专利名称：：一种乙酸萘酯酶的提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种乙酸萘酯酶的提取方法，尤其是一种可用于有机磷农药快速测定的乙酸萘酯酶的提取方法。(二)
背景技术：
测定有机磷农药残留的方法主要有色谱法和酶抑制法，色镨法虽然可靠，但耗时、成本高，需要受过专门训练的技术人员操作，只适合在实验室检测，不适合在现场检测。在用酶抑制法快速测定有机磷农药中常用的酶为乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶从动物血液或组织中提取。动物乙酰胆碱酯酶不太适合现场快速检测使用，这是因为动物乙酰胆碱酯酶源不仅取材不便，而且必须冰冻保存，乙酰胆碱酯酶价格也比较昂贵，如对有机磷农药较敏感的电鳐乙酰胆碱酶，800元/500U,使对果蔬中农药残留的快速测定产品难以普及应用。现有公开的测定果蔬中有机磷农药残留的植物源性酯酶的提取方法，由于酶源的处理、提取液的选择、酶源浸泡时间以及酶源质量与提取液比例的选择等条件优化不足的原因，所提取出的酶对有机磷农药的最低检出限较高。本方法提供的提取方法能够制得对有机磷农药敏感、对农药的最低检出限较低的酯酶。在目前公开的资料中将这类酶称为植物酯酶，根据酶学分类和命名，这种命名方法不够确切。本方法中根据该酯酶催化的底物(乙酸萘酯)和酶学分类、命名原则，将该酯酶命名为乙酸萘酯酶。所述乙酸萘酯酶可催化下列反应乙酸萘酯+水』4"-萘酚+乙酸"-萘酚+固蓝盐B4显色产物+氯化锌+氯化氢
发明内容本发明的目的是提供一种能用于快速测定果蔬中有机磷农药残留的乙酸萘酯酶的提取方法，以代替动物乙酰胆碱酯酶，降低生产成本，提高检测灵敏度，使有机磷农药残留可在现场快速测定。为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种乙酸萘酯酶的提取方法，所述方法包括如下顺序步骤(1)将含有乙酸萘酯酶的植物种子去皮磨粉，04。C下、用815倍质量的蒸馏水浸泡12~18h,取上清液2000~6000r.p.m、0~4°C离心，取上清液，得酯酶粗提液；所述含有乙酸萘酯酶的植物种子来自下列之一的作物①小麦、②荞麦、③黄豆、④玉米、⑤水稻、大麦。(2)水浴条件下，往酯酶粗提液中加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵饱和度为5075%,再于3000~5000r.p.m、04。C离心，取沉淀，用pH6~7的磷酸緩冲液稀释210倍，得稀释后的酶液；(3)将稀释后的酶液用1030倍体积的蒸馏水透析，直至不产生沉淀为止，酶液再经浓缩、干燥，得所述乙酸萘酯酶。所述步骤(1)中蒸馏水浸泡时间优选为15h。所述步骤(2)中所用磷酸緩冲液pH值为6.38。具体的，所述步骤(3)中浓缩步骤为采用真空冷冻千燥机，04°C下浓缩酶液至固体。所述步骤(3)中浓缩步骤为将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000做干燥剂，4"C下浓缩。具体的，所述方法按如下顺序步骤进行(1)将含有乙酸萘酯酶的植物种子去皮磨粉，04。C下、用IO倍质量的蒸馏水浸泡15h,取上清液4500r.p.m、04。C离心，耳又上清液，得酯酶粗提液；(2)水浴条件下，往酯酶粗提液中加入石克酸铵，使酶液中硫酸铵饱和度为50%,再于4500r.p.m、04。C离心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩沖液稀释4倍，得稀释后的酶液；(3)将稀释后的酶液用20倍体积的蒸馏水透析24h后，酶液采用真空冷冻干燥机，4"C下浓缩酶液至固体，并冷冻干燥，得所述乙酸萘酯酶。或者，所述方法按如下顺序步骤进行a)将含有乙酸萘酯酶的植物种子去皮磨粉，04。C下、用10倍质量的蒸馏水浸泡15h,取上清液4500r.p.m、04。C离心，取上清液，得酯酶粗提液；b)水浴条件下，往酯酶粗提液中加入石克酸铵，使酶液中碌u酸铵饱和度为50%，再于4500r.p.m、04。C离心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩沖液稀释4倍，得稀释后的酶液；c)将稀释后的酶液用20倍体积的蒸馏水透析24h后，酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，用量为4mL/g酶液，4。C下浓缩酶液，得所述乙酸萘酯酶。乙酸萘酯酶可以使乙酸-a-萘酯水解为萘酚和乙酸，萘酚与显色剂固蓝B盐作用形成紫红色的偶氮化合物。当样品溶液中依次加入酶片和底物后，若样品中不含有机磷农药，则酶催化底物乙酸-a-萘酯迅速分解，样品溶液很快变为紫红色；若样品中含有机磷农药时，酶被有机磷农药抑制，催化能力下降或丧失，底物分解变慢或不分解，样品颜色变化緩慢或不发生变化，根据样品颜色的变化情况可判断样品中是否含有有机磷农药或其含量的情况。本发明所提供的乙酸萘酯酶提取方法，其原料来源广泛，制备工艺简单稳定，生产成本低，提取酶后的副产物无毒无害，可作其它原料用。经测定，产品用于对有机磷农药残留的检测，具有很高的灵敏度。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1:从小麦粉中提取乙酸萘酯酶的步骤如下(1)将小麦粉在4。C用蒸馏水浸泡15h,小麦粉与水的质量比为1:10,耳又其上清液；所得的上清液以4500r.p.m,0-4。C离心，耳又其上清液，即得酯酶粗提液；(2)在冰浴中，緩慢搅拌酯酶粗提液中，并加入石克酸铵，使酶液中硫酸铵的饱和度约为50%;上述所得溶液于4500r.p,m,04。C冷冻离心，保留沉淀；加入pH6.38的磷酸緩冲溶液溶解沉淀，并用pH6.38的磷酸緩冲溶液稀释4倍；(3)将上步经过碌u酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积20倍的蒸馏水透析24h,其间换水5次，直至用1。/。BaCl2无法测出硫酸根为止；植物植酶的浓缩用真空冷冻干燥机，在4t:条件下浓缩酶液至固体，并冷冻干燥，所得的酯酶制品密封后在冰箱冷藏中保存。测定样品从小麦粉中提取的酯酶。测定方法取lmL稀释后的酶液到试管中(酶液浓度为50mg/L),加入lmlpH=6.38的样品溶液，放在35。C的水浴中10min,加入lml显色基质溶液(l:9的1250mg/L乙酸-a-萘酯乙醇溶液与1562mg/L固蓝B盐水溶液)。反应10min后，观察颜色变化，呈紫红色为样品不含有机磷农药，颜色由浅至深，样品所含有才几^畴农药量由多至少。所提取出的酶能够促使下列反应发生，因此提取出的酶为乙酸萘酯酶。"-乙酸萘酯+水~^~>"-萘酚+乙酸"-萘酚+固蓝盐B—显色产物+氯化锌+氯化氢测定结果用分光光度法，由此酶液直接测定水中有机磷农药的检出限为曱胺磷0.03mg/L;敌敌畏0.0008mg/L;乐果0.16mg/L;马拉碌u磷4.5mg/L;辛硫磷8mg/L。按照上述提取方法及测定方法，改变步骤(l)中蒸馏水浸泡时间、或测定时磷酸緩冲溶液的pH值、或测定时的水浴温度，以反应时间(单位为分钟)为横坐标，吸光度为纵坐标作图得到的斜率可反映出酶活性的大小；一、用小麦粉在4'C用蒸馏水浸泡0.5h后提取出的酶，测得的斜率为0.028;而浸泡15h后提取出的酶，测得的斜率为0.046,可知浸泡15h所得的产物酶活要高于浸泡0.5h所得的产物。二、pH值与酶活间的关系(见表l):表1<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由表1可知，在反应液pH值为6.38时乙酸萘酯酶的酶活为最高，因此在提取过程中优选采用pH6.38的磷酸緩沖液进行沉淀和稀释，以使获得乙酸萘酯酶的酶活最大化，同时制得的乙酸萘酯酶可直接用于测定，无需再调pH,简化了操作。三、温度与酶活间的关系(见表2):表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由表2可知，在35。C下进行测定，酶活最高。实施例2:从荞麦粉中提取乙酸萘酯酶的步骤如下(1)将荞麦粉在4。C用蒸馏水浸泡15h，粉末与水的质量比为1:10,弃去沉淀，取其上清液；所得的上清液以4500r.p.m,04。C离心，取其上清液，即得酯酶粗提液。(2)在水浴中，緩慢搅拌酯酶粗提液中，并加入硫S吏铵，使酶液中硫酸铵的饱和度在50%的范围内；上述所得溶液于4500r.p.m,0-4。C冷冻离心，保留沉淀；加入pH6.38的磷酸緩冲溶液溶解沉淀，并用pH6.38的磷酸緩冲溶液稀释4倍；(3)将上一步经过碌u酸铵沉淀的酶液装入透析袋中，用其体积20倍的蒸馏水透析24h，其间换水5次，直至用1。/。BaCl2无法测出硫酸根为止；采用透析法浓缩酶液，将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，用量为4mL/g，在4。C条件下浓缩酶液，所得的植物酯酶制品密封后在冰箱冷藏中保存。所提取出的酶能够促使下列反应发生，因此提取出的酶为乙酸萘酯酶。"-乙酸萘酯+水"-萘酚+乙酸"-萘酚+固蓝盐B—显色产物+氯化锌+氯化氢n权利要求1.一种乙酸萘酯酶的提取方法，所述方法包括如下顺序步骤(1)将含有乙酸萘酯酶的植物种子去皮磨粉，0～4℃下、用8～15倍质量的蒸馏水浸泡12～18h，取上清液2000～6000r.p.m、0～4℃离心，取上清液，得酯酶粗提液；所述含有乙酸萘酯酶的植物种子来自下列之一的作物①小麦、②荞麦、③黄豆、④玉米、⑤水稻、⑥大麦；(2)冰浴条件下，往酯酶粗提液中加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵饱和度为50～75％，再于3000～5000r.p.m、0～4℃离心，取沉淀，用pH6～7的磷酸缓冲液稀释2～10倍，得稀释后的酶液；(3)将稀释后的酶液用10～30倍体积的蒸馏水透析，直至不产生沉淀为止，酶液再经浓缩、干燥，得所述乙酸萘酯酶。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中蒸馏水浸泡时间为15h。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中所用磷酸緩沖液pH值为6.38。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中浓缩步骤为采用真空冷冻干燥机，04。C下浓缩酶液至固体。5.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中浓缩步骤为将酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000做干燥剂，4。C下浓缩至体积为浓缩前酶液体积的1/5-1/3。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行:(1)将含有乙酸萘酯酶的植物种子去皮磨粉，04。C下、用IO倍质量的蒸馏水浸泡15h,取上清液4500r.p.m、04。C离心，取上清液，得酯酶粗提液；(2)冰浴条件下，往酯酶粗提液中加入硫酸铵，使酶液中石克酸铵饱和度为50%,再于4500r.p.m、04。C离心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩冲液稀释4倍，得稀释后的酶液；(3)将稀释后的酶液用20倍体积的蒸馏水透析24h后，酶液采用真空冷冻干燥机，4。C下浓缩酶液至固体，并冷冻干燥，得所述乙酸萘酯酶。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法按如下顺序步骤进行(1)将含有乙酸萘酯酶的植物种子去皮磨粉，04。C下、用IO倍质量的蒸馏水浸泡15h，取上清液4500r.p.m、04。C离心，取上清液，得酯酶粗提液；(2)冰浴条件下，往酯酶粗提液中加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵饱和度为50%,再于4500r.p.m、04。C离心，取沉淀，用pH6.38的磷酸緩冲液稀释4倍，得稀释后的酶液；(3)将稀释后的酶液用20倍体积的蒸馏水透析24h后，酶液装入透析袋中，用聚乙二醇6000作干燥剂，用量为4mL/g酶液，4。C下浓缩酶液至体积为浓缩前酶液体积的1/5~1/3,得所述乙酸萘酯酶。全文摘要本发明提供了一种乙酸萘酯酶的提取方法，所述方法包括如下顺序步骤(1)将植物种子去皮磨粉，0～4℃下、用蒸馏水浸泡12～18h，取上清液离心，取上清液，得酯酶粗提液；(2)冰浴条件下，往酯酶粗提液中加入硫酸铵，使酶液中硫酸铵饱和度为50～75％，再于离心，取沉淀，用pH6～7的磷酸缓冲液稀释2～10倍，得稀释后的酶液；(3)将稀释后的酶液用蒸馏水透析，直至不产生沉淀为止，酶液再经浓缩、干燥，得所述乙酸萘酯酶。本发明所提供的乙酸萘酯酶提取方法，其原料来源广泛，制备工艺简单稳定，生产成本低，提取酶后的副产物无毒无害，可作其它原料用。经测定，产品用于对有机磷农药残留的检测，具有很高的灵敏度。文档编号C12N9/16GK101148660SQ20071007120公开日2008年3月26日申请日期2007年9月6日优先权日2007年9月6日发明者严航贞,刘维屏,璟叶,张安平,张宏华,苗优娜,赵美蓉申请人:浙江工业大学