乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法

专利名称：：乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶与胞外多糖的提取方法
技术领域：
：本发明涉及乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶(BileSaltHydrolase3SH)和胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)的提取方法，适用于功能性乳制品中BSH、EPS作为功能因子及EPS作为天然稳定剂，开发生产新型的功能食品。技术背景益生菌(Probiotics)是指一类通过肠道定殖作用改善宿主特定部位微生态平衡并兼有若干其他有益生理功能的微生物。它们通过改善肠道微生物生态平衡，控制肠道感染，降低血清胆固醇水平，提高乳糖不耐症人对乳糖的利用，并能刺激特异性或非特异性免疫反应，具有免疫增强的作用。益生菌制品的活菌应该代谢稳定，活性较强，通过消化道后大量存活，进入肠道后发挥益生菌作用。目前用于生产益生菌剂的优良菌种有双歧杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属中的乳酸乳球菌乳酸亚种等。早在1963年人们就证实摄取含有某种乳杆菌或者双歧杆菌发酵的酸奶具有降低血清胆固醇的含量。迄今，国内外研究者对于乳酸菌降低胆固醇的作用机理尚存在不同观点，主要集中于以下三点(l)乳酸菌菌体细胞直接吸收同化胆固醇；(2)乳酸菌的胆盐水解酶活性使结合态胆盐降解为游离态胆盐，后者溶解度下降与胆固醇发生共同沉淀作用；(3)其他理论，如吸收同化与共沉淀联合作用。胆盐水解酶(BSH)是乳酸菌产生的代谢产物。该酶能在人体肝肠循环中将结合态胆盐降解产生氨基酸与溶解度较低的游离态胆盐。后者能与胆固醇结合形成沉淀复合物而排出体外，从而降低血清总胆固醇的含量。有文献报道乳酸菌在亚优化生长条件下，出于对自身的保护作用，可分泌胞外多糖(EPS)。Whitfield等研究表明胞外多糖的形成有利于微生物抵抗不良环境因素，如干燥、渗透压条件、抗生素或毒物作用、巨噬细胞或噬菌体的侵袭等。自1982年日本学者Shiomi等人报道乳酸菌EPS具有抗肿瘤作用以来，引起了许多学者的注意。从报道的研究结果看，乳酸菌EPS主要有以下几个方面的功能改善发酵乳制品组织状态，控制酸奶的脱水收縮，防止乳清析出；改善菌株对肠道黏膜的非特异性粘附，增强菌株对肠道的定殖作用；抗肿瘤作用；调节免疫系统作用；对细胞体具有保护作用；抑制肠道腐败菌的繁殖，防治结肠癌的作用。目前认为乳酸菌EPS抗肿瘤作用的机理有以下几个方面(l)影响血液供应，鉴于细菌素能引起肿瘤细胞组织缺血性坏死，曾经设想多糖的抗肿瘤作用可能影响肿瘤的血液供应；(2)刺激某种器官或组织，分泌一种物质攻击肿瘤细胞；(3)细胞膜接触抑制作用。肿瘤细胞表面具有很强的负电荷，而有些多糖可以结合这些电荷，使细胞表面被"中和"从而有利于细胞接受信号终止分裂。国内关于干酪乳杆菌的研究主要是其降血脂、抗高血压、治疗过敏性疾病等保健功效上，如上海光明乳业股份有限公司申请的"干酪乳杆菌Bd—II菌株及其在降低血脂方面的应用"，专利申请号为CN03128995.9;干酪乳杆菌LC2W菌株及其在抗高血压方面的应用专利申请号为CN03129450.2两项专利；景岳生物科技股份有限公司申请的新的微生物株类干酪乳杆菌GM-080及其治疗过敏相关疾病的用途，专利申请号为CN200410038566,X。虽然国外关于干酪乳杆菌降低血清胆固醇功效的研究也有一项专利报道丄acto6a"7/wscase/6cW7stainandusedtoreducebloodcholesterol(20060127380)，但是，目前国外几乎无关于乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌等菌株产胆盐水解酶和胞外多糖的专利报道。国内虽然有"一种干酪乳杆菌胆盐水解酶及其生产方法与专用生产菌株(200610112696.2)"、"一种双歧杆菌胞外多糖及其生产方法与专用生产菌株(200510105465.4)"、"干酪乳杆菌胞外多糖及其粗品、制备方法和应用(200510028970.3)"三项专利报道，而国内尚无乳酸乳球菌乳酸亚种、嗜热链球菌中胆盐水解酶和胞外多糖的提取方法的相关文章报道和专利报道。
发明内容本发明的第一个目的是提供两种具有高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌。本发明所提供的乳酸菌是乳酸乳球菌乳酸亚种subsp./ac&)KS4，嗜热链球菌(5^eptococcws^zewop/zz7ws)Tx，已于2006年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏号分别为CGMCCJ^1807(菌株KS4)，CGMCCJMM810(菌株Tx)。乳酸乳球菌乳酸亚种(丄actococcws/acfesubsp./ac&)KS4，嗜热链球菌(5^ptococcwAmwo;M^)Tx，分离筛选自吉林、呼和浩特市普通家庭的藏灵范(又称开菲尔粒)。在含有碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基上，乳酸乳球菌乳酸亚种(丄actococcws/acfesubsp./ac他)KS4禾口嗜热链球菌(浙eptococci^Aermop/z//—Tx菌株的菌落大小为12mm，表面光滑，边缘整齐，呈圆形，无光泽，凸起，灰白色，半透明，菌落周围有溶解CaC03的透明圈，菌落有较高黏性。个体形态呈球形或卵圆形，一般成对或链状排列，G+兼性厌氧菌。上述方法得到的用于生产胆盐水解酶和胞外多糖的两种具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌属于本发明保护范围。本发明的第二个目的是提供两种乳酸菌胆盐水解酶及其提取方法。本发明所提供乳酸菌胆盐水解酶的提取方法是由乳酸乳球菌乳酸亚种(丄actococcws/"ctosubsp./acto)KS4，嗜热链球菌(浙e/tococcws^zez-wo/M—Tx得到的胆盐水解酶。(1)乳酸菌发酵液以10000r/min，4'C离心10min，收集沉淀菌泥；(2)用生理盐水离心洗涤菌体沉淀2次(条件同上)；(3)加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎10min(功率400450w，工作5s，间歇3s);(4)以10000r/min，4*€离心10min除去细胞碎片，收集含酶上清液。(5)上清液用70%75%饱和浓度的硫酸铵于4X:盐析24h，以10000r/min，4'C离心1520min，收集沉淀的蛋白物质；(6)用0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蛋白物质，再以预处理的透析袋于4t:透析至透析液经BaCl2检验无沉淀为止，透析液即为胆盐水解酶提取液。(7)将50mL或100mL的胆盐水解酶提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25r条件下预冻至冻结状态(1624h)，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.220.24mBar真空度、冷阱温度为-55。C条件下升华干燥3672h，其干燥物即为乳酸菌胆盐水解酶粗品。上述方法得到乳酸菌胆盐水解酶及其专用生产菌株也属本发明保护范围。本发明的第三个目的是提供两种乳酸菌胞外多糖的提取方法。本发明所提供胞外多糖的提取方法是由嗜热链球菌CS^印tococa^Aermqp/n7w力Tx，乳酸乳球菌乳酸亚种(丄ac/ococcws/ac他subsp./acfe)KS4得到的胞外多糖。(1)乳酸菌发酵液以8000r/min，4'C离心10min，收集上清液；(2)上清液加入1/5体积pH5.0的10%三氯乙酸于4。C振荡处理30min;(3)处理液以10000r/min，4。C离心1015min，收集上清液；(4)上清液加入3倍体积的95%冷乙醇于4-C处理1112h，离心(条件同上)，收集沉淀的多糖物质；(5)多糖物质以蒸馏水溶解，脱脂棉过滤除去不溶物，再以预处理的透析袋于4"C透析过夜，透析液即为多糖提取液。(6)将50mL或100mL多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25"C条件下预冻至冻结状态，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.160.18mBar真空度、冷阱温度为-55'C条件下升华干燥3672h，其干燥物即为乳酸菌胞外多糖粗品。干燥后的胞外多糖呈白色(或略带浅黄)结晶状态。上述方法得到乳酸菌胞外多糖及其专用生产菌株与优化提取方法也属于本发明保护范围。乳酸乳球菌乳酸亚种C^"ococcws/ac/z'ssubsp./acfe)KS4，嗜热链球菌CS^eptococcwAew7o//2z7^)Tx分离筛选于东北普通家庭的藏灵燕(又称开菲尔粒)，具有可靠的安全性。其产生的胆盐水解酶水解结合态胆盐的产物为游离态胆盐和氨基酸，对人体无害。本发明用此两种乳酸菌株提取的胆盐水解酶和胞外多糖，其原料来源方便，提取工艺简单，发酵周期短，操作简单，成本较低，对设备要求低，适于工业化生产。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积百分含量。实施例1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸乳球菌乳酸亚种(丄actococcws/ac"ssubsp./ac^s)KS4，嗜《冉链球菌(5^eptococciw//zerwop/n./iw)Tx的筛选与鉴定1、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶菌株的筛选取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成10'410'6的稀释菌液。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37'C培养24h，挑取有溶解圈的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37。C培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37。C增菌培养23代，再以1%2%接种量转接入含胆固醇的1号培养基，37'C培养20h后，以邻苯二甲醛比色法测定I号培养基中发酵前后胆固醇的含量，并计算胆固醇降低率(%)。根据胆固醇降低率确定高效降胆固醇的菌株。具体测定方法取0.4mL培养前后的发酵液于比色管中，加入0.2mL邻苯二甲醛(lmg/mL)和4mL混合酸(冰醋酸、浓硫酸等量混合)，充分混合后室温静置10min，以不含胆固醇的I号培养基为空白调O,于550nm测定吸光值(A)，在胆固醇-吸光值标准曲线上查得发酵前后胆固醇的含量(结果见表1)。表l不同乳酸菌株降低胆固醇的初筛试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>_研究表明，采用高通量筛选技术和邻苯二甲醛法获得高效降低胆固醇的乳酸菌是KS4和Tx菌株。其中，KS4菌株降低胆固醇能力最强。它们在有关文献报道中属于降低胆固醇能力较强菌株。将初筛后获得的具有高效降胆固醇的菌株，在含0.1%胆固醇和0.3%牛黄胆酸钠的MRS培养基平板上(分别以含0.1%胆固醇的MRS培养基、0.3%牛黄胆酸钠的MRS培养基作为对照)，对称放置牛津杯，加入O.lmLMRS培养菌液，于37'C厌氧培养34d后，观察牛津杯周围是否有银色沉淀现象，其结果见表2。阳性者以茚三酮法检测银色沉淀物中是否有胆盐的水解产物——氨基酸存在，根据蓝紫色反应初步确定菌株是否产生胆盐水解酶。将茚三酮反应阳性菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。由表1和表2结果显示，沉淀圈的大小与胆盐水解酶的活力和降低胆固醇的百分率成正比。复筛试验总体比较，菌株KS4和Tx能够高产胆盐水解酶，其中菌株KS4产酶能力最强。高效降低胆固醇的乳酸菌株源于其产生多量或高活力的胆盐水解酶。故可利用KS4菌株大量提取胆盐水解酶，并利用这些高产胆盐水解酶的乳酸菌株进一步开发研制高效降胆固醇的功能性酸奶。表2产胆盐水解酶乳酸菌株复筛试验结果^^菌株代号试验项目KS4Tx含胆固醇和牛黄胆酸钠的MRS培养基沉淀现象含胆固醇的MRS培养基沉淀现象含牛黄胆酸钠MRS培养基沉淀现象茚三酮反应检测胆盐的水解产物++++++++注"+"表示牛津杯周围有不同程度的银色沉淀现象；表示无沉淀现象。2、高产胞外多糖菌株的筛选取藏灵菇滤液5mL注入带玻璃珠的45mL无菌生理盐水中，充分振荡30min，制成菌悬液，而后10倍梯度稀释成1(T410,6。以稀释倾注法接种平板，倒入含碳酸钙和纳他霉素的MRS选择性培养基，37'C培养24h，挑取有溶解圈、黏性较高的单菌落划线接种于MRS斜面培养基中，于37。C培养24h。革兰氏染色，视其个体形态和纯度。转接种于MRS液体培养基中，37'C增菌培养23代，再以P/。2^接种量转接入MRS液体培养基中，37"C培养12h后，以苯酚-硫酸比色法测定培养液中EPS的含量。将测得样品吸光度y值代入标准曲线公式尸0.8649x(r2-0.9991)即得到EPS浓度x值(100mg/L)，其结果见表3。根据MRS培养基中的EPS含量，确定产胞外多糖的菌株。将产胞外多糖的菌株划线接种于MRS斜面试管，培养后保存备用。表3分离菌株产胞外多牵害测试结果菌株代号多糖A柳nm多糖含量(mg/L)KS41.303150.65Tx1.192137.82研究表明，采用高通量筛选技术和苯酚-硫酸法获得较高合成EPS的乳酸菌是KS4和Tx菌株。其中KS4菌株EPS的产量最高。它们在有关文献报道中均属于产EPS能力较强的菌株。3、筛选菌株发酵性能鉴定将筛选的KS4和Tx菌株培养物转接入灭菌脱脂乳中连续传代活化23代，37'C培养过夜至牛乳凝固。再以1%接种量转接入盛脱脂乳的三角瓶中，于37'C培养过夜至牛乳凝固后，再冷藏后熟过夜，测定发酵剂的活力(包括凝乳时间、酸度、黏度、还原韧天青时间，乳酸菌活菌数量)。分别于37X:、40°C、43。C养过夜至牛乳凝固后，进行感官综合评定，其结果见表4。表4筛选乳酸菌株的发酵性能测试结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>研究表明，菌株KS4和Tx均具有良好的发酵性能。其中由Tx菌株制备发酵剂的黏度最高，凝乳时间最短，感官综合评分最高，其次是KS4菌株。故可利用Tx菌株大量提取EPS，并利用这些产EPS的乳酸菌株进一步开发研制具有抗癌作用的功能性酸奶。根据发酵剂的活力和感官综合评定分数高低，确定发酵性能优良的菌株。将筛选产胆盐水解酶、胞外多糖和发酵性能优良的MRS斜面菌株，接种于各种理化鉴定培养基中，37'C培养进行鉴定。4、高效降胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖菌株的鉴定常规生理生化试验鉴定糖醇类发酵试验，耐盐试验(7.5。/。NaCl)，不同温度试验(1(TC、40°C)。Biolog全自动微生物鉴定仪鉴定挑取MRS平板上的目的单菌落划线接种于BUA+B平板上(含5%无菌脱纤维绵羊血)，37。C培养得到单菌落后，以Biolog的专用接种液调整菌悬液的浊度至65士2。/。T，接种于AN微量鉴定板中，3537'C厌氧培养2448h后，于鉴定仪上读取鉴定结果。鉴定结果如表5所示。鉴定菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种a"ctococcwsubsp./ac&)，菌株Tx为嗜热链球菌(/Sr邵tococcws^2e，opMw)。表5菌株KS4、Tx的鉴定项目与结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>"%以上的菌株为阳性；"_"95%以上的菌株为阴性。实施例2、利用乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、嗜热链球菌Tx提取胆盐水解酶1、高产胆盐水解酶的发酵工艺条件用于培养乳酸乳球菌乳酸亚种KS4、嗜热链球菌Tx高产胆盐水解酶的培养基成分(w/v):葡萄糖2%，大豆蛋白胨2%，MnS040.025%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，吐温800.1%，磷酸氢二钾0.2%，乙酸钠0.5%，柠檬酸二铵0.2%，硫酸镁0.058%,蒸馏水1000mL，0.07MPa灭菌20min。高产胆盐水解酶的发酵工艺条件发酵温度37°C，发酵时间12h，培养基的初始pH值6.0，接种量2%。在此发酵条件下，乳酸乳球菌乳酸亚种KS4的酶活力是优化前的11.84倍。2、发酵液中胆盐水解酶的提取方法与酶活力测定(1)胆盐水解酶的提取方法胆盐水解酶的分离纯化目的是将该目的胞内酶提取出来，经过纯化使之达到要求的纯度。提取的关键技术是选择破碎细胞的有效方法。将在上述发酵条件下得到的乳酸菌发酵液以10000r/min，4。C离心10min，弃上清液，菌体用无菌生理盐水离心洗涤2次(条件同上)，弃上清液，加入O.lmol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎10min(功率400450w，工作5s，间歇3s)，以10000r/min，4°C离心10min，除去细胞碎片，收集含胆盐水解酶的上清液；上清液用70%75%饱和浓度的硫酸铵于4'C盐析24h，以10000r/min，4匸离心1520min，收集,J雜糖糖醇糖糖苷糖苷糖糖糖糖Wccf摘籽藻梨三叶萄杨二二5。o。oJ^棉海山蔗松七葡水松果蜜乳，S恥沉淀的蛋白物质；以O.lmol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蛋白物质(加缓冲液的量为初始发酵液体积的一半)，用预处理的透析袋于4'C透析至透析液经BaCl2检验无沉淀为止，即透析完全(期间每隔12h换一次无菌磷酸盐缓冲液)，透析液即为胆盐水解酶提取液。上述采用适宜的超声波破碎细胞的提取方法，解决了胞内胆盐水解酶较难提取的问题。(2)酶活力测定取O.lmL胆盐水解酶提取液，加入1.8mL0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)和0.1mL的结合胆盐(6mmol/L牛黄胆酸钠)，于旋涡混合器上振荡混匀lmin，将混合液于37。C振荡酶解40min。酶反应完毕，立即加入80%三氯乙酸(加量与酶液等体积)，混匀，中止酶反应lmin后离心(条件同上)，上清液即为酶反应液。胆盐水解酶活力的测定是通过结合胆盐降解后释放的氨基酸量的多少来衡量。即该酶活力与氨基酸的生成量成正比。可采用茚三酮显色法测定氨基酸的含量。取2mL酶反应液，加入茚三酮显色剂lmL，混匀后于沸水浴中加热16min，自来水冷却，加入5mL稀释液，摇匀，同上操作以2mL蒸馏水替代酶反应液作为空白对照调0，于570nm测吸光值A(生成的颜色在60min内稳定，最好在30min之内完成)。胆盐水解酶于每分钟生成l^mol的氨基酸定义为一个酶活力单位。(3)胆盐水解酶的真空冷冻干燥将50mL或100mL的胆盐水解酶提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25"C条件下预冻至冻结状态(1624h)，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.220.24mBar真空度、冷阱温度为-55°(:条件下升华干燥367211，其干燥物即为乳酸菌胆盐水解酶粗品。实施例3、利用嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4提取胞外多糖1、高产胞外多糖的发酵工艺条件用于培养嗜热链球菌Tx、乳酸乳球菌乳酸亚种KS4高产胞外多糖的培养基成分(w/v):蔗糖6%，胰蛋白胨3%，硫酸锰0.025%,牛肉膏1.0%，酵母粉0.50%，吐温800.10%，磷酸氢二钾0.20%，乙酸钠0.50%，拧檬酸二铵0.20%，硫酸镁0.058%，蒸馏水1000mL，0.07MPa灭菌20min。高产胞外多糖的发酵条件发酵温度32。C,发酵时间16h，培养基的初始pH值6.5，接种量3%。在此发酵条件下，嗜热链球菌Tx胞外多糖的产量是优化前的2.6倍。2、发酵液中胞外多糖的提取方法与浓度测定(1)胞外多糖的提取方法乳酸菌发酵液以8000r/min，4'C离心10min，收集上清液，加入1/5体积pH5.0的10%三氯乙酸于4'C振荡处理30min(优化提取条件)，再以10000r/min，4。C离心1015min,收集上清液，加入3倍体积的95。/。冷乙醇于4'C处理1112h，离心(条件同上)，收集沉淀的多糖物质。多糖物质以无菌蒸馏水溶解(加蒸馏水的量为初始发酵液体积的一半)，无菌脱脂棉过滤除去不溶物，再以预处理的透析袋(先用50%乙醇煮沸10min，而后用含2%碳酸氢钠的1mmol/LEDTA溶液煮沸10min，再以蒸馏水煮沸3次，每次换水煮沸lmin)于4'C透析过夜(期间换无菌蒸馏水34次)，透析液即为多糖提取液。同时以pH0.5的10%三氯乙酸处理为普通提取条件作对照。(2)胞外多糖浓度测定取少量多糖提取液用苯酚-硫酸比色法测定其在490nm处的吸光值，根据标准曲线计算EPS浓度。若EPS的浓度较高，可适当稀释2倍。在计算优化提取条件下EPS浓度时，在标准曲线上查得结果乘以2。准确称取标准葡萄糖100mg于500mL容量瓶中，加水至刻度。各种试剂按表6所示的量在比色管中均匀混合操作，室温放置20min后于4卯nm测定EPS吸光值(以2.0ml蒸馏水按同样显色操作为空白调0)。以葡萄糖含量(100mg/L)为横坐标，吸光度(A49()皿)为纵坐标绘制标准曲线。将测得样品吸光度y值代入标准曲线公式y-0.380x(R、0.9555)即得到EPS浓度x值(100mg/L)。其优化提取条件与普通提取条件EPS产量对比试验结果见表7。表6苯酚-硫酸法测多糖标准曲线参数表200mg/L葡萄糖溶液(mL)蒸馏水(mL)6n/。苯酚(mL)浓硫酸(mL)A490腦1.50.52.010.02.0391.42.62.010.01，1.32.72.010.01.8511.22.82.010.01.7311.12.92.010.01.6551.03.02.010.01.7070.93.12.010.01.5470.83.22.010,01.3470.73.32.010.01.2610.63.42.010.01.0390.53.52.010.00.9190.43.62.010.00.7160.33.72.010.00.5370.23.82.010.00.3750.13.92.010.00.166(3)胞外多糖的真空冷冻干燥将50mL或lOOmL多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，胶塞密封，在-25"C条件下预冻至冻结状态(24h)。冷冻干燥机使用前检查内部有无积水并检查封闭性，确定有无积水和漏气点并关闭通气阀后开启。待LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)内部温度降低到-4(TC以下时真空泵开始工作，其内部真空度降低到0.200mBar以下时开始上样。上样时应迅速将冻干瓶从低温冰柜中取出，将胶塞与冻干机接口套紧以确保封闭性，打开通气阀。当整个封闭系统真空度降至0.180mBar时冻干开始。于真空度为0.160.18mBar、冷阱温度为-55匸条件下升华干燥。50ml初始液需要冻干36h，100ml初始液需要冻干72h。当冻干瓶的内部水分完全升华后关闭通气阀，将冻干瓶取下并缓慢释放冻干机内负压，待其恢复常压后，先关闭真空泵，再关闭冷冻干燥机。将冻干瓶内干燥物质移入灭菌三角瓶中，称重。干燥后的胞外多糖粗品呈白色(或略带浅黄)结晶状态。表7优化提取条件与普通提取条件对比试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>研究表明，优化提取条件比普通提取条件的多糖浓度提高5.2倍。以1600mL发酵液经冷冻干燥后得到1.76g粗多糖为例，其胞外多糖提取率为91.3%。说明采用优化的提取条件，可明显提高胞外多糖的提取率。本专利所属项目北京市自然科学基金"藏灵菇益生菌产生物活性物质及生理功能的研究"项目编号5062006项目起止时间2006.01-2008.12项目负责人刘慧权利要求1、乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶和胞外多糖的提取方法，其技术特征在于从藏灵菇中筛选获得两种高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌，且它们均具有高效降低胆固醇和良好的发酵性能。利用两种乳酸菌提取胆盐水解酶，并采用适宜的超声波破碎细胞的提取方法，解决了胞内胆盐水解酶较难提取的问题。同时采用优化的胞外多糖提取条件，提高了多糖的提取率。2、根据权利要求l所述的用于生产胆盐水解酶和胞外多糖的两种具有高效降低胆固醇及高产胆盐水解酶和胞外多糖的乳酸菌属于本发明保护范围。这两种乳酸菌的分类命名是菌株KS4为乳酸乳球菌乳酸亚种(Z^tococa^/化fesubsp./oc^s)(CGMCCJV21807)，菌株Tx为嗜热链球菌CS^ptococ/feywo/^/ws)(CGMCCJV21810)。3、根据权利要求1所述的利用两种乳酸菌提取的胆盐水解酶及其专用生产菌株与超声波破碎细胞的提取方法也属于本发明保护的范围。胆盐水解酶提取方法乳酸菌发酵液以10000r/min，4'C离心10min，收集沉淀菌泥；用生理盐水离心洗涤菌体沉淀2次(条件同上)；加入0.1mol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)至发酵液原体积，细胞悬浮液于冰浴中进行超声波破碎10min(功率400450w，工作5s，间歇3s);以10000r/min,4。C离心10min，除去细胞碎片，收集含胆盐水解酶的上清液；上清液用70%75%饱和浓度的硫酸铵于4"盐析2411，以10000r/min，4"C离心1520min，收集沉淀的蛋白物质；以O.lmol/L的磷酸盐缓冲液(pH6.5)溶解蛋白物质，用预处理的透析袋于4'C透析至透析液经BaCl2检验无沉淀为止，透析液即为胆盐水解酶提取液。将50mL或100mL的胆盐水解酶提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25。C条件下预冻至冻结状态(1624h)，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.220.24mBar真空度、冷阱温度为-55'C条件下升华干燥3672h，其干燥物即为乳酸菌胆盐水解酶粗制品。4、根据权利要求1所述的利用两种乳酸菌提取的胞外多糖及其专用生产菌株与优化提取方法也属于本发明保护的范围。胞外多糖提取方法乳酸菌发酵液以8000r/min，4'C离心10min，收集上清液；加入1/5体积pH5.0的10%三氯乙酸于4。C振荡处理30min;以10000r/min，4。C离心1015min，收集上清液；加入3倍体积的95。/。冷乙醇于4。C处理ll12h，离心(条件同上)，收集沉淀的多糖物质；以蒸馏水溶解多糖物质，脱脂棉过滤除去不溶物，再以预处理的透析袋于4'C透析过夜，透析液即为胞外多糖提取液。将50mL或100mL胞外多糖提取液注入500mL无菌冻干瓶内，在-25'C条件下预冻至冻结状态，在LABCONCO冷冻真空干燥机(美国产)上于0.160.18mBar真空度、冷阱温度为-55T:条件下升华干燥3672h，其干燥物即为乳酸菌胞外多糖粗制品。干燥后的胞外多糖呈白色(或略带浅黄)结晶状态。全文摘要本发明名称为乳酸乳球菌和嗜热链球菌中胆盐水解酶(BSH)和胞外多糖(EPS)的提取方法，适用于功能性乳制品中BSH、EPS作为功能因子及EPS作为天然稳定剂，开发生产新型的功能食品。本发明利用高产BSH和EPS的乳酸乳球菌乳酸亚种KS4(CGMCC№1807)、嗜热链球菌Tx(CGMCC№1810)，通过优化发酵条件和提取方法得到乳酸菌胆盐水解酶和胞外多糖粗品。采用适宜的超声波细胞破碎提取方法，解决了胞内胆盐水解酶较难提取的问题；通过优化EPS的提取条件，提高了EPS的提取率。本发明制得BSH和EPS的发酵工艺与提取方法简单，发酵周期较短，对设备要求低，成本较低，适于工业化生产。文档编号C12N9/00GK101333519SQ200710123108公开日2008年12月31日申请日期2007年6月28日优先权日2007年6月28日发明者慧刘,张红星,艾启俊,董瑞婷,钟德寿申请人:北京农学院