专利名称：Mrpink在抑制罗氏沼虾精子活性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及罗氏沼虫下雄性生殖系统特异性Kazal型蛋白酶抑制剂 MRPINK在抑制罗氏沼蚱精子活性中的应用。
(二) 背景^支术
生物的性别、生殖现象是生物学研究的主要内容之一，它涉及到许多 重大的生物学问题，比如性别决定、遗传、发育和进化等，因此历来倍受 关注。目前对于性别、生殖的分子机制研究主要集中在人类和模式生物中， 而对于一般水生生物这方面的研究很少，尤其在甲壳类中，已知的相关分 子信息更加缺乏。
虾类作为具有重要经济价值的水生生物，在分子水平的研究开展得相 对较少，因此，大量获取水生动物性别和生殖相关基因资源来研究它们的 生殖生物学、遗传育种等显得尤为必要。坏类同龄雌雄性别个体的大小、 生长速度相差悬殊，性别与生殖制约着它们的产值。若能培育出单性虾， 并进行单性化养殖可以大幅度提高上市商品规格和养殖产量，因此坏类性 别控制一直是遗传育种研究的热点之一。目前有关这方面的认识仅仅局限 在形态结构和一般的组织化学、生化成份和基本的生理指标，在基因水平 的认识和可操作性则几乎为零。
(三)
发明内容
本发明则是通过对罗氏沼虾雄性生殖相关基因进行克隆、表达特征分 析以及定位功能等研究，提供了罗氏沼虾雄性生殖系统特异性Kazal型蛋
白酶抑制剂MRPINK在抑制罗氏沼坏精子活性中的应用。 本发明采用的技术方案是
罗氏沼坏雄性生殖系统特异性Kazal型蛋白酶抑制剂MRPINK在抑 制罗氏沼奸精子活性中的应用。(有关MRPINK的相关介绍参见文献 Cao JX， Dai JQ， Dai ZM， Yin GL and Yang WJ. A male-reproduction-related kazal-type peptidase inhibitor gene in the prawn, Macra6rac/z/wm rase"6ergz7: molecular characterization and expression patterns. Marine Biotechnology. 2007， 9: 45~55.)
所述 MRPINK 的 cDNA 序列 如下
TAGTTCACGAAGGCGAATGTAAGCAAGACTACTGCGCCCCGGTAG
AGACTGAAGTATGGTAGCGAGGTGGTGACTGTTGGAAATAGACCA
TTACGTGAGTGAAAACGGCGATATATGAATATGTTCCATCAATCAA具体的，所述应用为以MRPINK制备精子活性抑制剂，用于罗氏 沼奸精子冻存。
优选的，所述精子活性抑制剂为MRPINK。所述MRPINK的氨基酸 序 列 如 下
MKLYIFTFCLAASILVGFSSGEYRFLVSPLCPVRCTLRYIPVCGSDGRTY
DGQTYLNECFAKVAACGFPNLKIVHSGLCGPRPKTEVW 。
选取罗氏沼虾几乎全组织，包括肌肉、肝胰腺、心脏、鳃、胃、血
细胞、雄性生殖系统、卵巢、脑、中枢神经、脂肪体、眼柄、肠和腹
部神经进行Northern blotting分析，结果表明MRPINK基因仅表达在雄性
生殖系统，而且在输精管中的表达占主导地位，其次是末端壶腹，在精巢
中的表达并不是4艮高。
到，此后其表达出现，但表达量随着罗氏沼虾逐渐生长发育并无明显变化。 MRPINK基因的表达在罗氏沼虾的不同生长发育时期呈现恒定趋势，表 明这一基因更多的与维持内环境稳定和整个组织的完整性相关，而不是调 控精子形成或形态分化的特异阶段。
运用原位杂交的实验手段在细胞水平上斥企测了 MRPINK在罗氏沼虾 雄性生殖系统中的定位，发现这MRPINK基因的mRNA仅表达在输精管 和末端壶腹的内壁上皮分泌细胞中。这一特异性的定位暗示着它可能在精
子自身保护、生殖系统中蛋白酶降解及内环境稳定等过程中发挥功能。
MRPINK基因的表达在罗氏沼虾生长发育时期呈现恒定趋势且仅在 输精管和末端壶腹的内壁上皮分泌细胞中有表达,表明这一基因在精子自 身保护、生殖系统中蛋白酶降解及维持内环境稳定等过程中发挥了重要功 能。MRPINK是蛋白酶抑制剂，参与维持雄性生殖系统内环境的稳定， 对精子的生理成熟和活力维持可能有十分重要的意义。在我们的研究中发 现，在罗氏沼虾的精子中添加MRPINK能有效的抑制精子活性。
人类精子库已应用于临床治疗，但是作为生育能力的储备形式仍然有 很大的局限性。目前人类精子储存的办法是将精子冻存在装有液态氮的大 罐子中，在超低温情况下保持精子自身能量不被消耗。但在精子冷冻和复 苏过程中，温度的变化会对精子产生生物物理损伤和化学损害，使精子细 胞膜水、电介质浓缩、紊乱、使不稳固的类脂蛋白变性、以及机械性破坏 从而影响精子的生命活力。此外，精子冷冻的价格非常昂贵，需要一套严 格的控制系统，以避免出现差错。
在精子的冻存中添加类似的蛋白酶抑制剂，抑制精子内酶活性，使精 子不活化，对精子的低温储存具有重要的借鉴意义。 具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围 并不仅限于此
实施例l: MRPINK基因及其编码的蛋白质的获得
具体可参见文献Cao JX， Dai JQ， Dai ZM, Yin GL and Yang WJ. A male-reproduction-related kazal-type peptidase inhibitor gene in the prawn， Afocra6rac/z/簡 ra5^w6ergz7: molecular characterization and expression
patterns. Marine Biotechnology. 2007, 9: 45~55.
① 取罗氏沼虾雄性和雌性生殖系统组织，按Trizol试剂盒说明抽提总 腦A;
② 建立罗氏沼虾雄性生殖系统SSHcDNA文库，筛选差异性表达的基因 片段
A. 第一条链的合成按Oligotex mRNA Kits法，提取PolyA+RNA,以 PolyA+RNA为模板反转录合成单链cDNA。
B. 双链(dscDNA)的合成，Rsal酶消化产生平末端。
C. 接头连接把RsaI酶切后雄性组织ds cDNA分成两份，分别加上接 头1 ( Adaptor 1)和接头2 (Adaptor 2) , 16。C连接过夜，形成两组检测 子(Tester )。
D. 消减杂交
第一，分别将Tester 1和Tester 2的连接产物与Rsal酶消化的过量驱动子 (Driver) ds cDNA混合，在98。C下热变性，然后在65 68。C下放置10 小时使Tester和Driver的cDNA进行充分地杂交。检测子单链cDNA片 段被均化，即平均高、低丰度的cDNA浓度，使其基本相等。 第二，将第一次杂交的产物混匀到一起，然后在68。C继续放置过夜(约 16小时)，使Tester 1和Tester 2之间的目的差异cDNA形成异源杂交子。
E. 巢氏PCR扩增差异表达的cDNA 。
F. 筛选差异性文库PCR产物经连接转化到TOPO10载体上，构建差异 表达基因富集的cDNA文库，筛选差异性表达的基因。
③ 全长cDNA的获得
利用FirstChoice RLM-RACE kit合成5，和3'RACE,分别得到487bp 的5'端和270bp的3，端，拼接完成后获得全长cDNA，命名为MRPINK基
因。
MRPINK cDNA序列如下:
TAGTTCACGAAGGCGAATGTAAGCAAGACTACTGCGCCCCGGTAG
ATCAAGTTCTGATCGGCTGTGTACTAATAACTTCGTACATATGGCC
ATATTGGAGGTTTCTGAGATACGCCCAGTTGTCTATTACATCTGAA
MRPINKcDNA全长736bp,编码区405bp, 5'和3，非翻译区长度分 别是72bp和247bp,其中3，非翻译区具有多聚腺普酸信号。该基因已递 交到GenBank,其序列号为AY885242。
MRPINK氨基酸序列如下 MKLYIFTFCLAASILVGFSSGEYRFLVSPLCPVRCTLRYIPVCGSDGRTY GNKCJLDNARLCDNSNVQVVHEGECKQDYCAPVVRCPPVIKAVCAN
DGQTYLNECFAKVAACGFPNLKIVHSGLCGPRPKTEVW。
它编码135个氨基酸，分子量约14.7kDa，推演的氨基酸序列中具有
两个Kazal型domain,且含有21个氨基酸的信号肽。
MRPINK和已知的Kazal型蛋白酶抑制剂在氨基酸序列上的同源性
为16~32%，其Kazal型domain序列上有19~52%的同源性，表明这个蛋
白属于Kazal家族中的成员。MRPINK作为蛋白酶抑制剂，与已知哺乳动
物蛋白酶抑制剂可能具有相似的功能。
实施例2: MRPINK对罗氏沼奸的精子活性的抑制作用 明胶底物实验
罗氏沼虾精子(挑选成熟雄性罗氏沼奸，摘取壶腹磨碎，离心，计数， 使精子浓度为lx106 cells/ml)用MRPINK(2 mg/ml) 28°C预处理lh;未 经MRPINK处理的罗氏沼虾精子作为对照组；将处理后样品涂于已含明 胶(终浓度为5%)的玻片上，37-C孵育过夜，相差显微镜(400x)下观察。
实验结果表明95%罗氏沼虾精子会降解明胶形成暈轮(图l-A),经 MRPINK处理的精子不能降解明胶形成暈轮(图l-B), MRPINK能有效 抑制罗氏沼虾精子降解明胶的活性。由此说明，MRPINK对罗氏沼虾的 精子活性有抑制作用。
序列表—ST25
SEQUENCE LISTING
〈110〉浙江大学
〈120〉 MRPINK在抑制罗氏沼虾精子活性中的应用
〈130〉
〈160〉 2
〈170> Patentln version 3. 4
<210〉 1
<211〉 736
〈212> 腿
〈213> Macrobrachium rosenbergii
<400> 1
eigttg3C3gactgccagcttcctgtgcagaattctgaacgataggcttaggtaagacctc60
acaactagcaaaatgaaactgtacatcttcaccttctgcctagccgcgtcaattctcgtc120
gggttt"tcatctggggaataccgcttcct1:gtctctccactgtgccccgtacgttgtact180
ctgaggtacatccctgtctgtggcagcgacggccgaacgtacggga^c犯atgtcacctg240
gacaatgcacgtctctgtgacaacagcaatgttcaggtagttcacgaaggcgaatgt犯g300
caagactactgcgccccggtagtccgctgcccaccggtcataaaagccgtatgtgccaac360
gacggccaaacatacttgaacgagtgtttcgccaaagtcgcagcctgcggattccctaac420
ctgaagatagtccacagcggattatgtggtcctagaccaaagactgaagtatggtagcga480
ggtggtgactgttggaaatagaccattacgtgagtgaaaacggcgata化tgaatatgtt540
ccatcaatcaaatcaagttctgatcggctgtgtactaataacttcgtacatatggccttc600
tttcaagttctcctgatttccaccagatttattatatttttatggatsttggaggtttct660
cagttgtctattacatctgagatcaataaagcctttgtaa720
cagg犯aaa3736
<210〉 2 <211〉 134 <212> PRT
〈213> Macrobrachium rosenbergii
<400〉 2
Met Lys Leu Tyr lie Phe Thr Phe Cys Leu Ala Ala Ser lie Leu Val 15 10 15
Gly Phe Ser Ser Gly Glu Tyr Arg Phe Leu Val Ser Pro Leu Cys Pro 20 25 30
Val Arg Cys Thr Leu Arg Tyr lie Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly Arg 35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Lys Cys His Leu Asp Asn Ala Arg Leu Cys Asp Asn 50 55 60
Ser Asn Val Gin Val Val His Glu Gly Glu Cys Lys Gin Asp Tyr Cys 65 70 75 80
Ala Pro Val Val Arg Cys Pro Pro Val lie Lys Ala Val Cys Ala Asn 85 90 95Asp Gly Gin Thr Tyr Leu Asn Glu Cys Phe Ala Lys Val Ala Ala Cys 100 105 110
Gly Phe Pro Asn Leu Lys lie Val His Ser Gly Leu Cvs Gly Pro Arg 115 120
Pro Lys Thr Glu Val Trp 130
权利要求
1.罗氏沼虾雄性生殖系统特异性Kazal型蛋白酶抑制剂MRPINK在抑制罗氏沼虾精子活性中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于所述MRPINK的cDNA序列如 下AGTTGACAGACTGCCAGCTTCCTGTGCAGAATTCTGAACGATAGGCTTAGGTAAGACCTCACAACTAGCAAAATGAAACTGTACATCTTCACCTTCTGCCTAGCCGCGTCAATTCTCGTCGGGTTTTCATCTGGGGAATACCGCTTCCTTGTCTCTCCACTGTGCCCCGTACGTTGTACTCTGAGGTACATCCCTGTCTGTGGCAGCGACGGCCGAACGTACGGGAACAAATGTCACCTGGACAATGCACGTCTCTGTGACAACAGCAATGTTCAGGTAGTTCACGAAGGCGAATGTAAGCAAGACTACTGCGCCCCGGTAGTCCGCTGCCCACCGGTCATAAAAGCCGTATGTGCCAACGACGGCCAAACATACTTGAACGAGTGTTTCGCCAAAGTCGCAGCCTGCGGATTCCCTAACCTGAAGATAGTCCACAGCGGATTATGTGGTCCTAGACCAAAGACTGAAGTATGGTAGCGAGGTGGTGACTGTTGGAAATAGACCATTACGTGAGTGAAAACGGCGATATAACCAGATTTATTATATTTTTATGGATATTGGAGGTTTCTGAGATA CGCCCAGTTGTCTATTACATCTGAAGAAAAACTTGATCAATAAA GCCTTTGTAACAGGAAAAAAAAAA AA 。
3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为以MRPINK制备 精子活性抑制剂，用于罗氏沼虾精子冻存。
4. 如权利要求3所述的应用，其特征在于所述精子活性抑制剂为 MRPI服。
5. 如权利要求1~4之一所述的应用，其特征在于所述MRPINK的氨基酸 序 列 如 下 MKLYIFTFCLAASILVGFSSGEYRFLVSPLCPVRCTLRYIPVCGSDGRTANDGQTYLNECFAKVAACGFPNLKIVHSGLCGPRPKTEVWc
全文摘要
本发明提供了罗氏沼虾雄性生殖系统特异性Kazal型蛋白酶抑制MRPINK在抑制罗氏沼虾精子活性中的应用。在研究中发现，在罗氏沼虾的精子中添加MRPINK能有效的抑制精子活性，使精卵不能受精。在精子的冻存中添加类似的蛋白酶抑制剂，抑制精子内酶活性，使精子不活化，对精子的低温储存具有重要的借鉴意义。
文档编号C12N5/08GK101366944SQ200710070808
公开日2009年2月18日 申请日期2007年8月16日 优先权日2007年8月16日
发明者曹俊霞, 杨卫军, 马文明 申请人:浙江大学