专利名称：：通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法
技术领域：
：本发明创造涉及一种适用于牛早期胚胎性别鉴定的PCR反应技术体系。性别控制及其发展动态概述家畜性别控制(SexControl)是一项能显著提高家畜繁殖效率的生物工程技术，本文简称性控技术。性控技术对家畜生产、育种和遗传疾病的防治均有非常重要的意义。在生产上，通过性别控制不但可以提高畜牧业的经济效益，还可以节省怀孕期母畜本繁殖年度的伺料消耗；在育种方面，通过性别控制可以增加选择家畜遗传和表型性别的强度，加快遗传进展；通过性别控制还可以消除不理想的携带隐性遗传病的性别，防止性连锁疾病；另外，在诱发牛产双胎上具有重大意义，一般情况下，如果移植的两枚胚胎是一雄一雌，就会造成异性孪生母犊不育，通过性别控制，就可以避免这种情况的发生。近年来，随着胚胎移植技术的逐步应用，特别是胚胎冷冻技术的不断完善，国际间的种畜交流逐渐被出售的胚胎所代替，已知性别的胚胎则备受欢迎和重视。细胞遗传学、组织免疫学、分子生物学等学科的迅速发展和高精密仪器的研制成功，为性别控制的研究提供了理论依据和先进手段。在以往的20多年中，对哺乳动物的性别控制进行了大量研究，如应用性激素、改变体液酸碱度、控制受精时间、食物营养、饲喂不同^属元素、改变生殖道环境、杀死或灭活带某种染色体的精子等，但这些方法有些仅能改变一定性比，达不到完全控制性别的目的，并且这些实验结果常常是不稳定的和缺乏重复性。随着对哺乳动物生殖机理认识的逐步深入，性别控制成为一种可能。现代生物科学理论认为动物的性别在两性配子完成受精、形成受精卵时就决定下来了，所以性别控制主要可以从两个方面入手。第一是控制雄性动物仅产生一种类型的精子或分离X、Y精子，然后用特定类型精子进入受精过程来实现对性别的控制。第二是控制胚胎的性别，而怀孕之初可能是控制胚胎性别的最有利时机，因对晚期胚胎进行操作比较困难，而且对已经发生分化的胚胎进行操作可能会造成致命性的伤害。所以，目前性别控制的研究和应用主要集中在配子水平的精子性别鉴定和胚胎水平的胚胎性别鉴定两个方向上。从目前性别控制研究的范围和进展情况来看，通过附植前胚胎的性别鉴3定达到性别控制的目的更具现实意义。因此，多年来胚胎性别鉴定的研究极其广泛。对胚胎性别鉴定方法的要求应是准确、迅速、经济、简便和无损害的，并应适合任何发育阶段的胚胎。事实上，要求某一方法达到所有条件是极不容易的。若能具备其中某些主要指标，则将是一种较好的方法。
发明内容本发明创造的目的是建立一种快速、灵敏、准确率高的适用于牛早期胚胎性别鉴定的PCR反应技术体系，建立一套切实可行的显微操作胚胎徒手分割方法。本发明创造的目的是这样实现的通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，其组成包括胚胎手工分割，提取胚胎细胞DNA(模板)，多重PCR扩增反应，扩增产物的检测与鉴定，在一个反应体系中，同时加入多对不同的引物，从而获得最大效率的PCR产物，PCR扩增所用引物包括a.用于特异性鉴定的引物上游弓l物5，AACGAAGACGAAAGGTGGC3';下游弓l物5'CCGCCGAAATCCGTGTAG3';b.用于内参照的引物上游引物5'CTAGTAGGCATCCTATTCCATGCC3';下游引物5，ATTCAGGCAAACTGACACCTCCG3。所述的通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，所述的多重PCR扩增反应为PCR反应体系各组分配比为灭菌三蒸水(ddH20)13nl、10xZ-r"《缓冲液2.0nl、2.5mmol/LdNTP混合物2.0jd、2.5U/nlZ-7ii《DNA聚合酶0.2jil、模板(胚胎细胞DNA提取液)5.0pl、Sl和S2各1.0pl、oil和a2各0.4^U，总计25pl。该反应采用两步法PCR，反应条件为98.0°C，6sec;62.8°C，10sec共30个循环。所述的通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，其特征是所述的胚胎分割过程包括采用玻璃针切割法切割胚胎，将晚期桑椹胚或襄胚移入加有12.5%蔗糖的PBS，当胚胎沉入底部，左手将培养皿把握在实体显微镜的视野下，用右手的拇指和食指捏住玻璃切割针，用针尖后部切割，对于桑椹胚和囊胚，由于其细胞数较多，为了减小对胚胎的伤害，可以只切取10%左右的细胞和一小部分透明带，刚开始切割时玻璃切割针位于胚胎上部，切割过程中逐渐偏向内细胞团对侧，使切下的部分越来越小，使得取样部分约为10%,切下的样品应为滋养层细胞，这样可以减小切割对胚胎发育的影响，切到培养皿底部时轻轻后拉，使之彻底切断，然后向水平方向横拉，使之与剩余部分分离，为了防止样品间交叉污染，每次切割下一个样品之前用PBS涮洗切割针，切割顺利，形态满意，定为切割成功。一种通过多重聚合酶链式反应进行胚胎性别鉴定方法在牛胚胎性别鉴定中的应用。这个技术方案有以下有益效果1.建立了快速、灵敏、准确率高的适用于牛早期胚胎性别鉴定的PCR反应体系。根据牛SRY基因序列设计了特异性引物，设立a—乳清蛋白基因作为内参照，两对引物种属特异性好，扩增灵敏度高。2.此体系采用多重PCR(MuleiplexPCR)，即同一体系内同时加入两对引物，其中一对是作为内参照，另一对是作为特异性鉴定的引物。此方法操作简便，用时较短，更重要的是增加了鉴定的准确率。在一个反应环境中，同时加入多对不同的引物，从而获得最大效率的PCR产物，也就是说，在PCR反应体系中，因此随温度变化的多次重复，就可使极微量的DNA片段，甚至单拷贝基因复制到108以上拷贝，实现对目的DNA的快速放大。3.本技术首次将Z-rfl《DNA聚合酶用于PCR性别检测，它是一种用于高速PCR的耐热性DNA聚合酶，反应速度及保真性能都很高，其反应速度约为/7ii《DNA聚合酶的5倍，其保真性能约为r7ii《DNA聚合酶的3倍。使用z-r"《进行PCR反应可大大节省反应时间，适合于本实验中胚胎在体外时间不宜过长的特殊要求的PCR反应。使反应时间从原来的110min减少到28min，縮短了74.5%。4.首次使用了Z—7ii《DNA聚合酶，结合多重PCR技术，使PCR反应时间縮短为原来的1/4,准确率达到100%。反应时间的缩短使胚胎回收、PCR反应、电泳检测和移植的整个过程缩短为3h左右。5.建立了一套切实可行的显微操作胚胎徒手分割方法。6.在奶牛生产实践中，人为控制其性别及比例，一方面能够加速优良品种繁育，扩大优良母畜的利用率，节省妊娠母畜本繁殖年度的饲料消耗，从而成倍地增加畜牧业的经济效益。另一方面，还可以消除不理想的携带隐性遗传病的性别，防止性连锁疾病，加速家畜的遗传进展，加快奶畜群的更新。附图1是本发明方法的PCR扩增产物电泳检测与鉴定图。具体实施例方式实施例l:通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，其组成包括胚胎手工分割，提取胚胎细胞DNA(模板)，多重PCR反应，扩增产物的检测与鉴定，在一个反应环境中，同时加入多对不同的引物，从而获得最大效率的PCR产物，引物设计所用引物分别参照GenBank上牛的性别决定基因(Sex—determiningregionofYChromosome,SRY)、a—乳清蛋白基因(a—lactalbumin,a—LA)序列设计引物，设计软件为DANMAN、PrimerPremier5.0,由上海博亚生物技术有限公司合成。PCR扩增所用引物:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>胚胎分割过程采用玻璃针切割法切割胚胎，将晚期桑椹胚或囊胚移入加有12.5%蔗糖的PBS，当胚胎沉入底部，左手将培养皿把握在实体显微镜的视野下，用右手的拇指和食指捏住玻璃切割针，用针尖后部切割，对于桑椹胚和囊胚，由于其细胞数较多，为了减小对胚胎的伤害，可以只切取10%左右的细胞和一小部分透明带，刚开始切割时玻璃切割针位于胚胎上部，切割过程中逐渐偏向内细胞团对侧，使切下的部分越来越小，使得取样部分约为10%,切下的样品应为滋养层细胞，这样可以减小切割对胚胎发育的影响，切到培养皿底部时轻轻后拉，使之彻底切断，然后向水平方向横拉，使之与剩余部分分离，为了防止样品间交叉污染，每次切割下一个样品之前用PBS涮洗切割针，切割顺利，形态满意，定为切割成功。制备模板取适当数量的胚胎细胞(510个)用PBS洗3次，在体视显微镜下，用口吸管吸入预先放有5jilDNA提取液的0.2mlEp管中，室温下放置5min，直接用于PCR扩增。制备PCR的反应液其组成及配比如下灭菌三蒸水(ddH20)13屮、10xZ-Taq缓冲液2.0pl、2.5mmol/LdNTP混合物2.0^1、2.5U/filZ-TaqDNA聚合酶0.2pl、模板(细胞DNA提取液)5.0jil、Sl和S2各1.0jil、al和a2各0.4nl，总计25nl。整个过程在冰上进行，Z-TaqDNA聚合酶最后加入。PCR反应该反应采用两步法PCR，将混合好的PCR的反应液放入PCR仪，按照反应条件98.0'C，6sec，然后转到62.8'C，10sec，再转回到98.0'C，6sec，如此反复在两组温度和时间之间共进行30个循环，进行反应。基因扩增产物电泳检测与鉴定取PCR产物6ul，力卩lul6XLoadingBuffer,上样于0.8%琼脂糖凝胶，同时加4ulMarker(DL2000)作参照。恒压180V/cm电泳30min，电泳结束后，雌性牛胚胎样品出现一条109bp大小的特异性4带(如下图中1-4、6泳道)，雄性牛胚胎样品出现两条大小分别为109bp和432bp的特异性条带(如下图中5泳道)。PCR扩增产物电泳检测与鉴定见图1。图中M:DL2000Marker;泳道1一4:牛胚胎样品；泳道5:阳性对照，模板为雄性牛组织DNA;泳道6:阳性对照，模板为雌性牛组织DNA;泳道7:没有添加模板的阴性对照实施例2:一种以上所述的通过多重聚合酶链式反应进行胚胎性别鉴定方法在牛胚胎性别鉴定中的应用。权利要求1.一种通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，其组成包括胚胎手工分割，提取胚胎细胞DNA(模板)，多重PCR扩增反应，扩增产物的检测与鉴定，其特征是在一个反应体系中，同时加入多对不同的引物，从而获得最大效率的PCR产物，PCR扩增所用引物包括a.用于特异性鉴定的引物上游引物5′AACGAAGACGAAAGGTGGC3′；下游引物5′CCGCCGAAATCCGTGTAG3′；b.用于内参照的引物上游引物5′CTAGTAGGCATCCTATTCCATGCC3′；下游引物5′ATTCAGGCAAACTGACACCTCCG3′。2.根据权利要求1所述的通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，其特征是所述的多重PCR扩增反应为PCR反应体系各组分配比为灭菌三蒸水(ddH20)13^1、10xZ-7ii《缓冲液2.0jil、2.5mmol/LdNTP混合物2.0jd、2.5U/plZ-7ii《DNA聚合酶0.2jd、模板(胚胎细胞DNA提取液)5.0fil、Sl和S2各1.0nl、al和a2各0.4jd，总计25jU，该反应采用两步法PCR，反应条件为98.0°C，6sec;62.8'C，10sec共30个循环。3.根据权利要求1或2所述的通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法，其特征是所述的胚胎分割过程包括釆用玻璃针切割法切割胚胎，将晚期桑椹胚或囊胚移入加有12.5%蔗糖的PBS，当胚胎沉入底部，左手将培养皿把握在实体显微镜的视野下，用右手的拇指和食指捏住玻璃切割针，用针尖后部切割，对于桑椹胚和囊胚，由于其细胞数较多，为了减小对胚胎的伤害，可以只切取10%左右的细胞和一小部分透明带，刚开始切割时玻璃切割针位于胚胎上部，切割过程中逐渐偏向内细胞团对侧，使切下的部分越来越小，使得取样部分约为10%，切下的样品应为滋养层细胞，这样可以减小切割对胚胎发育的影响，切到培养皿底部时轻轻后拉，使之彻底切断，然后向水平方向横拉，使之与剩余部分分离，为了防止样品间交叉污染，每次切割下一个样品之前用PBS涮洗切割针，切割顺利，形态满意，定为切割成功。4.一种通过多重聚合酶链式反应进行胚胎性别鉴定方法在牛胚胎性别鉴定中的应用。全文摘要通过多重聚合酶链式反应进行牛早期胚胎性别鉴定方法。性控技术对家畜生产、育种和遗传疾病的防治均有非常重要的意义。本方法的组成包括胚胎手工分割，提取胚胎细胞DNA(模板)，多重PCR扩增反应，扩增产物的检测与鉴定，在一个反应体系中，同时加入多对不同的引物，从而获得最大效率的PCR产物，PCR扩增所用引物包括a.用于特异性鉴定的引物上游引物5′AACGAAGACGAAAGGTGGC3′；下游引物5′CCGCCGAAATCCGTGTAG3′；b.用于内参照的引物上游引物5′CTAGTAGGCATCCTATTCCATGCC3′；下游引物5′ATTCAGGCAAACTGACACCTCCG3′。本方法用于牛胚胎的性别鉴定。文档编号C12Q1/68GK101260425SQ20071007184公开日2008年9月10日申请日期2007年3月7日优先权日2007年3月7日发明者娣刘,野袁申请人:黑龙江省农业科学院畜牧研究中心