专利名称：纳米细菌纤维素醛基化改性的方法
技术领域：
本发明涉及一种纳米细菌纤维素醛基化改性的方法，属于纳米生物材料研究范畴。
背景技术：
纤维素是高分子水凝胶材料的一种，是地球上最为丰富的一类生物大分子，它可被 分为植物纤维素和纳米纤维素，其中植物纤维素是植物体最主要的组成部分；细菌纤维 素是微生物细胞外大分子物质的代表，是初级代谢的特定产物。细菌纤维素与植物纤维 素的最大区别在于化学纯度，前者是一种纯纤维素，而后者通常与难以除去的半纤维素 及木质素相连。细菌纤维素在培养基中自发形成了精细的网状结构，而这种特殊的结构 决定了纤维素的化学和物理性能。
细菌纤维素良好的力学性能、透气性能、生物相容性等性质使其在生物医用领域中
具有十分广泛的商业化应用潜力。细菌纤维素制备出的现代创伤敷料在1987年就有了
成功用于治愈烧伤、烫伤及皮肤移植的例子。至今为止，细菌纤维素的医用商品已经出
现了很多，如Biofi^、 Gengiflex⑤等。
最近细菌纤维素作为软组织工程支架的研究也有了进展。虽然己经有很多种高分子 材料用于制备软骨组织支架，如天然高分子材料中的胶原、纤维蛋白、藻酸盐等，人工 合成高分子材料中的PGA、 PLA等，但软组织工程支架不仅要求具有足够的力学性能、 良好的生物相容性和降解性能，还要有微孔结构用以细胞的生长和物质的传输。以上的 材料都不能够很好的符合软组织工程支架的要求。细菌纤维素的各项性能能够较好的满 足软组织工程支架的要求，有很好的应用潜力。软骨细胞在细菌纤维素基体上的繁殖速 度虽然仅为在胶原11上的50%，但在相同的体外免疫反应程度下，软骨细胞在细菌纤维 素基体上的生长速度要高于在藻酸盐基体上的生长速度；软骨细胞在经磷化处理和硫化 处理的细菌纤维素膜上的生长速度没有明显的提高。在这种由细菌纤维素构成的支架 上，软骨细胞保持了分化型。细菌纤维素的杨氏模量与关节软骨组织的相似，拉伸强度 则高于胶原网状组织；细菌纤维素的压縮模量与藻酸盐相似，但低于关节软骨组织的压 縮模量。
细菌纤维素G 10nm)虽然具有天然精细的网络结构、优良的力学性能和生物相 容性，但是细菌纤维素与细胞的黏附以及载药方面的表现并不突出。为使细菌纤维素成 为更加适宜的组织工程支架，对其进行改性就显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种纳米细菌纤维素醛基化改性的方法，釆用氧化的方法，将 醛基接枝在细菌纤维素分子链上，醛基可以为细胞黏附、固定蛋白、接枝药物和抗体提
供活性位点，从而大大的提高了细菌纤维素的反应活性和细胞黏附性，以提高其反应活 性和细胞黏附性，满足细菌纤维素作为组织工程支架的要求。
本发明提供的一种纳米细菌纤维素醛基化改性的方法包括如下步骤
1) 利用微生物发酵方法制备纳米细菌纤维素水凝胶，经过碱液纯化处理并充分清 洗后，得到纳米纤维素水凝胶；
2) 将上述的纳米纤维素悬浮于水中，加入含有2， 2, 6， 6-四甲基哌啶氧化物与溴 化钠的溶液中充分搅拌；
3) 在碱性条件加入次氯酸钠溶液，维持碱性反应体系；
4) 在20 3(TC条件下，反应20 40分钟后，加入无水乙醇终止反应，取出纤维素 水凝胶膜，充分清洗后置于4'C冰箱中保存待用。
所述的微生物为根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气 杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌的一种或几种。
所述的悬浮于水中的细菌纤维素为30 60 g，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物 0.1 0.3g、 NaBrl 3g;所述的有效氯为5% 10%的次氯酸钠溶液0.5 0.2 g。
所述的碱液为NaOH、 KOH或氨水溶液的一种或几种。
所述的碱性反应体系的pH为10 12。
本发明提供的一种纳米细菌纤维素醛基化改性的方法包括如下步骤
1) 利用木醋杆菌作为生物反应器，经过发酵制备出乳白色的细菌纤维素水凝胶膜；
2) 将细菌纤维素水凝胶悬浮于去离子水中，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物和 NaBr，充分搅拌；
3) 向反应体系中加入次氯酸钠溶液，并加入碱液保证反应体系维持碱性条件10
12;
4) 在20 3(TC条件下，搅拌20 40分钟后，加入无水乙醇终止反应，取出纤维 素水凝胶膜，充分清洗后置于4'C冰箱中保存待用。
所述的细菌纤维素水凝、2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物和NaBr的质量比为30 60: (U 0.3: 1 3。所述的次氯酸钠溶液是有效氯为5% 10%的次氯酸钠溶液。
本发明是利用有机物羟基可以被氧化成醛基的反应机理，并结合细菌纤维素分子富 含丰富羟基的结构特点，经过反复实验后探索出一种对细菌纤维素进行醛基改性的方 法。本发明在十分温和的条件下制备了含有醛基的纳米细菌纤维素，大大的提高了细菌 纤维素的反应活性和细胞黏附性，以提高其反应活性和细胞黏附性，满足细菌纤维素作 为组织工程支架的要求，可以极大的拓展纳米细菌纤维素的应用领域。
图1是经过反应后的细菌纤维素的SEM照片。 图2是用来鉴定醛基的指示剂。 图3是将反应后的细菌纤维素置于指示剂充分混合后的照片。
具体实施方式
实例1
利用木醋杆菌作为生物反应器，经过发酵制备出乳白色的细菌纤维素水凝胶膜[L.
Hong, Y丄.Wang, S.R. Jia, Y. Huang, C. Gao, Y.Z. Wan Hydroxyapatite/bacterial cellulose composites synthesized via a biomimetic route, Materials Letters 60 (2006) 1710 -1713.]。木醋杆菌菌种置于琼脂固体培养基中，在4。C下冷藏保存。
将由木醋杆菌生成的细菌纤维素50g悬浮于去离子水中，加入2， 2， 6， 6-四甲基 哌啶氧化物0.1g和溴化钠1.3g，充分搅拌。然后缓慢加入有效氯为10%的次氯酸钠溶 液0,25g，并加入0.5M的氢氧化钠溶液调节体系的pH为11。开始计时，在25'C下反 应30min后，加入40ml无水乙醇终止反应。将细菌纤维素取出用去离子反复冲洗后， 即得到醛基化细菌纤维素。
将实例1得到的醛基化细菌纤维素可以由以下方式进行评价 微观结构
反应细菌纤维素利用环境扫描电镜(ESEM)观察其微观结构如图l所示。氧化细 菌纤维素依然保持精细的网络结构。符合组织工程支架的要求。 醛基鉴定
在100 ml锥形瓶中加入50 ml黄色指示剂如图2所示，该指示剂遇醛基则由黄色 变为温和的粉红色。将反应后的细菌纤维素水凝胶膜切成小块置于指示剂中充分振荡混 合。由图3可以看出指示剂变为温和的粉红色，说明按照本发明的改性方法可以将醛基 接枝到细菌纤维素分子上，成功制备出醛基化细菌纤维素。
指示剂的配制在250ml锥形瓶中加入100ml盐酸羟胺的甲醇溶液(20g/L)，然后 向锥形瓶内滴加8滴百里酚蓝的乙醇溶液(O.lg百里酚蓝溶于100ml 20%的乙醇中)。 若此时溶液呈黄色则作为指示剂待用，否则用氢氧化钠的甲醇溶液(0.03mol/L)滴至黄 色后再作为指示剂使用。 实例2
将由木醋杆菌生成的细菌纤维素50g悬浮于去离子水中，加入2， 2, 6， 6-四甲基 哌啶氧化物0.1g和溴化钠1.3g，充分搅拌。然后缓慢加入有效氯为5%的次氯酸钠溶液 0.5g，并加入0.5 M的氢氧化钠溶液调节体系的pH为10。开始计时，在3(TC下反应20min 后，加入40ml无水乙醇终止反应。将细菌纤维素取出用去离子反复冲洗后，即得到醛 基化细菌纤维素。评价方法同实例l。
权利要求
1、一种纳米细菌纤维素醛基化改性的方法，其特征在于包括如下步骤1)利用微生物发酵方法制备纳米细菌纤维素水凝胶，经过碱液纯化处理并充分清洗后，得到纳米纤维素水凝胶；2)将上述的纳米纤维素悬浮于水中，加入含有2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物与溴化钠的溶液中充分搅拌；3)在碱性条件加入次氯酸钠溶液，维持碱性反应体系；4)在20～30℃条件下，反应20～40分钟后，加入无水乙醇终止反应，取出纤维素水凝胶膜，充分清洗后置于4℃冰箱中保存待用。
2、 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的微生物为根瘤菌属、八叠 球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属、固氮菌属、木醋杆菌的一种 或几种。
3、 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的悬浮于水中的细菌纤维素为 30 60g，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌啶氧化物0.1~0.3g、 NaBrl 3g;所述的有效氯 为5% 10%的次氯酸钠溶液0.5 0.2g。
4、 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的碱液为NaOH、 KOH或氨水溶液的一种或几种。
5、 根据权利要求1中所述的方法，其特征在于所述的碱性反应体系的pH为10 12。
6、 一种纳米细菌纤维素醛基化改性的方法，其特征在于包括如下步骤1) 利用木醋杆菌作为生物反应器，经过发酵制备出细菌纤维素水凝胶膜；2) 将细菌纤维素水凝胶悬浮于去离子水中，加入2， 2， 6， 6-四甲基哌咬氧化物和 NaBr，充分搅拌；3) 向反应体系中加入次氯酸钠溶液，并加入碱液保证反应体系维持碱性条件10 12;4) 在20 30。C条件下，搅拌20 40分钟后，加入无水乙醇终止反应，取出纤维 素水凝胶膜，充分清洗后置于4'C冰箱中保存待用。
7、 根据权利要求6中所述的方法，其特征在于所述的细菌纤维素水凝、2， 2, 6， 6-四甲基哌啶氧化物和1 3gNaBr的质量比为30 60: (U 0.3: 1 3。
8、 根据权利要求6中所述的方法，其特征在于所述的次氯酸钠溶液是有效氯为5 % 10%的次氯酸钠溶液。
全文摘要
本发明涉及纳米细菌纤维素醛基化改性的方法。该方法以纳米级细菌纤维素为基本原料，其中纳米细菌纤维素具有精细的三维网络结构，且微纤维直径为3～10nm；将纳米细菌纤维素悬浮于去离子水中，向去离子水中加入氧化剂，其中氧化剂为2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物、溴化钠和次氯酸钠；在20～30℃的碱性环境下反应20～40min，其中碱性溶液的pH为10～12。本发明在十分温和的条件下制备了含有醛基的纳米细菌纤维素，可以极大的拓展纳米细菌纤维素的应用领域。
文档编号C12P19/00GK101182561SQ20071015074
公开日2008年5月21日 申请日期2007年12月5日 优先权日2007年12月5日
发明者万怡灶, 芳 何, 罗红林, 川 高, 远 黄 申请人:天津大学