专利名称：一种miRNA屏障技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术。
背景技术：
miRNAs是一类长为21～25nt的非编码的单链RNA分子，广泛存在于植物和从线虫到人类的细胞中。微小RNA(microRNA，miRNA)是一种广泛存在、对基因表达进行微调的分子，在人类基因组中miRNA基因约占1％，是一类进化上高度保守、在生命中起着重要调控作用的分子。miRNA的靶向基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因，尽管miRNA的作用也是特异的，特别是5′端的2～8个碱基，特异性靶向于它的靶基因，但是与siRNA(smallinference RNA)不同的是miRNA的特异性并不是那么强，在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶向基因或多个miRNA调控一个靶向基因。
目前寻找miRNA、筛选miRNA靶向位点的方法比较成熟，例如用MirScan计算机分析工具来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功，另外miRseeker、NCBI的BLAST以及mfold软件也都是寻找miRNA常用的软件工具，2004年6月吴政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶向位点的方法等。虽然目前寻找、筛选miRNA靶向位点的方法比较成熟，也已经发现了千余个miRNA，但至今为止真正确认功能的miRNA还是微乎其微。
发明内容
为了进一步研究目标mRNA和miRNA对目标mRNA的调控作用，本发明提供了一种miRNA屏障技术。miRNA屏障技术按以下步骤实施(一)测定目标mRNA的3’UTR内与miRNA结合的靶向基因序列；(二)合成可与步骤(一)测得的靶向基因序列严密结合的特异性反义寡聚屏障序列；(三)将特异性反义寡聚屏障序列转导入细胞与目标mRNA结合形成二倍体，即可屏障目标mRNA的miRNA；所述步骤(二)中特异性反义寡聚屏障序列分子两端的5个核苷酸或脱氧核苷酸锁定，核糖环被位于2’氧原子和4’碳原子的亚甲基桥连。
本发明miRNA屏障技术与传统miRNA反义技术的明显不同点1、本发明miRNA屏障技术根据目标mRNA的3’UTR内与miRNA结合的靶向基因序列设计特异性反义寡聚屏障序列，而传统miRNA反义技术则是根据该miRNA的序列设计反义寡聚序列(AMO)。
2、本发明miRNA屏障技术通过所合成的特异性反义寡聚屏障序列与目标mRNA的结合，阻止了miRNA对目标mRNA蛋白翻译的特异性抑制作用，从而增加目标mRNA的表达。传统miRNA反义技术则是与该miRNA相结合，导致该miRNA失效并降解，从而增加目标mRNA的表达。
3、本发明miRNA屏障技术中所合成的特异性反义寡聚屏障序列与目标mRNA序列完全互补，所以具有基因特异性。而传统miRNA反义技术仅是根据该miRNA特异性片段设计，不具有基因特异性。同时，由于一个miRNA可能作用于多个靶向基因，所以该miRNA失效可能会影响多个基因的正常表达。
经免疫印迹检测证实特异性反义寡聚屏障序列转导进细胞后能够阻断内源miRNA到达目的mRNA的结合位点，降低了miRNA的基因表达抑制作用，而且本发明中的特异性反义寡聚屏障序列具有翻转内源性miRNA引起的目的mRNA抑制的作用。
本发明的技术方法具有导入基因稳定、高效表达，安全性高的优点。本发明不仅表明以基因特异性方式干预miRNA作用的可行性，而且为研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，也使选择性的基因治疗策略成为可能，并为miRNAs基因特异性应用奠定了基础。
图1是HCN2 mRNA、HCN4 mRNA、特异性反义寡聚屏障序列X1、X2和X3的序列图；图2、图3和图4是具体实施方式
四中对比实验的3项检测结果图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式miRNA屏障技术按以下步骤实施(一)测定目标mRNA的3’非编码区(3’UTR)内与miRNA结合的靶向基因序列；(二)合成可与步骤(一)测得的靶向基因序列严密结合的特异性反义寡聚屏障序列；(三)将特异性反义寡聚屏障序列转导入细胞与目标mRNA结合形成二倍体，即可屏障靶向mRNA的miRNA；所述步骤(二)中特异性反义寡聚屏障序列分子两端的5个核苷酸或脱氧核苷酸锁定，核糖环被位于2’氧原子和4’碳原子的亚甲基桥连。
本发明中特异性反义寡聚屏障序列导入靶向细胞后阻断了内源性该miRNA的作用，并可维持长期有效，且对靶向细胞无害。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(二)中特异性反义寡聚屏障序列为22nt。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一的不同点是步骤(三)中采用磷酸钙-DNA共沉淀法、脂质体介导DNA转染法或电击法转导特异性反义寡聚屏障序列。其它步骤及所选参数与实施方式一相同。
具体实施方式
四本实施方式经检测证实miR-1和miR-133可以抑制HCN2 mRNA表达，而且HCN4 mRNA是miR-1的又一靶向位点。根据目标HCN2 mRNA和HCN4 mRNA的3’UTR的miRNA结合位点，分别设计特异性反义寡聚屏障序列miRNA-masking antisense ODN1、ODN2和ODN3，HCN2mRNA、HCN4 mRNA及特异性反义寡聚屏障序列miRNA-masking antisenseODN1、ODN2和ODN3的序列如图1所示；合成特异性反义寡聚屏障序列且序列ODN1、ODN2和ODN3；将特异性反义寡聚屏障序列转导到细胞中与目标mRNA结合形成二倍体。
在相同实验条件下，将等剂量的传统miRNA反义技术合成的miR-1和miR-133的反义寡聚序列及ODN1、ODN2和ODN3转导到细胞中与空白对照细胞进行对比试验，实验结果表明HCN2和HCN4的表达及功能明显提高，具体检测结果如图2、图3和图4所示。在ODN1、ODN2和ODN3转导进细胞后HCN2与HCN4的蛋白水平和起搏电流传导性都明显大幅提高，说明HCN2与HCN4的表达和功能明显提高，证明本实施方式miRNA屏障获得成功。
具体实施方式
五本实施方式miRNA屏障技术按以下步骤实施(一)测定目标mRNA的3’非编码区(3’UTR)内与miRNA结合的靶向基因序列；(二)合成可与步骤(一)测得的靶向基因序列严密结合的22nt的特异性反义寡聚屏障序列，特异性反义寡聚屏障序列分子两端的5个核苷酸或脱氧核苷酸锁定，核糖环被位于2’氧原子和4’碳原子的亚甲基桥连，并构建miRNA靶点—萤光素酶指示剂载体(PGL3-靶DNA)；(三)将特异性反义寡聚屏障序列转导入购自美国标准菌库(ATCC，Manassas，VA)的H9c2细胞(大鼠心室肌细胞株)，再将1μg PGL3-靶DNA以及0.1μg PRL-TK(胸苷激酶驱动的Renilla萤光素酶表达载体)利用lipofectamine 2000(Invitrogen)进行共转染，在转染的48小时内用双重的萤光素酶指示剂测定试剂盒(Promega)在发光测量计上(Lumat LB9507)测量萤光素酶的活性(双萤光素酶报告基因系统归一反应)。
本实施方式以目标mRNA的3’UTR为模板通过PCR技术合成能与miRNA结合的寡核苷酸序列，并参照Promega公司萤光素酶检测系统产品说明书(原英文技术手册号码TB281)中载体的构建方法将合成的寡核苷酸序列插入到下游萤光素酶基因(采用HindIII和SpeI双酶切)的多克隆位点上。本实施方式中细胞都是在无血清的培养液中饥饿24小时后进行转染。本实施方式中反义的寡核苷酸对lipofectamine 2000需有特异性。
目标mRNA转录的定量检测采用传统的实时RT-PCR技术，从转染48小时之后的培养的新生大鼠心室肌细胞中提取总的RNA，这种mirVanaTMqRT-PCR检测试剂盒(Ambion)能够从总的RNA中能够灵敏的，快速地定量miRNA的表达。
经多组、多次对照实验证明采用miRNA屏障技术后mRNA表达蛋白的水平显著提高70％以上。
进行miRNA屏障技术的基因特异性妨碍miRNA活动的可行性评估，经实验证明miRNA类似物诱导的靶向基因抑制作用在本实施方式合成的特异性反义寡聚屏障序列存在时也存在；本实施方式合成的特异性反义寡聚屏障序列在阻断被AMO阻断的miRNA时与AMOs无叠加效应；而且本实施方式合成的特异性反义寡聚屏障序列对细胞内源性miRNA的水平无影响。
权利要求
1.一种miRNA屏障技术，其特征在于miRNA屏障技术按以下步骤实施(一)测定目标mRNA的3’UTR内与miRNA结合的靶向基因序列；(二)合成可与步骤(一)测得的靶向基因序列严密结合的特异性反义寡聚屏障序列；(三)将特异性反义寡聚屏障序列转导入细胞与目标mRNA结合形成二倍体，即可屏障靶向mRNA的miRNA；所述步骤(二)中特异性反义寡聚屏障序列分子两端的5个核苷酸或脱氧核苷酸锁定，核糖环被位于2’氧原子和4’碳原子的亚甲基桥连。
2.根据权利要求1所述的一种miRNA屏障技术，其特征在于步骤(二)中特异性反义寡聚屏障序列为22nt。
3.根据权利要求1所述的一种miRNA屏障技术，其特征在于步骤(三)中采用磷酸钙-DNA共沉淀法、脂质体介导DNA转染法或电击法转导特异性反义寡聚屏障序列。
全文摘要
一种miRNA屏障技术，它涉及一种生物技术。miRNA屏障技术按以下步骤实施(一)测定目标mRNA的3′UTR内与miRNA结合的靶向基因序列；(二)合成特异性反义寡聚屏障序列；(三)将特异性反义寡聚屏障序列转导入细胞与目标mRNA结合形成二倍体，即可屏障靶向mRNA的miRNA；所述步骤(二)中特异性反义寡聚屏障序列分子两端的5个核苷酸或脱氧核苷酸锁定，核糖环被位于2′氧原子和4′碳原子的亚甲基桥连。本发明的技术方法具有导入基因稳定、高效表达，安全性高的优点。本发明不仅表明以基因特异性方式干预miRNA作用的可行性，而且为研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，也使选择性的基因治疗策略成为可能，并为miRNAs基因特异性应用奠定了基础。
文档编号C12N15/09GK101054576SQ20071007200
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月6日 优先权日2007年4月6日
发明者杨宝峰, 王志国, 吕延杰, 王宁, 张莹 申请人:哈尔滨医科大学, 王志国