专利名称：一种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用。
背景技术：
油田三次采油中水溶性聚合物聚丙烯酰胺(HPAM)已广泛使用，在中国的大庆油田现在广泛使用“三元复合驱”采油技术三次采油，“三元”主要包括超高分子量聚丙烯酰胺(HPAM)、碱和表面活性剂。超高分子量聚丙烯酰胺(HPAM)水溶液被用来作为驱油剂注入油层，使具有较大黏度的原油(成分主要为饱和烃、芳烃、胶质及沥青质)与水之间流度比下降，减弱水的粘性指进，从而提高原油采收率。聚合物驱油的采出液中不仅含有原油，而且还含有大量的聚丙烯酰胺，造成含聚丙烯酰胺的污水大量增加，污水中聚丙烯酰胺含量也大幅增加。油田含聚丙烯酰胺的污水是一类比较复杂、特殊的污水，存在含油多，黏度大的特点，因此难于去除或降解油田污水中的聚丙烯酰胺。
发明内容
本发明的目的是为了解决目前难于去除或降解油田污水中的聚丙烯酰胺的问题，而提供的一种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌及其应用。
本发明提供的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL(Clostridium Daqing WL)经鉴定属于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，保藏日期为2007年1月10日，保藏号为CGMCC No.1911；大庆梭菌-WL为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，在pH 5.0～11.0、10～65℃的条件下生长，菌株长短多变，宽为0.4μm～0.8μm，长为1.4μm～4μm，无鞭毛；大庆梭菌-WL在固体培养基上生长为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘整齐；大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源。上述梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，可用于生物降解聚丙烯酰胺。
本发明提供的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL(Clostridium Daqing WL)通过16S rDNA基因序列比对分析与其最相近种属斯氏梭菌(Clostridiumsticklandii)的相似性为94％，16S～23S rDNA间隔区序列比对结果显示保守区域仅为tRNAAla和tRNAIle序列，变异区域与同属已知的其它种芽胞梭菌细菌的16S～23S rDNA间隔区序列没有同源性区域。根据《OrenA，VentosaA，GrantWD.Proposed minimal standards for the description of new taxa in the OrderHalobacteriales.Int J Syst Bacteriol，1997，47233-2381》中16S rDNA序列同源性小于97％既可认定为属于不同种的理论，本发明提供的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL属于一个新菌种——梭状芽胞杆菌属大庆梭菌种(ClostridiumDaqing)。
本发明提供的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源。将10mL菌液浓度为6×106个/mL的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL加入90mL聚丙烯酰胺浓度为500mg/L的油田污水中培养20天后油田污水中聚丙烯酰胺的降解率为35％～76％。
梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL(Clostridium Daqing WL)属于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市海淀区中关村北一条13号，保藏日期为2007年1月10日，保藏号为CGMCC No.1911。
图1是梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL的透色电镜观察图，图2～图4是梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL的原子力显微镜观察图，图5是梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL和相近菌株的16S rDNA序列构建的NJ系统发育树图，图6是聚丙烯酰胺固体粉末干片的扫描电镜观察图，图7是聚丙烯酰胺水溶液干片的扫描电镜观察图，图8是经梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解7天后的聚丙烯酰胺溶液干片的扫描电镜观察图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL(ClostridiumDaqing WL)经鉴定属于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)的一个新种—大庆梭菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年1月10日，保藏号为CGMCC No.1911；大庆梭菌-WL为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，在pH 5.0～11.0、10～65℃的条件下生长，菌株长短多变，宽为0.4μm～0.8μm，长为1.4μm～4μm，无鞭毛；大庆梭菌-WL在固体培养基上生长为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘整齐；大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源。
本实施方式中的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL的长短不一，菌株宽为0.4μm～0.8μm、长为1.4μm～4μm。图1是梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL的透色电镜观察图，图2～4是梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL的原子力显微镜观察图，可以从图1～4观察到梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL无鞭毛。
本实施方式中的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL以硫酸盐、亚硫酸盐和还原性硫化物为电子受体将其还原成H2S，并兼性厌氧。本实施方式中的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL能以乳酸钠、甲酸钠、苹果酸、葡萄糖、琥珀酸、酵母膏和蛋白胨为碳源，以硫酸氨、尿素为氮源生长。
具体实施方式
二本实施方式梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL(ClostridiumDaqing WL)菌株是通过以下步骤测得(一)梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL菌株的分离、纯化和筛选a.取聚丙烯酰胺注入站母液罐的水溶液5～10mL放入充满氮气、含有厌氧无菌水的厌氧瓶中，并加入5～20颗玻璃珠在30～38℃的条件下振荡4±0.1h；b.用厌氧无菌水倍比稀释菌液，再将菌液接种于改良Starkey固体培养基中，采用“滚管”培养7～10天；c.进行多次分离纯化直至用电镜确认为纯菌株；(二)挑选高效降解菌株将纯菌株富集化培养后按相同接种量接种于以聚丙烯酰胺为唯一碳源制备培养基，从中选出聚丙烯酰胺降解率最高的菌株(梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL)；(三)菌株(梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL)的生理生化分析菌株(梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL)的生理生化鉴定参照《伯杰细菌鉴定手册》第八版操作，鉴定结果为梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL以硫酸盐、亚硫酸盐和还原性硫化物为电子受体将其还原成H2S，并兼性厌氧；梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL能以乳酸钠、甲酸钠、苹果酸、葡萄糖、琥珀酸、酵母膏和蛋白胨为碳源，以硫酸氨、尿素为氮源生长；改良Starkey液体培养基液相末端产物经气相色谱检测为乙醇、乙酸、丙酸和丁酸；
(四)菌株(梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL)分类鉴定a.用宝生物工程(大连)有限公司试剂盒提取菌株(梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL)的DNA，并进行PCR扩增，16S rDNA序列的上游引物Eubac27F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，16S～23S rDNA间隔区的上游引物P15’-GGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA-3’，下游引物P25’-CCTCTGACTGCCAGGGCATCC-3’；PCR反应体系为50μL，50LPCR反应体系中包括DNA模板40ng，终浓度为0.3U的TagDNA聚合酶，浓度为0.3mmol/L的dNTP，浓度为0.1μmol/L的引物Eubac27F、浓度为0.1μmol/L的引物1492R、浓度为0.1μmol/L的引物P1和浓度为0.1μmol/L的引物P2；PCR扩增程序为94℃预热5min，94℃变性30s，58℃复性45s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；b.扩增产物于1.0％的琼脂糖电泳检测；c.DNA凝胶回收试剂盒切胶回收后与pGEM-T(Promega)载体连接，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞；d.LB固体培养基中加入氨苄青霉素AMP(5μg/mL)和X-gal(5-溴-4-氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，筛选蓝白斑转化子；e.提取质粒并测序，测序工作由上海生物工程有限公司完成；梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，16S～23S rDNA间隔区部分基因序列如SEQ ID NO.2所示。
本实施方式步骤(一)中改良Starkey固体培养基按0.5g HPAM、0.5gK2HPO4、1.0g NH4Cl、2g Na2SO4、0.1g CaCI2·2H2O、2.0g MgSO4·7H2O、1.0g酵母膏、6mL浓度为60％的乳酸钠溶液、2％的刃天青溶液1mL、0.5g L-半光盐酸盐、12g琼脂糖和1000mL水的比例配制，并在培养基121℃灭菌20min后，单独加入0.1mL浓度为3％的FeSO4·(NH4)2SO4溶液制成；其中培养基煮沸后加入L-半光盐酸盐，并通入高纯氮气驱氧30±2min，培养基由红色变成淡黄色表明培养基为厌氧状态；121℃灭菌20min后单独加入0.1mL浓度为3％的FeSO4·(NH4)2SO4溶液。本实施方式步骤(三)中改良Starkey液体培养基与改良Starkey固体培养基的区别仅在于不加入琼脂糖。
本实施方式步骤(一)中“滚管”培养是应用Hungate提出的厌氧操作技术，将菌液注入融化的固体培养基中，在冷水中滚动，使培养基在离心力作用下，附着在管壁上，使菌在表面上生长的培养方法。
本实施方式步骤(四)中的PCR引物由大连宝生物工程有限公司合成。
对本实施方式获得的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL基因序列进行比对分析，梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL与其最相近种属斯氏梭菌(Clostridiumsticklandii)的16S rDNA基因相似性为94％；16S～23S rDNA间隔区序列比对结果显示保守区域仅为tRNAAla和tRNAIle序列，变异区域与同属已知的其它种芽胞梭菌细菌的16S～23S rDNA间隔区序列没有同源性区域。经过分析梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL属于一种新菌种——梭状芽胞杆菌属大庆梭菌种(Clostridium Daqing)，根据梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL和相近菌株的16SrDNA序列构建的NJ系统发育树如图5所示。
具体实施方式
三本实施方式梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，可用于生物降解聚丙烯酰胺。
对梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL生物降解聚丙烯酰胺的能力进行检测在10～38℃的条件下取10mL、含菌落数为6.0×106个/mL的梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL培养液加入90mL聚丙烯酰胺浓度为500mg/L的油田污水中培养20天后油田污水中聚丙烯酰胺的降解率为35％～76％。经过梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL生物降解聚丙烯酰胺表面结构发生变化，分子链上的酰胺基水解成羧基，侧链降解，部分官能团发生改变，溶液黏度下降70％以上。
经气质联机(GC-MS)分析聚丙烯酰胺发生断链梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解聚丙烯酰胺的降解物经质谱计算机系统检索并与纯化合物谱图核对，确定保留时间为9.368min的是底物正十六酰胺(C16H33N)，为聚丙烯酰胺生物降解作用下C-C断链后的产物；还有3-甲基-4-康醇(C8H18O)保留时间为1.505min，2-甲基丁二酸异丁酯(C13H24O4)保留时间为2.418min，除此之外另有14种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL的降解物和代谢产物，其中除少数含双键、环氧和羰基的低分子量聚丙烯酰胺(C4～C30)碎片外，大多数是丙烯酰胺低聚体的衍生物。
将聚丙烯酰胺固体粉末、聚丙烯酰胺水溶液和经梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解7天后的聚丙烯酰胺溶液制成干片，为增加干片电导性进行喷金(Gatan 682离子刻蚀镀膜仪)，然后在扫描电镜(HITACHI S-4700)下观察聚丙烯酰胺的结构，扫描电镜观察结果图分别入如图6、图7和图8所示。扫描电镜观察结果发现，聚丙烯酰胺固体粉末多数为块状，呈凸凹不平；聚丙烯酰胺在水溶液中结构变成规则的鳞片状，排列整齐，结构均匀；聚丙烯酰胺经梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解后，聚丙烯酰胺结构变得杂乱无张，结构发生明显的改变完形成许多细小的无规则的条状分支，聚丙烯酰胺表面结构发生改变，说明梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL对聚丙烯酰胺具有降解作用。
将聚丙烯酰胺固体粉末、聚丙烯酰胺水溶液和经梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解7天后的聚丙烯酰胺溶液制成干片后进行红外光谱检测，红外光谱检测结果如图9所示，图中曲线A为聚丙烯酰胺水溶液干片红外光谱曲线，图中曲线C为聚丙烯酰胺固体粉末干片红外光谱曲线，图中曲线B为经梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解7天后的聚丙烯酰胺溶液干片红外光谱曲线；图中3198.8299吸收峰的出现值代表N-C键断裂；在图中经梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解7天后的聚丙烯酰胺溶液干片红外光谱曲线出现615.2946到1116.7572的吸收峰代表不同的苯环结构，这些苯环结构为梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL降解或代谢产物。红外光谱检测证明梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL以聚丙烯酰胺为碳源和氮源，聚丙烯酰胺侧链降解、部分官能团发生改变，导致聚丙烯酰胺断链。
序列表<110>哈尔滨工业大学<120>一种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌及其应用<160>2<210>1<211>1695<212>DNA<213>梭状芽胞杆菌属(Clostridium)<220>
<223>梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL 16S rDNA<400>1TGCTTAACAC ATGCAAGTCG AGCGGGCAAT TTATCTAGCA CTGATTACTT CAAATGGAAA 60TCATAAGTGT AATCATGAAT TTCTACCTTA TAATAAAGAA AAAAGAAATT CATGTACGCA 120AATAGTGATA ACACATTTTA GTGAAGTGAT GAGTGCTGGA TAAATTGCTA GCGGCGGACG 180GGTGCGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCCCTA TCACTGGGAT AACACACTGA AAAGTGTGCT 240AATACCAGAT AATATAAGCT TTTGGCATCA TTAGCTTATC AAAGAATTTC GGATAGGGAT 300GGGCCCGCGT CTGATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC ACCAAGGCAA CGATCAGTAG 360CCGACCTGAG AGGGTGATCG GCCACACTGG AACTGAGACA CGGTCCAGAC TCCTACGGGA 420GGCAGCAGTG GGGAATATTG CACAATGGGC GAAAGCCTGA TGCAGCAACG CCGCGTGAGC 480GATGAAGGCC TTCGGGTCGT AAAGCTCTGT CCTATGGGAA AGATAATGGA CGGTACCCAT 540TAGGGAATTA ANATACCCCT GGTAGTTCCA CCGNNTGTAA ANCGATGGAG TAATTAGGNT 600GTCGGCTNTC AAAGGTCGGT GCCGNCGTTN ACACATTAAG TACTCCNGCG TGGGGGAGTA 660CGCTGCAAGA GTGAAAGTCA AAAGGGATTG ACGGGGACCC GCACAAGTAG CGGAGCATGT 720GGTTTAATTG GAAGCAACGC GAAGAACCTT ACGTAGGCTT TGACATCCCT TTGCAAAAGC 780CCTTAACCGG GCTCCTCTTG TTCGCAAGAC AAAGGTGACA GGTGGTGCAT GGTTGTCGTC 840AGCTCGTGTC GTGAGATGTT GGGTTAAGTC CCGCAACGAG CGCAACCCCT ATTTTTAGTT 900GCCATCAGTT AGGCTGGGCA CTCTAGAAAG ACTGCCGAGG ACAACTCGGA GGAAGGTGGG 960GATGACGTCA AATCATCATG CCCCTTATGC TTAGGGCTAC ACACGTGCTA CAATGGCTGT 1020TACAAAGGGC TGCGAGACCG CGAGGTGGAG CCAATCCCAT AAAAACAGTC TAAGTTCGGA 1080TTGCAGGCTG AAACTCGCCT ACATGAAGCC GGAGTTACTA GTAATCGCAG ATCAGAATGC 1140TGCGGTGAAT GCGTTCCCGG GTCTTGTACA CACCGCCCGT CACACCATGG AAGTTGGGGG 1200CACCCAAAGT TAGTTATCCA ACCTTACGGA GGAGGCTACC TAAGGTGAAT TCAATGACTG 1260GGGTGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTATCG GAGGGTGCGG CTGGATCACC TCCTTTCTAG 1320GGAGAAATTG GTTTACTATC CAGTCTTGAG AGTTCATCTC TCATAGATGT GGGGGCATAG 1380CTCAGTTGGG AGAGCACCTG CCTTGCAAGC AGGGGGTCAG GAGTTCGACT CTCCTTGTCT 1440CCACCATTTG CACAATACTA TTGTGCTTTG CACATTGAAA ACTGCATATC ATAAACAATC 1500CTAATAAGGT CAGCGAGAGC TGATTTTAAG TAATAAAAGG TTACATTTTC TCTTAGAAAA 1560TGAAAAGGTC AAGTTAGAAA GAGCGTAGGG TGAATGCCTT GGCGCTGGGA GCCGATGAAG 1620GACGTGGTAA GCTGCGATAA GCTTTGGGGA GGTGCAAGCA ACCTTTGATC CAGAGATTTC 1680CGTATGGGGA AACCC 1695
<210>2<211>436<212>DNA<213>梭状芽胞杆菌属(Clostridium)<220>
<223>梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL 16S～23S rDNA间隔区部分基因序列<400>2GGGGTGAAGT CGTAACAAGG TAGCCGTATC GGAGGGTGCG GCTGGATCAC CTCCTTTCTA 60GGGAGAAATT GGTTTACTAT CCAGTCTTGA GAGTTCATCT CTCATAGATG TGGGGGCATA 120GCTCAGTTGG GAGAGCACCT GCCTTGCAAG CAGGGGGTCA GGAGTTCGAC TCTCCTTGTC 180TCCACCATTT GCACAATACT ATTGTGCTTT GCACATTGAA AACTGCATAT CATAAACAAT 240CCTAATAAGG TCAGCGAGAG CTGATTTTAA GTAATAAAAG GTTACATTTT CTCTTAGAAA 300ATGAAAAGGT CAAGTTAGAA AGAGCGTAGG GTGAATGCCT TGGCGCTGGG AGCCGATGAA 360GGACGTGGTA AGCTGCGATA AGCTTTGGGG AGGTGCAAGC AACCTTTGAT CCAGAGATTT 420CCGTATGGGG AAACCC 43权利要求
1.一种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌，其特征在于梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL(Clostridium Daqing WL)经鉴定属于梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年1月10日，保藏号为CGMCC No.1911；大庆梭菌-WL为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，在pH 5.0～11.0、10～65℃的条件下生长，菌株长短多变，宽为0.4μm～0.8μm，长为1.4μm～4μm，无鞭毛；大庆梭菌-WL在固体培养基上生长为黑色圆形菌落，表面光滑，边缘整齐；大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源。
2.如权利要求1所述梭状芽胞杆菌属大庆梭菌的应用，其特征在于梭状芽胞杆菌属大庆梭菌-WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，可用于生物降解聚丙烯酰胺。
全文摘要
一种梭状芽胞杆菌属大庆梭菌及其应用，它涉及一种微生物及其应用。它解决了目前难于去除或降解油田污水中的聚丙烯酰胺的问题。梭状芽胞杆菌属大庆梭菌－WL保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2007年1月10日，保藏号为CGMCC No.1911；大庆梭菌－WL为革兰氏阳性杆菌，内生芽孢，兼性厌氧，在pH 5.0～11.0、10～65℃的条件下生长，菌株长短多变，宽为0.4μm～0.8μm，长为1.4μm～4μm，无鞭毛。本发明梭状芽胞杆菌属大庆梭菌－WL属于一种新菌种。梭状芽胞杆菌属大庆梭菌－WL能以聚丙烯酰胺为唯一碳源，可用于生物降解聚丙烯酰胺。将10mL菌液浓度为6×10
文档编号C12R1/145GK101054567SQ20071007200
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月6日 优先权日2007年4月6日
发明者魏利, 马放 申请人:哈尔滨工业大学