专利名称：用于dna检测的微电子传感器装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于对至少一种生物目标物质(尤其是核酸分子或其片段)的研究的微电子传感器装置，包括对目标特定反应物和传感器组件的使用。本发明还包括一种用于对至少一种生物目标物质的研究的一种方式以及对该微电子传感器装置的使用。
背景技术：
美国2005/0009070A1公开了 一种小型生物传感器，其包括多井(multi-well)板，其中可选择性地控制在所述板的反应井中的温度，以便为聚合酶链反应(PCR)提供最佳条件。在美国6 864 140 B2中，说明了一种微传感器，其具有以薄膜晶体管形式在与发生(生物)化学反应的样品室相邻的衬底上的多晶硅上形成的局部加热元件。然而，用这个已知装置不可能对样品室中样品进行进一步的研究。此外，美国6 867 048 B2公开了一种微电子生物传感器，其中，将具有传感器元件阵列的微芯片布置在具有加热元件的膜上。这个膜允许采用对于所有传感器元件都相同的方式来控制相邻样品室中的温度。
发明内容
基于这个情形，本发明的目的是提供用于对生物目标物质进行更准确且更节省成本的研究的手段，尤其是与PCR过程相结合。
通过根据权利要求1的微电子传感器装置、根据权利要求18的方法和根据权利要求29的使用来实现这个目的。在从属权利要求中公开了优选实施例。
根据本发明的微电子传感器装置是想要用于对至少一种生物目标物质(例如DNA片段)的研究。术语"研究"在此应包括对目标物质的某些特性的定性和/或定量检测，可选的还包括对所述物质的处理，例如通过PCR进行处理。该传感器装置包括以下组件
a) 样品室，在样品室可以提供要研究的样品。样品室通常是空腔(cavity)或填充了一些物质的腔，这些物质如凝胶体，其可以吸收样品物
质；它可以是开口的腔、封闭的腔、或通过流体连接通道连接到其它腔的腔。样品室还包含至少一种目标特定反应物(target specific reactant)，所述反应物和/或所述目标物质包括标签，如果反应物与目标物质发生反应，该标签就改变可观察特性(这个改变可以发生在反应期间和/或反应之后，并可以包括特性的出现或消失)。例如反应物可以包括探针分子(probemolecule),其特定地结合到特定生物目标分子上，并且该标签可以是反应物的功能性部分，具有一些易于检测到的特性，例如荧光。样品室最初可以包含固态(干燥的)形式的反应物，其随后在添加样品时溶解。
b) 传感器组件，用于检测标签的所述可观察特性。传感器组件可以包括单一传感器单元，其可选地配有扫描单元，用于顺序地扫描样品室中不同位置。可替代的，传感器组件可以包括与样品室中不同位置相关联的多个单一传感器单元。
c) 加热组件，在其被例如电能驱动时，与样品室的至少一子区域交换热量。加热组件优选地可以将电能转换为热，热被传递到样品室中。然而，还有可能加热组件从样品室吸收热量，并在消耗能量的情况下将其传递到其它一些地方。
d) 控制单元，用于选择性地驱动加热组件(即用于向其提供能量)。所述的微电子传感器装置允许通过感测标签的可观察特性，监测在样
品室中的目标特定反应物与包含在样品中的生物目标物质之间的反应过程。在反应开始之前感测所述特性还允许确定在样品室中反应物或目标物质的量。而且，可以使用加热组件来为例如敏感生物样品的操控而提供最佳条件，或者为测试结合过程的选择性而提供最佳条件。
根据微电子传感器装置的优选实施例，加热组件包括加热阵列，其具有多个可单独控制的加热元件。在最普遍的意义上，术语"阵列"在本发明的上下文中应表示多个元件(例如加热元件)的任意一维，二维或三维排列。通常，这个阵列是二维的，并优选地还是平面形的，而且(加热)元件以规则的样式排列，例如网格或矩阵样式。具有选择性受控的加热元
8件的加热阵列可以用来在样品室中产生实际中任何想要的空间和/或时间温 度曲线。
在另一个优选实施例中，样品室包括反应表面，其构成至少一部分室 壁，其中，所述反应表面覆盖有所述至少一种目标特定反应物。将目标特 定反应物结合到表面具有这样的优点其固定于规定位置并具有规定浓度， 从而实现传感器组件的最佳访问。而且，空间信息的可用性允许在相同反 应隔间中存在不同捕获探针。另外，在样品室的剩余部分中可以选择性地 存在或不存在未固定的目标特定反应物。未固定的反应物的优点是更快的 动力性和更好的经定义的杂交(没有表面附着的影响)。
根据微电子传感器装置的再另一个优选实施例，控制单元适于驱动加 热组件，以使得可以在样品室中进行放大过程。例如，所述放大可以是PCR 过程，它是用于核苷酸序列的放大和研究的重要工具，而且它需要对温度 的控制和重复的加热循环。这可以有利地由微电子传感器装置的加热组件
来提供。PCR优选地在溶液中进行，以确保引物和/或检测探针与分析物之
间有效的反应动力性和良好定义的杂交相互作用。可替代的，可以使用附
着到表面的引物、附着到表面的放大引物(ampifluor primer)、附着到表面 的LuX引物，或附着到表面的蝎形引物。后一方案的优点在于，在同一反 应隔间中可以存在多个反应，因为空间信息是可利用的。理论上，这会导 致较高的灵敏度，因为每一个反应隔间都较大，并因此可以包含更多样品 体积。
控制单元还可以适于根据在反应物与相关目标物质之间的杂交的融化 曲线来驱动加热组件。融化曲线说明了在目标物质与反应物之间取决于温 度的杂交断开。通过沿着融化曲线缓慢地升高温度，在弱结合的目标物质 与反应物之间的杂交首先分解，最后仅留下在目标物质与反应物之间最佳 匹配的最强结合。这些配对(duplex)的融化温度优选地被设计为出现在表 示反应物的序列结构的、明确定义的温度上或温度范围内。因此，可以实 现杂交的严格性/专一性测试。
尽管微电子传感器装置原则上可以只包括一种目标特定反应物，但如 果使用不同种类的目标特定反应物，更通用的"多元"研究就是可能的。 在具体实施例中，可以将这些目标特定反应物分布在作为样品室的一部分
9的反应表面上。而且，如上所定义的，所述分布优选地可以与加热元件的 加热阵列对准。因此，反应表面上与特定加热元件相关的每一个区域(即 在所述区域中的温度主要受所述加热元件控制)都可以用相关类型的反应 物来覆盖。通常，术语"对准"会表明在两个实体(即在此情况下是加热 阵列的加热元件与反应表面上受不同覆盖的区域)之间的固定(不因位移 而改变的)关系。
样品室(和反应表面(如果可适用))可选地可以包括反应隔间，根据 定义，这些反应隔间在物理上是彼此分开的，例如由中间壁彼此分开。以 此方式，利用提供给样品室的样品，可以在不同反应隔间中同时执行多个 不同过程。
如上所定义的，前述反应隔间优选地与加热元件的加热阵列对准。于 是由加热元件提供的温度控制与隔间唯一性地相关。每一个反应隔间都可 以特定地仅与一个或(可能的话)与几个不同加热元件相关。而且，隔间 的壁可选地可以设计为在隔间之间提供隔热。
微电子传感器装置的传感器组件可以具体包括传感器元件阵列，例如 光电传感器，用于检测由标签射出的荧光。采用多个传感器元件，可以并 行监测反应表面上的不同区域，从而监测同时发生的多个过程。
如上所定义的，前述传感器元件优选地与加热元件的加热阵列对准。 例如，可以成对地排列加热和传感器元件，或者每一个加热元件可以与一 组几个传感器元件相关(或反之亦然)。所述对准的优点在于，加热和传感 器元件在不同位置类似地相互作用。因此，在整个阵列上可以提供一致性 的/周期性的条件。这个技术还允许执行(多个)化学步骤。
加热组件(或者如果存在的话，其加热元件)可以具体包括电阻带、
薄膜晶体管(TFT)、透明电极、珀耳帖元件、射频加热电极或者辐射加热 (IR)元件。所有这些元件都可以将电能转换为热，其中珀耳帖元件还可 以吸收热量，并从而提供冷却功能。
微电子传感器装置可选地可以包括冷却单元，例如珀耳帖元件或冷却 块，其与加热组件和/或与样品室热接触。如有必要，这允许降低样品室的 温度。冷却单元与用于产生热量的加热组件相结合，从而能够实现对温度 的双向完全控制。
10微电子传感器装置还包括至少一个温度传感器，其使微电子传感器装 置可以监测在样品室中的温度。温度传感器优选地可以集成到加热组件中。 在具体实施例中，加热组件包括至少一个被设计为可以作为温度传感器来 工作的加热元件，这就允许在无需额外硬件的情况下测量温度。
在温度传感器可用的情况下，控制单元优选地耦接到所述温度传感器， 并适于根据样品室中的预定(时间和/或空间)温度曲线，以闭合回路方式 控制加热组件。这就允许为例如敏感生物样品的处理鲁棒性地提供最佳条 件。
微电子传感器装置还可以包括微机械或电气装置，例如泵或阀门，用 于控制样品室中流体的流动和/或粒子的运动。控制样品和/或粒子的流动对 于微流体装置中样品的通用处理是非常重要的。在具体实施例中，至少一 个加热元件适于借助热毛细作用效应，在样品室中产生流体流动。因此， 其加热能力可以用于移动样品。
可以在样品室与加热和/或传感器阵列之间布置电绝缘层和/或生物相
容层。例如，这样的层可以由二氧化硅Si02或光阻材料SU8组成。
当实现根据本发明的微电子传感器装置时，可以使用大面积电子器件 (LAE)矩阵方案，优选地使用有源矩阵方案，以便接触加热组件(或如 果存在的话，加热元件)和/或传感器组件(或如果存在的话，多个传感器 组件)。将LAE技术尤其是有源矩阵技术(例如用于薄膜晶体管(TFT)) 应用于例如平板显示器的生产中，例如LCD， OLED和电泳显示器。可选 地，可以由控制单元使用一次一行的寻址方案来寻址加热元件。
反应表面可以是微芯片的表面，所述微芯片包括加热组件和/或传感器 组件。在优选实施例中，反应表面包括多孔膜，其为反应物的附着提供较 大面积。
样品室、加热阵列和传感器组件的相互布置可以是任意的，只要实现 在这些组件之间的预期共同操作。如果样品室包括覆盖了反应物的反应表 面，则这个反应表面优选地相邻于加热组件。因此，穿过反应表面，发生 在加热组件与样品室内部之间的热交换，从而在发生决定性反应的所述表 面上提供了最佳温度控制。
本发明还涉及一种用于对至少一种生物目标物质的研究的方法，该方法包括以下步骤-
a) 为样品室提供至少一种目标特定反应物，其中，目标特定反应物 和/或目标物质包括标签，如果反应物与目标物质反应，则所述标签就改变 可观察特性。
b) 控制目标特定反应物在样品室中的存在，其中，术语"控制"意 思是包括简单的监测过程，并且可选地还包括基于监测结果的、样品室中 反应物的量的活动性变化。在任何情况下，"控制"都会包括对样品室中目 标特定反应物的确定或测量，例如结合到反应表面上的反应物的阻抗度量 测量。可选的，该测量自身可以影响在反应物与表面(例如用于固定反应 物的表面)之间的化学反应，例如通过升高在表面上的温度来影响。
c) 使目标物质与目标特定反应物发生反应，其中，这种反应通常包 括在反应物与目标物质之间的结合或杂交。
d) 测量标签在步骤c)(即在目标物质与反应物之间的反应)期间和/ 或之后已变化的可观察特性。
该方法按照其普遍形式包括可以用上述种类的微电子传感器装置来执 行的步骤。因此，可以参考前述说明来获得该方法的更多详细信息、优点 和改进。
在该方法的优选实施例中，目标特定反应物包括标签，通过测量所述 标签的可观察特性来控制目标特定反应物在样品室中的存在。
目标特定反应物可选地可以附着到样品室中的反应表面上，这就提供 了空间信息，从而允许多个并行测量。
该方法可以具体包括根据预期空间和/或时间温度曲线对样品室中的 (或者如果适用，在反应表面上)准确(优选的是闭环)温度控制。这就 允许了敏感生物样品的处理、表面结合(杂交)过程的选择严格性、和对 温度敏感型化学反应的控制。
根据该方法的另一个优选实施例，在样品室中执行PCR过程，具体是 在其反应表面上执行。
而且，可选地，根据在目标物质与反应物之间的杂交的融化曲线，在 步骤c)之后可以升高在上述反应表面上的温度。
以下将说明本发明的多个优选实施例，其应用于以上定义的微电子传感器装置和方法。
在微电子传感器装置和/或方法的第一优选实施例中，标签的可观察特 性包括发光性(光和电的，例如荧光、磷光、电致发光)、磁化强度、吸光 率、色度测量和/或反射系数。对于要进行观察的荧光，必须提供激发光， 例如由微电子传感器装置中的背光来提供激发光。这种激发光还可以用于 观察磷光。
在微电子传感器装置或方法的实践中重要的实施例中，如果目标特定 反应物还没有与目标物质进行反应，就存在标签的可观察特性(即可观察 到的)。例如，这允许在微电子传感器装置的制造之后，检查带有标签的反 应物在反应表面上的正确分布。
在传感器装置和/或方法的另一个实施例中，如果目标特定反应物已经 与目标物质反应了，则标签的荧光就被熄灭。在反应发生之前对所述荧光 的观察允许例如检查在反应表面上的反应物的量。在反应物与目标特定反 应物之间的反应进行期间，由于荧光的相关熄灭，荧光会由此减少。这提 供了对己经发生反应的目标特定物质的量的间接测量。如果反应物包括标 签并且目标物质包括猝灭剂作为功能组，就能够具体实现荧光的熄灭。
在本发明的另 一个重要实施例中，如果目标特定反应物己经与目标物 质发生反应，则由于从一个反应方(例如目标特定反应物)的受激标签到
另一反应方(例如目标物质)的荧光标签的荧光共振能量转移(FRET)而 改变了标签的荧光。因此，将在第一波长发生的反应物标签的荧光发光变 为在第二 (不同的)波长发生的目标物质标签的荧光发光，或者反之亦然。 这允许确定还没有发生反应的反应物和已经发生反应的目标物质的量(或 者反之亦然)。对已经发生反应的目标物质的直接观察允许例如在所关注的 实际结合的目标物质与减少反应物标签的荧光的附带过程(by-processes) 之间进行区分。
生物目标物质和/或目标特定反应物具体可以包括蛋白质和/或寡核苷 酸，例如DNA、 RNA、 PNA (肽核酸)、LNA (锁定核酸)、ANA (阿糖核 酸ambinonucleicacid)、和/或HNA (己糖醇核酸)。寡核苷酸在各种生物研 究中具有高度重要性。例如，可以在PCR过程中准备它们，由于多方面的 温度控制的可能性，可以用根据本发明的微电子传感器装置来有利地执行
13PCR过程。
在本发明的另一个实施例中，反应物包括用于PCR过程的引物。如果 引物是固定不动的，即结合到反应表面上，则就可以实现"固态PCR"。
在前述实施例中，反应物具体可以是蝎形引物和杂交探针。将参考附 图更详细地说明这个实施例。
本发明还涉及上述微电子传感器装置对于分子诊断、生物样品分析、 化学样品分析、食品分析、环境分析和/或法庭分析的使用。
参考以下所述的实施例，本发明的这些及其它方面会是显而易见的， 并加以阐明。借助附图，将这些实施例作为实例来说明，在附图中
图1示意性地显示了根据本发明的、具有加热阵列和荧光反应物的微 电子传感器装置的透视图2显示了将反应表面分割为不同隔间的情况；
图3是基于FRET的测量的图示说明；
图4是基于单分子蝎形引物用作反应物的测量的图示说明。
附图中类似的参考数字标记指代相同或相似组件。
具体实施例方式
聚合酶链反应(PCR)是用于对来自DNA片段的复杂混合物的特定基 因元素进行放大的常用技术。例如，它可以用于基因表达谱绘制(gene expression profiling)、基因分析(例如SNP谱)、法庭分析、或传染体的检 测和识别。为此目的，对大量DNA模板的同时分析会是必要的。然而，执 行并分析多个PCR是费力且花费高的任务。
因此就希望开发一种可靠的系统，其允许多个PCR的同时执行和/或分 析。为了用PCR进行例如传染体(例如体液或食品中的微生物)的识别， 必须分析特定种类的序列。实现该目的的一个方案是采用专用于可能存在 的每一个种类的引物来放大DNA片段。然而这是非常费力(且花费高的) 方案，因为必须分别运行每一个PCR (可以在同一反应管中运行的PCR的 数量是有限的)。另一个方案是进行所谓的宽带PCR。特定基因在种类之间是高度恒定的(例如细菌rRNA基因)。当将这种基因选择为PCR目标时， 可以将对于大量种类而言都相同的引物用于PCR放大。为了识别微生物， 可以在PCR之后执行与特定种类的探针的杂交。这意味着对于每一个种类 来说，特定探针都是以微阵列样式在固体表面上固定不动的。当允许用宽 带PCR产品库与该阵列杂交时，仅是与探针互补的PCR产物会发生结合。
以下，说明了不同实施例，其能够使用微电子传感器装置中微阵列形 式的反应表面同时执行和/或分析多个PCR。
图1示意性地显示了根据本发明的微电子传感器装置的典型设计。该 装置包括样品室SC，其中可以提供包含(生物)目标分子20的样品流体。 样品室SC的下壁由反应表面RS构成，在反应表面RS上固定了目标特定 反应物IO (即在该实例中的杂交探针)。反应表面RS可选地可以是多孔材 料，其有利地具有PCR产物可以结合到其上的较大面积。这就提高了分析 速度，因为由于可以固定更多探针分子，PCR产物与表面的杂交的机会以 及过程的动态范围增大。
将反应表面RS布置在加热阵列的顶部上，加热阵列由加热元件HE的 矩形排列组成。加热元件HE耦接到控制单元CU，以进行单独控制。因此， 可以按所希望的来控制在样品室SC中的空间和时间温度曲线。
在样品室SC的顶面上，布置了传感器阵列，其由与加热元件HE对准 的各个传感器元件SE的矩形排列组成。传感器元件SE可以测量作为反应 物10的一部分的标签12的可观察特性，其中，如果在反应物10与相应的 目标分子20之间的发生了反应，那么所述特性就会变化。
在图l所示的实施例中，标签12的可观察特性是荧光。用排列在(透 明)加热阵列下面的背光BL来激发这些标签的荧光。为了实现高激发强度， 所述背光优选地包括LED或激光。由标签12发出的荧光可以以空间分解 的方式由相关传感器元件SE来检测。如果目标物质20不存在，则对荧光 的测量允许验证固定在反应表面RS上的反应物10的分布和量。
可选地，带有标签的反应物10和目标特定物质20被设计为使得目标 物质包括猝灭剂24，如果目标物质结合到反应物，猝灭剂24就停止标签 12的荧光发光。由此造成的荧光发光的下降随后提供了对所结合的目标物
15通过包含光电传感器SE的离散阵列连同离散的加热阵列，可以获得一 种全面集成的"奇特的"系统。光电传感器的阵列可以基于CCD或CMOS 技术，并通常可以位于反应表面RS之下或之上。可替代地，光电传感器可 以包括光电二极管或光电TFT (具有透明栅极金属的薄膜晶体管)。在优选 实施例中，加热阵列和光电传感器阵列是基于大面积电子技术和有源矩阵 原理(例如低温多晶硅-LTPS)。例如，可以作为感测装置的组件来包含基 于有源矩阵原理的阵列。这种装置优选地借助于一种公知的大面积电子技 术来制造，该技术例如为a-Si (非晶硅)、LPTS或有机半导体技术。TFT、 二极管或MIM (金属-绝缘体-金属)可以用作有源元件。有源矩阵技术通 常在平板显示器领域使用，用于许多显示效应的驱动，例如LCD, OLED 和电泳显示器，并提供了制造一次性使用的生化模块的节省成本的方法， 所述生化模块例如包括传感器阵列和热处理阵列。另外，有源矩阵技术允 许对除了用于温度控制和光感测的那些组件之外的其他组件进行节省成本 的集成(例如温度传感器，用于电粒子操控的电极)。作为生物芯片或类似 系统，这有利地可以包含多种组件，其数量仅随着装置变得更高效且更通 用而增大。
光电传感器SE和加热元件HE可选地位于同一衬底的顶部上。 集成阵列形式的传感器装置的优点是，可以生产完全集成封装的PCR 盒(cartridge),其仅需要外部电气连接(增加了鲁棒性)。这实现了便携式 应用，例如手持式读出装置。而且，不再需要读出主装置中的复杂且昂贵 的光学器件，并且可以实现迅速、实时的检测；可以连续地并同时地监测 样品室中的所有面积。
由于核酸片段产物与探针的杂交是取决于温度的，因此可以根据单个 核苷酸在临界温度上的不匹配来区分出极佳的杂交。因此，在杂交微传感 器中，精确温度控制是基本的。可以通过得到所谓的融化曲线来确定结合 的特定性。在比极佳温度低的温度上执行杂交(允许次最佳匹配)。随后缓 慢升高温度，同时不断测量荧光信号。每一个不匹配都会在特定温度上融 化，直至仅有完全互补于探针的核酸片段保持结合为止。这就允许确定结 合的特定性。
可以具体用根据图1的微电子传感器装置来执行前述过程，其包括阵
16列形式的温度控制。这个装置的每一个元件都优选地用不同核酸探针10所 覆盖。随后可以将核酸片段20的集合施加到杂交室SC，并结合到探针分 子10。如果阵列中每一个元件的温度都升高到每一个探针的最佳温度，就 可以冲洗掉未结合的核酸片段。
在优选实施例中，加热阵列包括装置阵列的每一个元素(即反应表面 上的唯一覆盖区)有一个加热元件HE (例如电阻性加热元件、TFT、珀耳 帖元件等)。另外，可以将一个或多个温度传感器(例如基于电阻的变化、 p-n结特性、TFT特性、热电偶等)集成在阵列中。这个传感器或这些传感 器可以提供实际温度的读数。而且，阵列上的闭合反馈回路可以用于控制 温度，而无需外部控制器。
在另一个实施例中，泵送/混合元件(例如电极)可以集成在温度受控 的微电子传感器装置中，用于粒子操控和/或引起局部对流，例如基于动电 学的原理(例如电泳、电渗、介电电泳等)。这可以有利地增强核酸片段与 反应表面间的结合动力。
因此，所述奇特的温度控制的优点是可以进行杂交阵列形式的准确融 化曲线分析。这使得可以在特定结合与非特定结合之间进行区分。而且， 可以为每一个探针分别调整最佳温度，确保更好的化验动力性和更快的杂 交。最后，奇特的温度控制使得可以执行附着到表面的("固态")多元PCR， 如以下参考图4所述的。
图2示出了将反应表面RS划分为隔间CP的一种可能方案，其中隔间 CP由壁WA分开。壁WA防止了样品流体在隔间之间的不受控的混合。根 据需要，以下实施例是可行的(i)将微传感器芯片的整个样品室都作为单 一室而构建；(ii)将每个与一个加热元件/或传感器元件相关的单元都作为 单一室而构建；或(iii)将规定数量的前述单元作为单一室而构建。在室 SC中不同隔间的使用使得可以在同一芯片上同时选择不同PCR (缓冲剂) 条件。
用目标特定反应物(探针分子)覆盖反应表面RS例如可以用喷墨打印 或平版印刷技术来进行。因此，希望能够控制涂敷在反应表面RS的每一点 上的材料量。如所述的，这可以通过将荧光染料作为标签附着在探针分子 上来实现。其次，还希望能够控制所标记的PCR产物与反应表面之间的非
17特定结合(粘住)。这可以通过利用FRET (荧光共振能量转移)原理来实现，在图3中示出了它。目标特定反应物10在此情况下由杂交探针11组成，其经链13附着到反应表面RS并携带荧光标签12。
在阶段A的开始，通过用结合到模板链23上的带有荧光标签22的引物21进行的PCR放大，来准备目标物质20。随后，结果产生的双链DNAPCR产物在阶段B融化，以释放经^C大的链20，其就是阶段C中的检测过程的目标物质。可以通过重复的PCR循环或通过重复的线性放大的循环来进一步放大链20。链20能够与探针分子11杂交，使得两个染料分子12和22很近地接触。通过激发附着到探针上的染料分子12，经由FRET激发附着到引物上的染料分子22，并发出可检测到的光。(可替代的，可以用相反的方式来使用FRET，即激发引物21的荧光标签22，并检测附着到探针上的染料分子12。这通常会给出较少的背景，因为如果存在PCR产物，就仅存在荧光团22 (从而是可激发的)。
因此，带有标签的目标特定反应物10与带有标签的引物21的使用实现了对于在制造过程期间设置在反应表面RS上的探针分子的量的控制以及明显削弱了对PCR产物与反应表面的非特定结合的检测，其中带有标签的引物21可以借助FRET、通过激发附着到探针上的染料分子12来激发。
在一个附加实施例中，带有标签的引物21可以包括猝灭剂来代替染料分子(22)，以使得在PCR产物结合到反应表面的(特定)上时，就熄灭带有标签的探针10的荧光。
己经提到可以用局部温度控制进行"固态"(附着到表面的)PCR。在此情况下，不是附着探针寡核苷酸，而是将一个(或两个)PCR引物附着到固体表面上。在图4中示出了这个方案的一个实例，其中将蝎形引物附着到反应表面上。此类引物同时起到PCR引物和杂交探针的作用，非常适合于快速实时的PCR检测，具有(对于单一基础的不匹配的)极佳的分辨力。蝎形由特定探针序列组成，所述特定探针序列由在探针的5，和3'侧上的互补主干序列保持在发夹环构造中。荧光团12 (充当标签)附着到该环的3，端。发夹环结构经由PCR阻塞物14连接到引物15的5'端。PCR阻塞物起到荧光团13的猝灭剂的作用。蝎形经由链接器部分13结合到固体反应表面RS上，连接器部分13附着到PCR阻塞物14。在阶段A，模板分子20结合到引物15，并在PCR放大过程中延长。在已经完成了延长之后(阶段B)，模板20从扩增子(amplicon) 16融化离开。当降低温度时，特定探针序列11能够在扩增子16中结合它的补体(阶段C)。这个杂交打开了发夹环，从而不再熄灭标签12的荧光，并可以测量荧光信号。PCR阻塞物14防止了连读，在没有特定模板的情况下这会导致发夹环的断开。因此这避免了来自非特定PCR产物(例如引物二聚体或引导错误事件)的错误信号。附着到反应表面RS上的蝎形引物的数量(例如平均密度X表面积)至少应超过使荧光信号比为实时PCR分析而设定的阈值信号大所必需的荧光团的数量。
所述方案的优点包括
-蝎形引物的使用为系统带来了两倍的专一性引物序列和探针序列都必须匹配，以便提供信号。因为引物和探针被合并在一个分子中，蝎形引物相对于其它实时检测方法(例如Taqman探针或分子信标)，在快速循环条件下显示出较好的性能。
-在每个像素上方的较小体积的PCR空间使得极其快速的循环成为可能，这就减少了整个化验所需的时间。另外，还减少了生化物(引物、酶)的开销。
-固态PCR易于与奇特的检测传感器结合，产生了集成的PCR系统。-使用不同的荧光团或表面上不同的位置实现了多元检测(即，对不同目标的检测)。
在所述实施例中(但也在本公开内容中所述的其它实施例中)，两个引物都可以是序列特定的，或者一个引物可以是宽带引物。而且，引物之一可以是附着到表面的，而另一个引物可以是可溶解的，或者两个引物都可以是附着到表面的。在附加实施例中，在反应表面上涂了前向(例如蝎形)和反向引物的混合物(例如通过喷墨打印机)。这避开了将PCR阵列分隔成区的需要，因为PCR产物的前向和反向链都保持附着到表面上。未分隔成区的PCR室更便于构建，并会提供更好的灵敏度，同时样品包含非常低的模板浓度。
对于本发明的全部实施例，以下附加说明适用
-探针分子IO可以包括DNA、 RNA、 PNA (肽核酸)、LNA (锁定核
19酸)、ANA (阿糖核酸arabinonucleic acid)、和/或HNA (己糖醇核酸)寡核苷酸。
-RNA、 PNA、 LNA和HNA能够与DNA形成异源双链核酸分子，其比DNA:DNA同源双链更稳定。这确保了对于序列不匹配的增强的分辨能力(更特定的杂交)。异源双链核酸分子较高的稳定性还允许在指定温度上使用更短的寡核苷酸探针，减小了非特定结合的机会。
-独立于杂交缓冲剂的离子强度来构成PNA:DNA双重构造。这使得可以使用低盐缓冲剂，其避免了 dsDNAPCR扩增子的不想要的复性。
-尽管主要针对微生物DNA识别举例说明了各个实施例，该方法还可用于其它PCR多元对象，如基因定型、基因表达谱绘制等。
-而且，主要以荧光检测来举例说明了各个实施例。明显的，其它检测手段(磁性、发光性、吸光度、反射率)对于一些实施例也是可行的(除了基于FRET的检测之外)。
总之，本发明公开了将几个先进的特点用于微阵列型PCR检测的可能
性
-基于FRET的检测具有的主要优点是，能够通过减少虚假信号来验证反应表面产物和增强的专一性。
-局部温度控制具有的主要优点是，能够通过为反应表面阵列的每一个元件控制最佳杂交温度来提高专一性，并能够进行固态PCR。
-固态PCR具有的主要优点是，能够在集成系统中进行小型化的实时多元PCR。
-集成的奇特检测器具有的主要优点是，能够得到充分集成的且鲁棒的PCR盒，其无需具有精密光学器件的读出主机。
最后，应指出本申请中的术语"包括"不排除其它元件或步骤，"一个"不排除多个，单一处理器或其它单元可以完成几个模块的功能。本发明存在于一切新特征和一切特征组合中。而且，权利要求中的参考标记不应解释为限制其范围。
20
权利要求
1、一种微电子传感器装置，用于对至少一种生物目标物质(20)的研究，包括a)样品室(SC)，其包含至少一种目标特定反应物(10)，其中，所述反应物和/或所述目标特定物质(20)包括标签(12)，如果所述反应物(10)与所述目标物质(20)发生反应，所述标签(12)就改变可观察特性；b)传感器组件(SE)，其用于检测所述标签(12)的所述可观察特性；c)加热组件(HE)，其用于与所述样品室(SC)的至少一子区域交换热量；d)控制单元(CU)，其用于选择性地驱动所述加热组件(HE)。
2、 如权利要求1所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述加热组件包括具有多个加热元件(HE)的加热阵列。
3、 如权利要求l所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述样品室(SC)包括反应表面(RS)，其覆盖有所述 目标特定反应物(10)。
4、 如权利要求l所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述控制单元(CU)适于驱动所述加热组件(HE)，以 便可以在所述样品室(SC)中进行PCR过程。
5、 如权利要求l所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述控制单元(CU)适于根据在所述目标物质(20)与 所述反应物(10)之间的杂交的融化曲线来驱动所述加热组件(HE)。
6、 如权利要求2所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述样品室(SC)包括反应表面(RS)，并且不同种类 的目标特定反应物(10)采用与所述加热阵列对准的方式分布在所述反应表面(RS)上。
7、 如权利要求1所述的微电子传感器装置， 其特征在于，所述样品室(SC)包括反应隔间(CP)。
8、 如权利要求2和权利要求7所述的微电子传感器装置， 其特征在于，所述反应隔间(CP)与所述加热元件(HE)对准。
9、 如权利要求1所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述传感器组件包括独立传感器元件(SE)的阵列。
10、 如权利要求2和权利要求9所述的微电子传感器装置， 其特征在于，所述传感器(SE)与所述加热元件(HE)对准。
11、 如权利要求1所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述加热组件(HE)包括电阻带、薄膜晶体管TFT、透 明电极、珀耳帖元件、射频加热电极或者辐射加热电极。
12、 如权利要求l所述的微电子传感器装置，其特征在于，其包括至少一个温度传感器，所述温度传感器优选地集 成在所述加热组件中。
13、 如权利要求12所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述控制单元(CU)耦接到所述温度传感器，并适于根 据所述样品室(SC)中的预定温度曲线，以闭合回路方式控制所述加热组 件(HE)。
14、 如权利要求1所述的微电子传感器装置，其特征在于，其包括微机械或电气装置，优选的是泵(PE)或阀门， 用于控制所述样品室(SC)中流体的流动和/或粒子的运动。
15、 如权利要求l所述的微电子传感器装置，其特征在于，使用大面积电子器件矩阵方案，优选地是有源矩阵方案， 来接触所述加热组件(HE)和/或所述传感器组件(SE)。
16、 如权利要求3所述的微电子传感器装置， 其特征在于，所述反应表面(RS)包括多孔膜的表面。
17、 如权利要求3所述的微电子传感器装置，其特征在于，所述反应表面(RS)相邻于所述加热组件(HE)。
18、 一种方法，用于对至少一种生物目标物质(20)的研究，包括以 下步骤a) 为样品室(SC)提供至少一种目标特定反应物(10)，其中，所述 目标特定反应物(10)和/或所述目标物质(20)包括标签(12)，如果所述 反应物(10)与目标物质(20)发生反应，所述标签(12)就改变可观察 特性；b) 控制所述目标特定反应物(10)在所述样品室(SC)中的存在；c) 使目标物质(20)与所述反应物(10)发生反应；d) 测量在步骤c)期间和/或之后、所述标签(12)的所述可观察特性。
19、 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述目标特定反应物(10)包括所述标签(12)，通过测 量所述标签(12)的所述可观察特性来控制所述目标特定反应物(10)在 所述样品室(SC)中的存在。
20、 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述目标特定反应物(10)附着到所述样品室(SC)中 的反应表面(RS)上。
21、 如权利要求18所述的方法，其特征在于，根据预定温度曲线，优选地通过闭合回路，来控制所述 样品室(SC)中的温度。
22、 如权利要求18所述的方法，其特征在于，在所述样品室(SC)中，具体是在反应表面(RS)上执 行PCR过程。
23、 如权利要求20所述的方法，其特征在于，根据在所述目标物质(20)与所述目标特定反应物(10) 之间的杂交的融化曲线，在步骤c)之后升高在所述反应表面(RS)上的 温度。
24、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，所述标签(12)的所述可观察特性包括发光性，具体是荧光、磷光、或电致发光；磁化强度；吸光度；色度测量；和/或反射系 数。
25、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，如果所述目标特定反应物(10)还没有与所述目标物质(20)发生反应，则所述标签(12)的所述可观察特性存在。
26、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，如果所述目标特定反应物(IO)己经与所述目标物质(20)发生反应，则所述标签(12)的荧光被熄灭。
27、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，如果所述目标特定反应物(IO)已经与所述目标物质(20)发生反应，就借助于到所述目标物质(20)和/或所述目标特定反应物(10)的荧光标签(22)的荧光共振能量转移(FRET)来改变所述标签(12)的 荧光。
28、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，所述生物目标物质(20)和/或所述目标特定反应物(10)包括蛋白质和/或寡核苷酸，优选的是DNA、 RNA、 PNA、 LNA、 ANA或 HNAo
29、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，所述目标特定反应物(IO)包括用于PCR过程的引物(15)。
30、 如权利要求1所述的微电子传感器装置或权利要求18所述的方法， 其特征在于，所述目标特定反应物(10)是蝎形引物，其包括PCR引物(15)和杂交探针(11)。
31、 如前述任意一项权利要求所示的微电子传感器装置的使用，其用 于分子诊断、生物样品分析、化学样品分析、食品分析、环境分析或法庭 分析。
全文摘要
本发明涉及一种微电子传感器装置和一种方法，用于对生物目标物质(20)的研究，例如象DNA片段之类的寡核苷酸。在一个实施例中，该装置包括反应表面(RS)，目标特定反应物(10)附着到该反应表面(RS)，且该反应表面(RS)位于样品室(SC)与选择性受控加热元件(HE)的阵列之间。可以按所希望的控制样品室(SC)中的温度曲线，以提供例如用于PCR和/或用于杂交的受控融化的条件。反应物(10)和/或目标物质(20)包括具有可观察特性(如荧光)的标签(12)，如果目标物质(20)结合到反应物(10)，则所述标签就改变，所述特性由传感器元件的阵列检测，所述传感器例如为光电传感器(SE)。如果结合了目标物质(20)，标签(12)的荧光优选地可以借助于FRET传递到另一个不同的荧光标签(22)或者熄灭。
文档编号C12Q1/68GK101466848SQ200780021122
公开日2009年6月24日 申请日期2007年5月24日 优先权日2006年6月8日
发明者E·R·福森纳尔, H·R·施塔白特, M·T·约翰逊, M·W·G·蓬吉 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司