专利名称：拟miRNA序列及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA序列及其制备方法。
背景技术：
miRNAs是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过酶加工后生成的一类长约21～25nt的非编码的单链RNA分子，广泛存在于植物和从线虫到人类的细胞中。微小RNA(miRNA)是一种广泛存在、对基因表达进行微调的分子，在人类基因组中miRNA基因约占1％，miRNA的靶向基因多数是参与转录、信号转导、肿瘤发生的基因，是一类进化上保守、在生命中起着重要调控作用的分子。miRNA对靶向基因的微调具有如下优点①比从蛋白水平的调节更节省能量；②相对于转录调节，miRNA的效果更快而且是可逆的；③对于一些只需微量蛋白进行调节的细胞功能，就可通过miRNA来达到调控目的；④内含子中编码的miRNA是一种可高效利用的细胞内资源。
尽管miRNA的作用也是特异的，特别是5′端的2～8个碱基，特异性靶向于它的靶基因，但是与siRNA(small inference RNA)不同的是miRNA的特异性并不强，在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶向基因或多个miRNA调控一个靶向基因，因此缺乏基因特异性。
发明内容
本发明的目的是为了解决miRNA缺乏基因特异性的缺陷，而提供的一种拟miRNA序列及其制备方法。
拟miRNA序列为22nt，序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与目标mRNA的3’UTR的延伸序列特异性互补。上述拟miRNA序列按以下步骤制备(一)测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根据延伸序列特异性设计含有22 nt的拟miRNA序列，其中拟miRNA序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补，即得到拟miRNA序列。
本发明通过MirScan、miRseeker、BLAST及mfold等基因序列分析软件和网上基因序列比对工具测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列，并找到目标mRNA的特异性片断，再根据延伸序列特异性设计拟miRNA序列。
本发明中的拟miRNA序列与传统的外源性小分子干扰RNA(siRNA)相比具有以下明显区别①虽然拟miRNA和siRNA都是外源性RNA，但siRNA必须与靶标基因序列完全配对才能起到基因沉默的作用，而拟miRNA只需与靶标基因序列配对6个核苷酸便可起到基因沉默的作用。设计拟miRNA比设计siRNA要更容易，因为在靶标基因上寻找一段较短的基因特异性序列显然比寻找一段较长的基因特异性序列的机率要高得多。
②作用位置拟miRNA与内源性miRNA一致主要作用于靶标基因的3’UTR区，而siRNA可作用于mRNA的任何部位。
③作用方式拟miRNA与miRNA都主要抑制目标基因的翻译，在某些条件下亦可导致目标基因mRNA降解，即拟miRNA在目标基因转录后抑制起作用；而siRNA通过降解目标基因mRNA而起到基因沉默的作用，不直接影响目标基因的翻译过程。因此一旦消除了拟miRNA之后完整的目标基因mRNA即可恢复翻译过程而合成蛋白，而在消除siRNA之后蛋白翻译过程须待新的消除基因mRNA完成转录后才能重新启动。
人工合成拟miRNA与内源性miRNA具有如下区别人工合成的拟miRNA是根据目的基因的序列设计而成，基因作用具有特异性，拟miRNA下游调控靶点单一且特异；而内源性miRNA的作用缺乏选择性，一个miRNA可以作用于多个基因，产生多重后续效应。本发明提供的拟miRNA序列因具有基因特异性，为研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，可广泛应用于疾病的基因诊断与治疗，并扩展应用于生物学领域。
本发明拟miRNA具有转导稳定、高效表达，安全性高的优点。
图1是miR-HCN2基因序列图；图2是miR-HCN4基因序列图；图3是H9c2细胞内转录HCN2的mRNA水平检测图，图中黑色实心条形柱表示转导miR-HCN2后H9c2细胞内mRNA的水平，图中白色空心条形柱表示空白对照组H9c2细胞内mRNA的水平；图4是H9c2细胞内转录HCN4的mRNA水平检测图，图中黑色实心条形柱表示转导miR-HCN4后H9c2细胞内mRNA的水平，图中白色空心条形柱表示空白对照组H9c2细胞内mRNA的水平。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式拟miRNA序列为22nt，序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与目标mRNA的3’UTR的延伸序列特异性互补。
本实施方式拟miRNA序列可通过以下方式导入1、直接将拟miRNA导入体内的方法(a)异位导入将拟miRNA导入非病变的细胞，如皮下，肌肉等；(b)原位导入将拟miRNA直接导入病变的部位，如肿瘤细胞、骨髓细胞等；2、拟miRNA治疗的体外导入(回输)即将病人的部分组织或细胞取出在体外培养，在导入拟miRNA后再回输入体内；3、体细胞拟miRNA导入将拟miRNA转移到体细胞(使之发挥内源性miRNA功能，以达到治疗的目的)；4、生殖细胞的拟miRNA导入将拟miRNA转移到患者的生殖细胞(精细胞或卵细胞)或中早期胚胎中(使其可以发育成正常个体，一般采用显微注射法)。
本实施方式拟miRNA序列可用于多种疾病，如肿瘤、高血压、哮喘、糖尿病、肥胖症、心脏病、老年痴呆症等的协助诊断和治疗。
经多组对比实验证明拟miRNA序列22nt中5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸必须与目标mRNA的3’UTR中延伸序列特异性互补，否则合成出的拟miRNA对目标mRNA的表达无影响。
具体实施方式
二本实施方式拟miRNA序列按以下步骤制备(一)测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根据延伸序列特异性设计含有22nt的拟miRNA序列，其中拟miRNA序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补，即得到拟miRNA序列。
在已知因miRNA紊乱而引起的高血压、心脏病等心血管疾病的基础上，可采用拟miRNA诊断并治疗。如在心肌肥大发病过程中患者体内的miR-29c、miR-93、miR-150、miR-195等miRNA发生变化，在心衰过程中患者体内的miR-24、miR-125b、miR-195、miR-199a、miR-214等miRNA发生变化，因此采用本实施方式方法制备上述miRNA的拟miRNA序列在基因水平治疗这些疾病。
本实施方式制备的拟miRNA序列用于肿瘤的诊断与治疗，例如miR-15和miR-16定位在染色体13q14区段，研究发现65％的慢性淋巴性白血病(CLL)病人携带miR-15与miR-16丢失或突变的癌细胞，在慢性淋巴性白血病、多发性骨髓瘤和前列腺癌中也常有该区段的丢失。这两种miRNA通过抑制Bcl-2蛋白的表达调节细胞凋亡过程，Bcl-2蛋白主要通过作用于线粒体来实现其抑制凋亡的生物学活性，因此当miR-15和miR-16丢失或突变，Bcl-2蛋白的表达量上升，肿瘤细胞凋亡受阻，所以导致肿瘤发生。因此采用本实施方式制备拟miRNA可达到治疗上述肿瘤的作用。
本实施方式制备的拟miRNA序列用于神经系统疾病的诊断与治疗。如可以定位Alzheimer′s disease(阿耳茨海默病，老年性痴呆)、Parkinson′s disease(帕金森氏病，震颤麻痹)等神经系统疾病的致病miRNA，就可以采用拟miRNA进行治疗。
通过人工合成并导入相应拟miRNA调节失去控制的基因转录和翻译，可以诊断与治疗由遗传因素引发的疾病，如糖尿病、肥胖症、哮喘等疾病。
有些miRNA是干细胞特有的(如小鼠干细胞特异表达miR-290～295，人干细胞特异表达miR-371～373)，因此可人工合成相应的拟miRNA进行干细胞诱导分化治疗相关疾病。同样拟miRNA可以应用于其它生物学领域，如Notch信号途径在多细胞生物发育中极为重要，在果蝇中Notch基因编码螺旋-环-螺旋抑制子和羽毛蛋白，最近发现这些基因的3’UTR K-box、GY-box、Brd-box模序也为miRNA所调节，K-box被miR-2、miR-11调节，GY-box被miR-7调节，Brd-box被miR-4、miR-79调节，进而影响翅膀血管空间分布、薄厚等表型，因此可人工合成的拟miR-2、miR-11、miR-7、miR-4及miR-79等，可对其它生物体的器官功能进行调节。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(二)中拟miRNA序列5’末端有2～7个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补。其它步骤及所选参数与实施方式二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(二)中拟miRNA序列5’末端有3～6个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补。其它步骤及所选参数与实施方式二相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
二的不同点是步骤(二)中拟miRNA序列5’末端有4～5个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补。其它步骤及所选参数与实施方式二相同。
具体实施方式
六本实施方式经检测证实miR-1和miR-133能够抑制HCN2的转录、miR-1能够抑制HCN4的转录、miR-1和miR-133也可以用于降低心室肌细胞起搏点活性。首先通过基因序列分析软件测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列，并找到目标mRNA的特异性片断，再根据延伸序列特异性设计22nt的拟miRNA序列miR-HCN2(miR-HCN2基因序列如图1所示)，拟miRNA序列miR-HCN2的5’末端有8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与目标mRNA的3’UTR的延伸序列特异性互补。然后再构建miRNA靶点—萤光素酶指示剂载体(PGL3—靶DNA)以目标mRNA的3’UTR为模板通过PCR技术合成能与miRNA结合的寡核苷酸序列，并参照Promega公司萤光素酶检测系统产品说明书(原英文技术手册号码TB281)中载体的构建方法将合成的目标寡核苷酸序列插入到下游萤光素酶基因(采用HindIII和SpeI双酶切)的多克隆位点上。再将10nM拟miRNA序列miR-HCN2转导入美国标准菌库(ATCC，Manassas，VA)H9c2细胞(大鼠心室肌细胞株)，再将1μg PGL3—靶DNA以及0.1μg PRL-TK(胸苷激酶驱动的Renilla萤光素酶表达载体)用lipofectamine 2000(Invitrogen)共转染入H9c2细胞，在转染的48小时内用双重的萤光素酶指示剂测定试剂盒(Promega)在发光测量计上(Lumat LB9507)测量萤光素酶的活性(双萤光素酶报告基因系统归一反应)。
本实施方式中细胞都是在无血清的培养液中饥饿24小时后进行转染。本实施方式每组数据通过均数±标准误表示，采用非配对student t-检验进行统计，双尾p＜0.05认为有明显统计学意义，在GraphPad Prism中用非线性最小二乘法进行曲线拟合。
本实施方式中用10nM miR-HCN2处理过的大鼠细胞其HCN2表达水平发生变化，内源的HCN2蛋白下调约75％。采用与本实施方式相同的方法观察到针对HCN4的拟miRNA序列miR-HCN4(miR-HCN4基因序列如图2所示)同样能够抑制HCN4的蛋白表达，约抑制70％。经检测H9c2细胞内转录HCN2和HCN4的mRNA水平分别如图3和图4所示，证实了模拟miRNA的作用实符合天然miRNAs的作用规律。
miR-HCN2/miR-HCN4的功能关联为了明确miR-HCN2/miR-HCN4能够干扰HCN2和HCN4的表达，本实施方式评价这些因子对起搏电流(If)、心肌细胞收缩频率产生的影响。首先将这些因子转染进入乳鼠细胞，以全细胞膜片钳记录If电流，所有检测电位下，相对于阴性对照组，转染了miR-HCN2/miR-HCN4的细胞其If电流明显降低，在-120mV时miR-HCN2(10nM)与miR-HCN4(10nM)分别降低If电流约66％和41％。乳鼠心肌细胞在培养皿中原代培养时保持原有特性，当转入包被有层粘连蛋白的培养皿中时，基础收缩同步频率明显稳定，为59±7次/分钟。测定收缩率前用TFO-HCN4，miR-HCN2/miR-HCN4孵育细胞48小时(不加脂质体)，单层细胞收缩频率被miR-HCN2及miR-HCN4不同程度抑制，同时应用miR-HCN2及miR-HCN4会增加抑制程度，实验数据与蛋白表达及荧光强度的结果相符。
权利要求
1.拟miRNA序列，其特征在于拟miRNA序列为22nt，序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与目标mRNA的3’UTR的延伸序列特异性互补。
2.如权利要求1所述拟miRNA序列的制备方法，其特征在于拟miRNA序列按以下步骤制备(一)测定目标mRNA的3’UTR的延伸序列；(二)根据延伸序列特异性设计含有22nt的拟miRNA序列，其中拟miRNA序列5’末端有1～8个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补，即得到拟miRNA序列。
3.根据权利要求2所述的拟miRNA序列的制备方法，其特征在于步骤(二)中拟miRNA序列5’末端有2～7个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补。
4.根据权利要求2所述的拟miRNA序列的制备方法，其特征在于步骤(二)中拟miRNA序列5’末端有3～6个核苷酸、3’末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补。
全文摘要
拟miRNA序列及其制备方法，它涉及一种RNA序列及其制备方法。它解决了miRNA缺乏基因特异性的缺陷。拟miRNA序列为22nt，序列5′末端有1～8个核苷酸、3′末端有7个核苷酸与目标mRNA的3′UTR的延伸序列特异性互补。拟miRNA序列按以下步骤制备(一)测定目标mRNA的3′UTR的延伸序列；(二)根据延伸序列特异性设计含有22nt的拟miRNA序列，其中拟miRNA序列5′末端有1～8个核苷酸、3′末端有7个核苷酸与延伸序列特异性互补，即得到拟miRNA序列。本发明提供的拟miRNA序列因具有基因特异性，为研究miRNAs的功能提供了新的研究手段，可广泛应用于疾病的基因诊断与治疗，并扩展应用于生物学领域。
文档编号C12N15/113GK101054580SQ20071007200
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月6日 优先权日2007年4月6日
发明者王志国, 杨宝峰, 吕延杰, 张勇 申请人:哈尔滨医科大学, 王志国