专利名称：选择转化细胞的方法
背景技术：
本申请要求2006年6月6日申请的美国临时专利申请60/811,190的优先权，在此将其公开内容全部引入作为参考。
1.发明领域 本发明总地涉及植物生物技术领域。更具体地，本发明涉及使用生长素样除草剂作为选择剂来选择转化植物细胞的方法。
2.相关领域的描述 目前全世界已有超过80.0百万公顷的土地上生长着转基因作物。通过转基因提供的改良性状显著提高了生产力，并且在许多情况中降低了对可能潜在污染环境的除草剂和杀虫剂的依赖。然而，为了使转基因作物在市场是持续竞争性的，需要增加新价值的性状。
在转基因植物的产生中，特别重要的步骤是转基因细胞的选择。这是因为在任何已知的转化实验方案中通常只有小百分比的细胞得到转化。使用选择标记基因能够使得从那些不含标记基因的细胞中选择出含有标记基因的细胞。在单个植物中堆叠多个转基因的尝试中，这变得尤为困难，因为需要多个选择标记基因。此外，尽管之前已经描述了多种选择标记，但是许多没有给予任何特定农艺学价值的性状，并且因此不必要使得规章批准复杂化。或者，必需采用劳动密集型步骤来尝试从给定的转基因植物中培育出选择标记。因此，具有选择标记和性状双重功能的选择标记基因是尤其有价值的。
用于植物转化的常用选择标记基因是新霉素磷酸转移酶II，从Tn5分离的并给予对卡那霉素的抗性(Fraley等，1983)，以及潮霉素磷酸转移酶，其给予对抗生素潮霉素的抗性(Vanden Elzen等，1985)。给予抗生素抗性的细菌来源的其他选择标记基因包括庆大霉素乙酰基转移酶，链霉素磷酸转移酶，氨基糖苷-3’-腺苷酰转移酶和博来霉素抗性决定簇(Hayford等，1998；Jones等，1987；Svab等，1990；Hille等，1986)。
用于植物转化的不是细菌来源的其他选择标记基因也是可用的。这些基因包括，例如，小鼠二氢叶酸还原酶，植物5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶和植物乙酰乳酸合成酶(Eichholz等，1987；Shah等，1986；Charest等，1990)。在一些杀虫剂中，选择标记基因给予抗性的是草甘膦，草铵膦或溴苯腈(Comai等，1985；Gordon-Kamm等，1990；Stalker等，1988)。
之前已经从各种原核和真核生物体中分离出编码使除草剂和其他排外(xenophobic)化合物失活的酶的基因。在一些情况中，这些基因已经在遗传上工程化，用于在植物中成功的表达。通过该方法，已经研发了对除草剂2，4-二氯苯氧基乙酸(Streber和Willmitzer，1989)，溴苯腈(Stalker等，1988)，草甘膦(Comai等，1985)和草丁膦(DeBlock等，1987)耐受的植物。尽管这些植物已经证明了在商业情况中的价值，需要耐受其他除草剂的植物来避免对任何单种除草剂的过度依赖和增加用于控制杂草的管理难度的选择。
除了上述除草剂，存在模拟或作用类似称为生长素的天然植物生长调节剂的生长素样除草剂。生长素样除草剂似乎影响细胞壁可塑性和核酸代谢，这可以导致不受控制的细胞分裂和生长。由生长素样除草剂引起的伤害症状包括茎干和叶柄的偏上性弯曲和扭曲，叶子翘曲和卷曲以及异常的叶形和脉络。
麦草畏是生长素样除草剂的一个实例并且用作出土前和出土后除草剂，用于控制一年生和多年生阔叶杂草以及玉米，高粱，小粒谷类作物，牧草，干草，牧场，甘蔗，芦笋，草坪和草籽作物种的几种窄叶杂草(Crop Protection Reference(作物保护参考)，1995)。非常不幸地，麦草畏伤害许多商业作物，并且双子叶植物，如大豆，棉花，豌豆，马铃薯，向日葵和canola，对除草剂特别敏感。尽管存在这种情况，生长素样除草剂在控制杂草生长中是非常有效的，并且因此是农业中的重要工具。通过杂草对其他除草剂的耐受性的产生强调了这一点。
最近，从给予麦草畏耐受性的嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia)分离出麦草畏单加氧酶(DMO)的基因(US专利申请20030135879)。DMO涉及除草剂麦草畏(3，6-二氯-邻甲氧基苯甲酸)转化成非毒性的3，6-二氯水杨酸。该基因在表达DMO基因的植物中提供了对麦草畏的耐受性。然而，迄今为止使用分离的选择标记基因只选择了含有该基因的转化体，能够使用DMO基因作为直接选择标记的技术还没有得到描述。需要使用选择标记使得产生对生长素样除草剂耐受的植物复杂化，因为对所用的转化载体需要另外的基因并且还具有调控障碍。
因此，本领域中需要新的选择标记基因和新的除草剂耐受基因。特别需要的是一种细胞的选择方法，该细胞表达可以直接选择的给予麦草畏和其他生长素样除草剂耐受性的基因。具有标记和性状双重功能的选择标记基因将消除研发产品过程中与制备和追踪两个表达单位相关的成本并将促进具有有价值新性状的植物的产生。
发明概述 在一个方面中，本发明提供了选择转化植物细胞的方法，其包括步骤a)将含有用编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸转化的转基因植物细胞的植物细胞群接触含有含量为抑制缺乏多核苷酸群的细胞生长的生长素样除草剂的培养基，其中多核苷酸含有选自以下的核酸序列(1)编码SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲酰胺和42℃条件下与SEQ IDNO7核酸序列的补体杂交的核酸序列，(4)与SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)编码与SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列；和b)基于由转化细胞呈现的对生长素样除草剂的耐受性从植物细胞群中选出转化的植物细胞。可以将细胞群接触含有生长素样除草剂的培养基任何允许选择转基因细胞的时间量。在特定的实施方案中，这可以包括至少1-3小时或可以不确定地进行，例如，持续数十或甚至数百天。在一个实施方案中，该方法可以在步骤a)之前和/或在步骤a)和步骤b)之间包括在缺乏生长素样除草剂的培养基上培养植物细胞群。缺乏生长素样除草剂的培养基可以含有细胞分裂素，如6-苄基氨基嘌呤(BAP)。在特定的实施方案中，6-苄基氨基嘌呤的浓度为约10mg/l培养基或更低，包括约8、6、5、4.5、4、3.5、3、2.5、2、1.5、1和约0.5mg/l或更低。
在本发明特定的实施方案中，编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸没有在遗传上连接麦草畏单加氧酶以外的选择或筛选标记基因。编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸可以可操纵地连接叶绿体转运肽。本发明的方法还可以进一步包括步骤从转化的植物细胞再生转基因植物。在本发明的特定方面中，转化的植物细胞来自双子叶或单子叶细胞。双子叶植物的实例包括苜蓿，豆类，花椰菜，卷心菜，胡萝卜，花菜，棉花，豌豆，油菜籽和大豆，单子叶植物包括玉米，洋葱，水稻，高粱和小麦。在特定的实施方案中，植物是棉花，大豆或双低油菜(canola植物)。
在特定的方面中，生长素样除草剂选自苯氧基羧酸化合物，苯甲酸类化合物，吡啶羧酸化合物，喹啉羧酸化合物和草除灵(benazolinethyl)化合物。在一个实施方案中，苯氧基羧酸化合物选自2，4-二氯苯氧基乙酸，4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸和(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸。在特定的实施方案中，2，4-二氯苯氧基乙酸化合物，4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸和/或(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸以约0.001mg/l至约10mg/l的浓度包含于培养基中，包括，例如，约0.01mg/l至约10mg/l，约0.01mg/l至约5mg/l，约0.1mg/l至约5mg/l，约1mg/l至约5mg/l，约1mg/l至约10mg/l，约5mg/l至约10mg/l和约0.1mg/l至约3mg/l。在其他实施方案中，苯甲酸类化合物是麦草畏(3，6-二氯-邻甲氧基苯甲酸)并且以约0.001mg/l至约10mg/l的浓度包含于培养基中，包括，例如，约0.01mg/l至约10mg/l，约0.01mg/l至约3mg/l，约0.001mg/l至约0.1mg/l，约1mg/l至约10mg/l，约2mg/l至约10mg/l和约0.001mg/l至约1mg/l。在特定的实施方案中，培养基含有至少两种生长素样除草剂，例如，麦草畏和2，4-二氯苯氧基乙酸。在本发明的方法中，细胞群可以包括子叶外植体，并且通过土壤杆菌介导的转化来制备转化的植物细胞。
在另一个方面中，本发明提供了含有编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸并且能够在含有0.01mg/l麦草畏的培养基中生长的转基因植物细胞，其中麦草畏单加氧酶没有在遗传上连接选择或筛选标记基因，并且其中编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸包括选自以下的核酸序列(1)编码SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲酰胺和42℃条件下与SEQ IDNO7核酸序列的补体杂交的核酸序列，(4)与SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)编码与SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。在特定的实施方案中，将细胞限定为通过在此公开的选择方法所制备的。本发明还提供了含有这样细胞的组织培养物。组织培养物包括培养基中的细胞，该培养基含有含量为抑制与缺乏多核苷酸的转基因植物细胞基因型相同的植物细胞生长的生长素样除草剂。本发明进一步提供了从转基因植物细胞再生的转基因植物。
附图简述 以下的附图形成本发明说明书的一部分并且包括来进一步证明本发明的特定方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合在此所示特定实施方案的详述可以更好地理解本发明。
图1.大豆外植体对麦草畏的应答，添加或未添加BAP。(A)在不含麦草畏(左)或含有0.1mg/l麦草畏(右)的培养基上，13DAT。(B)用土壤杆菌(Agrobacterium)接种外植体并且共培养3天，然后在含有0(左上)，0.1(中上)，0.5(右上)，1.0(左下)，5.0(中下)和10(右下)mg/l麦草畏的培养基上培养，11DAT(14DAI)。(C)还是用土壤杆菌接种外植体并且共培养3天，然后在含有不同水平的麦草畏并结合BAP的培养基上培养。从左至右0，0.1，1.0和5.0mg/l麦草畏。从上至下0，1.0，3.0，5.0mg/l BAP。
图2.使用麦草畏选择的实验中(Exp508)具有GFP+小芽(上)或部分(下)的外植体实例。在可调的明视野下(左)或用于检测GFP表达的UV光下(右)在45DAI摄取图片。
图3.来自麦草畏选择的CGP-阳性情况。(A)在可调解剖显微镜下在29DAI观察到小芽。(B)如在用于检测GFP的荧光下所观察的，相同的芽显示出CFP-表达。(C)A&B中的小芽发育成有抵抗力的伸长的芽(箭头)，48DAI。
图4.在含有0.01(左)，0.02(中间)和0.05mg/l麦草畏的培养基上培养的外植体的应答，23DAT(29DAI)。
图5.将分开的有抵抗力的芽在液体生根培养基上培养，培养基中含有作为支持材料的小玻璃珠(A)，几乎所有的芽产生了根。(B)半固体培养基也可以用于根诱发。
图6.(A)幼小的大豆花来自具有CP4和GUS基因的转基因植物(上)和通过麦草畏选择用pMON73691转化的并且还携带GFP基因的植物(下)。(B)在装配有荧光的解剖显微镜下观察相同的两朵花来检测GFP表达。在用含有DMO和GFP基因的pMON73691转化的花上观察到GFP表达。(C，D)打开相同的用pMON73691转化的花，以在各个花的结构中显示GFP表达。
图7.用带有不同构建体的土壤杆菌接种后在含有0.01mg/l麦草畏的选择培养基上培养大豆外植体，这些构建体含有用不同CTP驱动的不同形式的DMO基因。(A)pMON73696，DMO-w，带有CTP1。(B和D)pMON73698，DMO-c，带有CTP1。(C)pMON73691，DMO-c，带有CTP2。各自在39(A&B)和54DAI(C&D)摄取图片。通过图A和C中的箭头来表示有抵抗力的芽。
图8.显示出野生型拟南芥(Arabidopsis)对培养基中各种浓度麦草畏的敏感性。
图9.显示出用编码DMO的多核苷酸转化的麦草畏耐受性拟南芥植物的复原。
发明详述 在一方面中，本发明提供了用生长素样除草剂如麦草畏来选择转化细胞的方法。本发明克服了现有技术中的缺陷之前需要将给予生长素样除草剂耐受性的基因结合分开的选择标记基因，以复原转化体。直接选择消除了对外源选择标记基因的需求，这种需求使转化程序和随后转基因植物的上市批准复杂化。转基因细胞的有效选择是至关重要的，因为在转化实验方案中通常只有少量细胞得到转化。然后在支持植物再生的培养基中培养暴露于选择剂而存活的细胞，来产生转基因植物。特别是使用编码麦草畏单加氧酶(DMO)的核酸，本发明可以选择和形成对生长素样除草剂呈现出耐受性的转基因植物，这可以应用于含有除草剂耐受性植物的区域中，用于有效的杂草控制。
例如，可以通过以下的方法来进行根据本发明的转化细胞的选择首先将编码DMO的多核苷酸分子引入选定的目标植物组织中；将含有转化植物细胞的细胞接触含有含量为抑制与不含DMO编码多核苷酸的转化植物细胞相同基因型的植物细胞生长的生长素样除草剂的培养基；并选择能够在培养基中生长的植物细胞。因此，可以从大群的非转基因细胞中选出转基因细胞。在示例性的实施方案中，可以通过包括更多的物质如生长调节剂来改进选择培养基。可以将组织维持于含有生长调节剂的基础培养基上，直至获得足够的组织来开始植物再生工作，或重复几轮人工选择后，直至组织的形态学适于再生，通常至少2周，然后转移至有助于成熟成植物的培养基中。可以在该培养基上每2周转移培养物。发芽表示应该转移至缺乏生长调节剂的培养基的时间。
各种植物组织可用于转化。在特定的实施方案中，植物细胞来自植物外植体，指的是从能够被转化并随后再生成转基因植物的植物上切除的部分。典型的外植体包括细胞悬浮液、分生组织、成熟或未成熟的胚芽、干胚芽、湿胚芽、干燥的胚芽、种子、愈伤组织、子叶、子叶结、叶子或茎干。
一旦已经选择出转基因细胞，并从其生长出组织，可以使用各种测试证实再生组织或植物中外源DNA或“转基因”的存在。这样的测试包括，例如，“分子生物”测试包括，例如，DNA和RNA印迹以及PCRTM；“生化”测试，如检测蛋白质产物的存在，例如，通过免疫方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过酶功能；植物部分测试，如叶或根测试；此外还有，通过分析整个再生植物的基因型。
A.核酸和重组构建体 1.麦草畏单加氧酶(DMO) 在本发明的一个实施方案中，将表达麦草畏单加氧酶(DMO)多肽的DNA构建体用作植物细胞中的选择标记基因。在此按照SEQ IDNO2，4，6，8，10或12来提供示例性DMO多肽。按照SEQ ID NO1，3，5，7，9或11来提供编码这些序列的示例性核酸。因此，在本发明的一个实施方案中，将这些序列用于转化细胞的选择。如本领域公知的，可以容易地制备和使用这些序列的同源序列和衍生物。例如，可以使用编码与SEQ ID NO2，4，6，8，10或12所提供的多肽具有至少70％序列同一性的DMO多肽的核酸，包括与这样的序列至少约75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的同一性。还可以使用与SEQ ID NO1，3，5，7，9或11所提供的核酸序列呈现出至少70％序列同一性的核酸，包括与这样的序列至少约75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或更高的同一性。在一个实施方案中，使用GCG Wisconsin Package(Accelrys，San Diego，CA)，MEGAlign(DNAStar，Inc.，1228S.Park St.，Madison，Wis.53715)的序列分析软件包测定同一性，使用缺省参数。这样的软件通过比对相似性或同一性的程序来匹配相似的序列。
可以通过本领域公知的技术来获得表达DMO多肽的多核苷酸分子。根据标准方法可以容易地制备具有降解生长素样除草剂能力的DMO的变体并测试活性。还可以通过本领域已知的技术来鉴定这样的序列，例如，从合适的生物体来鉴定，这样的生物体包括降解生长素样除草剂如麦草畏的细菌(U.S.专利No.5,445,962；Krueger等，1989；Cork和Krueger，1991；Cork和Khalil，1995)。分离DMO序列的一种方法是通过核酸杂交，例如，与从来源生物体构建的文库杂交，或通过RT-PCR，基于公开的DMO使用来自来源生物体的mRNA和引物。因此，本发明包括在严谨条件下与在此所述的DMO编码序列杂交的核酸的用途。本领域技术人员理解可以通过提高盐浓度和降低温度来使得条件不太严谨。因此，可以容易地操纵杂交条件，并因此通常是根据所需的结果可选择的方法。高严谨条件的实例是5×SSC，50％甲酰胺和42℃。通过在这样的条件下洗涤，例如，10分钟，可以除去在这些条件下没有与特定目标序列杂交的那些序列。因此，本发明的一个实施方案包括在5×SSC，50％甲酰胺和42℃的洗涤条件下持续10分钟与选自SEQ ID NO1，3，5，7，9或11杂交的DMO编码序列的用途。
SEQ ID NO1显示了来自嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonasmaltophilia)的DMO，为了在双子叶植物中表达使用拟南芥(Arabidopsis thaliana)密码子选择进行了优化。SEQ ID NO2中给出了预测在位置2，3，112各自具有Ala，Thr，Cys的多肽。SEQ ID NO3显示了另一种为了在双子叶植物中表达而优化的嗜麦芽假单胞菌DMO，并编码SEQ ID NO4的多肽，预测在位置2，3，112各自具有Leu，Thr，Cys。SEQ ID NO5显示了双子叶植物优化DMO的编码序列，SEQ ID NO6为多肽，预测在位置2，3，112各自具有Leu，Thr，Trp。SEQ ID NO7和8显示了DMO的编码和多肽序列，预测在位置2，3，112各自具有Ala，Thr，Cys。SEQ ID NO9和10显示了双子叶植物优化DMO的编码序列和多肽序列，预测在位置2，3，112各自具有Ala，Thr，Trp。SEQ ID NO11和12显示了来自嗜麦芽假单胞菌的DMO的编码序列和多肽序列(US专利申请No20030135879)。
还可以根据本领域公知技术使用已知的DMO多肽序列在化学上合成变体。可以在自动化DNA合成仪中通过磷酰亚胺酸酯(phosphoamidite)化学合成DNA序列。化学合成具有多个优势。特别地，化学合成是理想的，因为表达DNA序列的宿主偏好的密码子可以用来优化表达。不是所有的密码子都需要改变来获得提高的表达，但是优选至少将宿主中很少使用的密码子改变成宿主偏好的密码子。通过将高于约50％，最优选至少约80％的密码子改变成宿主偏好的密码子可获得高水平的表达。许多宿主细胞的密码子偏好是已知的(PCTWO 97/31115；PCT WO 97/11086；EP 646643；EP 553494；以及U.S.专利Nos5,689,052；5,567,862；5,567,600；5,552,299和5,017,692)。可以通过本领域已知的方法推断出其他宿主细胞的密码子偏好。此外，使用化学合成，可以容易地改变DNA分子或其编码的蛋白的序列，例如，以优化表达(例如，消除影响转录或翻译的mRNA二级结构)，在方便的点添加独特的限制位点和删除蛋白酶分裂位点。
可以对蛋白质的多肽序列如在此提供的DMO序列进行修饰和改变，同时保持酶活性。以下是基于改变蛋白质的氨基酸来形成等价物，或甚至改良的修饰多肽和相应编码序列的讨论。在本发明特定的实施方案中，可以以这种方式改变DMO序列并用于本发明的方法中。通过改变DNA序列的密码子来实现氨基酸的改变。
例如，已知可以用特定的氨基酸替代蛋白质结构中的其他氨基酸，而没有可测量地失去与底物分子上的结构如结合位点相互结合的能力。因为蛋白质相互作用的能力和性质限定了蛋白质的生物功能活性，因此可以在蛋白质序列中形成特定的氨基酸序列置换，并且当然可以在基础DNA编码序列中进行置换，而仍然获得具有类似特性的蛋白质。因此，考虑了可以在在此所述的DMO肽序列和相应的DNA编码序列中进行各种改变，而没有可测量地失去它们的生物效用或活性。
在进行这样的改变时，可以考虑氨基酸的亲水性(hydropathic)指数。本领域通常能理解亲水性(hydropathic)氨基酸指数在给予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性(Kyte等，1982)。认可了氨基酸的相对亲水性(hydropathic)特征有助于所得到蛋白质的二级结构，这随后限定了蛋白质与其他分子的相互作用，其他分子例如为酶，底物，受体，DNA，抗体，抗原等。基于它们的疏水性和电荷特征已经给每个氨基酸指定了亲水性(hydropathic)指数(Kyte等，1982)，这些为异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
本领域已知氨基酸可以由其他具有相似亲水性(hydropathic)指数或分值的氨基酸替代并仍然得到具有相似生物活性的蛋白质，即，仍然获得生物功能上等价的蛋白质。在进行这样的改变时，优选亲水性(hydropathic)指数在±2内的氨基酸置换，特别优选在±1内的那些，更特别优选的是在±0.5内的那些。
本领域还可以理解可以基于亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。U.S.专利4,554,101描述了蛋白质的最大局部平均亲水性，如通过其邻接氨基酸的亲水性支配的，与蛋白质的生物特性相关。如U.S.专利4,554,101中所述的，已经将以下的亲水性值指定给氨基酸残基精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。可以理解氨基酸可以替代另一个具有相似亲水性值的并仍然获得生物上等价的蛋白质。在这样的改变中，优选亲水性值在±2以内的氨基酸置换，特别优选在±1之内的那些，±0.5之内的那些甚至更特别地优选。考虑了这些和各种前述特征的示例性置换是本领域技术人员公知的，并包括精氨酸和赖氨酸；谷氨酸盐和天冬氨酸盐；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
2.转化构建体 通常将根据本发明用作选择标记的DMO编码多核苷酸引入细胞中，作为含有DMO有效表达必需的表达控制序列的构建体。可操纵地连接表达控制序列与编码序列的方法是本领域公知的(Maniatis等，1982；Sambrook等，1989)。表达控制序列是以任何方式涉及转录控制的DNA序列。合适的表达控制序列及其使用方法是本领域公知的。特别地，可以使用启动子，使用或不用增强子序列，5’-未翻译片段，用于蛋白质或RNA产物靶向植物细胞器的转运或信号肽，特别是靶向叶绿体，以及3’未翻译片段，如多腺苷酸化位点。本领域技术人员将知道各种增强子，启动子，内含子，转运肽，靶向信号序列，以及5’和3’未翻译片段(UTR)可用于有效的植物表达载体的设计中，如公开于例如U.S.专利申请公开2003/01403641中的那些。
适用于本发明和其他用途的启动子是本领域公知的。描述这样的启动子的实例包括U.S.专利6,437,217(玉米RS81启动子)，U.S.专利5,641,876(水稻肌动蛋白启动子)，U.S.专利6,426,446(玉米RS324启动子)，U.S.专利6,429,362(玉米PR-1启动子)，U.S.专利6,232,526(玉米A3启动子)，U.S.专利6,117,611(组成型玉米启动子)，U.S.专利5,322,938，5,352,605，5,359,142和5,530,196(35S启动子)，U.S.专利6,433,252(玉米L3油质蛋白启动子)，U.S.专利6,429,357(水稻肌动蛋白2启动子以及水稻肌动蛋白内含子)，U.S.专利5,837,848(根特异性启动子)，U.S.专利6,294,714(光诱导型启动子)，U.S.专利6,140,078(盐诱导型启动子)，U.S.专利6,252,138(病原体诱导型启动子)，U.S.专利6,175,060(磷缺乏诱导型启动子)，U.S.专利6,635,806(γ-coixin启动子)和U.S.专利申请系列No.09/757,089(玉米叶绿体醛缩酶启动子)。可以发现使用的其他启动子是胭脂碱合成酶(NOS)启动子(Ebert等，1987)，章鱼碱合成酶(OCS)启动子(在根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导质粒上携带其)，花椰菜花叶病毒属的启动子，如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等，1987)，CaMV35S启动子(Odell等，1985)，玄参花叶病毒35S启动子(Walker等，1987)，蔗糖合成酶启动子(Yang等，1990)，R基因符合启动子(Chandler等，1989)和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子等。用于本发明中特别有益的启动子是CaMV35S，FMV35S，PCISV，AtAnt1和P-AGRtu.nos启动子(请参阅表1)。
通过使用编码转运肽的序列可以获得用于异源基因表达的益处。转运肽通常指的是连接目标蛋白时指导蛋白到达特定的组织，细胞，亚细胞位置或细胞器的肽。实例包括，但不限于，叶绿体转运肽，核靶向信号和液泡信号。叶绿体转运肽在本发明中特别有用，用于指导DMO酶的表达到达叶绿体。预期通过植物细胞细胞中发现的降解麦草畏的内源还原酶和铁氧还蛋白有助于DMO功能。植物叶绿体特别富含还原酶和铁氧还蛋白。因此，在产生转基因麦草畏耐受性植物的优选实施方案中，可以使用编码肽的序列，将知道麦草畏降解加氧酶进入叶绿体中。可替换地或另外地，还可以在细胞中表达异源还原酶和/或铁氧还蛋白。
优选可以将编码叶绿体靶向序列的DNA置于DMO编码序列的上游(5’)，但也可以置于编码序列的下游(3’)，或同时在编码序列的上游和下游。特别地，可以将叶绿体转运肽(CTP)工程化来融合待靶向植物叶绿体中的蛋白质的N-端。作为前体物质从核基因表达出许多叶绿体定位蛋白并通过进入步骤过程中除去CTP来靶向叶绿体。可以从这样的多肽的一级氨基酸序列鉴定出有用的CTP。叶绿体蛋白的实例包括核酮糖-1，5-二磷酸盐羧化酶的小亚基(RbcS2)，铁氧还蛋白，铁氧还蛋白氧化还原酶，捕光复合物蛋白1和蛋白II，以及硫氧还蛋白F。已经在体内和体外证明了可以通过使用与CTP的蛋白融合体将无叶绿体蛋白靶向叶绿体并且CTP足以将蛋白靶向叶绿体。例如，引入合适的叶绿体转运肽，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS(Klee等，1987)和矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，1986)，已经显示出将异源EPSPS蛋白序列靶向转基因植物中的叶绿体。其他示例性叶绿体靶向序列包括玉米cab-m7信号序列(Becker等，1992；PCT WO97/41228)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(Creissen等，1991；PCT WO97/41228)。在本发明中，AtRbcS4(CTP1)，AtShkG(CTP2)，AtShkGZm(CTP2合成的)和PsRbcS以及其他的公开于U.S.临时申请系列No.60/891,675中，例如，关于DMO多肽的表达是特别有益的(例如，SEQ ID NO17-28，用于CTP的肽序列和编码它们的核酸序列)。
作为翻译前导序列的5’UTR是位于基因的启动子序列和编码序列之间的DNA遗传成分。翻译前导序列存在于翻译起始序列的完全加工的mRNA上游。翻译前导序列可以影响初级转录物加工成mRNA，mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例特别包括玉米和矮牵牛热休克蛋白前导序列(U.S.专利No.5,362,865)，植物病毒外壳蛋白前导序列，植物核酮糖前导序列(Yurner核Foster，1995)。在本发明中，特别发现益处的5’UTR是GmHsp，PhDnaK，TEV和L-Atnos(请参阅表1)。
3’非翻译序列，3’转录终止片段或多腺苷酸化片段意思是连接和位于结构多核苷酸分子下游的DNA分子，并包括提供能够影响转录，mRNA加工或基因表达的多腺苷酸化信号和其他调控信号的多核苷酸。多腺苷酸化信号在植物中起作用来促成多腺苷酸核苷酸添加至mRNA前体物质的3’端。多腺苷酸化序列可以源自天然基因，源自各种植物基因，或源自T-DNA基因。3’转录终止片段的实例是胭脂碱合成酶3’片段(nos3’；Fraley等，1983)。举例说明了不同的3’非翻译片段的用途(Ingelbrecht等，1989)。来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等，1984)和T-AGRtu.nos(Rojiyaa等，1987，Genbank登录号E01312)对于用于本发明中特别有益。
可以将DMO-编码多核苷酸分子表达单位连接表达单位中的第二个多核苷酸分子，该表达单位含有用于筛选/分选标记或用于给予所需性状的基因的遗传成分。通常用于筛选推测的转化细胞的基因包括β-葡糖苷酸酶(GUS)，β-牛乳糖苷酶，荧光素酶和氯霉素乙酰基转移酶(Jefferson，1987；Teeri等，1989；Koncz等，1987；De Block等，1984)，绿色荧光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994；Haseloff等，1995；和PCT申请WO 97/41228)。将通过StLS1破坏的AvGFP用于工作实施例中，用于获得植物细胞中的表达(请参阅表1)。
第二个多核苷酸分子包括，但不限于，提供与植物形态学，生理学，生长和发育，产量，营养提高，疾病或害虫抵抗力或环境或化学耐受性相关的所需特征的基因并可以包括含有以下特征的遗传成分除草剂抵抗力(U.S.专利6,803,501；6,448,476；6,248,876；6,225,114；6,107,549；5,866,775；5,804,425；5,633,435；5,463,175)，提高的产量(U.S.专利RE38,446；6,716,474；6,663,906；6,476,295；6,441,277；6,423,828；6,399,330；6,372,211；6,235,971；6,222,098；5,716,837)，昆虫控制(U.S.专利6,809,078；6,713,063；6,686,452；6,657,046；6,645,497；6,642,030；6,639,054；6,620,988；6,593,293；6,555,655；6,538,109；6,537,756；6,521,442；6,501,009；6,468,523；6,326,351；6,313,378；6,284,949；6,281,016；6,248,536；6,242,241；6,221,649；6,177,615；6,156,573；6,153,814；6,110,464；6,093,695；6,063,756；6,063,597；6,023,013；5,959,091；5,942,664；5,942,658，5,880,275；5,763,245；5,763,241)，真菌疾病抵抗力(U.S.专利6,653,280；6,573,361；6,506,962；6,316,407；6,215,048；5,516,671；5,773,696；6,121,436；6,316,407；6,506,962)，病毒抵抗力(U.S.专利6,617,496；6,608,241；6,015,940；6,013,864；5,850,023；5,304,730)，线虫抵抗力(U.S.专利6,228,992)，细菌性疾病抵抗力(U.S.专利5,516,671)，植物生长和发育(U.S.专利6,723,897；6,518,488)，淀粉产生(U.S.专利6,538,181；6,538,179；6,538,178；5,750,876；6,476,295)，改良的油产生(U.S.专利6,444,876；6,426,447；6,380,462)，高油产生(U.S.专利6,495,739；5,608,149；6,483,008；6,476,295)，改良的脂肪酸含量(U.S.专利6,828,475；6,822,141；6,770,465；6,706,950；6,660,849；6,596,538；6,589,767；6,537,750；6,489,461；6,459,018)，高蛋白质产生(U.S.专利6,380,466)，果实成熟(U.S.专利5,512,466)，提高的动物和人类营养(U.S.专利6,723,837；6,653,530；6，5412，59；5,985,605；6,171,640)，生物聚合物(U.S.专利RE37,543；6,228,623；5,958,745和U.S.专利申请No.US20030028917)，环境应激抵抗力(U.S.专利6,072,103)，药物肽和分泌肽(U.S.专利6,812,379；6,774,283；6,140,075；6,080,560)，提高的加工性状(U.S.专利6,476,295)，提高的消化率(U.S.专利6,531,648)，低棉子糖(U.S.专利6,166,292)，工业化酶生产(U.S.专利5,543,576)，提高的风味(U.S.专利6,011,199)，氮固定(U.S.专利5,229,114)，杂种种子产生(U.S.专利5,689,041)，纤维产生(U.S.专利6,576,818；6,271,443；5,981,834；5,869,720)和生物燃料产生(U.S.专利5,998,700)。这些或其他遗传成分，方法和转基因中的任何一种可以用于本发明中，这是本领域技术人员根据本发明的公开内容将可以得知的。
或者，第二个多核苷酸分子可以通过引起内源基因表达靶向抑制的RNA编码分子影响上述的植物特征或基因型，例如，通过反义，抑制RNA(RNAi)或共抑制介导的机制。RNA还可以是催化性RNA分子(即，核酶)，工程化来分裂所需的内源mRNA产物。因此，编码影响目标基因型或形态学改变的转录RNA分子的任何多核苷酸分子可以用于本发明的实践中。
可以在土壤杆菌中与携带T-DNA转移和整合功能的第二个质粒一起的第一个质粒的右缘(RB)和左缘(LB)片段之间的T-DNA上提供表达单位。构建体还可以含有质粒主链DNA片段，这提供了在细菌细胞中的复制功能和抗生素选择，例如，大肠杆菌(Escherichia coli)复制起点如ori322，宽范围宿主复制起点，如oriV或oriRi，以及选择标记的编码片段，如Spec/Strp，编码给予壮观霉素或链霉素抗性的Tn7氨基糖苷乙酰基转移酶(aadA)，或庆大霉素(Gm，Gent)选择标记基因。对于植物转化，宿主细菌菌株通常是根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)ABI，C58或LBA4404。然而，植物转化领域中技术人员抑制的其他菌株也可以用于本发明中。
3.转基因细胞的制备 可以通过本领域已知的任一种将转基因引入细胞中的技术来实现转化植物细胞(参见，例如，Miki等，1993)。认为这样的方法的实例实际上包括将DNA引入细胞中的任何方法。已经描述的方法包括电穿孔，如U.S.专利No.5,384,253中所说明的；微炮弹轰击，如U.S.专利No.5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861和6,403,865中所说明的；土壤杆菌介导的转化，如U.S.专利No.5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840和6,384,301中所说明的；以及原生质体转化，如U.S.专利No.5,508,184中所说明的。通过应用如这些的技术，根据本发明实际上可以稳定地转化和选择任何植物品种的细胞，并使这些细胞发育成转基因植物。
最广泛使用的将表达载体引入植物的方法是基于农杆菌的天然转化系统(例如，Horsch等，1985)。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)是植物致病的土壤细菌，其在遗传上转化植物细胞。根癌农杆菌和发根农杆菌的Ti和Ri质粒各自携带负责植物遗传转化的基因(例如，Kado，1991)。各种参考文献提供了关于农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移方法的描述，包括Gruber等，上文，Miki等，上文，Moloney等，1989和U.S.专利No.4,940,838和5,464,763。其他自然地与植物相互作用的细菌，如中华根瘤菌(Sinorhizobium)，根瘤菌(Rhizobium)和中生根瘤菌(Mesorhizobium)，可以进行改良来介导基因转移至各种不同的植物中。通过获得无害的(disarmed)Ti质粒和合适的二元载体，使得这些植物相关的共生细菌能胜任基因转移(例如，Broothaerts等，2005；U.S.专利申请11/749,583)。
B.组织培养和培养基 根据本发明，可以通过使用含有抑制缺乏DMO多肽表达的细胞生长含量的生长素样除草剂的培养基来选择转基因细胞。“培养基”指的是用于使细胞在体外生长的各种营养混合物，即，在完整的活生物体之外生长。培养基通常是大部分细胞类型生长需要的各种成分(盐，氨基酸，生长调节剂，糖，缓冲剂)的悬浮剂。然而，每种特定的细胞类型需要用于生长的特定范围的成分比例，并且甚至更特定的用于最佳生长的配方范围。用允许细胞类型生长的各种培养基开始的培养物中的细胞生长速率也将不同。
可以通过首先在出芽培养基上随后在生根培养基上培养外植体来实现再生转化植物细胞。根据本发明，这些培养基除了营养素和生长调节剂以外通常还包括生长素样除草剂如麦草畏作为选择剂。对于每种植物系统可以实施和优化各种培养基和转移需求，用于转基因植物的转化和复原。因此，可以用营养上等价的成分，或转基因情况的相似选择和复原方法来改变或替代本发明中公开的这些培养基和培养条件，并且仍然落入本发明的范围内。
将营养培养基制成液体，但是也可以通过将液体加入能够提供固体支持的材料中来固化。琼脂是最常用于该目的的。Bactoagar，Hazelton琼脂，Gelrite和Gelgro是适于组织培养中植物细胞生长的特定类型的固体支持物。一些细胞类型将在液体悬浮液中或在固体培养基上生长并分裂。
受体细胞目标包括，但不限于，分生组织细胞，愈伤组织，未成熟胚芽和配子细胞，如小孢子花粉，精子和卵细胞。在特定的实施方案中，可以使用从其可以再生转基因植物，包括能繁殖的转基因植物的任何细胞。例如，转化未成熟胚芽后选择和启动愈伤组织，随后再生转基因植物。未成熟胚芽的直接转化消除了受体细胞培养物长期发育的需要。分生组织细胞(即，能够连续细胞分裂并且特征在于未分化细胞学外观的植物细胞，通常在植物中的生长点和组织中发现，如根尖，茎端，侧芽等)也可以用作受体植物细胞。由于它们未分化的生长和用于器官分化的能力以及全能性，可以将单个转化的分生组织细胞复原成整个转化的细胞。
体细胞是各种类型的。胚芽发生细胞是体细胞的一个实例，可以诱导其通过胚芽形成再生成植物。非胚芽发生细胞是通常以这样的方式没有应答的那些。
可以使用将细胞群内的受体细胞富集的特定技术。例如，II型愈伤组织发育，接着人工选择和培养脆弱的胚芽发生组织，通常导致受体细胞的富集，用于例如微炮弹转化中。
可以在使用各种转化方法进行植物细胞转化后进行培养物的选择。以下工作实施例中描述了农杆菌转化后的选择。此外，如下提供了用于通过微炮弹轰击制得的转化细胞选择的示例性程序 1.将组织(悬浮液)涂布于滤器上，微炮弹轰击，然后将滤器转移至培养基。在2-7天后，将滤器转移至选择培养基。轰击后大约3周，从滤器挑选组织作为新鲜选择培养基上分开的愈伤组织块。
2.与以上1中的相同，除了在轰击后将悬浮液放回液体中-接受液体选择7-14天，然后以低密度吸移至新鲜选择平板上。
3.直接放置在培养基或滤器上的同时轰击愈伤组织。在颗粒轰击1-14天后，将细胞转移至选择培养基。以两周的间隔将滤器上的组织转移至新鲜选择培养基中1-3次。然后将愈伤组织短暂地放入液体中，用于将组织以低密度分散于选择平板上。
4.在DNA引入后一至七天时将愈伤组织转移至选择平板上。将组织作为小的愈伤组织单位在选择平板上亚培养，直至鉴定转化体。
在特定的实施方案中，在培养物中生长后选择受体细胞。将培养的细胞生长于固体支持物上或以液体悬浮液的形式生长。在任一种情况中，可以以培养基的形式给细胞提供营养素，并且控制环境条件。存在多种类型的由氨基酸，盐，生长调节剂和维生素构成的组织培养基。本发明实施中所用的大部分培养基具有相似的成分，而根据已知的组织培养时间，培养基的成分组成和比例可以不同。例如，各种细胞类型通常在超过一种类型的培养基中生长，但根据生长培养基将呈现出不同的生长速率和不同的形态学。在一些培养基中，细胞存活但不能。通常还基于所选的物种或细胞类型来优化培养基组成。
之前已经描述了适于植物细胞培养的各种类型的培养基。以下将限定这些培养基的实例。在一些实施方案中，优选使用含有较低氨/硝酸盐比例的培养基如N6，通过将细胞维持于能够持续分裂的原胚状态来促进受体细胞的传代。在本发明的特定实施方案中，使用Woody植物培养基(WPM)(Lloyd和McCown，1981)。
细胞培养物的维持方法有助于它们作为转化受体细胞来源的用途。转移至新鲜培养基的细胞的人工选择，转移至新鲜培养基的频率，培养基的组成和环境因素，包括但不限于，光质量和含量以及温度，都是维持用作受体细胞来源的愈伤组织和/或悬浮液培养物的因素。在富集培养物内的受体细胞中，将愈伤组织在不同培养条件之间交替是有益的。例如，可以在悬浮液培养物中培养细胞，但是以规律的时间间隔转移至固体培养基。在固体培养基上生长一定时间后，可以人工选择细胞，用于返回至液体培养基。重复这一转移至新鲜培养基的次序可以用来富集受体细胞。将细胞培养物通过1.9mm筛网对于维持愈伤组织或悬浮液培养物的易碎性和使用该细胞类型时富集可转化细胞而言是有用的。
C.转基因植物 一旦选择了转基因细胞，可以使用本领域的公知技术将细胞再生成转基因植物。随后可以分析转化的植物来测定DNA构建体上所含的特定目标核酸的存在或不存在。分子分析可以包括，但不限于，DNA印迹(Southern，1975)，RNA印迹分析，蛋白质印迹分子或PCR分析，免疫诊断方法和田地评价。可以进行这些和其他公知方法来证实由所公开方法产生的转化植物的稳定性。这些方法是本领域技术人员公知的(Sambrook等，1989)。
可以产生耐生长素样除草剂的转基因植物。特别地，可以用本发明的DNA构建体转化目前已知的受到生长素样除草剂伤害的经济上重要的植物，包括作物，果树以及观赏植物和树木，使得它们变成耐除草剂的。可以转化目前认为对生长素样除草剂耐受性的植物，以提高它们对除草剂的耐受性。特别地发现可以用于本发明中的植物实例包括，但不限于，苜蓿(alfalfa)，豆类(beans)，花椰菜(broccoli)，卷心菜(cabbage)，胡萝卜(carrot)，花菜(cauliflower)，芹菜(celery)，棉花(cotton)，黄瓜(cucumber)，茄子(eggplant)，生菜(lettuce)，甜瓜(melon)，豌豆(pea)，胡椒(pepper)，南瓜(pumpkin)，萝卜(radish)，油菜籽(rapeseed)，菠菜(spinach)，大豆(soybean)，倭瓜(squash)，番茄(tomato)，西瓜(watermelon)，玉米(corn)，洋葱(onion)，水稻(rice)，高粱(sorghum)，小麦(wheat)，黑麦(rye)，黍米(millet)，甜菜(sugarcane)，燕麦(oat)，黑小麦(triticale)，柳枝稷(switchgrass)和草坪(turfgrass)。
一旦产生了含有转基因的转基因植物，可以通过杂交将转基因引入与第一个植物性别相适的任何植物中，不需要直接转化第二个植物。因此，如在此所用的术语“后代”表示根据本发明产生的亲本植物的任何一代的后代，其中后代包括根据本发明制得的选定DNA构建体。因此“转基因植物”可以是任何一代的。“杂交”植物提供了相对于起始植物系具有一个或多个添加的转基因或等位基因的植物系，如在此所述的，将杂交定义为通过将起始系与含有本发明的转基因或等位基因的供体植物系杂交导致特定序列引入植物系的技术。为了实现这，例如，进行以下步骤(a)种植第一个(起始系)和第二个(含有所需转基因或等位基因的供体植物系)亲本植物的种子；(b)使第一个和第二个亲本植物的种子生长成带花的植物；(c)用第二个亲本植物的花粉给第一个亲本植物的花授粉；和(d)采收在带有已受精花的亲本植物上产生的种子。
D.定义 如在此所用的，术语“转化的”指的是其中已经引入了外源多核苷酸分子如构建体的细胞，组织，器官或生物体。可以将引入的多核苷酸分子整合至受体细胞，组织，器官或生物体的基因组DNA，使得通过随后的后代经过遗传得到引入的多核苷酸分子。“转基因”或“转化”细胞或生物体还包括细胞或生物体的后代，以及从杂交中使用这样的转基因植物作为亲本的育种程序中产生的后代，并且从外源多核苷酸分子的存在产生改变的基因型。
可以通过在含有生长素样除草剂的植物组织培养基中培养植物细胞来实现将转化的植物细胞“接触”含有生长素样除草剂的组织培养基。
“组织培养基”指的是用于支持非土壤环境中的植物生长和发育的液体，半固体或固体培养基。本领域技术人员已知的合适植物组织培养基包括基于MS的培养基(Murashige和Skoog，1962)或基于N6的培养基(Chu等，1975)，补充了其他植物生长调节剂，如生长素，细胞分裂素，激动素，ABA和赤霉素。其他培养基添加剂可以包括但不限于氨基酸，大量元素，铁，微量元素，肌醇，维生素和有机物，碳水化合物，未限定的培养基成分，如酪蛋白水解产物，含有或不含合适的胶凝剂，如琼脂形式的，如低熔点琼脂糖或
如果需要制备半固体或固体培养基。本领域技术人员熟知各种组织培养基，得到合适地补充时，支持植物组织生长和发育并且适于植物转化和再生。可以作为商业制剂购买这些组织培养基或定制和改良。这样的培养基的实例包括但不限于Murashige和Skoog(1962)，N6(Chu等，1975)，Linsmaier和Skoog(1965)，Uchimiya和Murashige(1962)，Gamborg’s培养基(Gamborg等，1968)，D培养基(Duncan等，1985)，McCown’sWoody植物培养基(McCown和Lloyd，1981)，Nitsch和Nitsch(1969)，以及Schenk和Hildebrandt(1972)或因此补充的这些培养基的衍生。本领域技术人员知道培养基和培养基补充剂，如用于转化和再生素营养素和生长调节剂，并且对于目标植物，可以优化其他培养条件，如孵育过程中的光强度，pH和孵育温度。
“生长素样除草剂”也称为生长素类(auxinic)或生长调节剂除草剂或4组除草剂(基于它们的作用模式)。这些除草剂模拟或作用类似称为生长素的天然植物生长调节剂。生长素包括天然激素，如吲哚乙酸和萘乙酸，两者都引起植物中的细胞伸长。生长素类(auxinic)除草剂的作用模式在于它们似乎影响了细胞壁的可塑性和核酸代谢，这可以导致不受控制的细胞分裂和生长。生长素样除草剂的组包括四个化学家族苯氧基类，羧酸(或吡啶)类，苯甲酸类和最新的家族喹啉(quinaline)羧酸类。苯氧基羧酸类苯氧基类除草剂是最常见的并且从二十世纪四十年代发现(2，4-二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)开始就用作除草剂了。其他实例包括4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)，2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(2，4-DP)，(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(2，4，5-T)，2-(2，4，5-三氯苯氧基)丙酸(2，4，5-TP)，2-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)-N-苯基丙酰胺(稗草胺)，(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸(MCPA)，4-(4-氯-邻甲苯氧基)丁酸(MCPB)和2-(4-氯-2-甲基苯氧基)丙酸(MCPP)。
吡啶羧酸类第二大化学家族是羧酸除草剂，也称为吡啶类除草剂。实例包括3，6-二氯-2-吡啶羧酸(Clopyralid)，4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶羧酸(毒莠定)，(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(绿草定)和4-氨基-3，5-二氯-6-氟-2-吡啶氧基乙酸(氟草烟)。苯甲酸类实例包括3，6-二氯-邻甲氧基苯甲酸(麦草畏)和3-氨基-2，5-二氯苯甲酸(choramben)。喹啉羧酸类第四种并且最新的生长素类(auxinic)除草剂化学家族是喹啉羧酸家族。实例包括3，7-二氯-8-喹啉羧酸(quinclorac)。这种除草剂是独特的，因为它还控制一些草籽，这与基本上只控制阔叶或双子叶植物的其他生长素样除草剂不同。该类别中的其他除草剂是7-氯-3-甲基-8-喹啉羧酸(quinmerac)。
“生长素样除草剂作用”意思是由生长素样除草剂引起的伤害症状。这些包括茎干和叶柄的偏上性弯曲和扭曲，叶子翘曲和卷曲以及异常的叶形和脉络。所有这些除草剂移位，其中一些移位超过其他的。这些除草剂中的一些具有土壤活性，一些可以在土壤中存留相当长的时间段。由于它们的作用，将它们广泛用于许多作物上，包括小粒谷类作物，玉米，水稻和其他饲料作物，草坪，牧场，非作物和工业场所。
可以通过本发明中所述的方法来实现“选择”耐生长素样除草剂的转化植物细胞。简而言之，用含有DMO编码多核苷酸分子转化起始细胞群中的至少一些植物细胞。将所得到的植物细胞群置于含有选定浓度的生长素样除草剂的培养基中，使得转化的植物细胞生长，而未转化的细胞不生长。可以以经验为根据地测定生长素样除草剂的合适浓度。在选择前，可以在没有生长素样除草剂的培养基上培养外植体。这样的培养基称为延迟培养基。可以将外植体置于延迟培养基上，使其在置于选择培养基之前生长一段时间。可以根据特定的生长素样除草剂和外植体系统来优化选择方案。通常使用多步骤选择，并且在每个步骤中可以使用不同含量的选择剂。
“耐受性”意思是将转化植物细胞置于含有防止未转化细胞存活和再生成植物的水平的生长素样除草剂的培养基中时能够存活并再生成植物。“耐受性”还表示在施加抑制未转化植物生长含量的生长素样除草剂后，转化细胞能够生长。
实施例 包括以下的实施例来说明本发明的实施方案。本领域技术人员应当知道以下实施例中公开的技术表示发明人发现的在本发明的实践中能良好地起作用的技术。然而，根据本发明的公开内容，本领域技术人员应当知道可以在公开的特定实施方案中进行许多改变而仍然获得类似或相似的结果，没有脱离本发明的概念，精神和范围。更具体地，将清楚化学上和生理上都相关的特定试剂可以替代在此描述的试剂，而将获得相同或相似的结果。认为本领域技术人员清楚的所有这些相似的替代和改变在所附权利要求限定的本发明的精神，范围和改变之内。
实施例1 DMO编码多核苷酸构建体的制备 制备几种二元载体，用于测试DMO编码多核苷酸选择转化大豆细胞的能力。表1中给出了用于制备二元载体的遗传成分，并包括CaMV35S启动子和增强子(U.S.专利No.5,322,938；5,352,605；5,359,142；和5,530,196)；来自大豆(Glycine max)Hsp17.9基因的GmHsp未翻译前导序列(U.S.专利5,659,122)；来自Aequorea victoria的GFP蛋白的头126.3氨基酸的AvGFPI编码片段(U.S.专利5,491,084；6,146,826)，在氨基酸65具有丝氨酸至苏氨酸的变化并且对于植物表达是优化的；来自马铃薯(Solanum tuberosum)LS1基因的StLS1第二内含子(Eckes等，1986)；对于植物表达优化的来自Aequorea VictoriaGFP蛋白最后112.6氨基酸的AvGFPII编码片段(U.S.专利5,491,084；6,146,826)；来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合成酶基因的T-Atnos3’未翻译片段(Rojiyaa等，1987，GenBank登录号E01312)；FMV玄参花叶病毒35S启动子(U.S.专利6,051,753；5,378,619)；来自矮牵牛(Petunia hybrida)Hsp70基因的PhDnaK未翻译前导序列(U.S.专利5,362,865)；和拟南芥(Arabidopsis)SSU1A转运肽的AtRbcS4(CTP1)编码片段。后一成分包括转运肽，成熟蛋白的24个氨基酸，和转运肽最后6个氨基酸的重复序列(U.S.专利5,728,925)。还使用的是拟南芥(Arabidopsis thaliana)5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)转运肽的AtShkG(CTP2)编码片段。该序列是从野生型序列变化而来的(Klee等，1987)，因为最后的密码子从GAG(谷氨酸)变成TGC(半胱氨酸)。使用了AtShkGzmcodon(CTP2syn)序列，其与AtShkG(CTP2)相同，但使用玉米(Zea mays)密码子对植物表达进行了优化(参见WO04009761的SEQ ID NO14)。使用了来自嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)的麦草畏单加氧酶的PmDMOCys112Atcodon片段(US专利申请20030115626)，在位置112具有半胱氨酸并使用拟南芥密码子(SEQ ID NO1，3，7)对双子叶植物表达优化。还用于构建体设计的是用于来自嗜麦芽假单胞菌的麦草畏单加氧酶的PmDMOTrp112Atcodon编码片段(US专利申请20030115626)，在112位置具有色氨酸(Trp)并使用拟南芥密码子(SEQ ID NO5，9)对转子叶植物表达优化；来自豌豆(Pisum sativum)RbcS2-E9基因的PsRbc23’多腺苷酸化片段(Coruzzi等，1984)；来自拟南芥的腺嘌呤核苷酸易位体1基因的At/Ant1启动子/内含子；工程化用于植物中表达的非天然产生的aroA-CP4的AtaroA-CP4编码片段(U.S.专利5,633,435)；来自烟草蚀刻RNA病毒的TEV5’未翻译前导序列(Carrington和Freed，1990)；来自豌豆核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亚基和成熟rubisco蛋白(Coruzzi等，1984)；来自根癌农杆菌pTiT37胭脂碱合成酶基因的L-At.nos5’未翻译片段(GenBank登录号V00087；Bevan等，1983)，和用于花生褪绿条纹病病毒的全长转录物的PC1SV启动子。后一序列在直接重复片段中具有双倍的179nt，重复片段之间为6nt，接着为含有TATA盒的70bp片段(US专利5,850,019)。表2中概述了不同的CTP和DMO-编码多核苷酸分子变体。
表2.二元载体中所用的叶绿体转运肽和DMO编码多核苷酸 在pMON73690，pMON73691，pMON73696和pMON73698的情况中，将DMO编码多核苷酸分子连接选择标记GFP，并在相同的T-DNA上提供，以显示DMO编码多核苷酸分子可以与另一个基因一起使用。在pMON58498，pMON84254和pMON73724的情况中，通过将它们分开在两个T-DNA上，使DMO编码多核苷酸分子没有与其他转基因连接(选择标记或农艺学性状基因)。
实施例2 选择方法的研发 如下所示的将大豆[Glycine max(L.)Merrill]cv.A3525的成熟种子浸透、灭菌并在室温发芽。可以容易地使用的其他大豆基因型实例包括，但不限于，Jack，Williams，Bert，Thorne，Granite，Lambert，Chapman和Kunitz。简而言之，将干种子(约770g)在2L从可购得的Clorox制得的200ppm次氯酸钠溶液中浸泡3分钟。排出溶液并将种子放置约2h。然后将2L豆类灭菌/发芽培养基加入种子中。约9-10h后，将种子准备手工切除外植体。豆类发芽培养基含有以下以mg/L计的成分--NH4NO3240，KNO3505，CaCl2·2H2O176，MgSO4·7H2O493，KH2PO427，H3BO31.86，Na2MoO4·2H2O0.216，MnSO4·H2O5.07，ZnSO4·7H2O2.58，FeSO4·7H2O2.502，KI0.249，Na2EDTA.2H2O3.348，CuSO4·5H2O0.0008，CoCl2·6H2O0.0008，B11.34，B30.5，B60.82，Bravo(75％ WP；Diamond Shamrock Company，Cleveland，Ohio)30，克菌丹(50％WP；Micro Flo Company，Lakeland，FL)30，Cefotaxime125，和蔗糖25000，pH5.8。
对于外植体的机械切除，用2L 200ppm次氯酸钠溶液将种子处理15分钟。排出溶液后，用2L无菌将种子冲洗1分钟。用于机械切除的机器和方法描述于US专利申请公开20050005321中。简而言之，将浸泡过的种子通过机器中的三套滚筒，无菌蒸馏水随之流动，将其碾碎。收集子叶、种皮和外植体(胚轴)的混合物并通过手工或使用自动筛选装置来筛选，以收集外植体。用0.05％乙醇将外植体漂洗1min，接着用无菌蒸馏水漂洗两次，用于除去更多的碎片。
将上述的二元载体移动至解除的(disarmed)根癌农杆菌菌株C58中(ABI)。如下制备用于注射的农杆菌接种物将250ml含有50mg/l卡那霉素(Sigma，St.Louis，MO)和75mg/l壮观霉素(Sigma，St.Louis，MO)的LB培养基(Luria-Bertani；Difco，Detroit，MI)接种0.5ml甘油中的农杆菌储备菌(Acros Organics，Geel，Belgium)并在200rpm28℃大约振荡20-22h，直至OD660达到0.8至1.0。然后将农杆菌培养液在3500rpm(约3565g)2-4℃离心25min。除去上清液后，将农杆菌沉淀物重悬浮于接种培养基中，该培养基含有2/5x大量营养素，1/10x微量营养素和Gamborg’s B5培养基的维生素，补充3.9g/l MES(Sigma，St.Louis，MO)，和30g/l葡萄糖(Phyto Technology Laboratories，ShawneeMission，KS)，pH5.4。将农杆菌细胞悬浮液的密度调节至0.30至0.35的OD660后，将硫辛酸(Sigma，St.Louis，MO)加入农杆菌悬浮液中至0.25mM的终浓度。
如下进行农杆菌介导的注射和外植体的共培养将约100个切除的外植体分散于无菌培养容器PLANTCON(MP Biomedicals，LLC，Irvine，CA)的盖子中。将五ml农杆菌接种物加入每个PLANTCON盖子中的外植体中。然后将外植体在超声波仪(Ultrasonic MultiCleaner，Model W-113，Honda，Japan)中超声波处理20sec。将一片割成PLANTCON底大小的Whatmann#1滤纸(Whatman Inc.，Clifon，NJ)置于PLANTCOND的底部。将外植体从盖子转移至含有农杆菌接种物的滤纸上。然后在Percival培养器中孵育PLANTCON，以16h亮(约85-90μE)和8h暗光周期并在23℃孵育2至4天，用于共培养。
在2-4天共培养阶段后，首先在转移至含有麦草畏的选择培养基之前，在没有麦草畏的培养基(延迟培养基)上培养外植体。直至从延迟培养基转移至选择培养基，将外植体保持于用于共培养的相同PLANTCON中，但是将10或12ml延迟培养基加入每个PLANTCON中。或者，将外植体转移至新的PLANTCON中，每个含有一片高压处理的毡制品(Jo-Arm Fabrics & Crafts，Madidon，WI)和30ml延迟培养基。延迟培养基含有改良的木本植物培养基(Lloyd和McCown，1981)，补充1或5mg/l BAP(6-苄基氨基嘌呤)，200mg/l羧苄青霉素(Phyto Technology Laboratories，Shawnee Mission，KS)，200mg/l头孢噻肟(Hospira，Lake Forest，IL)和100mg/l羧噻吩青霉素(Duchefa，The Netherlands)。BAP可以帮助维持生长素样细胞分裂素比例，因为麦草畏是一种生长素除草剂，并且促进从顶端分生组织产生多个枝条。可以用于本发明实践中的其他合适细胞分裂素包括腺嘌呤细胞分裂素(例如，激动素，玉米素，苄基腺嘌呤(即，6-苄基氨基嘌呤)，腺嘌呤和苯脲细胞分裂素(例如，N，N’-二苯脲)和噻苯隆(TDZ)。
在液体培养基中或在半固体培养基上进行选择。选择培养基是缺少BAP的延迟培养基并含有不同浓度的麦草畏。对于在液体培养基中的选择，将50或60ml选择培养基和一片具有五个平行裂缝的泡沫海绵(Wisconsin Foam Products，Madison，WI)置于每个Plantcon中。将二十五个外植体植入向上位置的裂缝中，使得顶端分生组织面朝上。每两至三周，用新鲜培养基替代老的培养基。
通过将4g/l AgarGel(Sigma，St.Louis，MO)加入液体培养基中来制备半固体培养基。为了在半固体选择培养基上的选择，将外植体单独植入PLANTCON中的培养基中。在选择和枝条发育的后期(大约在选择培养基上4周)，任选将20ml液体选择培养基覆盖半固体培养基上。外植体在选择培养基上培养约4至5周后，具有张开的三小叶植物叶的伸长枝条开始发育。当大约和超过2cm长时，从最初的外植体上分离这些耐受性枝条，并转移至液体或半固体根诱导培养基。
用于根诱导的培养基与用于枝条发育的相同，并且还补充了麦草畏来降低逃逸的频率。或者，将补充0.01mg/l麦草畏的豆类生根培养基(BRM)用于根诱导。该培养基含有1/2强度的MS盐，MS维生素，100mg/l肌醇，100mg/l半胱氨酸，30mg/l蔗糖和100mg/l替卡西林(Ticarcilin)，并用8g/l洗过的琼脂固化。对于在液体培养基中的根诱导，将足够小的玻璃珠(Inotech Biosystems International Inc.，Dottikon，Switzerland)和60ml生根培养基置于每个PLANTCON中，使得培养基和珠子处于相同的水平。将高达九个分离的枝条插入每个PLANTCON中用于液体根诱导或半固体培养基的珠子中。几乎所有枝条在1-2周中在生根培养基上产生根(图5)。然而，只有将延伸并旺盛生长的其中保留了现有的和新发育叶子的那些枝条转移至土壤，用于生长至成熟。将所有培养物保持于荧光下，使用16h的光周期，约20-70μE的光强度，27-28℃，直至将R0植物转移至土壤中。
在一个研究中，在含有0.01至0.1mg/l麦草畏的选择培养基中选择用pMON73691转化的大豆细胞(图1A&B；图4)。从生长于含有0.05或0.1mg/l麦草畏的选择培养基上的外植体长出的枝条没有生长很多并最终褪色，没有获得耐受性枝条。然而，在含有0.01mg/l麦草畏的选择培养基中，从800个外植体中收集到30个麦草畏耐受性枝条。这些中的十二个在生根培养基上形成了根并将其转移至土壤中。测试了这些中十个的DMO编码多核苷酸，发现七个是阳性的。在0.02mg/l的麦草畏水平，收集到很少的耐受性枝条。这些结果表明0.01mg/l或更低的麦草畏浓度对于选择麦草畏耐受性枝条是最有效的。本领域技术人员可以容易地改变该水平，用于特定的研究，然而，这将取决于外植体的性质，构建体和其他变量。
为了证明含有连接基因的耐受性枝条的选择，选择后，将植物可表达的DMO编码核酸连接植物可表达的GFP-编码核酸并引入细胞中。接种(DAI)后45天检测培养物的GFP表达。在几个外植体上观察到GFP-阳性的小芽，表明这些芽源自用连接的DMO编码多核苷酸分子转化的细胞(图2)。这些芽中的几个发育成GFP阳性枝条，并且对于GFP基因是阳性的(图3，6)。这些结果证明了DMO编码多核苷酸分子可以用作选择标记，而且用于含有并表达连接基因的转化体的复原。通过pMON73691转化的R0植物的自花授粉来证实后代中通过遗传得到了GFP转基因。收集未成熟的R1种子(约4mm长)，并切成两半来暴露子叶组织。在装备有荧光的解剖显微镜下检测种子的子叶组织中的GFP表达。
还在Oasis生长培养基，即填料(plugs)(Smithers-Oasis NorthAmercia，Kent，OH，USA)中实现了生根。将总共102个麦草畏-选择的枝条插入Oasis填料中，用于诱导生根。填料周围为含有0.01mg/l麦草畏的液体培养基。将填料中的枝条保持于28℃和16-h光照的培养室中。三十个枝条产生了根并显示出对麦草畏的抵抗力，显示了相对展开的新叶片。通过侵入者测试检测带有根的植物，并且发现19个植物含有DMO和GUS两种基因。液体培养基上的逃逸率为约33％，这比在半固体培养基中诱导根时的53％逃逸率低得多。枝条的阴性基因型，即，在液体培养基比在半固体培养基中可以更快地看到翘曲的叶子。这表明液体选择培养基中的生根对于消除逃逸是一种更有效的方法。
实施例3 转化大豆植物的分子分析 为了证实获得麦草畏耐受性植物是DMO编码多核苷酸转移的结果，从每个R0或R1植物收集叶片组织，提取DNA，并通过InvaderTM技术(Third Wave Technologies，Madison，WI)和DNA印迹分析证实DMO编码基因的存在，使用来自Roche的非放射性探针试剂盒(Indianapolis，IN)。
对于Invader测试，使用的引物是初级探针5’-acggacgcggagATGCTCAACTTCATCGC-3’(SEQ ID NO13)和Invader寡聚5’-TCCGCTGGAACAAGGTGAGCGCGT-3’(SEQ ID NO14)。初级引物中小写字母的序列是分裂的5’flap序列，并且不与目标序列互补。
对于DNA印迹分析，使用897bp的DNA片段来制备探针。使用正向引物5’-GTCGCTGCCCTGCTTGATATT-3’(SEQ ID NO15)和反向引物5’-CGCCGCTTCTAGTTGTTC-3’(SEQ ID NO16)来扩增897bp DNA片段。对0.01mg/l麦草畏枝条选择的总共12个枝条转移至土壤。通过Invader和/或DNA分析测试了十个植物。这些中的七个显示出存在DMO编码核酸(表3)。这些中的几个对于GFP-编码多核苷酸也是阳性的，证实了使用DMO编码核酸作为选择标记用于收集含有连接基因的转化体的能力。
表3.通过Invader和/或DNA分析测试R0植物的DMO编码核酸。
实施例4 用DMO编码多核苷酸分子变体转化的麦草畏耐受性植物的选择 使用两个DMO编码多核苷酸分析变体来获得麦草畏耐受性植物。第一个变体在氨基酸位置112具有半胱氨酸(DMOCys112；pMON73698)，而第二个在氨基酸位置112具有色氨酸(DMOTrp112；pMON73696)。使用两个变体的选择获得了麦草畏耐受性枝条(图7)。选择并且枝条和生根诱发后，将生根的植物转移至土壤，用于生长至成熟，并通过InvaderTM和/或DNA印迹分析证实DMO编码基因的存在。发现用pMON73696转化的几个植物在R0和R1代中对DMO基因是阳性的，表示使用本发明方法的种系转化。
表4.用DMO编码核酸变体转化的麦草畏耐受性枝条的选择。
实施例5 用结合不同叶绿体转运肽的DMO编码多核苷酸分子转化的麦草畏耐受性植物的选择 已知不同的叶绿体转运肽(CTP)以不同的效率将外源多肽靶向叶绿体。因此，通过用DMO编码多核苷酸分子转化大豆外植体来测试不同类型CTP的效果，通过CTP2(pMON73691)或CTP1(pMON73698)来靶向或不靶向叶绿体(pMON73690)。如表5中所示的，通常，用含有CTP2或CTP1的构建体收集枝条(请参阅图7)。将生根的植物转移至土壤中，用于生长至成熟，并通过InvaderTM和/或DNA分析来测试DMO编码核酸的存在。发现用pMON73691转化的几个植物在R0和R1代中对于DMO基因是阳性的，表明使用本发明方法的种系转化。
在温室研究中分析18个DAT时，还发现携带PCISV/RbcS/DMO-Wdc/Nos或PCISV/CTP2nat/DMO-Cnative/Nos表达单位的几个转基因植物对于麦草畏处理是耐受性的，处理以1lb/A(Clarity，BASF)，以V3-4。
表5.用结合不同叶绿体转运肽的DMO编码核酸转化的麦草畏耐受性植物的选择 实施例6 结合农艺学性状基因使用作为选择标记的DMO编码多核苷酸分子 DMO编码多核苷酸分子作为选择标记的一个有益作用是收集含有遗传上连接基因的转化体，例如，给予改良的农艺学性状。通过用具有2-DNA的pMON58498转化大豆外植体证明了这种能力，第一个T-DNA具有DMO编码多核苷酸分子，第二个T-DNA具有用于草甘膦耐受性的CP4基因。将半固体培养基上选择的转基因植物转移至土壤中，并通过InvaderTM和/或DNA分析测试来显示DMO和CP4核酸的存在。
尽管DMO和CP4-编码多核苷酸分析都可以用作选择标记，显示了可以单独使用麦草畏选择来选择含有CP4转基因的转化体。如表6中所示的，从两个处理各自再生的植物中除了一个都具有DMO和CP4基因。因此，该研究证明了使用DMO作为选择标记用于收集农艺学基因的能力。可以理解可以以这种方式选择在遗传上连接选择DMO标记的任何基因，如引入基因组中的，例如，以50cM内存在，并且这样的基因不必定需要引入相同的载体上。
表6.DMO作为选择标记结合农艺学性状基因的用途 实施例7 含有DMO编码多核苷酸分子的植物对其他生长素样除草剂的耐受性 进行分析来测定具有DMO编码多核苷酸的大豆植物是否能够使麦草畏以外的其他生长素样除草剂失活。通过将各种浓度的其他生长素样除草剂的市售制剂施加至含有DMO的植物组织或植物来进行这，其他的生长素样除草剂如2，4-D(Helena，Collierville，TN)，MCPA(Agriliance，St.Paul，MN)，绿草定(GARLON 3A；Dow Elanco，Indianapolis，IN)，clopyralid(STINGER；Dow Elanco，Indianapolis，IN)，毒莠定(TORDON 22K；Dow Elanco，Indianapolis，IN)，或Banvel或Clarity(BASF，Raleigh，NC)。
如上所述，对于称为情况1-4的情况，使用DMO编码多核苷酸通过农杆菌介导的大豆外植体转化获得转基因大豆植物。将非转基因系用作对照。将非转基因和转基因大豆种子植入含有Redi-earthTM(Scotts-Sierra Horticultural Products Co.，Marysville，Ohio)的3.5英寸方形塑料罐中。将罐子置于35英寸×60英寸玻璃纤维灌溉盘中的毛细管席上，用于测试阶段过程中的喷灌和/或地下灌溉，使得维持用于植物生长的最佳土壤水分。用100gm/cu.ft含量的Osmocote(14-14-14缓慢释放；Scotts-Sierra Horticultural Products Co.，Marysville，Ohio)给罐子施肥，以在温室测试的过程中维持植物生长。将植物生长于27℃/21℃白天/夜晚温度的温室中，使用25％-75％的相对湿度，以模拟晚春的季节生长条件。提供14h最小光周期，按照需要，使用约600μE的补充光。
使用Teejet9501E平的扇形喷嘴(Spraying Systems Co，Wheaton，IL)，使用履带式喷雾器进行所有除草剂的施加，使用最小24psi(165kpa)的空气压力设定。将喷雾嘴保持在高出用于喷雾的植物材料顶部约16英寸的高度。喷雾体积为10加仑/英亩或93升/公顷。当植物达到V-3阶段时进行施加。在随机的分组设计中建立所有的试验(根据含量来随机化)，每个处理4至6个重复，这取决于植物质量，利用率，并说明每个温室限制内已经发生的任何环境变化。
在处理后大约4，14，18和21天(DAT)在视觉上确定温室试验中所有处理过的植物，以相对于未处理对照植物0至100％的等级来评价损伤，零表示“没有”损伤，100％表示“完全”损伤或死亡。使用掌上计算机收集数据并使用标准统计学方法来分析。表9中显示的结果清楚地表明转基因大豆相对于非转基因系对其他生长素样除草剂如2，4-D和MCPA的耐受性。
表7.在V3后25DAT应用不同生长素样除草剂对非转基因或转基因大豆植物相对于未处理对照的百分比损伤。*
*％损伤表示为ANOVA平均比较。**活性酸等价物克数/公顷 该实施例显示了转基因大豆植物呈现出对其他生长素样除草剂的耐受性，表明了麦草畏和其他生长素样除草剂如2，4-D和MCPA很可能具有共同的失活机理。在绿草定，chlopyralid和毒莠定的情况中，在该研究中280g ae/ha的施加量显示出太严厉，因此，在大多数情况中希望降低浓度来减少植物伤害。该结果表明生长素样除草剂可以用于选择用DMO多核苷酸分子转化的植物细胞，尤其是在对麦草畏非常敏感的植物情况中，例如，棉花。可以使用检验格网的处理接着观察处理过的植物组织来优化给定条件下用于选择的生长素样除草剂的合适浓度。这样网格的实例分析了约0.001mg/l至约10mg/l浓度的作用，包括0.01，0.1，1.0，2.0和5.0mg/L。
还对携带DMO基因的转基因大豆植物测试了另一种生长素样除草剂Butyrac 200(2，4-DB；Albaugh)，测试植物对该除草剂的耐受性。作为发芽后处理来施加除草剂，以三个施加量对两个转基因大豆情况进行施加，并与非转基因系比较所有三个施加量的总作物损伤280g/ha(0.25lb/a)，561g/ha(0.5lb/a)和841g/ha(0.75lb/a)(参见表8)。两个转基因大豆系显示出对2，4-DB低水平的耐受性。该实施例证明了麦草畏耐受性大豆对低水平的2，4-DB也是耐受的，并且在控制由相同或邻近区域的喷雾偏差引起的损伤中应当是有用的，以防止作物损耗，并且在除草剂传送设备不完全洗涤后呈现出对残余水平的2，4-DB的耐受性。
表8.将2，4-DB施加至非转基因或转基因大豆植物16DAT时相对于未处理对照的百分比损伤
实施例8 DMO基因作为选择标记对抗其他生长素样除草剂的用途 用带有pMON73691(含有DMO和GFP基因)的农杆菌菌株ABI接种新鲜分离的大豆外植体(没有子叶的成熟胚轴)。与农杆菌在23℃以及16-h光和8-h暗的光周期下共培养3-d后，在液体延迟培养基中培养外植体，该培养基含有补充了5mg/lBAP，200mg/l羧苄青霉素，200mg/l头孢噻肟和100mg/l羧噻吩青霉素的改良木本植物培养基。将外植体在延迟培养基上培养4天。然后将它们转移至PLANTCON中的液体选择培养基中。选择培养基和延迟培养基相同，除了添加了各种水平的2，4-D(0.01，0.1，1.0或2.0mg/L)或0.01mg/L麦草畏，如以下的表9中所示的。每个PLANTCON含有60ml选择培养基和一片具有5个裂缝的泡沫海绵。将二十五个外植体均匀地插入裂缝中。将培养物维持于28℃以及16-h光和8-h暗的光周期下，并在装备的无菌显微镜下定时检测，来检测GFP表达组织。在接种后48天(DAI)时，对用0.01mg/L麦草畏，0.01，0.1或1.0mg/L2，4-D处理的外植体数量观察表达GFP(GFP+)的芽或幼小的枝条，但是没有观察用2mg/L 2，4-D处理的外植体。对用1或2mg/L 2，4-D处理的外植体观察到大范围愈伤组织发育。用0.01或0.1mg/L的2，4-D处理中，外植体具有大范围的枝条生长，并且少数具有伸长的GFP+枝条。
表9.使用DMO作为选择标记和2，4-D作为选择剂的实验概述 实施例9 用DMO编码多核苷酸转化但没有延迟步骤的麦草畏耐受性植物的选择 在三个研究中产生了含有DMO基因但没有延迟选择步骤的转基因植物。作为实例，用带有pMON73696的农杆菌感染并共培养外植体。共培养阶段后，将外植体在含有5mg/l BAP和0.01mg/l麦草畏的液体培养基上培养4天，然后转移至含有0.01mg/l麦草畏的液体或半固体选择培养基上。如表10中所示的，从农杆菌共培养后立即使用选择的处理(717-2和757-2)中获得麦草畏耐受性枝条。
表10.用DMO编码多核苷酸转化而没有延迟步骤的麦草畏耐受性植物的选择 实施例10 作为拟南芥选择标记的DMO的用途 首先测试拟南芥对不同水平麦草畏的敏感性。将野生型拟南芥变种哥伦比亚种子播种于含有各种水平麦草畏的植物组织培养基上。图8显示了野生型拟南芥对培养基中1.0mg/L非常敏感。然后使用floral dip方法(Clough和Bent，1998)，用含有DMO多核苷酸的构建体转化拟南芥植物。将R1种子播种于含有高达4mg/L麦草畏的培养基上。例如，图9显示了用pMON73696转化后回收麦草畏耐受性植物(由箭头显示)。发现这些麦草畏耐受性植物含有一个或多个DMO核苷酸拷贝，如通过InvaderTM测试所确定的。该实施例证明了DMO在产生其他植物物种的麦草畏耐受性植物中的用途。
***** 根据本发明的公开内容不需要过度实验就能制得和进行在此公开和要求的所有组合物和/或方法。尽管根据优选实施方案已经描述了本发明的组合物和方法，本领域技术人员将清楚可以对组合物和/或方法以及在此所述方法的步骤或步骤的次序进行改变，而没有脱离本发明的概念，精神和范围。更具体地，将清楚化学和生理上都相关的特定试剂可以替代在此所述的试剂，而获得相同或相似的结果。认为所有这些本领域技术人员显而易见的相似替代和改变在所附权利要求限定的精神，范围和概念之内。
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<223> 人造序列的描述人造引物
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权利要求
1.选择转化植物细胞的方法，所述方法包括以下步骤
a)将含有用编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸转化的转基因植物细胞的植物细胞群接触含有含量为抑制缺乏该多核苷酸的细胞群的细胞生长的生长素样除草剂的培养基，其中多核苷酸含有选自以下的核酸序列(1)编码SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲酰胺和42℃条件下与SEQ IDNO7核酸序列的补体杂交的核酸序列，(4)与SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)编码与SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列；和
b)基于由转化细胞呈现的对生长素样除草剂的耐受性从植物细胞群中选出转化的植物细胞。
2.权利要求1的方法，包括在步骤a)之前和/或在步骤a)和步骤b)之间在缺乏生长素样除草剂的培养基上培养植物细胞群。
3.权利要求2的方法，其中缺乏生长素样除草剂的培养基含有细胞分裂素。
4.权利要求2的方法，其中缺乏生长素样除草剂的培养基含有6-苄基氨基嘌呤(BAP)。
5.权利要求4的方法，其中6-苄基氨基嘌呤的浓度为约10mg/l培养基或更低。
6.权利要求1的方法，其中编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸没有在遗传上连接麦草畏单加氧酶以外的其他选择或筛选标记基因。
7.权利要求1的方法，进一步包括步骤
d)从转化的植物细胞再生能繁殖的转基因植物。
8.权利要求1的方法，其中转化的植物细胞来自双子叶或单子叶植物。
9.权利要求8的方法，其中双子叶植物选自苜蓿，豆类，花椰菜，卷心菜，胡萝卜，花菜，芹菜，棉花，黄瓜，茄子，生菜，甜瓜，豌豆，胡椒，南瓜，萝卜，油菜籽，菠菜，大豆，倭瓜，番茄和西瓜。
10.权利要求8的方法，其中单子叶植物选自玉米，洋葱，水稻，高粱，小麦，黑麦，黍米，甜菜，燕麦，黑小麦，柳枝稷和草坪。
11.权利要求1的方法，其中编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸可操纵地连接叶绿体转运肽。
12.权利要求1的方法，其中生长素样除草剂选自苯氧基羧酸化合物，苯甲酸类化合物，吡啶羧酸化合物，喹啉羧酸化合物和草除灵化合物。
13.权利要求12的方法，其中所述苯氧基羧酸化合物选自2，4-二氯苯氧基乙酸，(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸和4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸。
14.权利要求13的方法，其中培养基中含有浓度为约0.001mg/l至约10mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸化合物。
15.权利要求12的方法，其中所述苯甲酸类化合物是麦草畏(3，6-二氯-邻甲氧基苯甲酸)。
16.权利要求15的方法，其中培养基中含有浓度为约0.001mg/l至约10.0mg/l的麦草畏。
17.权利要求1的方法，其中培养基含有至少两种生长素样除草剂。
18.权利要求17的方法，其中培养基含有麦草畏和2，4-二氯苯氧基乙酸。
19.权利要求1的方法，其中细胞群包括子叶外植体。
20.权利要求19的方法，其中通过农杆菌介导的转化来制备转化的植物细胞。
21.含有编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸并且能够在含有0.01mg/l麦草畏的培养基中生长的转基因植物细胞，其中麦草畏单加氧酶没有在遗传上连接选择或筛选标记基因，并且其中编码麦草畏单加氧酶的多核苷酸包括选自以下的核酸序列(1)编码SEQ ID NO8多肽的核酸序列，(2)含有SEQ ID NO7序列的核酸序列，(3)在5×SSC，50％甲酰胺和42℃条件下与SEQ ID NO7核酸序列的补体杂交的核酸序列，(4)与SEQ ID NO7的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸序列和(5)编码与SEQ ID NO8的多肽序列具有至少70％序列同一性的多肽的核酸序列。
22.含有权利要求21的细胞的组织培养物。
23.权利要求22的组织培养物，其中组织培养物包括在含有生长素样除草剂的培养基中的所述细胞，所述生长素样除草剂的含量为抑制植物细胞的生长或促进与缺乏多核苷酸的转基因植物细胞相同基因型的异常生长。
24.从权利要求21的植物细胞再生的转基因植物。
全文摘要
本发明提供了选择转基因细胞的方法。本发明涉及意想不到的发现使用生长素样除草剂作为选择剂可以从非转基因细胞中直接选出表达给予生长素样除草剂如麦草畏耐受性基因的细胞。以这种方式，可以直接产生对生长素样除草剂呈现出耐受性的植物，而不需要分开的选择标记。
文档编号C12N15/82GK101460626SQ200780021025
公开日2009年6月17日 申请日期2007年6月5日 优先权日2006年6月6日
发明者Y·万, R·J·布林克, P·C·C·冯 申请人:孟山都技术有限公司