步骤(f)中，分离浓缩时所采用的膜的截留分子量为1000。
在步骤(g)中，结晶时冷却到5℃，时间5小时；干燥时所采用的真空度为0.085Mpa，加热温度为50℃，时间4小时。
步骤(c)中所采用的保护剂为N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的1.0％～1.2％(W/V)，所采用的氧化剂为溴素，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.4％～0.5％(W/V)；在步骤(e)中所采用的还原剂为亚硫酸钠，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.4％～0.5％(W/V)，所采用的脱保护剂为氢氧化钡，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.4％～0.5％(W/V)；在步骤(g)中，对有效霉醇胺浓缩液进行稀释所采用的溶剂为乙醇，加入的量与有效霉醇胺浓缩液等量(V/V)。
过程中各相关物质的优选用量为所述保护剂N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的1.04％(W/V)，所述氧化剂溴素的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.44％(W/V)，所述还原剂亚硫酸钠的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.44％(W/V)，所述脱保护剂氢氧化钡的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.44％(W/V)。
本发明工艺合理、操作简便，采用的溶剂单一，生产过程基本无“三废”排放，环保条件好。通过对有效霉素(井冈霉素)滤液或高纯度粉剂(40％A、60％A)酶催化发酵，得到含有效霉素烯胺的发酵混合液，通过一系列的中间反应过程，得到纯度较高、质量稳定的有效霉醇胺产品，具体技术指标有效霉醇胺含量≥98.5％，干燥失重≤0.3％，溶液色泽(1∶100水溶液)为澄清、无色。
具体实施例方式
实施例1在250L种子罐中投入米粉、黄豆粉、磷酸二氢钾，加热至121℃灭菌40分钟，接入酶(细小芽孢杆菌)种子液，于40℃通气培养36小时；在2.3M3发酵罐中发酵，计料体积1.2M3，投入有效霉素滤液1.2M3，调节pH5.5，加入磷酸二氢钾、氯化钾等无机盐，于121℃灭菌40分钟，冷却；将在种子罐培养结束的种子液移入发酵罐中，于28℃培养4天放罐；再将放罐的发酵液通过加温、冷却处理，过滤去除颗粒状杂质。
所得滤液用300L D152弱酸性树脂吸附，流量300L/h，吸附结束用纯水洗涤；然后用NaOH溶液洗脱，洗脱量为树脂体积的1.5倍，洗脱液通过截留分子量为2000的膜浓缩，得到浓缩液25L，有效霉素烯胺含量1.2％。
上述浓缩液加入保护剂N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯0.25kg，在常温常压下反应6小时，取样检测，保护物比例占90％以上，结束反应；把所得保护产物投入200L反应釜中，加入氧化剂溴素0.1kg，在0℃左右反应4小时，取样检测，保护物浓度≤5％，反应结束。
将所得氧化产物用H110树脂分离，去除杂质。
所得浓缩液用0.1kg还原剂亚硫酸钠进行还原，常温下反应2小时，用酸调节至pH5.0；在还原产物中加入0.1kg的脱保护剂氢氧化钡，在60℃反应6小时，得到含有效霉醇胺的混合物。
将有效霉醇胺的混合物通过截留分子量为1000的膜浓缩，去除无机盐，浓缩到1L体积。
将有效霉醇胺浓缩液冷却到5℃结晶，时间5小时，所得晶浆经过滤得到有效霉醇胺结晶粉；在0.085Mpa真空和50℃条件下，干燥4小时，得到有效霉醇胺312g，检测得含量98.5％，水分0.2％，符合其产品质量标准。
实施例2在250L种子罐中投入米粉、黄豆粉、磷酸二氢钾，加热至121℃灭菌40分钟，接入酶(细小芽孢杆菌)种子液，于40℃通气培养36小时；在2.3M3发酵罐中发酵，计料体积1.2M3，投入40％A高纯度有效霉素粉剂60kg，磷酸二氢钾、氯化钾等无机盐，于121℃灭菌40分钟，冷却；将在种子罐培养结束的种子液移入发酵罐中，于28℃培养4天放罐；再将放罐的发酵液通过加温、冷却处理，过滤去除颗粒状杂质。
所得滤液用300L D152弱酸性树脂吸附，流量300L/h，吸附结束用纯水洗涤；然后用NaOH溶液洗脱，洗脱量为树脂体积的1.5倍，洗脱液通过截留分子量为2000的膜浓缩，得到浓缩液25L，有效霉素烯胺含量1.21％。
上述浓缩液加入保护剂N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯0.26kg，在常温常压下反应6小时，取样检测，保护物比例占90％以上，结束反应；把所得保护产物投入200L反应釜中，加入氧化剂溴素0.11kg，在0℃左右反应4小时，取样检测，保护物浓度≤5％，反应结束。
将所得氧化产物用H110树脂分离，去除杂质。
所得浓缩液用0.11kg还原剂亚硫酸钠进行还原，常温下反应2小时，用酸调节至pH5.0；在还原产物中加入0.11kg的脱保护剂氢氧化钡，在60℃反应6小时，得到含有效霉醇胺的混合物。
将有效霉醇胺的混合物通过截留分子量为1000的膜浓缩，去除无机盐，浓缩到1L体积。
将有效霉醇胺浓缩液冷却到5℃结晶，时间5小时，所得晶浆经过滤得到有效霉醇胺结晶粉；在0.085Mpa真空和50℃条件下，干燥4小时，得到有效霉醇胺325g，检测得含量98.6％，水分0.2％，符合其产品质量标准。
实施例3在250L种子罐中投入米粉、黄豆粉、磷酸二氢钾，加热至121℃灭菌40分钟，接入酶(细小芽孢杆菌)种子液，于40℃通气培养36小时；在2.3M3发酵罐中发酵，计料体积1.2M3，投入60％A高纯度有效霉素粉剂36kg，磷酸二氢钾、氯化钾等无机盐，于121℃灭菌40分钟，冷却；将在种子罐培养结束的种子液移入发酵罐中，于28℃培养4天放罐；再将放罐的发酵液通过加温、冷却处理，过滤去除颗粒状杂质。
所得滤液用300L D152弱酸性树脂吸附，流量300L/h，吸附结束用纯水洗涤；然后用NaOH溶液洗脱，洗脱量为树脂体积的1.5倍，洗脱液通过截留分子量为2000的膜浓缩，得到浓缩液25L，有效霉素烯胺含量1.21％。
上述浓缩液加入保护剂N，N-二琥珀酰亚胺基碳酸酯0.3kg，在常温常压下反应6小时，取样检测，保护物比例占90％以上，结束反应；把所得保护产物投入200L反应釜中，加入氧化剂溴素0.12kg，在0℃左右反应4小时，取样检测，保护物浓度≤5％，反应结束。
将所得氧化产物用H110树脂分离，去除杂质。
所得浓缩液用0.12kg还原剂亚硫酸钠进行还原，常温下反应2小时，用酸调节至pH5.0；在还原产物中加入0.12kg的脱保护剂氢氧化钡，在60℃反应6小时，得到含有效霉醇胺的混合物。
将有效霉醇胺的混合物通过截留分子量为1000的膜浓缩，去除无机盐，浓缩到1L体积。
将有效霉醇胺浓缩液冷却到5℃结晶，时间5小时，所得晶浆经过滤得到有效霉醇胺结晶粉；在0.085Mpa真空和50℃条件下，干燥4小时，得到有效霉醇胺315g，检测得含量98.5％，水分0.2％，符合其产品质量标准。
权利要求
1.一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于它由下列步骤组成(a)酶催化发酵以有效霉素为原料，用细小芽孢杆菌进行催化发酵；(b)一次分离浓缩采用弱酸性树脂从步骤(a)所得发酵液中分离得到含有效霉素烯胺、有效霉素霉胺和氧基胺的混合液，并通过膜浓缩得到含有效霉素烯胺的浓缩液；(c)氧化先用保护剂对在步骤(b)所得含有效霉素烯胺的浓缩液中的氨基进行保护；再用氧化剂进行氧化，得到氧化产物；(d)分离对步骤(c)所得氧化产物进行物理分离，去除杂质；(e)还原先用还原剂对经步骤(d)分离的氧化产物进行还原，得到还原产物；再用脱保护剂对还原产物进行脱保护，以脱除反应产物中氨基上的保护物，得到含有效霉醇胺的混合液；(f)二次分离浓缩步骤(e)所得含有效霉醇胺的混合液经膜分离浓缩，去除脱保护物，得到有效霉醇胺浓缩液；(g)结晶干燥用溶剂对步骤(f)所得有效霉醇胺浓缩液进行稀释后冷却、结晶；晶浆经过滤得到有效霉醇胺结晶品；然后在真空和加热条件下进行干燥。
2.根据权利要求1所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于步骤(a)中所述有效霉素原料为有效霉素滤液、40％A有效霉素粉剂或60％A有效霉素粉剂；当以有效霉素滤液为原料时，投料过程中需调节pH5～6，当以40％A有效霉素粉剂为原料时，投入量为计料体积的5％(W/V)，当以60％A有效霉素粉剂为原料时，投入量为计料体积的3％(W/V)。
3.根据权利要求1所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于在步骤(b)中，分离时所采用的弱酸性树脂为D155、D152或H110树脂，浓缩时所采用的膜的截留分子量为2000。
4.根据权利要求1所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于在步骤(d)中所述的物理分离采用D155、D152或H110树脂。
5.根据权利要求1所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于在步骤(f)中，分离浓缩时所采用的膜的截留分子量为1000。
6.根据权利要求1所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于在步骤(g)中，结晶时冷却到5℃，时间5小时；干燥时所采用的真空度为0.085Mpa，加热温度为50℃，时间4小时。
7.根据权利要求1、2、3、4、5或6所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于步骤(c)中所采用的保护剂为N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的1.0％～1.2％(W/V)，所采用的氧化剂为溴素，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.4％～0.5％(W/V)；在步骤(e)中所采用的还原剂为亚硫酸钠，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.4％～0.5％(W/V)，所采用的脱保护剂为氢氧化钡，加入的量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.4％～0.5％(W/V)；在步骤(g)中，对有效霉醇胺浓缩液进行稀释所采用的溶剂为乙醇，加入的量与有效霉醇胺浓缩液等量(V/V)。
8.根据权利要求7所述的一种从有效霉素制备有效霉醇胺的方法，其特征在于所述保护剂N，N′-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的1.04％(W/V)，所述氧化剂溴素的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.44％(W/V)，所述还原剂亚硫酸钠的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.44％(W/V)，所述脱保护剂氢氧化钡的加入量为含有效霉素烯胺的浓缩液的0.44％(W/V)。
全文摘要
本发明涉及一种从有效霉素(井冈霉素)制备有效霉醇胺方法。化学法生产有效霉醇胺工艺复杂，设备腐蚀和环境污染也较严重，工人防护和生产安全有一定难度，且产品质量不稳定。本发明提出一种以有效霉素为原料经过酶催化发酵、氧化、还原和纯化得到有效霉醇胺的方法，所用有效霉素原料为有效霉素滤液、40％A有效霉素粉剂或60％A有效霉素粉剂；酶催化发酵采用的生物酶为细小芽孢杆菌。本发明工艺合理、操作简便，生产过程基本无“三废”排放，环保条件好，且产品质量稳定，有效霉醇胺含量≥98.5％。
文档编号C12R1/07GK101029318SQ200710067849
公开日2007年9月5日 申请日期2007年3月30日 优先权日2007年3月30日
发明者裘国寅, 姚萍华, 王雪钢 申请人:浙江钱江生物化学股份有限公司