专利名称：光反应器规模培养和促进转TNF-α基因蓝藻生长和基因表达的工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种封闭式光反应器进行规模培养和促进转TNF-a蓝藻生长和基因表达的生产工艺。
背景技术：
人肿瘤坏死因子a (human tumor necrosis factor-a ， hTNF-a )是由激活的单核巨噬细 胞产生的一种非糖基化蛋白，对肿瘤组织和肿瘤细胞有特异的杀伤作用，有望开发成为有前景 的抗肿瘤药。但由于其在临床上的严重的毒副作用，限制了它的使用。对此，我们拟用蓝藻 基因工程制备口服药来缓解毒副作用。蓝藻又称蓝细菌(cyanobacteria)，是一群种类繁多，分布广泛，能进行放氧光合作用 的原核生物。近年来蓝藻分子生物学的发展使蓝藻成为继太肠杆菌和酵母之后的新一代转外 源基因的表达宿主,受到广泛的重视。自20世纪90年代以来，已有多个药物蛋白的基因在蓝 藻中得到表达。1999年本研究集体把hTNF-a基因转入鱼腥藻7120并表达成功，经过多年的研究，其表达效率得到了很大的提高。并探索出了一套成熟的小规模培养转基因藻的方法，现在正在进行 用光生物反应器大规模培养藻的探索。光生物反应器的研究起始于本世纪50年代,至80年代初才得到较广泛的研究。目前，许多学者开始致力于微藻培养用光生物反应器的研究，并己应 用于生物工程和化工等领域，我们和上海联环生物技术公司合作，试制了100升的光生物反应 器，并成功地培养了转基因鱼腥藻和其他蓝藻。用100L光生物反应器的培养转基因微藻在国 内未见有报导。
发明内容
本发明涉及目的是提供一种封闭式光反应器进行规模培养和促进转TNF-a鱼腥藻生长和 基因表达的生产方法。本发明的方法包括建立可调控的100升封闭式光生物反应器，釆用内置三根可透光的玻 璃管及可调控光照设施，温度可调控系统，无菌空气鼓气设施，高温灭菌系统，C02配气设 施，通过环境条件的改变促进转基因的生长和外源基因的表达。分离收获藻细胞及破碎等工序。本发明方法的具体内容如下一、 改造并优化培养微藻的光生物反应器该反应器包括采用内置三根可透光的玻璃管 及可调控光照设施，温度可调控系统，无菌空气鼓气设施，高温灭菌系统，C02配气设施。 在该反应器下进行培养基的调配和人工调控促进转TNF-a鱼腥藻生长和基因表达。反应器主 体为圆柱形状，直径35cm，高度110cm。实用罐体体积0. 0811m3。反应器设置有灭菌，温控， 光控，鼓气和调节pH设施。培养过程可由程序控制自动运行。二、 在主体反应器中的光照设施及外置可调控光照设施反应器内置可透光的导流筒一 个，导流筒内径23. 5cm导流筒高63cm(改进后高98cm)可透光的灯筒玻璃管三个灯管筒84cm 灯管筒内径6cm，透光材料均为抗压力的无色透明钢化玻璃，灯筒可放置灯管6根(最初的 试验为三根)，每根灯管为功率18W，可组合使用，其光照强度为240umo1 ra—23—1。实用光照 面积(S): 0.3617 m2 (改进后为0.7571 m2)单位体积的光照面积(s/ v)为4.4589 nT (改 进后为9.335 m—')反应器操纵面板上设有三个光源开关，可控制反应器内灯管光照强度。三、 设置有进排气口的无菌空气设施及C02气体系统反应器通气采用工业上使用的空气 压縮机，并经常规的滤水、滤菌处理成为无菌空气；C02采用工业钢瓶，用玻尔呼吸器过滤 除菌，用流量计控制在5%通入反应器。反应器采用气升式气体分布器，分为两部分进行通气第一部分，气体从顶端通入，气体分步器直径15CM圆形中空钢管，其上均匀分布孔径2CM的 气孔。第二部分气体从顶端进气口用抗高压可灭菌软管连到底端取样口，由取样口进行由下 向上通气。通气流量为10L/min。四、 设置有温度调控系统温控系统由冷水循环装置，热水循环装置，回流管道，循环 水泵，以及测温控温系统组成。转TNF-a 7120生长适宜条件为28-30°C。反应器温度控制在 28'C上下浮动。五、 灭菌系统投入培养前将光生物反应器彻底清洗消毒。反应器安装后采用工业上使 用的蒸汽发生器进行灭菌。反应器主体及通气管道在12rC下灭菌15-20分钟。然后加入BG-11 培养基，培养基在12rC下灭菌15-20分钟。如需加入葡萄糖，葡萄糖需单独灭菌后加入。 葡萄糖在115'C灭菌15分钟。然后添加到培养基中，使最后的葡萄糖浓度达到50mmol/L，然 后将培养基的PH值调到8.0。六、 转TNF-a7120接种用此气升式光生物反应器，将种子罐中提前培养的藻种接入反 应器，起始接种浓度为0D75。在0. l左右，培养环境维持在温度28'C，初始PH值为8.0，通气 速率为10L/min。七、 收获转基因藻及干燥收集收藻后采用自然沉降法，沉降12小时后，弃去上清，剩 余沉淀用离心机6000转/分，离心15分钟，离心温度4摄氏度，离心后获得沉淀。沉淀藻 采用冻融法破碎，-20。C冰箱冷冻一天然后在30。C水中解冻，反复三次。冻融后藻液经低温 冷冻干燥得到冻干粉。
图l:光反应器及配套设备照片图2:转基因鱼腥藻IB02及野生型鱼腥藻细胞在光自养条件下的光密度曲线 图3:转基因鱼腥藻IB02及其资生型鱼腥藻细胞在添加5%(:02下的光密度曲线图4:转基因鱼腥藻IB02及其野生型鱼腥藻细胞在50mmol/L葡萄糖下的光密度曲线图5:改善培养条件对转基因藻生长的影响具体实施步骤下面结合实施案例对本发明做进一步详细说明。 实施案例一建立封闭式100L光反应器培养蓝藻。主体反应器为圆柱形，高110cm，直径35cm，使用 体积70L。内置三个灯筒，每个灯筒内置6根灯管，每根灯管功率18w。光照面积0.3617r^单 位光照面积4.4589m—1。通气量为10L/min。培养条件为转基因型7120、野生型7120均为 BG-11培养基培养。BG-11培养基经12rC灭菌20分钟。初始pH值8. 0，培养温度25'C 。野 生型7120培养周期12天，转基因型培养周期15天。每两日取样测定OD75。。收藻时野生型 7120 OD柳为0.428;转基因型7120 OD说为0.524。见图2。经沉淀12小时后，弃去上清， 用冷冻离心机离心收藻，转速6000r/m，温度4°C， 15分钟。破碎后冷冻干燥处理称量，计 算得到野生型7120产率0. 26g/L;转基因型7120产率O. 319 g/L;经酶联免疫测得表达率为 0. 35%。实施案例二改进封闭式100L光反应器培养蓝藻。主体反应器为圆柱形，高110cm，直径35cm，使用 体积70L。内置三个灯筒，每个灯筒内置6根灯管，每根灯管功率18w。光照面积0.3617!!12单 位光照面积4.4589nf1。添加C02， 0)2添加量用流量计控制在5%。通气量为10L/min。转基因 型7120、野生型7120均为BG-ll培养基培养。BG-11培养基经121° C灭菌20分钟。初始pH值8.0,培养温度28'C。野生型7120培养周期12天，转基因型培养周期12天。每日取 样测定0D7s。。收藻时野生型7120 OD，为0.545;转基因型7120 OD彻为0, 563。见图3。沉淀 12小时后，弃去上清，用冷冻离心机离心收藻，转速6000r/m，温度4'C， 15分钟。破碎后 冷冻干燥处理称量，计算得到野生型7120产率0. 387g/L;转基因型7120产率0. 419 g/L; 经酶联免疫测得表达率为0. 4%。 实施案例三再改进封闭式100L光反应器培养蓝藻。主体反应器为圆柱形，高110cm，直径35cm，使 用体积70L。内置三个灯筒，每个灯筒内置6根灯管，每根灯管功率18w。光照面积0.7571m2 单位光照面积9. 335m—、转基因型7120、野生型7120均为BG-11培养基培养。BG-11培养基 经121° C灭菌20分钟。灭菌后在反应器中添加经115。C单独灭菌20分钟的葡萄糖溶液，使 反应器内葡萄糖浓度为50mmol/L。通气量为10L/min。初始pH值8.0，培养温度28。C。野生 型7120培养周期8天，转基因型培养周期8天。每日取样测定0D75。。收藻时野生型7120 0D75。 为0.549;转基因型7120 0D75。为0.604。见图4。经沉淀12小时后，弃去上清，用冷冻离心 机离心收藻，转速6000r/ra，温度4°C， 15分钟。破碎后冷冻干燥处理称量，计算得到野生 型7120产率0. 509g/L;转基因型7120产率0. 631 g/L;经酶联免疫测得表达率为0. 8%。实施案例四优化封闭式100L光反应器培养蓝藻。主体反应器为圆柱形，高110cm，直径35cm，使用 体积70L。内置三个灯筒，每个灯筒内置6根灯管，每根灯管功率18w。光照面积0.75711112单 位光照面积9. 335m—1。转基因型7120为BG-11培养基培养。BG-11培养基经121° C灭菌20 分钟。灭菌后在反应器中添加经115'C单独灭菌20分钟的葡萄糖溶液，使反应器内葡萄糖浓 度为50mmol/L。通气量为10L/min。初始pH值8. 0，培养温度28°C。此阶段培养周期8天。 第8天添加2L经12rC灭菌20分钟的新鲜BG-ll培养基，培养条件不变，此阶段培养周期 为7天，每日取样测定OD7s。。收藻时转基因型7120 0075。为1.15。见图5。经沉淀12小时后， 弃去上清，用冷冻离心机离心收藻，转速6000r/ra，温度4'C， 15分钟。破碎后冷冻干燥处 理称量，计算得到转基因型7120产率1. 019 g/L;'经酶联免疫测得表达率为0. 8%。
权利要求
1.一种100升封闭式光反应器进行规模培养和促进转TNF-α鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。该反应器包括采用内置可透光的玻璃管及可调控光照设施，温度可调控系统，无菌空气鼓气设施，高温灭菌系统，CO2配气设施。在该反应器下进行培养基的调配和人工调控促进转TNF-α蓝藻生长和基因表达。包括培养基配制，灭菌，温控，光控，离心收藻，干燥收藻等工序。
2 . —种如权利1所述的规模培养和促进转TNF-a鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。 其特征是该工艺具体内容如下(1) 在主体反应器中的光照设施及外置可调控光照设施反应器内置可透光的导流筒一 个，导流筒内径23. 5cm导流筒高63cm(改进后高98cm)可透光的灯筒玻璃管三个灯管筒84cm 灯管筒内径6cm，透光材料均为抗压力的无色透明钢化玻璃，灯筒可放置灯管6根，每根灯 管为功率18W，可组合使用，其光照强度为240pmo1 m—2s—、实用光照面积(S): 0.7571 m2 单位体积的光照面积(s/ v)为9.335 nf'，反应器操纵面板上设有三个光源开关，可控制反 应器内灯管光照强度。(2) 设置有进排气口的无菌空气设施及C02气体系统反应器通气采用工业上使用的空 气压縮机，并经常规的滤水、滤菌处理成为无菌空气；C02采用工业钢瓶，用玻尔呼吸器过 滤除菌，用流量计控制在5ttl入反应器。反应器采用气升式气体分布器，分为两部分进行通 气第一部分，气体从顶端通入，气体分步器直径15CM圆形中空钢管，其上均匀分布孔径 2CM的气孔。第二部分气体从顶端进气口用抗高压可灭菌软管连到底端取样口，由取样口进 行由下向上通气。(3) 设置有温度调控系统温控系统由冷水循环装置，热水循环装置，回流管道，循环 水泵，以及测温控温系统组成。(4) 灭菌系统投入培养前将光生物反应器彻底清洗消毒。反应器安装后采用工业上使 用的蒸汽发生器进行灭菌。蒸汽发生器工作功率为45万千瓦。(5) 收获转基因藻及干燥收集采用高速冷冻离心机进行收藻，离心机可调转速3000-13000r/min，可调温度-20。C一2(TC，可调离心时间lmin-60min。干燥使用真空冷冻干 燥机，使用前预热半小时，工作温度-55°C，工作真空度为20Pa。
3. —种如权利2所述的规模培养和促进转TNF- a鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。 其特征是反应器内置可透光的导流筒一个，导流筒内径23.5cm导流筒高63cm(改进后高98cm) 可透光的灯筒玻璃管三个灯管筒84cm，灯管筒内径6cm，透光材料均为抗压力的无色透明钢 化玻璃，灯筒可放置灯管6根，每根灯管为功率18W，可组合使用，其光照强度为240txmo1 ra—2s—'。实用光照面积(S): 0.7571 m2，单位体积的光照面积(s/v)为9.335 nf1。反应器操 纵面板上设有三个光源开关，可控制反应器内灯管光照强度。工业空压机进行通气。培养基 为BG-11培养基。空气通入量10L/min。添加葡萄糖浓度为50mmol/L。
4. 一种如权利2所述的规模培养和促进转TNF-ci鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。 其特征是投入培养前将光生物反应器彻底清洗消毒。反应器安装后采用工业上使用的蒸汽发 生器进行灭菌。反应器主体及通气管道在12rC下灭菌15-20分钟。然后加入BG-11培养基， 培养基在121'C下灭菌15-20分钟。培养基灭菌后加入经115'C单独灭菌15分钟的葡萄糖溶 液，使培养基总体糖浓度达到50mmol/L。
5. —种如权利2所述的规模培养和促进转TNF-a鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。 其特征是将种子罐中提前培养的藻种接入反应器，起始接种浓度为0D75。在0.1左右，培养环 境维持在温度28。C ，初始PH值为8. 0，通气速率为10L/min。培养至第8天时加入2L经121 。C灭菌20分钟的新鲜BG-11培养基。
6. —种如权利2所述的规模培养和促进转TNF-ci鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。 其特征是收藻后采用自然沉降法，沉降12小时后，弃去上清，剩余沉淀用离心机6000转/ 分，离心15分钟，离心温度4'C，离心后获得沉淀。沉淀藻采用冻融法破碎，-18。C冰箱冷 冻一天然后在30。C水中解冻，反复三次。冻融后藻液经低温冷冻干燥得到冻干粉。
全文摘要
本发明涉及一种100升封闭式光生物反应器进行规模培养和促进转TNF-α鱼腥藻生长和基因表达的生产工艺。该反应器包括采用内置三根可透光的玻璃管及可调控光照设施，温度可调控系统，无菌空气鼓气设施，高温灭菌系统，CO<sub>2</sub>配气设施。在该反应器下进行培养基的调配和人工调控促进转TNF-α鱼腥藻生长和基因表达。该生产方法适宜于大规模培养转基因蓝藻，具有稳定性好，可控性强，可操作性强，批次间结果差异小等特点。
文档编号C12N15/28GK101265450SQ20071015059
公开日2008年9月17日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者宋东辉, 左维明, 张宏业, 张明华, 张芃芃, 施定基, 朱学义, 丹 李, 爽 李, 轩 李, 章华西, 艳 童 申请人:天津科技大学