专利名称：三叶青的组培快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种三叶青的组培快速繁殖方法。
背景技术：
植物是药物的天然宝库，人类利用药用植物来防病治病已有几千年历史。
全世界约有75%的人口以植物作为治疗疾病的药物来源(刑建民，2001)。当今 的处方药有25。^左右来自于药用植物(邱德有,2000)。随着经济和医疗保健事 业的飞速发展，中药资源的需求出现了空前的增长，从中药中提取有效成分应 用于化妆品、食品及工业原料的研究也越来越深入，这些原因在不同程度上加 大了中药资源的压力。加之长期以来，对开发利用中药资源的认识不足， 一些 地区不同程度上对中药资源进行了掠夺式的过度采收，致使很多中药资源蕴含 量下降，甚至耗竭， 一些种类濒临灭绝(黄璐琦，2001)。生物技术的蓬勃发展 为从根本上改变传统药材的生产提供了一个崭新的方法。植物组织和细胞培养 技术则是其中一个重要的手段。近年来，国内外在这方面已做了大量工作，己 成功离体培养获得试管植株的药用植物有200多种。
三叶青(T^raWgma/zems/wam/mDielsetGilg)为葡萄科崖爬藤属多年生常 绿草质蔓生藤本。异名为蛇附子(《植物名实图考》)，石抱子(《江西草药》)， 金线吊葫芦、三叶对(《浙江民间常用草药》等，为民间常用的中草药(中药辞海， 1993)。三叶青常生长于山坡或山沟，溪谷两旁林下阴处。主要分布在浙江、江 西、福建、湖北、湖南，广东、四川、贵州、云南、台湾等地(浙江植物志，1993)。 三叶青以块根或全草入药，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功能，用于 治疗高热惊厥、肺炎、哮喘、肝炎、风湿、月经不调、咽痛、瘰疬等症，具有 很好的疗效(中药辞海，1993)。有关三叶青的化学成分研究近几年非常热门， 三叶青不同部位化学成分的鉴定也有较多报道。三叶青根中含槲皮素、山柰酚、 山柰酚一3—0—新橙皮糖苷、(3-谷甾醇、胡萝卜苷及6 '—O-苯甲酰基胡萝卜苷 (杨大坚，1998:李瑛琦，2003)。三叶青地上部分含蒲公英萜醇、蒲公英萜 酮、P—谷甾醇及麦角甾醇(刘东，1999)。药理实验表明三叶青提取物具有一 定的肿瘤抑制作用(杨大坚，1998; 丁钢强，2005;冯正权，2006)、显著的抗 病毒及抗出血热的作用(杨学楼，1989;杨大坚，1998)和明显的消炎、镇痛 与解热作用(资古明，1989;黄真，2005)及保肝作用(伍昭龙，2006;钟晓明， 2006)。大鼠经口急性毒性实验表明(江月仙，2005)，按急性毒性分级标准
判定，属实际无毒；进一步小鼠骨髓细胞微核试验和小鼠精子畸形试验结果均 为阴性，说明三叶青未显示有致突变性。临床上主要用于抗癌及抗艾滋病毒、 治疗血液病与心脑血管疾病、肝炎、脑膜炎、急性支气管炎、肺炎、肠炎及咽 喉炎等感染性疾病，小儿外感高热等(伍昭龙，2006)。
由于本种植物用途广泛、药效显著，毫无节制地狂采滥挖，加上三叶青对 生长环境要求苛刻，这种珍贵的草药现已濒临灭绝。现有的三叶青野生资源根 本难以满足日益增长的医药领域的需要。为了保护野生的三叶青资源，同时又 能满足医药工业的应用，因此有必要建立三叶青的离体再生体系，这对丰富植 物组织培养的理论和应用生物技术保护种质资源以及满足临床应用等均有重要 意义。
然而，由于野生三叶青对生境要求苛刻(须生长在海拔700米的深山密林 和悬崖峭壁的背阴面，上面要有散射光，旁边要有细水渗出，下面要有树叶覆 盖，常年气温保持在18。C左右)，生长周期长，黄酮类及酚类物质含量高，非常 容易褐化，导致常规的组织培养技术十分难于对其进行快繁。
迄今为止，在国内外未见关于三叶青组织培养快繁成功的报道。我们通过 大量试验，终于摸索出一套成熟的方法，成功实现了三叶青的组培快繁，可以 快速培育出大量幼苗，为中药材GAP种植提供一种切实可行的开发项目。
参考文献
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文中所提及的縮写字母的以及见如下縮略词表
MSMurashige and SkoogMS培养基
medium
BA6- benzyladenine6-苄基腺嘌呤
KTkinetin激动素
NAAa-naphthaleneacetic acidot-柰乙酸
IBAindole-3-butyric acid吲哚丁酸
ZTzeatin玉米素
GA3gibberellic acid;3赤霉素
PVPpolyvinylpyrrolidone聚乙烯吡咯烷酮
ACActivated charcoal活性炭
发明内容
本发明的目的是提供一种三叶青的组培快速繁殖方法。
三叶青的组培快速繁殖方法的步骤如下
1)优选完整的腋芽为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗 30 40分钟后，置于75%酒精中处理20 30秒，然后在经0.1%的升汞Hgcl2 消毒6 10分钟后用无菌水冲洗，将腋芽接种于诱导培养基中，诱导培养为
MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l;
2) 将生长于诱导培养基上外植体转接于 MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、 MS+BA0.5mg/l +PVP0.5g/l、 MS+KTlmg/l+PVP0.5g/l、 MS+KT1.0 mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/域 MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l上的培养基上进行增殖培养；
3) 将进行增殖培养的高度为3 4公分壮苗转入生根培养基中，生根培养基 为1/2MS+NAA0.3mg/1或l/2MS+BA0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l;
4) 将己生根的植株取出，栽培于珍珠岩泥炭土为l: 1 2的混合基质上。 所述的将腋芽接种于诱导培养基中将所选取的腋芽接种于诱导培养基中，
培养2 3周，看到有许多绿色的芽点和小的不定芽出现，诱导培养基的pH值 5.8 6.0，培养温度25 27 °C，每天光照时间为16小时，光照强度为35 40 |umol.irf2.s-1。
所述的将生长于诱导培养基上芽转接于增殖培养基上进行增殖培养培养 20 25天，可见小芽可长成3 4公分的无根苗，每个芽的周围有2 6个新芽 出现，将丛生芽在无菌条件下取出，用解剖刀分开，置于上述增殖培养基中培 养，在20 25天内，各芽再生出一至数个新芽。
所述将高度为3 4公分的壮苗转入生根培养基中首先在黑暗条件下培养 2 3天，随后转到光下培养7 10天可诱导形成根，再培养20 25天形成发达 的根系。
所述的将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩泥炭土为1: 1 2的混合基 质上将装有生根幼苗的培养容器置于自然温度、光照的环境下锻炼5 7天， 然后打开瓶盖，放置1 2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩
泥炭土为1: 1的混合基质培养20 35天，开始的10 14天温度为23 25 。C， 相对湿度为70 80%。
本发明的优点(1)三叶青的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、 气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格
控制三叶青药材的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积 少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)在组培过程中进行脱毒处理， 提高三叶青的品质，有效解决野生三叶青品质不稳定，外观和有效成分不匀的 问题，为生产道地药材和产后加工销售提供保障条件。(4)该技术方法解决了 三叶青快速繁殖和稳定生根的重要技术环节，达到技术稳定，繁殖系数高的要 求，可应用于工业化生产的目的。(5)使用本发明提供的组培快繁技术得到的
三叶青幼苗进行人工栽培，可以得到个体差异小，品质均一的三叶青成品，可 以为临床应用提供品质稳定的原材料。(6)可以保存三叶青的种质资源，同时 有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。
具体实施例方式
三叶青的组培快繁技术，包括外植体的选取与处理、诱导培养、增殖培养、 生根培养、移栽等步骤。具体地操作中，可优选三叶青的腋芽为培养材料。经
洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗30 40分钟后，75%酒精处理20 30秒， 0.1%HgCl2 (内加2 3滴吐温T-20)灭菌处理6 10分钟，无菌水冲洗3 5次后， 接种于MS+BA1 .Omg/l或MS+BAl.0+IBAO. 1的启动培养基中进行诱导培养。在温 度为25 27。C，每天光照16小时，光强35 40nmoLm-ls"的温室中培养15 20 天。然后将每个外植体基部得到的从生芽切开，置于MS+BA0.5mg/1、 BA0.5mg/l+NAA0.05mg/1、 KT1.0mg/1、 KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l或ZTlmg/l培养 基中进行增殖培养。培养条件同上述诱导培养基。20 30天后，每个外植体可 以得到2 6株绿色健壮、高度达到3 4公分的植株。将需要生根的幼苗转移至 1/2MS+NAA 0.3mg/l或1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l培养基上 进行生根培养。培养条件同上述诱导培养。7 10天后可以看到有根原基形成， 20 25天完成生根。将装有生根植株的培养容器取出，于自然环境下放置5 7 天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置1 2天，然后将苗取出，将植 株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩泥炭土 (h 1)的混合基质上。开始 10天保持环境温度23 25。C，相对湿度在70% 80%，随后即可逐渐过渡到自然 的环境条件。炼苗一个月后移栽到大田，可达到90%的存活率。
上述技术中诱导、增殖及生根步骤的培养基的pH值均为5.8 6.0，培养温度 25 27°C，每天光照16小时，光照强度35 40pmol，m'2.s"。
使用本发明将三叶青的腋芽接种后，20 30天可诱导形成丛生芽， 一般诱 导率达到78 95%。在此基础上继代培养，丛生芽可大量繁殖，大约每25天继代 一次，平均增殖倍数为5.4。把继代后的丛生芽转移到本发明提供的生根培养基 中20 25天可大量发根，出根率在90%左右，培养30 45天可出瓶炼苗。
采用上述措施的本发明，掌握了三叶青组织培养中丛生芽的诱导和生长， 壮苗、生根等关键阶段的技术，成功解决了三叶青组培中生根困难、增殖率低、 成活率低等困难，使三叶青这一珍稀药用植物实现快速育苗、工厂化栽培成为 可能。使用本发明同时可以有效地保护这一珍稀野生植物资源、减少私挖滥采、 形成可持续利用和合理开发相互协调的良性循环。
本发明的优点体现在提供了三叶青的组织培养和快速繁殖技术，摸索出 了快速繁殖及其稳定生根等重要环节的关键性技术， 一个外植体一年就可克隆 繁殖出数万株后代，为该药用植物的商品化生产提供了一套切实可行的生产技 术路线，可以应用于三叶青的大规模工业化生产。 本发明采用下述非限定性实施例作进一步的说明。 实施例l
取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理流水冲洗30分钟后，
置于75%酒精中处理30秒，然后用0.1XHgCl2 (内力B2滴吐温T-20)灭菌处理6 分钟后用无菌水冲洗3次后，接种于MS+BA1.0mg/l培养基上，培养室的温度为 25°C，光照强度为35 pmol.m々s"，培养15天，可见每个外植体上有3 6个新芽 出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开，分别置于装 有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽可再生出数 个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培 养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化齐UPVP0.5g/l防 止褐化。培养20天后，将需要生根的三叶青植株转移至
1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。20天可生根。将已生根植 株的培养瓶取出，于自然环境下放置5天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水， 再放置1天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩泥炭 土 (1: 1)混合基质上。保持环境相对湿度在70%左右。最初两周避免直射光照 射， 一个月后移栽到大田中，可达到85%的存活率。 实施例2
取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理流水冲洗40分钟后， 置于75%酒精中处理20秒，然后用0.1XHgCl2 (内力口3滴吐温T20)灭菌处理IO 分钟后用无菌水冲洗5次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养 室的温度为27。C，光照强度为40^imol.rr^.s"，培养20天，可见每个外植体上有 4 7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开， 分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽 可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+BA0.5mg/1十PVP0.5g/l上培养 基上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止 褐化。培养20天后，将需要生根的三叶青植株转移至
1/2MS+NAA0.3mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。20天可生根。将已生根植 株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开瓶盖，在培养基表面浇少量水，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩泥炭土 (1: 2) 混合基质上。保持环境相对湿度在80%左右。最初两周避免直射光照射， 一个月
后移栽到大田中，可达到85%的存活率。 实施例3
取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理流水冲洗30分钟后， 置于75%酒精中处理30秒，然后用0.1XHgCl2 (内加2滴吐温T-20)灭菌处理8 分钟后用无菌水冲洗4次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养 室的温度为25。C，光照强度为36(111101.111-2.^，培养20天，可见每个外植体上有 4 7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开， 分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽 可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+KTlmg/l+PVP0.5g/l上培养基 上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐 化。培养20天后，将需要生根的三叶青植株转移至l/2MS+BA0.05mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培养。25天可生根。将已 生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置5天后打开瓶盖，在培养基表面浇少 量水，再放置2天，然后将苗取出，洗净培养基，将苗移栽到珍珠岩泥炭土 (1: 1)混合基质上。保持环境相对湿度在80%。 一个月后移栽到大田中，可达到85% 的存活率。 实施例4
取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理流水冲洗30分钟后，
置于75%酒精中处理30秒，然后用0.1。/。HgCl2 (内加2滴吐温T-20)灭菌处理8 分钟后用无菌水冲洗4次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养 室的温度为26。C，光照强度为38拜01.1^2.8-1，培养20天，可见每个外植体上有 4 7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开， 分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽 可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+KT1.0 mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l上培养基上进行连续培养，以达到快速增殖的目 的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐化。培养20天后，植株生长健壮，高度 达到3 4公分，部分植株的基部出现根。将需要生根的三叶青植株转移至 1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培 养。25天可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7后打开瓶盖， 在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂洗净，
将苗移栽到珍珠岩泥炭土 (1: 1)混合基质上。保持环境相对湿度在80%左右。 一个月后移栽到大田中，可达到85%的存活率。
实施例5
取采自富阳新登的三叶青的腋芽进行表面灭菌处理流水冲洗40分钟后，
置于75%酒精中处理20秒，然后用0.1XHgCl2 (内加2滴吐温T20)灭菌处理9 分钟后用无菌水冲洗4次后，接种于MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l培养基上，培养 室的温度为26t:，光照强度为36^mol.m—2.^,培养20天，可见每个外植体上有 4 7个新芽出现，将长有芽的外植体在无菌条件下取出，将芽用解剖刀分开， 分别置于装有上述相同培养基的培养容器中培养，20天后，各培养容器内的芽 可再生出数个新芽。再将每个芽分开，转接于MS+ZTlmg/l+PVP0.5g/l上培养基 上进行连续培养，以达到快速增殖的目的，其中加入抗氧化剂PVP0.5g/l防止褐 化。培养20天后，植株高度达到4 5公分。将需要生根的三叶青植株转移至 1/2MS+BA0.05 mg/1 +NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l+AC0.5g/l培养基上进行生根培 养。25天即可生根。将已生根植株的培养瓶取出，于自然环境下放置7天后打开 瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼脂 洗净，将苗移栽到珍珠岩泥炭土 (1: 1)混合基质上。保持环境相对湿度在 80%左右。 一个月后移栽到大田中，可达到85%的存活率。 实施例6
炼苗与移栽将实施例5得到的三叶青试管苗，在自然光照下炼苗7天后打
开瓶盖，在培养基表面浇少量水，再放置2天，然后将苗取出，将植株基部的琼 脂洗净，将苗移栽到以珍珠岩泥炭土 (1: 1)为基质的12公分塑料盆，每盆l
株，每15盆为一个单位。置于温室大棚中，保持最高昼温〈32°C，最低夜温〉 18°C，保持环境相对湿度在70 80%，遮光70%。移栽后用塑料膜覆盖，每天对 叶面喷1次水，IO天后除去覆盖的塑料薄膜，20天浇一次1/4MS营养液。l个月后， 幼苗成活率达到90%以上，可以移栽到大田。
权利要求
1.一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于方法的步骤如下1)优选完整的腋芽为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗30～40分钟后，置于75％酒精中处理20～30秒，然后在经0.1％的升汞Hgcl2消毒6～10分钟后用无菌水冲洗，将腋芽接种于诱导培养基中，诱导培养为MS+BA1.0mg/l或MS+BA1.0mg/l+IBA0.1mg/l；2)将生长于诱导培养基上外植体转接于MS+BA0.5mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l、MS+BA0.5mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1mg/l+PVP0.5g/l、MS+KT1.0mg/l+NAA0.05mg/l+PVP0.5g/l或MS+ZT1mg/l+PVP0.5g/l上的培养基上进行增殖培养；3)将进行增殖培养的高度为3～4公分壮苗转入生根培养基中，生根培养基为1/2MS+NAA0.3mg/l或1/2MS+BA 0.05mg/l+NAA0.3mg/l+GA30.2mg/l；4)将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩∶泥炭土为1∶1～2的混合基质上。
2. 根据权利要求1所述的一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于所 述的将腋芽接种于诱导培养基中将所选取的腋芽接种于诱导培养基中，培养 2 3周，看到有许多绿色的芽点和小的不定芽出现，诱导培养基的pH值5.8 6.0，培养温度25 27 °C，每天光照时间为16小时，光照强度为35 40 |imol.m-2.s-1。
3. 根据权利要求1所述的一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于所 述的将生长于诱导培养基上芽转接于增殖培养基上进行增殖培养培养20 25 天，可见小芽可长成3 4公分的无根苗，每个芽的周围有2 6个新芽出现， 将丛生芽在无菌条件下取出，用解剖刀分开，置于上述增殖培养基中培养，在 20 25天内，各芽再生出一至数个新芽。
4. 根据权利要求1所述的一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于所 述将高度为3 4公分的壮苗转入生根培养基中首先在黑暗条件下培养2 3 天，随后转到光下培养7 10天可诱导形成根，再培养20 25天形成发达的根 系。
5. 根据权利要求1所述的一种三叶青的组培快速繁殖方法，其特征在于所述的将已生根的植株取出，栽培于珍珠岩泥炭土为1: 1 2的混合基质上 将装有生根幼苗的培养容器置于自然温度、光照的环境下锻炼5 7天，然后打 开瓶盖，放置1 2天后，将植株基部的琼脂洗净，将苗移栽到珍珠岩泥炭土为l: 1的混合基质培养20 35天，开始的10 14天温度为23 25 °C,相对 湿度为70 80%。
全文摘要
本发明公开一种三叶青的组培快速繁殖方法。包括外植体的选取与处理，诱导培养，增殖培养，生根培养，移栽等步骤。本发明以MS培养基为基础，加入了辅助剂活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、6-苄基腺嘌呤、激动素、玉米素、萘乙酸、吲哚丁酸等，用于三叶青丛生芽诱导、壮苗及生根三个关键阶段的组织培养。本发明的优点(1)三叶青的生产可以在人为控制条件下进行，不受季节、气候条件与土壤等因素的制约，可排除病虫害的侵染和农药残留的影响，严格控制三叶青药材的质量。(2)增殖速度快，生产周期短，设备简单，占地面积少，能节省人力、物力等，便于工厂化生产。(3)可以保存三叶青的种质资源，同时有利于保护野生资源，减少对自然资源的破坏。
文档编号C12N5/04GK101103700SQ20071007070
公开日2008年1月16日 申请日期2007年8月6日 优先权日2007年8月6日
发明者傅承新, 姜维梅, 赵云鹏 申请人:浙江大学