生产3-羟基丙酸的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶的制作方法

专利名称：生产3-羟基丙酸的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶的制作方法
技术领域：
本公开涉及改良的P-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)的 核酸和氨基酸序列，具有改良的BAAT活性的细胞，所述细胞能够用 于将卩-丙氨酸转化为丙二酰半醛，丙二酰半醛又能通过3-HP脱氢酶转 化为3-羟基丙酸(3-HP)，以及使用该细胞生产3-HP及其衍生物的方 法。
对政府支持的确认
本发明是在能源部授予的合同GO 13144下由美国政府支持完成 的。美国政府在本发明中具有确定的权利。
背景技术：
有机化学物例如有机酸、酯和多元醇可用于合成塑料和其它产品。 为了满足对有机化学物的增长的需求，正在开发利用基于碳水化合物 而不是碳氢化合物的原料的更为有效和成本合算的生产方法。例如， 某些细菌已经被用于生产大量的乳酸，用于聚乳酸的生产。
3-羟基丙酸(3-HP)是一种有机酸。已经描述了几种生产3-HP的 化学合成路线，生物催化路线也已经被公开(Suthers等的WO 01/16346) 。 3-HP可用于专业合成，并可通过化学工业中的现有技术 被转化成商业重要的中间体，例如脱水成为丙烯酸、氧化成为丙二酸、 与醇发生酯化反应成为酯、以及还原成为L3-芮二醇。发明概述
化合物3-羟基丙酸(3-HP)可以从葡萄糖通过P-丙氨酸中间体经 生物催化来生产(

图1) 。 P-丙氨酸可以使用p-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基 转移酶(BAAT)和3-HP脱氢酶经丙二酰半醛转化为3-HP (图1)。 但是，该途径效率不高。
本文公开了新的(3-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)，它 们具有增强的将P-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。这种BAAT酶活 性的增强导致了丙二酰半醛和下游产物例如3-HP生产的相应增加。
分离的BAAT分子的具体例子包括在SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、
11、 13、 16和18中显示的核酸序列，以及在SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、
12、 14、 17和19中显示的它们的相应氨基酸序列，以及这些序列保 留了将P-丙氨酸与丙二酰半酵的互变能力的变异体、片段、融合物和 多态性。所公开的核酸分子可以与启动子可操作连接，并可以成为载 体的一部分。
所公开的BAAT序列可用于转化细胞，以便被转化的细胞具有 BAAT活性，从而使得细胞从卩-丙氨酸生产丙二酰半醛。在某些例子 中，这种转化的细胞生产3-HP或其衍生物。与SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19中任何一个特异性结合的结合剂也包涵在本公开 中。这种结合剂的一个例子是抗体，例如多克隆或单克隆抗体。
提供了分离的细胞，它们表达外源BAAT核酸分子，因此具有 BAAT活性，使得细胞可以将(3-丙氨酸转化为丙二酰半醛。这样的细 胞可以是真核或原核细胞，例如酵母细胞、植物细胞、真菌细胞或细 菌细胞(例如乳酸杆菌aa"o6ac/〃ws)、乳酸球菌(丄a"ococcw)、 芽孢杆菌(Ba"7/ws)或大肠杆菌(&c/zeWc/z/a)细胞)。还提供了含 有这样的细胞的转基因植物和生物体。在一个实施例中，将细胞用编码BAAT的核酸分子(例如SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16和 18中的任何一个或其保留了 BAAT活性的片段、融合物或变异体)转 化，从而赋予了被转化的细胞BAAT活性。该公开的细胞可用于生产 核酸分子、肽和有机化合物，例如丙二酰半醛和3-HP或其衍生物(例 如聚合化的3-HP、 3-HP酯或1,3-丙二醇)。3-HP在生物学上和商业上 都是重要的。例如，营养品业可以使用3-HP作为食品、饲料添加剂或 防腐剂，同时上面提到的衍生物可以从3-HP生产。这里描述的细胞可 以用于培养系统中，用来生产大量的3-HP以及其它有机化合物，例如 上面列出的那些。肽可用于催化有机化合物的形成，或者可用作抗原 以产生特异性结合剂。
在某些实施例中，所公开的细胞，除了BAAT活性之外，还可以 包括其它的酶活性，例如3-HP脱氢酶活性(例如编码与SEQ ID NO: 21、 23、 27或31具有至少95%序列同一性的蛋白的核酸分子)，其中所述 细胞产生3-HP。具有BAAT和3-HP脱氢酶活性的细胞还可以包括其 它酶活性，例如用于生产3-HP的衍生物。在一个实施例中，这样的细 胞还具有脂肪酶或酯酶活性，并产生3-HP的酯。在另一个实施例中， 这样的细胞还具有酯酶活性，并产生聚合的3-HP。在另一个实施例中， 这样的细胞还具有醇脱氢酶活性(EC l丄l.l)和醛脱氢酶活性(例如 来自1.2.1-类的酶)活性，并产生l,3-丙二醇。其他的酶活性可以是细 胞内源的或外源的(例如由编码酶的外源核酸分子提供)。
在某些实施例中，所公开的细胞，除了BAAT活性之外，还包括 其它的酶活性，例如生产P-丙氨酸所需的活性。这样的活性可以是细 胞内源的，或者可以由一种或多种外源核酸分子提供。这样的酶的例 子包括PEP羧化酶(例如在从PEP生产草酰乙酸时)、丙酮酸羧化酶 (例如在从丙酮酸生产草酰乙酸时)、天冬氨酸氨基转移酶以及天冬 氨酸脱羧酶(例如与SEQ ID NO: 39或具有至少95%序列同一性的蛋 白)。在具体的实施例中，至少一种编码这些酶的外源核酸分子包含 非天然的启动子，以增加酶的表达，例如提高至少20%。在具体的实施例中，所公开的细胞含有增加可用的丙酮酸以制造 卩-丙氨酸的突变。这样的突变的例子包括但不限于ApoxB突变(例如 使细胞的乙酸形成减少至少20%的突变)，AadhE或AatpFH突变(或 二者)(例如与不存在AadhE或AatpFH相比，突变导致细胞产生至少 多20%的3-HP)，或表达与SEQ ID NO: 52具有至少95%序列同一性 的外源核酸分子。
公开了使用所公开的具有BAAT活性的细胞从p-丙氨酸生产丙二 酰半醛的方法。在一个实施例中，将细胞转染p-丙氨酸转化成丙二酰 半醛所必需的一种或多种酶。在另一个实施例中，该方法包括从细胞 纯化(3-丙氨酸，然后将(3-丙氨酸与P-丙氨酸转化成丙二酰半醛所必需 的多肽相接触。
本公开还提供了制造3-HP或其衍生物的方法。在一个实施例中， 将所公开的细胞在允许3-HP或其衍生物形成的条件下培养。在另一个 实施例中，首先从所公开的细胞中纯化生产3-HP所需的酶，例如3-HP 脱氢酶，然后将其与丙二酰半醛在允许3-HP形成的条件下温育。在另 一个实施例中，将3-HP从所公开的细胞中纯化，然后将其与醇脱氢酶 或醛脱氢酶在允许1,3-丙二醇形成的条件下温育，或者与酯酶在允许聚 合的3-HP形成的条件下温育，或与脂肪酶或酯酶在允许3-HP酯形成 的条件下温育。
在某些实施例中，所公开的产物在体外(细胞外部)生产。在其 它实施例中，产物使用体外和体内(细胞内部)方法的组合来生产。 在其它实施例中，产物在体内生产。对于涉及体内步骤的方法来说， 细胞可以是分离的培养细胞或完整的生物体例如转基因植物，或单细 胞生物体例如酵母和细菌(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌和大 肠杆菌细胞)。这些细胞生产的产物可以是有机产物例如p-丙氨酸、 丙二酰半醛、3-HP，以及它们的衍生物例如有机酸、多元醇(例如1,3-丙二醇)，以及本文描述的BAAT酶。
从下面参考附图进行的详细描述，本公开的上述以及其它的特点 将变得更加明显。
附图简述
图1是经P-丙氨酸中间体产生3-HP及其衍生物的途径的图解。 图2A-B显示了改良的P-丙氨酸氨基转移酶(BAAT) (SEQ ID NO:
6、 10、 12、 14、 17和19)与原有BAAT序列(SEQ ID NO: 4)的比较。
粗体中的残基是相对于原有BAAT序列所做的改变。
序列表
在所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准 字母縮写和氨基酸的三字母密码来显示。每个核酸序列只显示一条链，
但是应该理解，对显示的链的任何引用均包含了互补链。
SEQ ID NO: 1和2是用于PCR扩增阿维链霉菌(S. averm^fc) SX4r基因的PCR引物。
SEQ ID NO: 3和4分别显示了天然阿维链霉菌的BAAT cDNA和 蛋白序列。
SEQ ID NO: 5和6分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和 蛋白序列，在本文中称为BAAT1。该蛋白与天然序列相比包含S24T 突变。
SEQ ID NO: 7和8分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA和 蛋白序列，在本文中称为BAATlb。该蛋白与天然序列相比包含T83A、 S314T和E348G突变。SEQ ID NO: 9和10分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA禾口 蛋白序列，在本文中称为BAAT2。该蛋白与天然序列相比包含S24T 和F113L突变。
SEQ ID NO: 11和12分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA 和蛋白序列，在本文中称为BAAT3。该蛋白与天然序列相比包含了 S24T、 F113L和A133T突变。
SEQ ID NO: 13和14分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA 和蛋白序列，在本文中称为BAATP3H。该蛋白与天然序列相比包含 P3H突变。
SEQ ID NO: 15显示了用于将P3H突变导入到BAAT2和BAAT3
突变体中的引物。
SEQ ID NO: 16和17分别显示了突变阿维链霉菌的BAAT cDNA 和蛋白序列，在本文中称为BAAT3ML。该蛋白与天然序列相比包含 P3H、 S24T、 F113L和A133T突变。
SEQ ID NO: 18禾Q 19分别显示了突变的阿维链霉菌的BAAT cDNA和蛋白序列，在本文中称为BAAT5-9。该蛋白与天然序列相比 包含P3H、 S24T、 D110N、 Fl 13L和A133T突变。该核酸序列还包含 沉默突变c207t、 c381g和t471c。
SEQ ID NO: 20和21分别显示了铜绿假单胞菌(Pse^tomomw awwg&oM)的3-HP脱氢酶的cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO: 22和23分别显示了粪产碱杆菌"/^//^"^/"^0/&) M3A的3-HP脱氢酶cDNA和蛋白序列。SEQ ID NO: 24和25显示了用于克隆恶臭假单胞菌(尸.；^"^) 的3-HP脱氢酶的扩增引物。
SEQ ID NO: 26和27分别显示了恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶 cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO: 28显示了用于将突变导入SEQ ID NO: 26显示的恶臭 假单胞菌的3-HP脱氢酶中的引物。
SEQ ID NO: 29是突变的恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶cDNA序列， 它没有改变SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。
SEQ ID NO: 30和31分别显示了大肠杆菌(五.co//)的ydfG cDNA 和蛋白序列。
SEQ ID NO: 32和33是用于将SEQ ID NO: 30克隆到pET28b载
体中的引物。
SEQ ID NO: 34和35分别为用于克隆丙酮丁醇梭菌(C. ac"o^MZc騰)的天冬氨酸脱羧酶的正向和反向引物。
SEQ ID NO: 36和37分别为用于克隆阿维链霉菌的天冬氨酸脱羧 酶的正向和反向引物。
SEQ ID NO: 38和39分别显示了丙酮丁醇梭菌的天冬氨酸脱羧酶 的cDNA和蛋白序列。
SEQ ID NO: 40和41分别显示了阿维链霉菌的天冬氨酸脱羧酶的 cDNA和蛋白序列。SEQ ID NO: 42和43分别为正向和反向引物，用于扩增质粒pKD4 的旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标记以供; ox^基因在大肠杆菌中的插 入性缺失。
SEQ ID NO: 44和45分别是用于证实旁侧带有FRT的卡那霉素抗 性标记插入到pox5基因中的正向和反向引物。
SEQ ID NO: 46和47分别是正向和反向引物，用于扩增pKDprom 上的旁侧带有FRT的氯霉素抗性标记和P^^启动子以插入到大肠杆 菌中ppc基因的上游。
SEQ ID NO: 48和49是用于扩增pKDprom上旁侧带有FRT的氯
霉素抗性标记和P,ac/ara启动子以插入到大肠杆菌a印C基因上游的引物。
SEQ ID NO: 50和51分别为正向和反向引物，用于扩增pKD3上 旁侧带有FRT的氯霉素抗性标记以插入到大肠杆菌g/"基因的上游中 以降低柠檬酸合成酶的表达。
SEQ ID NO: 52是在转化的弱化菌株中获得的修饰的g/"基因座 (KDg/")和核苷酸序列。改变的核苷酸序列位于57-138位，翻译在 138bp处开始。
SEQ ID NO: 53-55是用于测试修饰的g/"位点的完整性的引物。
SEQ ID NO: 56和57分别是正向和反向引物，用于从质粒pKD4 扩增旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标记，以供a^F/Z基因在大肠杆菌 中的插入性缺失。
SEQ ID NO: 58和59是用于证实旁侧带有FRT的卡那霉素抗性标 记插入到《^F//基因中的引物。详细描述
縮写和术语
为了更好地描述本公开并在本公开的实践中对本技术领域的普通 技术人员进行指导，提供了下面的对术语和方法的解释。本文中使用
的"包含"意味着"包括"，单数形式"a"或"an"或"the"包括复 数的指称，除非上下文另有明确指示。例如指称"包含细胞"包括了 一种或多种这样的细胞，指称"包含BAAT酶(comprising the BAAT enzyme)"包括指称一种或多种BAAT酶及其本技术领域的专业人员 已知的等价物，等等。术语"或者"是指所陈述的可选要素中的单个 要素或两个或多个要素的组合，除非上下文另有明确指示。例如，词 组"醇脱氢酶活性或醛脱氢酶活性"是指醇脱氢酶活性、醛脱氢酶、 或醇脱氢酶活性和醛脱氢酶活性的组合。
除非有另外的解释，本文中使用的所有技术和科学术语的意义都 与本公开所属的技术领域中的普通专业人员通常理解的相同。尽管与 本文描述的相似或等价的方法和材料可用于本公开的实践或检验中， 但适合的方法和材料描述在下面。所述材料、方法和实施例仅仅是说 明性的，而不意味着限制。从下面的详细描述和权利要求书中，本公 开的其它特点和优点将变得显见。
3-HP: 3-羟基丙酸
BAAT: 13-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶
adhE:编码醇脱氢酶(EC l丄l.l)的基因。也包括使用NAD+作 为电子受体催化伯或仲醇向醛的可逆氧化的蛋白醇脱氢酶。adhE的核 酸和蛋白序列可以公开获得。例如，GenBank登记号No: M33504、 AF093749、 AB008676和CP000255公开了 adhE的核酸序列，GenBank 登记号No: AAA2342、 AAC78120、 BAA77747和ABD21317公开了 adhE的蛋白序列。鄉FH:编码偶联FoFrATP合成酶的F！和组分的两个蛋白的基 因(atpF和atpH)。也包括该基因所编码的蛋白。atpFH的核酸和蛋 白序列可以公开获得。例如，GenBank登记号No: AB206839、 AF522463 、 NC000913、 AE009952和CR931997公开了 atpFH的核酸序列。
抗体含有与抗原(例如BAAT酶或其片段)特异性结合(发生 免疫反应)的抗原结合位点的分子。例子包括多克隆抗体、单克隆抗 体、人源化单克隆抗体，或其免疫有效的部分。包括免疫球蛋白分子 及其免疫活性部分。
针对本文公开的任何多肽的单克隆抗体可以从鼠类杂交瘤按照 Kohler & Milstein的经典方法(7Va&re 256:495, 1975)或其衍生方法来制备。
所含有的抗体针对本文公开的任何多肽的异源表位的多克隆抗血 清，可以通过用多肽(或其片段、融合物或变异体)免疫适当的动物 来制备，这些多肽可以是未修饰的或被修饰以增强免疫原性。对兔子 的有效免疫方案可以在Vaitukaitis等(丄C/zVz. ￡mfocn>zo/. Meto6. 33:988-91, 1971)中找到。
抗体片段可用于代替完整抗体，并且可以容易地在原核宿主细胞 中表达。制造和使用单克隆抗体的免疫有效部分、也称为"抗体片段" 的方法是众所周知的，包括在Better & Horowitz (MeAoc^ ￡wz_ymo/. 178:476-96, 1989)、 Glockshuber等(5/oc/zew/^7 29:1362-7, 1990)、美国 专利No. 5,648,237 (功能性抗体片段的表达，"Expression of Functional Antibody Fragments")、美国专利No. 4,946,778 (单多肽链结合分子， "Single Polypeptide Chain Binding Molecules")、美国专利No. 5,455,030 (使用单链多肽结合分子的免疫疗法，"Immunotherapy Using Single Chain Polypeptide Binding Molecules")、以及其中引用的参考文献中描 述的方法。可以生产针对BAAT肽(例如SEQ IDNO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19或其免疫性片段)的抗体。适合用作免疫原的基本上纯的多肽 可以从转染细胞、转化细胞或野生型细胞获得。最佳情况下，针对肽 抗原上的一个或多个表位产生的抗体将特异性检测该肽。也就是说， 针对一种特定多肽产生的抗体将识别和结合该特定多肽，而基本上不 识别或结合其它多肽。抗体与特定多肽特异性结合的测定可以通过许 多标准免疫分析方法中的任何一种来进行；例如Western印迹法。
"特异性结合"是指特定剂("特异性结合剂")与特定分析物 发生特异性反应的能力，例如与抗体发生特异性免疫反应，或与特定 肽序列发生特异性结合。结合是例如抗体分子和抗原决定簇之间的非 随机结合反应。抗体的结合特异性通常是由抗体与特异性抗原和无关 抗原的差异结合能力的参照点来确定，从而区别两种不同的抗原，特 别是当这两种抗原具有独特的表位时。与特定表位特异性结合的抗体 被称为"特异性抗体"。
(3-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT):能够在例如细胞中将 卩-丙氨酸转化成丙二酰半醛的酶。包括来自任何生物体例如原核生物的 任何BAAT基因、cDNA、 RNA或蛋白。在具体的例子中，BAAT核 酸序列包括SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16和18显示的核酸序 列、以及其保留了编码具有BAAT活性蛋白的能力的片段、变异体或 融合物，或由以上所述组成。在另一个例子中，BAAT蛋白包括SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19中显示的氨基酸序列、以及其保 留了BAAT活性的片段、融合物或变异体，或由以上所述组成。该描 述包括BAAT等位基因变异体，以及保留了将P-丙氨酸转化成丙二酰 半醛的能力的任何变异体、片段或融合序列。
BAAT的氨基酸序列包括全长序列，例如SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19，以及保留了将p-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力的较短的序列或变异体。能够对BAAT氨基酸序列做出并保留了所
需生物活性的具体取代的例子包括但不限于SEQIDNO:4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19中的V53L、 R104K、 L200I、 T312S、 A400S、 W411Y 或其组合。示例性片段包括SEQIDNO:4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或 19中的1-150、 1-140、 1-200、 1-250、 1-300、 1-350或1-400位氨基酸。
BAAT活性BAAT酶将p-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。在 一个实施例中，这样的活性出现在细胞中。在另一个实施例中，这样 的活性出现在体外。这种活性可以使用本技术领域任何已知的分析方 法来测量。例如，BAAT活性可以通过将酶与p-丙氨酸和a-酮戊二酸 进行温育，并通过高效液相色谱(例如使用Abe等/ C/2r0matogm; /^ 5， 712:43-9， 1998中的方法)测定反应产物(例如丙二酰半醛和谷氨酸) 来鉴定。在具体的实施例中，BAAT活性可以通过在BAAT的存在下， 使用Purpald⑧分析(参见实施例1)测量(3-丙氨酸产生的丙二酰半醛 来测定。在具体的实施例中，BAAT活性可以通过在BAAT和3-HP脱 氢酶的存在下，使用LC/MS (参见实施例8)测量从(3-丙氨酸和丙二 酰半醛中间体产生的3-HP来测定。
在具体的实施例中，如果酶对(3-丙氨酸的比活为至少0.3 U/mg(其 中的U是1 pmol/min)(例如使用在实施例4中描述的方法)、例如 至少1.5 U/mg、至少2 U/mg、至少2.5 U/mg或至少3 U/mg，该酶被称 为具有BAAT活性。
cDNA (互补性DNA): —段缺少内部非编码区段(内含子)和 决定转录的调控序列的DNA。 cDNA可以通过逆转录从细胞提取的信 使RNA来合成。
保守取代 一个或多个氨基酸取代(例如1、 2、 5、 10或15个氨
基酸残基)具有相似生化性质的氨基酸残基。通常，保守取代对所得 肽的活性影响很小或没有。例如，在BAAT肽中的保守取代基本上不影响该肽将P-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。在具体的实施例中，
保守取代是BAAT肽中的氨基酸取代，例如SEQIDNO:4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19中的保守取代，它们没有明显降低(例如降低不超过 20%、例如不超过10%)蛋白将P-丙氨酸转化成丙二酰半醛或其它下 游产物例如3-HP的能力。
丙氨酸扫描可用于鉴定肽中可以耐受取代的氨基酸残基。在一个 实施例中，当丙氨酸或其它保守氨基酸(例如上面列出的那些)取代 了一个或多个天然氨基酸时，活性的变化不超过25%，例如不超过20%、 例如不超过10%。
在具体的实施例中，如果天然BAAT (例如SEQIDNO:4)的情 况下产生的丙二酰半醛的量相比，所产生的丙二酰半醛的量比起含有 一个或多个保守氨基酸取代的BAAT的情况下所产生的丙二酰半醛的 量而言，减少不超过大约25%、例如不超过大约10%,则BAAT活性 基本上没有改变。
可以通过使用例如标准的方法例如位点定向诱变或PCR来操作编 码肽的核苷酸序列，来产生含有一个或多个保守取代的肽。或者，也 可以使用标准的肽合成方法来产生含有一个或多个保守取代的肽。
取代变异体是氨基酸序列中至少一个残基已经被移除、并在其位 置中插入了不同的残基的变异体。可以取代蛋白中的原始氨基酸并被 当作保守取代的氨基酸的例子包括Ser取代Ala; Lys取代Arg; Gln 或His取代Asn; Glu取代Asp; Ser取代Cys; Asn取代Gin; Asp取 代Glu; Pro取代Gly; Asn或Gin取代His; Leu或Val取代lie; lie 或Val取代Leu; Arg或Gin取代Lys; Leu或He取代Met; Met、 Leu 或Tyr取代Phe; Thr取代Ser; Ser取代Thr; Tyr取代Trp; Trp或Phe 取代Tyr;以及Ile或Leu取代Val。关于保守取代的进一步特别是信息可以在Ben-Bassat等， 5a"er/。/. 169:751-7， 1987) 、 O'Regan等，(G潔77:237-51, 1989)、 Sahin誦Toth 等，(/Vo&/" Sc/. 3:240-7， 1994 ) 、 Hochuli等， 6:1321-5, 1988) 、 WO 00/67796 (Curd等)以及遗传 学和分子生物学的标准教科书中发现。
缺失从核酸分子中除去一个或多个核苷酸，或从蛋白中除去一 个或多个氨基酸，将两边的区域连接到一起。
可检测的能够确定存在或出现。例如，如果从丙二酰半醛或3-HP 分别产生的信号强得足以被测量，那么从p-丙氨酸生产的丙二酰半醛
或从(3-丙氨酸生产的3-HP是可检测的。
DNA:脱氧核糖核酸。DNA是长链聚合物，包含大多数活生物体 的遗传物质(某些病毒的基因包含核糖核酸RNA) 。 DNA聚合物中的 重复单位是四种不同的核苷酸，每种含有四种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、 胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，碱基与连有磷酸基团的脱氧核糖相连。 DNA分子中被称为密码子的核苷酸三联体编码肽中的氨基酸。术语密 码子也用于DNA序列转录成的mRNA中三个核苷酸的相应(和互补 的)序列。
增强或增加改善某种事物的质量、数量或强度。
在一个实施例中，突变的BAAT酶、例如SEQ ID NO: 4的变异体， 如果该酶的活性相对于天然BAAT酶(例如SEQ ID NO: 4)的活性增 加，则增强了 BAAT酶的活性。在具体的实施例中，突变的BAAT酶
(例如SEQ IDNO: 5、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19)具有的将卩-丙氨 酸转化为丙二酰半醛的能力增加，例如增加了至少10%、至少20%、 至少50%、至少100%或甚至至少200%。例如，外源突变体BAAT酶
(例如SEQ IDNO: 5、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19)在细胞中的表达，可以增加下游产物例如丙二酰半醛、3-HP或其衍生物的生产(如果细 胞表达其它适合的酶)。这种增强可以使用本文公开的方法来测量， 例如使用在下面的实施例(例如实施例l和8)中公开的方法，在突变
体BAAT酶的存在下测定产生的丙二酰半醛或3-HP的量。
外源的当在本文中用于指称核酸分子和特定细胞时，是指任何
不源自于在自然界中发现的该特定细胞的核酸分子。因此，非天然存 在的核酸分子一旦被导入到细胞中，就被认为对于细胞来说是外源的。 天然存在的核酸分子对于特定的细胞来说也可能是外源的。例如，从
细胞X分离的完整编码序列， 一旦该编码序列被导入到细胞Y中，则 对于细胞Y来说就是外源核酸，即使X和Y是同样的细胞类型。
表达通过其将基因的编码信息转变成细胞的结构和功能、例如 蛋白、转运RNA或核糖体RNA的过程。被表达的基因包括被转录成 mRNA然后翻译成蛋白的基因，以及被转录成RNA但是没有被翻译成 蛋白(例如转运和核糖体RNA)的基因。
功能性缺失对基因序列进行的突变、部分或完全缺失、插入或 其它变异，降低或抑制了基因产物的产生，或使得基因产物没有功能。 例如，大肠杆菌中poxB的功能性缺失减少了由poxB基因编码的丙酮 酸氧化酶产生的乙酸。在另一个实施例中，大肠杆菌中W/^i/的功能 性缺失减少了通过FeFi复合体的质子传递产生的ATP。
功能上等价的具有相似的功能，例如序列变异体、片段或融合 物具有与天然序列相似功能的能力。在某些实施例中，功能等价物甚 至具有比天然序列更高的生物学活性。例如，BAAT的功能等价分子包 括了那些保留了 BAAT的功能、即将P-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能 力的分子。例如，功能等价物可以通过在BAAT中进行序列变更来提 供，其中具有一个或多个序列变更的肽(例如SEQIDNO:6、 8、 10、 12、 14、 17、 19)保留了未改变的肽(例如SEQ ID NO: 4)的功能，使得它保留了其将p-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力。
序列变更的例子包括但不限于保守取代、缺失、突变、移码和插 入。在一个实施例中，给定的肽与抗体结合，而功能等价物是与同样 的抗体结合的肽。因此，功能等价物包括与肽具有同样的结合特异性、 并且能够用作代替肽的试剂(例如在丙二酰半醛、3-HP及其衍生物的 生产中)的肽。在一个实施例中，功能等价物包括其中结合序列是不 连续的、其中抗体结合线性表位的肽。因此，如果肽序列是
MTPQPNPQVG (SEQ ID NO: 4的l-10位氨基酸)，功能等价物包括 不连续的表位，它可以表现如下(**=任何数量的居间氨基酸)NH2 _**_M**T**P**Q**P**N**P**Q**V**G-COOH。在该例子中，如果肽 的三维结构使得它能够结合与SEQ ID NO:4的l-10位氨基酸结合的单 克隆抗体，那么该肽与SEQIDNO:4的1-10位氨基酸在功能上等价。
杂交互补的单链DNA或RNA形成双链体分子的能力。在某些 例子中，杂交被用于确定两个或多个核苷酸序列之间的互补性。核酸 杂交技术可在本公开范围内用于获得分离的核酸。简单来说，任何与 BAAT核酸分子具有一定同源性的核酸分子(例如与SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18或其变异体或片段同源)都可以用作探针，用 于在中度到高度严紧的条件下通过杂交鉴定相似的核酸分子。 一旦鉴 定后，可以将核酸纯化、测序并分析，以确定它是否是具有BAAT活 性的BAAT。
杂交可以通过Southern或Northern分析来进行，以分别鉴定与探 针杂交的DNA或RNA序列。探针可以用例如生物素、荧光团、洋地 黄毒甙、酶或放射性同位素例如"P进行标记。待分析的DNA或RNA 可以在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，转移到硝酸纤维素、尼 龙或其它适合的膜上，并使用本技术领域众所周知的标准技术与探针 杂交，这些技术例如在Sambrook等(1989)的《分子克隆》(第二版) (Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory,Plainview,NY.)的7.39-7.52节中描述。通常，探针的长度为至少大约 20个核苷酸。例如，含有BAAT核酸序列的20个连续核苷酸(例如 SEQIDNO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的20个连续核苷酸)的探 针，可用于鉴定相同的或类似的核酸。此外，长于或短于20个核苷酸 的探针也可以使用。
本公开还提供了分离的核酸序列，其长度为至少大约12个核苷酸 (例如长度为至少大约13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 25、 30、 40、 50、 60、 100、 250、 500、 750、 1000、 1400、 2000、 3000、 4000 或5000个核苷酸)，并且在中度或高度严紧杂交条件下与BAAT核酸 序列、例如SEQIDNO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的正义或反义 链杂交。
中度严紧杂交条件是在大约42°C下、在含有25 mM KP04 (pH 7.4)、 5XSSC、 5XDenhart's溶液、50 ng/mL变性和超声过的鲑鱼精子 DNA、 50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖和1-15 ng/mL探针(大约5xl07 cpm/pg)的杂交溶液中进行杂交，同时在大约50°C下、用含有2X SSC 和0.1%十二垸基硫酸钠的清洗溶液进行清洗。
高度严紧杂交条件是在大约42°C下、在含有25 mM KP04 (pH 7.4)、 5X SSC、 5X Denhart's溶液、50 ^g/mL变性和超声过的鲑鱼精子 DNA、 50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖和1-15 ng/mL探针(大约5xl07 cpm/[ig)的杂交溶液中进行杂交，同时在大约65°C下、用含有0.2X SSC 和0.1%十二垸基硫酸钠的清洗溶液进行清洗。
分离的"分离的"生物成分(例如核酸分子、蛋白或细胞)已 经与该成分所天然存在中的其它生物成分，例如其它染色体和染色体 外DNA和RNA以及蛋白，基本上分开或纯化出来。已经被"分离的" 核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术 语也包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。
在一个例子中，分离的是指天然存在的核酸分子，其没有与在它 所源自的生物体的天然存在的基因组中与它直接邻接的两个序列(一 个在5'末端，另一个在3'末端)直接毗邻。例如而非限制性的，分离
的核酸分子可以是任何长度的重组DNA分子，只要在天然存在的基因 组中通常发现的直接在该重组DNA分子旁侧的核酸序列之一被移除了 或不存在即可。因此，分离的核酸分子包括但不限于独立于其它序列 作为分离的分子存在的重组DNA(例如，通过PCR或限制性内切酶处 理产生的cDNA或基因组DNA片段)，以及被掺入到载体、自主复制 的质粒、病毒(例如反转录病毒、腺病毒或疱疹病毒)或者原核或真 核生物的基因组DNA中的重组DNA。此外，分离的核酸可以包括作 为杂交或融合核酸序列的一部分的重组DNA分子。
在一个实施例中，术语"分离的"当用于指称核酸分子时，也包 括任何非天然存在的核酸分子，因为非天然存在的核酸序列在自然界 中没有发现，并且不具有天然存在的基因组中直接邻接的序列。例如， 非天然存在的核酸分子例如工程化的核酸分子被认为是分离的核酸分 子。工程化的核酸分子可以使用常用的分子克隆或化学核酸合成技术 来制造。分离的非天然存在的核酸分子可以独立于其它序列，或掺入 到载体、自主复制的质粒、病毒(例如反转录病毒、腺病毒或疱疹病 毒)或者原核或真核生物的基因组DNA中。此外，非天然存在的核酸 分子可以包括作为杂交或融合核酸序列的一部分的核酸分子。
核酸分子包含RNA和DNA二者，包括但不限于cDNA、基因 组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如化学合成或重组产生的 核酸分子。核酸分子可以是双链的或单链的。当是单链的时，核酸分 子可以是正义链或反义链。此外，核酸分子可以是环形的或线性的。
可操作连接当第一个核酸序列放置得与第二个核酸序列功能相关时，第一个核酸序列与第二个核酸序列可操作连接。例如，如果启 动子影响编码序列(例如BAAT编码序列)的转录或表达，则启动子
与编码序列可操作连接。 一般来说，可操作连接的DNA序列是相连的， 并且当需要连接两个蛋白编码区时，处于相同的阅读框中。以串联的 方式作为单个信使RNA转录的分离基因的构型被命名为操纵子。因此， 将基因紧密相邻放置在例如质粒载体中，置于单一启动子的转录调控 之下，构成了合成操纵子。
ORF (开放阅读框)不含有任何终止密码子的一系列编码氨基 酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以翻译成肽。
肽修饰本公开提供了新的肽(例如新的BAAT、天冬氨酸脱羧 酶和3-HP脱氢酶)以及合成实施方案。此外，具有丙氨酸2,3-氨基变 位酶活性的类似物(非肽有机分子)、衍生物(从所公开的肽序列起 始获得的化学功能化的肽分子)以及变异体(同源物)也可以用于本 文公开的方法。本文公开的肽包含的氨基酸列，可以是L-或D-氨基酸， 天然存在和其它。
肽可以通过各种化学技术进行修饰，以产生与未修饰的肽具有基 本上相同的活性、并任选具有其它所需性质的衍生物。例如，蛋白的 羧酸基团，不论是羧基末端或侧链，都可以提供成可药用的阳离子盐 的形式，或酯化形成CVd6酉旨，或转化成具有式NI^R2的酰胺、其中 R,和R2各自独立地是H或d-d6垸基，或合并形成杂环、例如5或6 员环。肽的氨基基团，不论是氨基末端或侧链，都可以是可药用的酸 加成盐的形式，例如HC1、 HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、 酒石酸和其它有机酸盐，或者可以被修饰成d-d6烷基或二烷基氨基，
或进一步转化成酰胺。
肽侧链的羟基基团可以使用公认的技术转化成CVd6烷氧基或转 化成Q-C,6酯。肽侧链的苯基和苯酚环可以被一个或多个卤素原子例如F、 Cl、 Br或I、或被CpQ6垸基、Q-q6烷氧基、羧酸及其酯、或 这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基基团可以被延伸成同源的C2-C4 亚烷基。巯醇可以用许多公认的保护基团中的任何一种、例如乙酰胺 基团来保护。本技术领域的专业人员也将认识到将环状结构导入本公 开的肽的方法，以选择和提供对结构的构象限制，产生增强的稳定性。 例如，可以给肽加上C-或N-末端半胱氨酸，以便当氧化时肽将含有二 硫键，产生环形的肽。其它的肽环化方法包括形成硫醚以及羧基和氨 基末端的酰胺和酯。
肽模拟和有机模拟实施方案也在本公开的范围内，藉此这些肽模 拟物和有机模拟物的化学组成成分的三维排列模拟了肽骨架和组分氨 基酸侧链的三维排列，导致本发明的蛋白的这些肽模拟物和有机模拟 物具有可检测的丙氨酸2，3-氨基变位酶活性。对于计算机模拟应用来 说，药效团是生物活性的结构要求的理想化的三维定义。肽模拟物和 有机模拟物可以被设计成用当前的计算机模拟软件拟合每个药效团 (使用计算机辅助药物设计或CADD)。对于在CADD中所使用的技 术的描述，参见在Klegerman & Groves主编的《药物生物技术》165-174 页中Walters的"药物的计算机辅助模拟"("Computer-Assisted Modeling of Drugs", /" Klegerman & Groves, eds., 1993, P/wrmacew〃ca/ 5/o"c/mo/ogy， Interpharm Press: Buffalo Grove， IL, pp. 165-174) 以及 Munson主编的《药理原理》第102章(/V/"">/m o/ Munson (ed.) 1995, Ch. 102)。
POXB:编码丙酮酸氧化酶的基因。也包括将丙酮酸代谢成乙酸和
C02的丙酮酸氧化酶蛋白。poxB主要表达在应激培养下或在好氧条件 下的稳定期表达。poxB核酸和蛋白序列可公开获得。例如，GenBank 登记号No: AE009952、 AX537387、 M28208和CR931997公开了 poxB 的核酸序列，GenBank登记号No: AAM86372、CAD57486、 AAB59101 和CAI36877公开了 poxB的蛋白序列。启动子一系列指导核酸分子的转录的核酸控制序列。启动子包 括靠近转录起始位点的必需核酸序列，例如在聚合酶II类型启动子情 况下的TATA元件。启动子也任选包含远处的增强子或阻遏子元件， 它们可以位于距转录起始位点多达几千碱基对的位置。
该术语包括内源启动子序列以及外源启动子序列(例如导入到染
色体中以启动基因例如BAAT表达的启动子)。可以用于实践本文公
开的方法的具体启动子类型包括但不限于组成型启动子和诱导型启动 子(例如响应或不响应特定刺激的启动子，例如光、氧、或化学浓度
例如乳糖、IPTG、阿拉伯糖或四环素诱导的启动子)
纯化的术语纯化的不要求绝对纯度；相反，它准备用作相对术 语。因此，例如，纯化的肽制备物(例如BAAT肽制备物)是其中的 肽比肽在其细胞内的环境中更加富集、使得肽与可能伴随它的细胞成 分(核酸、脂类、碳水化合物和其它肽)基本上分离开的制备物。在 另一个实施例中，纯化的肽制备物是其中的肽基本上不含污染物，例 如在肽的化学合成后可能存在的那些污染物的制备物。
在一个实施例中，当样品重量的至少大约50%由肽构成时，例如 当样品的至少大约60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 92%、 95%、 98%或 99%或更多由肽构成时，肽是纯化的。可用于纯化肽的方法的例子包括 但不限于在Sambrook等公开的方法(《分子克隆实验室手册》第17 章(Mo/ecw/or C7om'w 丄a6or齒z-y Mwwa/, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17)。蛋白纯度的测定可以通过例如蛋白样品的聚丙烯 酰胺凝胶电泳、然后在对聚丙烯酰胺凝胶染色后观察单一的肽条带； 高压液相色谱；测序或其它常规方法。
重组重组核酸分子或蛋白是具有不是天然存在的序列、具有通 过将两个原本分开的序列片段进行人工组合而制造的序列、或这二者。 该人工组合可以通过例如化学合成、或通过对核酸分子或蛋白的分离片段进行人工操作、例如遗传工程技术来实现。重组也用于描述已经 被人工操作过、但含有与从中分离到核酸的生物体中发现的相同调控 序列和编码区的核酸分子。
序列同一性/相似性两个或多个核酸序列、或两个或多个氨基酸 序列之间的同 一性/相似性，根据序列之间的同 一性或相似性来表示。 序列同一性可以根据百分同一性来度量；百分率越高，序列越一致。
序列相似性可以根据百分相似性来度量(其中考虑了保守氨基酸取 代)；百分率越高，序列越相似。核酸或氨基酸序列的同源物或直系 同源物当使用标准方法进行比对时，具有相对高度的序列同一性/相似 性。
对序列比对以进行比较的方法在本技术领域是众所周知的。各种
不同的程序和比对算法描述于Smith & Waterman, Jdv.々 p/. Ma仇 2:482， 1981; Needl函n & Wunsch, /. Mo/. B/o/. 48:443， 1970; Pearson & Lipman, /Voc. A^a〃.爿cac/. f/SJ 85:2444, 1988; Higgins & Sharp, G潔，73:237-44, 1988; Higgins & Sharp, C4B鹿5:151-3, 1989; Corpet 等，TVwd"W"es. 16:10881-卯，1988; Huang等.Com/ 她";^. & 5/維Z匿m 8， 155-65, 1992;以及Pearson等，Me仇Mo/.版24:307-31, 1994。 Altschul等，J Mo/. 215:403-10, 1990,提出了对序列比对方 法和同源性计算的详细考虑。
NCBI的基本本地比对搜索工具(NCBI Basic Local Alignment Search Tool ， BLAST) (Altschul等，Mo/.脂.215:403-10， 1990) 可以从几个来源获得，包括国立生物信息中心(NCBI, National Library of Medicine, Building 38A, Room 8N805, Bethesda, MD 20894)以及在因 特网上，与序列分析程序blastp、 blastn、 blastx、 tblastn和tblastx结合 使用。其它的信息可以在NCBI网点上发现。
BLASTN被用于比较核酸序列，而BLASTP被用于比较氨基酸序列。对于两个核酸序列的比较，选项可以设置如下-i被设置为含有要
比较的第一个核酸序列的文件(例如C:\seql.txt) ; -j被设置为含有要 比较的第二个核酸序列的文件(例如C:\seq2.txt) ; -p被设置为blastn; -o被设置为任何所需文件名(例如C:\output.txt) ; -q被设置为-1; -r 被设置为2;所有其它选项保留在它们的缺省设置。例如，下面的命令 可用于产生含有两个序列间对比的输出文件C:\B12seq-i c:\seql.txt-j c:\seq2.txt _p blastn —o c:\output.txt —q -l —r 2。
对于两个氨基酸序列的比较，B12seq的选项可以设置如下-i被 设置为含有要比较的第一个氨基酸序列的文件(例如C:\seql.txt) ; -j 被设置为含有要比较的第二个氨基酸序列的文件(例如C:\seq2.txt); -p被设置为blastp; -o被设置为任何所需文件名(例如C:\output.txt); 所有其它选项保留在它们的缺省设置。例如，下面的命令可用于产生 含有两个氨基酸序列间对比的输出文件C:\B12seq -i c:\seql.txt -j cAs叫2.txt —p blastp -o c:\output.txt。如果两个被比较的序列具有同源 性，那么指定的输出文件将会将那些同源的区域显示为比对序列。如 果两个被比较的序列不具有同源性，那么指定的输出文件将不显示比 对的序列。
比对后，通过对两个序列中出现同样的核苷酸或氨基酸残基的位 置数量进行计数，来确定匹配的数量。用匹配的数量除以被鉴定的序 列显示的序列长度、或除以分节的长度(例如来自被鉴定的序列显示 的序列中的100个连续核苷酸或氨基酸残基)，然后将得到的值乘以 100，就确定了百分序列同一性。例如， 一个核酸序列，当与具有1554 个核苷酸的测试序列比对时有U66个匹配，则与测试序列有75.0百分 同一性(1166+1554*100=75.0)。序列的百分同一性值被四舍五入到小 数点后一位。例如，75.11、 75.12、 75.13和75.14被四舍五入到75.1 ， 而75.15、 75.16、 75.17、 75.18和75.19被四舍五入到75.2。长度值总 是整数。在另一个实施例中，靶序列含有20个核苷酸的区域，该区域 与来自下面被鉴定序列的20个连续核苷酸进行比对，则该靶序列含有与被鉴定的序列具有75百分同一性的区域(即15+20*100=75)。
1 20耙序歹U: ATGACCCATCAGCCGAATCC
被鉴定的序列 ACG AGCC AAC AGCGGAATGC
对于大于大约30个氨基酸的氨基酸序列的比较来说，利用Blast 2序列功能，使用缺省BLOSUM62矩阵设置为缺省参数(间隙存在价值为ll，每个残基间隙价值为1)。同源物的典型特征为，使用NCBIBasicBlast 2.0、带数据库例如nr或swissprot数据库的间隙blastp，在与氨基酸序列的全长比对范围内计算，具有至少大约70%的序列同一性。用blastn程序搜索的査询使用DUST (Hancock和Armstrong, 1994，Co，f.柳/.10:67-70)进行过滤。其它程序使用SEG。此夕卜，可以进行手动比对。当通过该方法评估时，具有更高相似性的蛋白将显示出增加的百分同一性，例如与SEQ IDNO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、17或19中任何一个具有至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少97%或至少99%的序列同一性。
当对短肽(少于大约30个氨基酸)进行比对时，应该使用Blast2序列功能进行比对，使用设置为缺省参数的PAM30矩阵(开口间隙罚分为9，延伸间隙罚分为l)。当使用该方法评估时，与参比序列具有更高相似性的蛋白将显示出增加的百分同一性，例如至少60%、 70%、75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%、 99%的序列同一性。当比较小于完整序列的序列同一性时，同源物典型地在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少75%的序列同一性，并根据它们与参比序列的同一性，可以具有至少85%、 90%、 95%或98%的序列同一性。在这样的短窗口中确定序列同一性的方法在NCBI网点上有描述。
两种核酸分子密切相关的一个指示是这两种分子在严紧条件下彼此杂交。严紧条件是序列依赖性的，在不同环境参数下不同。通常，
在严紧条件下与BAAT基因序列杂交的核酸分子，在上述的条件下分 别与基于完整BAAT基因或该基因的选定部分的探针杂交。
由于遗传密码的简并性，没有显示出高度同一性的核酸序列仍然 可以编码一致的或相似的(保守的)氨基酸序列。使用这种简并性可 以对核酸序列进行改变，以产生都编码基本上相同蛋白的多种核酸分 子。通过这种方法测定，这样的同源核酸序列可以具有例如与SEQID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18中任何一个至少60%、至少70%、 至少80°/。、至少卯％、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。
本技术领域的专业人员将会认识到，这些序列同一性的范围仅仅 被提供作为指导；有可能获得在提供的范围之外的非常显著的同源物。
两种核酸序列基本上一致的备选(不一定是累积性)指示是第一 种核酸编码的肽与第二种核酸编码的肽发生交叉免疫反应。
特异性结合剂基本上只与确定的靶例如肽靶结合的剂。例如， BAAT结合试剂包括抗BAAT抗体以及其它基本上只与BAAT蛋白结 合的剂(例如肽或药物)。针对BAAT蛋白(或其片段)的抗体可用 于纯化或鉴定该蛋白。
转化细胞其中已经通过例如分子生物学技术导入了核酸分子、 例如BAAT核酸分子的细胞。转化包涵可以将核酸分子导入这样的细 胞的所有技术，包括但不限于用病毒载体转染、接合、用质粒载体转 化、以及通过电穿孔、脂转染和粒子枪加速导入裸露的DNA。
在足以…的条件下用于描述任何允许所需活性的任何环境的词组。在一个例子中，包括将细胞(例如细菌细胞)在足以允许所需活 性的生长培养基和温度下培养。在具体的实施例中，所需活性是细胞
生产(3-丙氨酸(或其下游产物，例如丙二酰半醛、3-HP或其衍生物)。
变异体、片段或融合物所公开的蛋白和核酸序列(例如BAAT、 天冬氨酸脱羧酶和3-HP脱氢酶)包括其保留所需生物活性的变异体、 片段和融合物。例如，编码BAAT蛋白(例如SEQIDNO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18)、融合的BAAT蛋白、或BAAT蛋白的片段或变异 体的DNA序列，其可以被工程化以允许蛋白在真核细胞、细菌、昆虫 或植物中表达。为了获得表达，DNA序列可以被改变并与其它调控序 列可操作连接。含有调控序列和蛋白的最终产物被称为载体。该载体 可以被导入到真核、细菌、昆虫或植物细胞中。 一旦进入细胞，载体 允许蛋白生产。
在一个实施例中，融合蛋白包含BAAT氨基酸序列(或其变异体 或片段)，例如SEQIDNO:4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19，它们与 其它不显著降低BAAT活性例如将p-丙氨酸转化为丙二酰半醛的能力 的氨基酸序列相连。在一个实施例中，其它氨基酸序列的长度不超过 大约10、 12、 15、 20、 25、 30或50个氨基酸，例如5-50个氨基酸。 此外，在BAAT序列和其它氨基酸序列之间可以放置间隔区序列。这 种间隔区可以为至少4个、至少6个或至少10个氨基酸，例如4-12 个氨基酸。
本技术领域的专业人员将会认识到，DNA序列可以以多种方式被 改变，而不影响所编码的蛋白的生物学活性。例如，可以使用PCR在 编码BAAT的DNA序列中产生变异。这样的变异体可以是对用于表达 蛋白的宿主细胞中的密码子偏好性进行最适化、或其它促进表达的序 列改变的变异体。
载体导入到细胞中时的核酸分子，进而产生转化细胞。载体可以包含允许它在细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体也可以 包含本技术领域已知的一种或多种选择性标记基因或其它遗传元件。
(3-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶序列
本公开提供了新的卩-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)蛋 白和编码这些蛋白的核酸序列。
歪^
本文公开了具有卩-丙氨酸/a-酮戊二酸氨基转移酶(BAAT)活性 的肽。使用几轮突变然后筛选丙二酰半酸的生产，在BAAT氨基酸序 列中鉴定到了几个突变能增加天然BAAT序列(SEQIDNO:4)的生 物学活性。这些取代包括P3H、 S24T、 D110N、 F113L和A133T，以 及它们的组合(取代的编号基于SEQIDNO:4)。
在例如表达外源BAAT的细胞中，BAAT肽具有将(3-丙氨酸转化 成丙二酰半醛的能力。在具体的实施例中，BAAT的生物学活性通过测 量酶的比活来确定(例如通过测量P-丙氨酸和a-酮戊二酸产生的L-谷 氨酸，参见实施例4)。在另一个实施例中，BAAT的生物学活性通过 测量酶对(3-丙氨酸的Km来确定(参见实施例4)。在具体的实施例中， 生物学活性增加的BAAT酶(例如变异体BAAT酶)是比活相对于天 然酶(例如SEQ ID NO: 4)增加了至少2倍的BAAT酶，例如增加了 至少3倍、至少5倍甚或至少10倍。在具体的实施例中，生物学活性 增加的BAAT酶(例如变异体BAAT酶)是比活为至少1.5 U/mg (其 中U是1 nmol/分钟)的BAAT酶，例如比活为至少2 U/mg、甚或比 活力为至少3U/mg。
所公开的BAAT肽可以与例如3-HP脱氢酶(例如SEQ ID NO: 21、 23、 27和31)组合用于生产3-HP (参见图1) 。 BAAT肽的具体例子 显示在SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19。 SEQ ID NO: 4 是天然的BAAT序列，而SEQ ID NO: 6、 8、 10、 12、 14、 17和19是BAAT生物学活性增加的变异体序列。
本公开还包涵SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19的保 留了BAAT生物学活性、甚或增加的BAAT活性的变异体、融合物和 片段。变异的BAAT肽序列可以通过使用标准的方法例如位点定向诱 变或PCR操控编码BAAT肽的核苷酸序列来产生。在具体的实施例中， SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19的变异体、融合物和片段 具有SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19的至少卯％的BAAT 活性，例如SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19的至少95%、 至少98%、至少100%甚或至少150%的BAAT活性。
在某些实施例中，BAAT肽包含与SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19至少80%的序列同一性(例如至少85%、至少卯％、至少 95%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性)，并包含P3H、 S24T、 D110N、 F113L或A133T取代，或其组合，并保留了BAAT活 性。例如，这样的序列可以包含P3H、 S24T、 D110N、 F113L或A133T 取代，S24T和F113L两种取代，S24T、 Fl 13L和A133T取代，P3H、 S24T、 F113L和A133T取代，或S24T、 Fl 13L和A133T取代，P3H、 S24T、 D110N、 F113L和A133T取代。本技术领域的专业人员将会认 识到提供BAAT活性的其它组合也是可能的。本公开也提供了编码这 些蛋白的核酸分子。
变异体包含一个或多个氨基酸的取代，例如一个或多个保守氨基 酸取代、 一个或多个非保守氨基酸取代、或其组合。变异体也包含一 个或多个氨基酸的缺失或插入(或其组合，例如单个缺失加上多个插 入)，例如不超过50个氨基酸、不超过20个氨基酸、不超过10个氨 基酸、不超过5个氨基酸、不超过2个氨基酸的添加或缺失，例如1-5 个氨基酸、1-10个氨基酸或2-20个氨基酸的添加或缺失。在具体的实 施例中，变异体BAAT序列包括与SEQIDNO:4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19中的任何一个至少80%的序列同一性，例如与SEQ ID NO: 4、6、 8、 10、 12、 14、 17和19至少85%、至少90%、至少95%、至少 97%、至少98%或至少99%的序列同一性，只要氨基酸序列编码的肽保 留BAAT活性即可。
非保守取代是其中氨基酸具有更显著差异的取代，例如它们对维 持下列的影响(a)取代的区域中多肽骨架的结构，例如是片层还是 螺旋构象；(b)耙位点处多肽的电荷或疏水性；或(C)侧链的体积。一
般情况下预期将在多肽的功能上产生最大变化的取代是下述取代，其
中(a)亲水性残基例如丝氨酸或苏氨酸，取代疏水性残基(或被疏水 性残基取代)，例如亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸；
(b) 半胱氨酸或脯氨酸取代任何其它残基(或被任何其它残基取代)；
(c) 具有正电侧链的残基例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸，取代负电残基 (或被负电残基取代)，例如谷氨酸或天冬氨酸；或(d)具有庞大侧链
的残基例如苯丙氨酸，取代不具有侧链的残基(或被不具有侧链的残 基取代)，例如甘氨酸。可以通过使用本文公开的分析方法分析肽催 化P-丙氨酸转化成丙二酰半醛的能力，来评估这些氨基酸取代(或其 它缺失或添加)对具有BAAT活性的肽的影响。理想情况下，非保守 氨基酸取代基本上不减少BAAT的生物学活性，甚至可以增加BAAT 的生物学活性(正如SEQ ID NO: 6、 8、 10、 12、 14、 17和19所证 实的那样)。
相反，保守取代是其中氨基酸具有相似的生物化学性质的取代。 在一个实施例中，BAAT序列在SEQ IDNO: 6、 8、 10、 12、 14、 17和 19任何一个中包含至少一个保守氨基酸取代，例如至少2个、至少3 个、至少4个、至少5个、至少6个、至少8个、至少9个、至少10 个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至 少16个、至少17个、至少18个、至少19个或至少20个保守氨基酸 取代，例如1-5、 1-10或1-20个保守氨基酸取代。可以做出、同时仍 保留BAAT活性的保守取代的具体例子包括但不限于A205S、L250V、 Y52W、 R50K或S144T (氨基酸号码参考SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、12、 14、 17或19的任何一个)。
提供了可以在本公开的细胞中表达、以例如在体内生产3-HP的 BAAT片段。本公开还提供了含有SEQIDNO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19的至少15个连续的氨基酸、并保留了 BAAT活性的BAAT 肽。BAAT肽也可以包含SEQ IDNO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19 的至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少 25个、至少30个、至少50个、至少75个、至少100个、至少150个、 至少200个、至少250个、至少300个、至少400个或至少425个连 续氨基酸残基，只要这些片段保留了将卩-丙氨酸转化成丙二酰半醛的 能力即可。
使用公开的BAAT序列可以产生融合蛋白(以及相应的核酸序 列)。融合序列可以包含与第二个氨基酸序列相连的全长BAAT蛋白 序列(例如SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17或19)或其具有 BAAT活性的变异体或片段。在某些实施例中，第二个氨基酸序列包括 至少5个氨基酸，例如至少10个氨基酸、至少20个氨基酸、至少30 个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、 至少150个氨基酸、甚或至少200个氨基酸，例如5-500个氨基酸。在 具体的实施例中，BAAT序列和第二个氨基酸序列通过间隔区序列相 连。间隔区的具体例子包括一个或多个丙氨酸或甘氨酸残基，或其它 非极性氨基酸或中性极性氨基酸。在某些实施例中，间隔区不超过50 个氨基酸，例如不超过20个氨基酸、不超过10个氨基酸、不超过5 个氨基酸，例如5-50个氨基酸。
微分f
还公开了编码具有BAAT活性的肽的分离核酸分子，例如包括 SEQIDN0:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的序列。但是，本公开还 包涵SEQIDNO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的变异体、融合物和 片段，它们保留了编码具有BAAT活性、甚或增加的BAAT活性的蛋白的能力。在一个实施例中，编码具有BAAT活性的肽的分离核酸分 子与启动子序列可操作连接，并可以作为载体的一部分。在具体的实
施例中，启动子是增强BAAT表达的启动子，例如增加至少25%。核 酸可以是重组核酸，其可以用于转化细胞和制造转化细胞或转基因植 物。
公开了含有至少一个外源核酸分子的转化细胞，该核酸分子编码 具有BAAT活性的肽(例如SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或 18，或其保留了 BAAT活性的片段、融合物或变异体)。在一个实施 例中，这样的转化细胞从(3-丙氨酸产生丙二酰半醛。在另一个实施例 中，细胞产生3-HP (或其衍生物例如3-HP的酯或聚合的3-HP)或有 机化合物例如1,3-丙二醇。被转化的细胞可以是真核或原核状态的，例 如细菌细胞&真菌细胞、植物细胞或酵母细胞。转基因细胞的具体例 子包括乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌或大肠杆菌细胞。还提供了含 有所公开的BAAT核酸分子的植物或表达这些BAAT核酸分子的转基 因细胞。
编码BAAT的核酸序列可以包含编码酶的完整核酸序列，以及其 保留了所需酶活性的部分。例如，BAAT核酸分子可以含有BAAT核 酸序列(例如SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18)的至少15 个连续核苷酸。应该认识到，本公开也提供了含有SEQIDNO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的至少18个、至少21个、至少27个、至少 50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个或至少 1200个连续核苷酸的分离核酸分子。在某些实施例中，SEQIDNO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的片段(或互补链)不编码具有BAAT活 性的蛋白，而是可以用作探针或引物的较短片段。
本文公开了变异的BAAT核酸序列。变异体可以含有单个插入、 单个缺失、单个取代、多个插入、多个缺失、多个取代或其任何组合 (例如单个缺失加上多个插入)，只要由其编码的肽保留了 BAAT活性(或可以作为探针或引物)即可。这种分离的核酸分子可以与BAAT 序列(例如SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18)共有至少60%、 至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性，只要核酸编码的肽保 留了 BAAT活性即可。
例如，可以对SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18进行一 种或多种下列改变24位的"g"可以用"a"取代；96位或144位的"c" 可以甩"t"取代；339位或1110位的"c"可以用"t"取代；816位的"a"可 以用"c"、 "t"或"g"取代；1200位或1296位的"c"可以用"a"、 "t"或"g" 取代；1152位的"g"可用"a"、 "t"或"c"取代；1344位的"g"可用"a"取代； 1353位的"t，，可用"g"、 "a，，或"c"取代。
BAAT序列的编码区可以通过利用遗传密码的简并性来改变编码
区序列来改变，这种方式使得尽管核酸序列明显改变，但它编码的肽 仍具有与天然氨基酸序列一致或基本上相似的氨基酸序列。例如，可
以使用具体物种的密码子偏好性和密码子使用表，来工程化利用该特 定物种的密码子使用偏好性的分离核酸分子。由于遗传密码的简并性， 丙氨酸由四种核苷酸密码子三联体编码GCT、 GCA、 GCC禾BGCG。 因此，在丙氨酸位置上开放阅读框架的核酸序列可以被改变成任何这 些密码子，而不影响所编码的多肽的氨基酸序列或肽的性质。基于遗 传密码的简并性，可以通过使用本文描述的标准DNA诱变技术从核酸 序列、或通过核酸序列的合成得到核酸变异体。因此，本公开也包涵 编码同样的多肽、但是由于遗传密码的简并性在核酸序列上不同的核 酸分子。因此，本文公开的BAAT核酸序列可以被设计成具有被目的 特定生物体偏好使用的密码子(例如在下面的实施例中描述的)。
本公开包涵编码BAAT序列的变异体、融合物或片段的核酸(例 如上面描述的那些)。本公开还提供了编码BAAT的分离核酸序列， 其中该序列长度为至少12个核苷酸(例如长度为至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少25个、、 至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少100个、至少 250个、至少500个、至少750个、至少1000个或至少1200个核苷酸)， 并且在杂交条件下与编码酶的核酸分子的正义链或反义链杂交。杂交 条件可以是中度或高度严紧的杂交条件。
BAAT肽和编码这些肽的核酸分子可以通过标准DNA诱变技术例 如M13引物诱变来产生。这些技术的详细情况提供在Sambrook等主 编的《分子克隆实验室手册》(第二版)的15章中(Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vol. 1-3， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring, Harbor, N.Y., 1989, Ch. 15)。核酸分子可以含有编 码区的变化，以配合要导入分子的具体生物体的密码子使用偏好。
具有BAAT活性的细胞
公开了例如由于存在外源BAAT核酸或蛋白而具有BAAT活性的 细胞。这样的细胞可以从P-丙氨酸产生丙二酰半醛，在某些实施例中， 如果细胞中也存在3-HP脱氢酶活性，也可以从丙二酰半醛产生3-HP (或其衍生物)。
本文公开的细胞表达的酶活性，可以通过表达编码具有所需活性 的酶的核酸、或通过直接供应该酶来提供。将外源核酸序列(例如载 体中的序列)导入细胞的方法是常规的。
在一个实施例中，由于表达外源BAAT核酸分子、例如增加BAAT 活性(例如与天然BAAT序列、例如SEQ ID NO: 3禾卩4相比)的变异 体分子，使细胞具有BAAT活性。这样的变异体分子的例子在本文中 提供(例如与SEQ ID NO: 5、 7、 9、 11、 13、 16或18具有至少90% 或至少95%序列同一性的核酸序列)。在某些实施例中，增加的BAAT 活性导致细胞从(3-丙氨酸生产丙二酰半醛增加，并且如果细胞也具有 3-HP脱氢酶活性，还导致从丙二酰半醛生产3-HP (或其衍生物)的增加。在具体的实施例中，丙二酰半醛或下游产物例如3-HP (或其衍生
物)的生产或产量增加了至少20%、例如至少50%、至少75%、至少 100%或至少150%。丙二酰半醛或3-HP的生产增加可以是相对于表达 天然BAAT序列(不论是否是外源的，例如SEQIDNO:3和4)的同 样类型细胞。测量这种生产的方法在本技术领域中是已知的，在本文 中提供了具体的非限制性例子。
含有BAAT活性的细胞可以是真核或原核的。这样的细胞的例子 包括但不限于细菌细胞(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌、大肠 杆菌、地芽孢杆菌(Geo6a"'肠)、棒杆菌(Cor，6ac/e"'wm)或梭菌
(C/o血W〖調))、真菌细胞(例如曲霉或根霉(她'zo戸) 细胞)、植物细胞(例如玉米、小麦、水稻或大豆细胞)以及酵母细 胞。在一个实施例中，细胞是微生物。术语"微生物"是指任何显微 生物体，包括但不限于细菌、藻类、真菌和原生动物。因此，大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌(5.犯6"fe)、地衣芽孢杆菌(及/!'c/2em/onm\y)、 酿酒酵母(S. cewvWae)、乳酸克鲁维斯酵母(A7mwomKeWac&)、 OmAWa 6/朋&"、铍褶假丝酵母(OrnWcfo 和巴斯德毕赤酵母
(尸/cWa pasfoWs)都是微生物并且可以使用。在另一个实施例中，细 胞是较大的生物体例如植物如转基因植物的一部分。可用于从P-丙氨 酸制造3-HP或其它有机化合物的植物的例子包括但不限于遗传工程的 植物作物，例如玉米、水稻、小麦和大豆。
在一个实施例中，具有BAAT活性的细胞是转化的细胞。这样的 细胞可以含有至少一种编码BAAT的外源核酸分子，例如含有SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18或其保留了编码具有BAAT活性蛋 白的能力的变异体、片段或融合物的序列(参见上面BAAT核酸分子 的讨论)。在某些实施例中，表达了至少两种不同的外源BAAT分子， 例如SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16和18中的两种或多种。
在一个实施例中，外源核酸分子是突变的BAAT，其中突变的BAAT (例如SEQ ID NO: 5、 7、 9、 11、 13、 16或18)增加了细胞中 BAAT活性，并可以增加从(3-丙氨酸生产丙二酰半醛。例如，在某些 实施例中，相对于天然BAAT (例如SEQ ID NO: 3和4)存在下从卩-丙氨酸生产的丙二酰半醛的量，突变的BAAT可以将细胞中从p-丙氨 酸生产丙二酰半醛增加至少3倍，例如增加至少4倍、至少5倍、至 少6倍、至少8倍或甚至至少10倍。
公开了含有BAAT活性以及其它酶活性的细胞。这样的细胞可用 于生产(5-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP、多元醇例如1,3-丙二醇、聚合 的3-HP、 3-HP和3-HP酯的共聚物。其它的酶活性对于细胞来说可以 是天然的，或可以由于导入了编码所需酶的核酸分子而是外源的。在 具体的实施例中，编码两种或多种所需酶、例如三种或多种所需酶的 操纵子被导入到细胞中。例如，含有编码BAAT、 3-HP脱氢酶和天冬 氨酸脱羧酶中的两种或多种的核酸分子的操纵子，可以被细胞表达。
本文提供了具有外源BAAT活性(例如由于表达本文公开的至少 一种BAAT分子)以及允许产生丙二酰半醛的下游产物、例如3-HP及 其衍生物的一种或多种内源或外源核酸分子的细胞。3-HP的存在可以 使用常规方法来确定，例如在Sullivan和Clarke U j潔.々广 Oz簡'他，38:514-8, 1955)中描述的方法。例如，具有BAAT和3-HP 脱氢酶活性(3-羟基丙酸脱氢酶活性，EC1丄1.59)(例如由于表达了 所编码的蛋白与SEQIDNO:21、 23、 27或31具有至少95%序列同一 性的核酸序列，例如SEQ ID NO: 20、 22、 26、 29或30)的细胞。这 样的细胞能够从p-丙氨酸和丙二酰半醛中间体生产3-HP。类似地，具 有天冬氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性(例如由于表达了 所编码的的蛋白与SEQ ID NO: 39或41具有至少95%序列同一性的核 酸序列，例如SEQ ID NO: 38或40) 、 PEP羧化酶活性、外源BAAT 活性(例如由于表达至少一种本文公开的BAAT分子)和3-HP脱氢酶 活性(例如由于表达SEQIDNO:20、 22、 26或29)的细胞，能够从 葡萄糖或丙酮酸生产3-HP。在这些实施例中，细胞可用于生产3-HP。生产3-HP的上述细胞还可以含有脂肪酶或酯酶活性，例如由于表
达编码脂肪酶或酯酶(EC 3丄l.-)的外源核酸分子的。这样的细胞可 用于生产3-HP的酯，例如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基 丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯、或3-羟基丙酸2-乙基己酯。生产3-HP的 上述细胞可以进一步含有酯酶活性，例如由于表达编码酯酶的外源核 酸分子。这样的细胞可用于生产聚合的3-HP。生产3-HP的上述细胞 还可以含有醇脱氢酶活性(ECl丄l.l)、醛脱氢酶活性(EC1.2丄-) 或这二者，例如由于表达编码醇脱氢酶、醛脱氢酶或二者的外源核酸 分子。这样的细胞可用于生产1,3-丙二醇。
在具体的实施例中，细胞中编码所需酶活性的外源核酸分子包括 增强所需酶表达的非天然启动子。这种所需前体的表达增加可以导致 下游产物、例如P-丙氨酸、丙酮酸、草酰乙酸、丙二酰半醛以及3-HP 及其衍生物的生产增加。在具体的实施例中， 一种或多种这些下游产 物的表达与例如使用天然启动子表达的量相比，增加了至少20%、至 少50%或甚至至少100%。
例如，使用常规的分子生物学方法，可以用启动子例如可以用乳 糖或IPTG诱导的/flc启动子、可以用阿拉伯糖诱导的"ra启动子、或 可以用四环素诱导的"f启动子或组成型启动子取代酶的天然启动子。 这样的非天然或合成的启动子与酶的编码序列可操作连接。在具体的 实施例中，这样的非天然启动子与酶的天然启动子相比，可以将酶的 表达增加至少20%，例如至少50%。酶的表达增加(在核酸或蛋白水 平上)可以使用常规的方法来检测，例如Southern印迹、northern印迹、 RT-PCR、聚丙烯酰胺凝胶电泳、western印迹或流式细胞术。在一个实 施例中，本公开的含有外源BAAT活性的细胞，也含有编码PEP羧化 酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、丙酮酸羧化酶、BAAT 或3-HP脱氢酶的一种或多种外源核酸分子(例如这些酶中的2、 3、 4、 5或6种)，其中这些酶中的一种或多种从非天然启动子表达。所公开的具有外源BAAT活性的细胞(例如生产3-HP的细胞) 也可以含有增加可用的丙酮酸来用作下游产物例如p-丙氨酸和3-HP的 前体的突变(例如一种或多种基因的功能性缺失)。丙酮酸的可用性 增加可以增加所需的下游产物例如3-HP及其衍生物的生产，例如增加 至少20%或至少50%。例如，poxB基因(ApojcB)的功能性缺失减少 了细胞的乙酸形成(例如减少至少20%或至少50%)，并可以增加细 胞中的丙酮酸。在另一个实施例中，adhE或AatpFH基因(AadhE或 AatpFH)的功能性突变可以增加细胞中的丙酮酸，从而将p-丙氨酸、 丙二酰半醛、3-HP (或其组合)的生产增加至少20%或至少50% (例 如与存在有功能的adhE或AatpFH基因相比)。对基因进行功能性缺 失的方法在本技术领域中是常规的。
所公开的具有外源BAAT活性的细胞(例如生产3-HP的细胞) 也可以含有柠檬酸合成酶基因的突变(例如这样的基因的功能性缺 失)，这显著降低柠檬酸合成酶的生物学活性。这样的突变可以增加 可用作天冬氨酸氨基转移酶反应的底物的草酰乙酸的量(图1)，从而 增加下游产物例如(3-丙氨酸和3-HP的生产。增加草酰乙酸的量可以增 加所需的下游产物例如3-HP及其衍生物的生产，例如增加至少20%或 至少50%。例如，SEQIDNO:52 (突变的gltA)的表达可以增加3-HP 的生产。
本技术领域的专业人员将会认识到，所公开的分离细胞可以含有
所需元件的多种组合，例如与一种或多种所需酶可操作连接的非天然 启动子(其中该启动子相对于天然启动子增加了酶的表达)、增加可用的
丙酮酸的突变、以及减少柠檬酸合成酶表达的突变。
在某些实施例中，所需产物(例如卩-丙氨酸、丙二酰半醛和3-HP 或其衍生)从细胞分泌出来，减少或消除破坏细胞膜以回收所需化合 物的需要。在一个实施例中，细胞产生的所需产物的浓度为每升至少1 mg/L (例如至少1 mg/L、至少5 mg/L、至A 10 mg/L、至少50 mg/L、 至少100 mg/L、至少200 mg/L、至少500 mg/L、至少1 g/L、至少2 g/L、 至少5 g/L或至少10 g/L)。当测定具体细胞的产物例如3-HP或其衍 生物的产量时，可以使用任何方法。参见例如^^〃ed ￡"vz>o"me"&/ M/m 6/o/ogy 59(12):4261-5 (1993)。在本公开范围内的细胞可以利用各 种不同的碳源。在另一个实施例中，radical SAM的酶产物(或其下游 有机化合物)不从细胞中分泌。在这样的实施例中，可以使用本技术 领域已知的方法破坏细胞膜，以回收有机化合物。
生产丙二酰半醛、3-HP及其衍生物的方法
公开了通过所公开的BAAT序列和所公开的具有BAAT活性的细
胞从卩-丙氨酸生产丙二酰半醛所涉及的方法和材料。此外，还公开了 从丙二酰半醛生产3-HP、以及有机化合物例如1,3-丙二醇、聚合的 3-HP、 3-HP和其它化合物例如丁酸、戊酸和其它化合物的共聚物、以 及3-HP的酯所涉及的方法和材料.具体来说，本公开提供了BAAT核 酸分子(例如SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16和18)、肽(例 如SEQIDNO:4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19)、宿主细胞、以及从 卩-丙氨酸生产丙二酰半醛的方法和材料，它们可用于更有效地制造丙二 酰半醛和3-HP及其衍生物例如1，3-丙二醇、聚合的3-HP和3-HP的酯。 尽管提供了生产P-丙氨酸和下游化学物质的具体方法和酶，本技术领 域的专业人员将会认识到，类似的方法和变异的酶也可以使用。
几条代谢途径可用于从卩-丙氨酸产生的丙二酰半醛生产有机化合 物(图1 )。3-HP可以通过使用从(3-丙氨酸产生丙二酰半醛的具有BAAT 活性的肽，从p-丙氨酸制造。丙二酰半醛可以用具有3-HP脱氢酶活性 (EC 1丄1.59或.31)的肽转化成3-HP。所获得的3-HP可以用具有酯 酶活性的肽转化成聚合的3-HP。 3-HP可以用具有醛脱氢酶(EC 1.2丄-)活性和醇脱氢酶活性(ECl丄l.l)的肽转化成1,3-丙二醇。所 获得的3-HP可以用具有脂肪酶或酯酶活性(EC3丄l.-)的多肽转化成 3-HP的酯。本公开还提供了增加(3-丙氨酸、丙二酰半醛、3-HP (及其衍生物) 的生产的方法。在具体的实施例中，使用本文提供的BAAT活性增加 的变异体BAAT序列，与例如使用非天然启动子来表达酶和增加可用 的丙酮酸相结合，可以增加(3-丙氨酸、丙二酰半醛和3-HP的生产，例 如增加至少20%、至少40%或甚至至少50%或至少100%。增加所需产 物的生产可以是相对于不表达改进的BAAT、不从非天然启动子表达一 种或多种酶、或不包含能增加可用丙酮酸的突变的同样类型细胞。例 如，增加可以是相对于当天然BAAT (例如SEQ ID NO: 3)表达时预 计的产物参比值。在另一个实施例中，增加可以是相对于含有天然 BAAT的实验样品。测量所需产物生产的方法在本技术领域中是已知 的，本文中公开了具体的非限制性例子。
所公开方法的执行可以在体内、体外，或其组合。例如，本文提
供的细胞或微生物可用于执行一个或多个图1中提供的步骤，或者含 有具有指定酶活性的肽的提取物可用于执行一个或多个图l中提供的
步骤。在一个实施例中，该方法可以包括在足以使细胞制造所需产物 (例如丙二酰半醛、3-HP或其衍生物)的条件下，对具有BAAT和其 它所需酶活性的公开细胞进行培养。对于涉及体内步骤的方法来说， 细胞可以是分离的培养细胞或完整生物体例如转基因植物，或单细胞 生物体例如酵母和细菌(例如乳酸杆菌、乳酸球菌、芽孢杆菌和大肠 杆菌细胞)。这样的细胞可以被称为生产细胞。由这些生产细胞生产 的产物可以是有机产物，例如P-丙氨酸、丙二酰半醛和3-HP (或其衍 生物)。
在另一个实施例中，使用了体外方法(或体内和体外方法的组合)。 例如，可以使用具有本文公开的BAAT活性的细胞生产丙二酰半醛， 将其纯化，然后与3-HP脱氢酶在体外允许3-HP形成的条件下温育。 本技术领域的专业人员将会认识到，体外合成步骤可以经过化学反应 或酶反应。例如，化学处理可用于执行图1施例中，3-HP可以通过转酯作用转化成3-HP酯，或通过加氢作用转 化成1,3-丙二醇。对有机酸例如3-HP进行的加氢可以使用任何方法例 如用于琥珀酸或乳酸加氢的方法来进行。例如，3-HP可以使用金属催 化剂来加氢。在另一个实施例中，3-HP可以脱水形成丙烯酸。任何方 法都可用于执行脱水反应。例如，3-HP可以在催化剂(例如金属或无 机酸催化剂)存在下加热以形成丙烯酸。
体力生产两二糜羊膨称3-H尸及真欲生欽
提供了体内生产丙二酰半醛和下游产品例如3-HP (及其衍生物) 有关的方法和材料。例如，丙二酰半醛和3-HP可以在细胞、例如本文 提供的细胞中生产。细胞可以是分离的培养细胞或完整生物体例如转 基因植物，或单细胞生物体例如酵母和细菌(例如乳酸杆菌、乳酸球 菌、芽孢杆菌和大肠杆菌细胞)。在具体的实施例中，该方法包括在 足以生产所需产物的条件下培养细胞。例如，细胞可以用表达适合的 产生所需产物的酶的一种或多种核酸分子进行转染，然后在足以制造 所需产物的条件下进行培养。所需产物可以从细胞提取，或者如果产 物被细胞分泌，则可以从细胞外培养基中回收。本技术领域的专业人 员将会认识到，编码适合的酶的外源核酸分子可以是一种或多种载体 的一部分，并可以包含其它核酸序列。
提供了与在体内从卩-丙氨酸生产丙二酰半醛有关的方法和材料。 在一个实施例中，该方法包括在允许细胞从P-丙氨酸制造丙二酰半醛 的条件下培养具有BAAT活性的公开细胞。在具体的实施例中，BAAT 活性是由于编码BAAT酶(例如与SEQIDNO:6、 8、 10、 12、 14、 17 或19具有至少95%序列同一性的酶)的外源核酸分子的存在。在某些 实施例中，细胞还包含编码其它酶活性的外源核酸分子，例如从PEP、 丙酮酸或二者生产(3-丙氨酸所需的酶活性。这样的酶的例子包括但不 限于PEP羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、和丙酮酸羧化酶、天冬氨 酸脱羧酶。在一个实施例中，细胞包含编码天冬氨酸脱羧酶的外源核 酸分子(例如编码与SEQ ID NO: 38或40具有至少95%序列同一性的天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子)。细胞也可以包含增加可用的丙酮 酸的突变。这样的突变的例子包括但不限于ApoxB突变(例如将细 胞的乙酸形成减少至少20%的突变)，AadhE或AatpFH突变(例如与 不存在AadhE或AatpFH相比，将丙二酰半醛的生产增加至少20%的突 变)，或减少柠檬酸合成酶产生的突变(例如表达与SEQ ID NO: 52 具有至少95%序列同一性的外源核酸分子)。
公开了在体内从丙二酸半醛生产3-HP有关的方法和材料。3-HP 可以在营养品工业中用作食品、饲料添加剂或防腐剂。此外，3-HP可 用于生产其衍生物，例如1,3-丙二醇、3-HP的酯、丙烯酸酯或丙烯酸、 聚合的丙烯酸酯、丙烯酸酯的酯、聚合的3-HP、 3-HP和其它化合物例 如丁酸、戊酸的共聚物。在一个实施例中，该方法包括在允许细胞从 丙二酰半醛制造3-HP的条件下对具有BAAT活性(例如上述的那些) 和3-HP脱氢酶活性(EC1丄1.59)的公开细胞进行培养。在具体的实 施例中，3-HP脱氢酶活性是由于编码3-HP脱氢酶(例如与SEQ ID NO: 21、 23、 27或31具有至少95%序列同一性的酶)的外源核酸分子的存 在。
3-HP的衍生物可以按照上面的描述在体内从丙二酰半醛产生的 3-HP来制造。3-HP的衍生物，例如3-HP的酯、聚合的3-HP或1,3-丙二醇，可以通过使用表达适当的酶的细胞在体内从3-HP来产生(参 见图1)。在一个实施例中，这些酶通过用能够表达具有必需酶活性的 蛋白的一种或多种核酸分子转染细胞来提供给细胞。例如，进一步含 有脂肪酶或酯酶活性(EC 3丄l.-)的细胞可用于将3-HP转化成3-HP 的酯(例如丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯或丙烯酸丁酯，例 如3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁 酯、或3-羟基丙酸2-乙基己酯)。进一步含有醛脱氢酶活性(EC 1.2丄-) 和醇脱氢酶活性(EC l丄l.l)的细胞可用于将3-HP转化成1,3-丙二醇。 进一步具有酯酶活性(EC3丄l.-)的细胞可用于将3-HP转化成聚合的 3-HP。使厉体力浙体W方法生产3-H尸J真欲生激
在具体的实施例中，生产产物例如3-HP或其衍生物的方法使用体 内和体外方法的组合来进行。例如，为了从丙二酰半醛产生3-HP，丙 二酰半醛可以在细胞中体内产生(在某些实施例中它从细胞或培养基 中被后续分离或纯化)，和将丙二酰半醛与其它酶或化学物质在体外 相接触，以产生3-HP或其衍生物。尽管提供了具体的酶和方法，但本 公开不限于这样的酶或方法。
例如，丙二酰半醛可以在BAAT活性增加的细胞(例如由于表达 生物学活性增加的BAAT)体内产生，随后使用本技术领域已知的标准 方法进行纯化。然后将丙二酰半醛与适合的酶相接触或温育，以在体 外产生所需的下游有机化学物质。例如，为了从丙二酰半醛产生3-HP， 可以将丙二酰半醛与具有3-羟基丙酸脱氢酶活性的肽相接触，以制造 3-HP。
3-HP的衍生物，例如3-HP的酯、聚合的3-HP或1,3-丙二醇，可 以在体外从3-HP来产生。例如，3-HP可以按照上面的描述在体外生 产生产，或在体内并然后分离。获得的3-HP可以在适当的酶(参见图 l和本公开)的存在下进行温育。在一个实施例中，将所有这些酶与丙 二酰半醛温育，并允许反应在体外进行。在另一个实施例中，将纯化 的3-HP用化学物质处理以产生所需的衍生物。例如，3-HP可以通过 转酯作用转化成3-HP的酯，通过氢化作用转化成1，3-丙二醇，或脱水 形成丙烯酸。
在体外生产丙二酰半醛和3-HP及其衍生物
具有所需酶活性的纯化的肽可用于生产丙二酰半醛或3-HP (或其 衍生物例如1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸酯的酯、3-HP 的酯和聚合的3-HP)。例如，含有基本上纯的具有BAAT活性的肽的 制备物可用于催化从(3-丙氨酸形成丙二酰半醛。此外，含有具有所需酶活性的肽的无细胞提取物可以单独或与纯
化的肽或细胞组合使用以生产3-HP或其衍生物。例如，含有具有BAAT 活性和3-HP脱氢酶活性的肽的无细胞提取物，可用于从P-丙氨酸形成 3-HP。任何方法都可用于生产无细胞提取物。例如，渗透冲击、超声、 或反复的冻融循环然后进行过滤或离心，可用于从完整细胞生产无细 胞提取物。
纯化的肽或无细胞提取物可用于生产3-HP，3-HP又被化学处理以 产生另一种化合物。例如，化学方法可用于将3-HP修饰成衍生物例如 1，3-丙二醇、丙烯酸、聚合的丙烯酸酯、丙烯酸酯的酯、3-HP的酯和 聚合的3-HP。
细胞发酵以生产有机酸
提供了包含体内方法(例如单独地或与体外方法相组合)的生产 丙二酰半醛和3-HP (及其衍生物)的方法。体内方法可以包括在培养 基中培养具有适当酶活性的细胞(例如微生物)，以便产生所需的产
物。 一般来说，培养基或培养条件可以使得细胞生长到足够的密度并 有效地产生产物。对于大规模生产工艺来说，可以使用任何方法，例 如在别处描述的那些(Demain和Davies主编的《工业微生物学和生物 技术手册》(第二版)(Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Edition, Editors: Demain and Davies, ASM Press); 以 及Stanbury和Whitaker的《发酵技术原理》(Principles of Fermentation Technology, Stanbury and Whitaker, Pergamon))。
简单来说，在含有具有例如葡萄糖碳源的适合培养基的罐(例如1 加仑、5加仑、10加仑、50加仑、100加仑、200加仑、500加仑或更 大的罐)中接种一种或多种所公开的细胞(例如微生物)。接种后， 将细胞温育以允许生物质产生。 一旦达到所需的生物质后，可以将含 有细胞的肉汤转移到第二个罐中。该第二个罐可以是任何大小。例如，第二个罐可以比第一个罐大、小、或同样大小。通常，第二个罐比第 一个罐大，使得可以在第一个罐的肉汤中再加入培养基。此外，该第 二个罐中的培养基可以与第一个罐中使用的培养基相同或不同。例如， 第一个罐可以含有具有木糖的培养基，而第二个罐含有具有葡萄糖的
一旦转移后，可以将细胞温育，以允许(3-丙氨酸、丙二酰半醛、 3-HP或3-HP衍生物的生产。一旦产生后，就可以用任何方法分离所 形成的产物。例如，普通的分离技术可用于从肉汤中除去生物质，普 通的分离方法(例如提取、蒸馏和离子交换方法)可用于从无细胞肉 汤中获得所需产物。或者，产物可以在其产生的同时被分离，或者它 可以在产物生产阶段已经结束后从肉汤中分离。在某些实施例中，细 胞被分离，并从细胞中提取所需产物。
艨
所公开的细胞可以包含下列酶中的一种或多种。这些酶可以是内 源的、外源的或其组合。术语"具有酶活性的肽"是指任何催化其它 物质的化学反应而在反应完成后其自身不被破坏或改变的肽。通常， 具有酶活性的肽催化从一种或多种底物形成一种或多种产物。这样的 肽可以具有任何类型的酶活性，包括但不限于与酶例如PEP羧化酶、
丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-HP 脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶有关的酶活性。
具有PEP羧化酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不 同的物种获得，包括但不限于天蓝色链霉菌(S^e/^omjFcwcoe/Zco/or)、 7T2mwo5"ec/zococcw5 vw/ca"w和大肠杆菌。PEP羧化酶活性是指将PEP 转化为草酰乙酸的能力。例如，PEP羧化酶核酸和蛋白被公开在 GenBank登记号No: AB057454、 AF177946或X05903 (核酸)和 BAB64533、 AAD53311或CAA29332 (蛋白)中。应该认识到，公共 可用的序列可以包含变异，只要肽保留了 PEP羧化酶活性即可。具有丙酮酸羧化酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种
不同的物种获得，包括但不限于艾特利根瘤菌(7 /^o6/謂e〃0 、谷氨 酸棒杆菌(Co7"e6a"en'wm g/wtom/cwm)和嗜热月旨肪芽孢杆菌(5ac〃/wj WewoAwmop/n7w)以及大肠杆菌。丙酮酸羧化酶活性是指将丙酮酸转 化为草酰乙酸的能力。例如，丙酮酸羧化酶的核酸和蛋白公开在 GenBank登记号No: U51439、 AF038548或D83706 (核酸)和 AAC44388、 AAB92588或BAA12072 (蛋白)中。应该认识到，公共 可用的序列可以包含变异，只要肽保留了丙酮酸羧化酶活性即可。
具有天冬氨酸氨基转移酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以 从各种不同的物种获得，包括但不限于苜蓿根瘤菌(朋/zoWwm 附e/〃o")、嗜热栖热菌(7Tz^7m^ Aermop/z//^)禾卩大肠杆菌。天冬氨 酸氨基转移酶活性是指将草酰乙酸转化成天冬氨酸的能力。例如，天 冬氨酸氨基转移酶的核酸和蛋白公开在GenBank登记号No: L05064、 D38459或X03629 (核酸)和AAA26245、 BAA07487或CAA27279 (蛋 白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了 天冬氨酸氨基转移酶活性即可。
具有天冬氨酸脱羧酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各 种不同的物种获得，包括但不限于谷氨酸棒杆菌、百脉根慢生根瘤菌 (MwoWn'zo6/wm/o")、丙酮丁醇梭菌、阿维链霉菌和大肠杆菌。天冬 氨酸脱羧酶活性是指将天冬氨酸转化成(3-丙氨酸的能力。例如，天冬 氨酸脱羧酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No: AF116H4、 AF311738、 L17086以及SEQIDNO: 38和40 (核酸)，以及GenBank 登记号No: AAD28430、 AAG47796、 AAA24271以及SEQ ID NO: 39 和41 (蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要 肽保留了天冬氨酸脱羧酶活性即可。
具有BAAT活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌(尸Mi^omo"as 和大肠杆菌。BAAT活性是指将卩-丙氨酸转化成丙二酰半醛的 能力。例如，BAAT的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No: AE004091或AE015451以及SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16和 18 (核酸)，以及GenBank登记号No: AAG08698或P28269以及 SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 17和19 (蛋白)中。应该认识到， 公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了BAAT活性即可。
具有3-HP脱氢酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种 不同的物种获得，包括但不限于类球红细菌(i /zocfo6a"w s/7/2awo!W^ )、 铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和大肠杆菌。3-HP脱氢酶活性是指将丙 二酰半醛转化成3-HP的能力。例如，3-HP脱氢酶的核酸和蛋白被公 开在GenBank登记号No: AF316325、 M84911、 NC002516、 AE015451 和SEQ ID NO: 20、 22、 26、 29和30 (核酸)，以及GenBank登记号 No: AAL26884、AAA25892、NP—252259、AAN70239以及SEQ ID NO: 21、 23、 27和31 (蛋白)中。应该认识到，公共可用的序列可以包含 变异，只要肽保留了 3-HP脱氢酶活性即可。例如，编码具有3-HP脱 氢酶活性的肽的核酸可以从铜绿假单胞菌的3-羟基异丁酸脱氢酶 (/W7W_S)基因获得，并可以具有GenBank登记号M84911中显示的序 歹ij (相应的蛋白序列显示在GenBank登记号AAA25892.1中)。
具有脂肪酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的 物种获得，包括但不限于皱褶假丝酵母、热带假丝酵母(Ca"AWa fro内ca/^)和白色念珠菌(Ca"a Wa a/6/cww)。脂肪酶活性是指特别 是在3-HP和醇之间催化酯键的水解或形成的能力。例如，脂肪酶的核 酸和蛋白被公开在GenBank登记号No: A81171、 Z30945、 AF188894 (核酸)和Z30945和AF188894 (蛋白)中。应该认识到，公共可用 的序列可以包含变异，只要肽保留了脂肪酶活性即可。
具有酯酶活性的肽以及编码这样的肽的核酸可以从各种不同的物种获得，包括但不限于皱褶假丝酵母、热带假丝酵母和白色念珠菌。
酯酶活性是指在两分子3-HP之间或一分子3-HP和3-HP的聚合物之 间、或两种3-HP的聚合物之间催化酯键的水解或形成、特别是酯键的 形成的能力。例如，酯酶的核酸和蛋白被公开在GenBank登记号No: Z30945和AF188894 (核酸)以及CAA83122和AAF35171 (蛋白)中。 应该认识到，公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了酯酶活性 即可。
具有醛脱氢酶(EC 1.2丄-)活性的肽以及编码这样的肽的核酸可 以从各种不同的物种获得，包括但不限于恶臭假单胞菌、大肠杆菌和 酿酒酵母。醛脱氢酶活性是指使用NADH或NADPH作为还原剂将羧 酸基团还原成醛基的能力。例如，醛脱氢酶的核酸和蛋白被公开在 GenBank登记号No: AB100375、 L40742和Z17314 (核酸)以及 BAD07372、 AAC36938和CAA78962 (蛋白)中。应该认识到，公共 可用的序列可以包含变异，只要肽保留了醛脱氢酶活性即可。
具有醇脱氢酶活性(ECl丄l.l)的肽以及编码这样的肽的核酸可 以从各种不同的物种获得，包括但不限于恶臭假单胞菌、运动发酵单 胞菌(Z. moWfe)和酿酒酵母。醇脱氢酶活性是指使用NADH或NADPH 作为还原剂将醛基还原成醇基的能力。例如，醇脱氢酶的核酸和蛋白 被公开在GenBank登记号No: AB100375、 M32100和M38457 (核酸) 以及BAD07371、 AAA27682和AAA34411 (蛋白)中。应该认识到， 公共可用的序列可以包含变异，只要肽保留了醇脱氢酶活性即可。
尽管公开了可以使用的酶的具体的例子，但本技术领域的专业人 员将会认识到，可以使用本技术领域已知的方法鉴定和获得具有所需 酶活性的肽的编码核酸分子。例如，具有所需酶活性的肽的编码核酸 分子可以使用常用的分子克隆或化学核酸合成方法和技术，包括PCR， 来鉴定和获得。此外，标准的核酸测序技术和基于遗传密码将核酸序 列翻译成氨基酸序列的软件程序，可用于确定特定的核酸是否与已知的具有酶活性的肽具有任何序列同源性。序列比对软件例如
MEGALIGN (DNASTAR, Madison, WI， 1997)可用于比较各种不同的 序列。此外，核酸和氨基酸数据库(例如GenBank禾B EMBL)可用于 鉴定具有所需酶活性的肽的编码核酸序列。简单来说，任何与具有所 需酶活性(例如PEP羧化酶)的肽具有至少80%同源性的氨基酸序列， 或任何与具有所需酶活性的肽的编码序列具有至少50%同源性的核酸 序列，都可用作査询序列以搜索GenBank。然后可以对鉴定到的肽进 行分析，以确定它们是否展现所需的酶活性。
核酸杂交技术也可用于鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核 酸分子。简单来说，己知酶活性的肽的编码核酸分子或其片段，可用 作探针，在中度到高度严紧条件下通过杂交鉴定相似的核酸分子。然
后可以将这种相似的核酸分子分离、测序和分析，以确定所编码的肽 是否具有所需的酶活性。
表达克隆技术也可用于鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核 酸分子。例如，已知与特定的酶相互作用的底物可用于筛选含有该酵 的噬菌体展示文库。噬菌体展示文库可以按照描述产生(Burritt等， j朋/. B/oc&m. 238:1-13, 1990)，或者可以从商业化供应商例如Novagen (Madison， WI)获得。
肽测序技术也可用于鉴定和获得具有所需酶活性的肽的编码核酸 分子。例如，可以将纯化的肽通过凝胶电泳进行分离，并通过例如氨 基酸微量测序技术测定其氨基酸序列。 一旦测定后，可以使用该氨基 酸序列设计简并的寡核苷酸引物。简并的寡核苷酸引物可用于通过 PCR获得编码多肽的核酸。 一旦获得后，可以对核酸进行测序，将其 克隆到适合的表达载体中，并导入微生物。
^A游置蕴表达
本文描述的酶(例如图1中列出的酶)可以在细胞中单独或组合生产。生产重组蛋白的方法在本技术领域中是众所周知的，因此，本 公开的范围包括任何本文公开的酶的重组表达。例如，重组核酸分子 可用于产生细胞并实践本文公开的方法。在具体的实施例中，本公开 的细胞(或使用这样的细胞的方法)包含至少一种外源核酸分子。
对于所公开的和公共可用的酶的核酸和氨基酸酶序列、例如PEP
羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-HP脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和醇脱氢酶(及其保留可所需 酶活性的变异体、片段和融合物)来说，能够通过标准的实验室技术 来表达或纯化这些蛋白。本技术领域的专业人员将会理解，肽可以在 任何目标细胞或生物体中重组生产，并在使用前、例如在生产3-HP或 其衍生物之前纯化。
具有特定酶活性的肽可以是天然存在的或非天然存在的肽。天然 存在的肽是任何具有在自然界中发现的氨基酸序列的肽，包括野生型 和多态性的肽。天然存在的肽可以从任何物种获得，包括但不限于酵 母、植物、真菌和细菌物种。非天然存在的肽是任何具有没有在自然 界中发现的氨基酸序列(例如SEQIDNO:5-14和16-19)的肽。因此， 非天然存在的肽可以是天然存在的肽的突变版本，或工程化的肽。例 如，BAAT活性增加的非天然存在的肽可以是天然存在的BAAT肽的 突变版本。肽可以使用本技术领域已知的方法，通过例如序列添加、 缺失、取代或其组合来进行突变。
转化的细胞可用于执行本文描述的途径中的步骤的一个或多个步 骤，或者转化的细胞可用于生产本公开的肽供随后在体外应用。例如， 单个微生物可以含有执行图1中描述的步骤所需的每个肽的外源编码 核酸，所述肽例如生产f3-丙氨酸、丙二酰半醛或3-HP (或其衍生物) 所需的酶。这样的细胞可以含有任何数量的外源核酸分子。例如，特 定的细胞可以含有至少一种、至少两种、至少三种或至少四种不同的 外源核酸分子，每一种都编码如图1所示将PEP或丙酮酸转化成P-丙氨酸(或后面的产物例如丙二酰半醛或3-HP)所必需的肽，或者特定 的细胞可以内源性产生将丙酮酸转化成p-丙氨酸的肽，同时含有将P-丙氨酸转化成3-HP的肽的外源编码核酸分子。
编码本文描述的酶的核酸分子可以使用标准的分子生物学方法导 入到细胞中。单个核酸分子可以编码超过一种酶或其它所需分子。例 如，可以使用含有两种以上核酸序列例如二、三、四、五、六或甚至
七种序列的操纵子。例如，每种核酸序列可以编码PEP羧化酶、丙酮 酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-羟基丙 酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶或醇脱氢酶。在具体的实施例中， 重组核酸序列包含PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、 天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-羟基丙酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢 酶和醇脱氢酶中的一种或多种的编码序列。
重组核酸序列可以包含促进编码酶的核酸序列表达的调控元件。 通常，调控元件是在转录水平上调控其它DNA序列表达的DNA序列。 因此，调控元件包括但不限于启动子、增强子等。例如， 一种或多种 启动子序列可以通过将启动子放置在cDNA序列的上游来促进编码序 列的表达。在一个实施例中，使用了与天然启动子相比增强编码序列 表达的非天然启动子。启动子的例子包括但不限于组成型启动子，以 及响应或不响应特定刺激(例如光、氧、化学物质浓度)的启动子。 本公开的核酸分子可以合并到载体中，载体可用于转化细胞，或者合 并到细胞的基因组中，或这二者中。例如，编码所需酶的cDNA被连 接到表达载体中，例如细菌表达载体。其它的克隆载体，例如其它质 粒、噬菌体、粘粒、动物病毒和酵母人工染色体，也可以使用。这些 载体可以被导入到各种不同的宿主中，包括简单和复杂的生物体，例 如细菌、真菌或植物，它们通过导入异源cDNA成为转基因生物。
单个外源核酸分子可以编码一种或超过一种的肽。例如，单个外 源核酸分子可以含有编码两种、三种或甚至四种不同肽的序列，例如下列的至少两种PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、
天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-HP脱氢酶、脂肪酶、酯酶、醛脱氢酶和
醇脱氢酶。此外，本文描述的细胞可以含有单拷贝或多拷贝(例如至
少5个、至少10个、至少20个、至少35个、至少50个、至少75个、 至少100个或至少150个拷贝)的特定外源核酸分子。本文描述的细 胞可以含有超过一种特定外源核酸。例如，特定的细胞可以含有大约 15拷贝的外源核酸分子X，以及大约25个拷贝的外源核酸分子Y。
任何方法都可用于将外源核酸分子导入细胞。将DNA转移到真核 细胞中是常规的技术。将核酸分子导入细胞的非限制性的示例方法包 括热冲击、脂质转染、电穿孔、接合、原生质体融合、用磷酸钙或磷 酸锶沉淀、DEAE葡聚糖、微注射和生物弹射投送(例如参见Ito等， 5ad"o/. 153:163-8, 1983; Durrens等，Cwr. 18:7-12， 1990;
Sambrook等，《分子克隆实验室手册》第二版(Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, second edition, 1989); 以及Becker禾卩Guarente, Me/Zzoc/s / 五wzymo/ogy 194:182-7, 1991)。在一个实施例中，可以通过用病毒载体 感染来导入cDNA，例如反转录病毒(Bernstein等，1985， Ge". 7:235)，例如腺病毒(Ahmad等，1986， J PW. 57:267)或疱疹病毒 (Spaete等，1982, Ce〃 30:295)。
在本公开的特定细胞中包含的外源核酸分子可以以任何形式维持 在该细胞中。例如，外源核酸分子可以被整合到细胞的基因组中或维 持在游离体状态。即细胞可以是稳定的或暂时的转化体。
实施例1
(3-丙氨酸氨基转移酶的纯化和克隆
本实施例描述了用于从灰色链霉菌(S&ej^omyc"gn&w)中克隆 天然p-丙氨酸氨基转移酶(BAAT)的方法。本技术领域的专业人员将 会认识到，类似的方法可用于从任何所需的生物体克隆BAAT。灰色链霉菌(ATCC21897;美国典型培养物保藏中心，American Type Culture Collection, Manassas, VA)在含有1%葡萄糖、0.1% K2HP04、 0.1%蛋白胨、0.05%酵母提取物、0.01% MgS(V7H20和0.2% P-丙氨酸的培养基中生长。在26。C和250 rpm的摇动下，培养物生长 在2.8L瓶的1L体积中。过夜生长后，通过离心收获细胞，用0.2倍体 积的0.85% NaCl清洗，将细胞团(2L培养基的大约10 g细胞)储存 在-80。C直到使用。
将细胞团在冰上融化。将细胞糊转移到研钵中，与大约2g海沙一 起碾磨。将细胞/沙混合物重新悬浮在大约30 ml缓冲液A中(20 mM pH 7.2的磷酸钾，20 nM磷酸吡哆醛，0.01% (3-巯基乙醇)，转移到玻璃 管中，超声裂解细胞。通过离心(30,000 xg离心30分钟)除去细胞 碎片和沙。将上清液加到已经用缓冲液A平衡的DEAE琼脂糖柱，用 缓冲液B (缓冲液A+ 1 MNaCl)以分步梯度(0%， 30%， 50%， 100%) 洗脱蛋白。P-丙氨酸氨基转移酶活性在50%的步骤中洗脱下来。
收集具有活性的级份，浓縮，并加到用缓冲液八+ 150mMNaCl平 衡的Superdex75柱。将具有(3-丙氨酸氨基转移酶活性的级份合并，使 用PD-10柱，用1 mMpH7.2的磷酸钾，20nM磷酸吡眵醛，0.01% p-巯基乙醇作为缓冲液进行脱盐，然后将脱盐的级份加到用缓冲液HA (20nM磷酸吡眵醛，0.01% (3-巯基乙醇)和1%缓冲液HB (100mM 磷酸钟，20)aM磷酸吡哆醛，0.01%^巯基乙醇)平衡的羟基磷灰石柱。 用缓冲液HB的逐步梯度(1%， 10%， 20°/o， 100Q/。)洗脱蛋白。卩_丙 氨酸氨基转移酶活性在100%的步骤中洗脱下来。将蛋白浓縮并保存在 —80。C。
将纯化的蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶上跑动，切下大约48,000道 尔顿的条带并测序。因为灰色链霉菌的基因组核苷酸序列不能公开获 得，使用BLAST软件将得到的肽片段用于搜索已经发表的阿维链霉菌基因组序列，并用于鉴定同源的基因。设计引物用于从阿维链霉菌基
因组DNA ( ATCC#31267D )扩增预测的开放阅读框架 CGGGATCCCTAAACCGTGTACTCGTCC ( SEQ ID NO: 1 )禾口 GGAATTCCATATGACCCCTCAGCCGAATC (SEQIDNO:2)。
使用富含GC的PCR系统(Roche)进行PCR，将得到的PCR片 段用M/el和^mffl消化，并使用快速连接试剂盒(Quick Ligation Kit, Roche)连接到已经用MM和5awHI消化的pET28b中，构建 pET28b/SaBAAT。
天然的阿维链霉菌BAAT cDNA和蛋白序列分别显示在SEQ ID NO: 3和4中。
实施例2
筛选生物学活性增加的BAAT
本实施例描述了用于分离对P-丙氨酸活性增加的BAAT蛋白(以 及编码它们的核苷酸)的方法。类似的方法可用于鉴定其它的BAAT 分子。
简单来说，筛选方法包括将含有BAAT的诱变文库的细胞生长在 以P-丙氨酸作为唯一氮源的培养基上。在这些条件下，只有能够将|3-丙氨酸转变成中间代谢物的细胞才能生长。例如，BAAT可以将p-丙 氨酸和a-酮戊二酸分别转变成丙二酰半醛和谷氨酸，谷氨酸进入中间 代谢并支持细胞生长。
诱变PCR基于Cadwell和Joyce的方案(尸O Me^o^^ p/. 2:28-33: 1992)进行。该方法使用了各种稀释度的诱变缓冲液，该缓冲液含有 21.2 mM MgCl2、2.0 mM MnCl2、3.2 mM dTTP和3.2 mM dCTP。将6.3% 和9.4 % (v/v)的诱变缓冲液加入到不同的PCR反应中(每个终体积为 100 pL)，另外还有含有1,5 mM MgCl2的IX T叫PCR缓冲液、0.25 )iM正向和反向载体引物、200 pM每种dNTP、 5 ng pET28b/SaBAAT DNA作为模板、5%DMSO、以及10单位TaqDNA聚合酶(Roche) 。 PCR程序的组成为在94°C起始变性2分钟；94。C 30秒、54。C 45秒和72°C2.25分钟共30个循环；以及在72。C最终延伸7分钟。
将PCR产物用限制性酶5flw/ZI和7Wfel消化，连接到类似消化的载体pPRONde中，并转化到大肠杆菌Electromax DH10B 细胞中(Invitrogen, Carlsbad, CA) 。pPRONde质粒是pPROLar.A122(ClontechLaboratories, Inc., Palo Alto， CA)的衍生物，其中使用来自Stratagene的QuikChange位点定向诱变试剂盒，通过寡核苷酸定向的诱变在起始ATG密码子处构建了 AWel位点。从随机选取的单菌落分离质粒DNA并测序，以获得对突变率的估计(每1000个核苷酸3个变化)。将多次转化体铺于含有25pg/mL卡那霉素的LB培养基上，获得了大约90,000个菌落。从平板刮下菌落，使用MiniSpin质粒方法(Qiagen，Valencia, CA)制备质粒DNA。将合并的质粒DNA通过乙醇沉淀进行浓缩。
将诱变的阿维链霉菌BAAT质粒文库转化到大肠杆菌BW25113的」g"6r菌株(Datsenko禾B Wanner, /Voc. Wa".爿cad Sc/. 97:6640-5:2000)的电感受态细胞中。gfl6r基因缺失被用于防止该基因编码的宿主的4-氨基丁酸氨基转移酶对(5-丙氨酸的任何可能的活性。转化体在SOC培养基中生长1.5小时，离心，用0.85。/。NaCl清洗，并重新悬浮在0.75mLNaCl中，以除去痕量的氮源。取200 用于接种25 mL不含NH4C1的M9基本培养基，其中添加了 0.5%甘油、50 pM吡哆醇-HCl、100 pM IPTG、 100 mM MOPS pH 7.0、 40 |ug/mL卡那霉素和5 mM (3-丙氨酸。好氧生长5天后，取1 mL培养物用于接种25 mL新鲜培养基。生长6天后，12,000个菌落在丰富培养基上铺板，从合并的菌落分离质粒DNA。
将大约700 ng DNA转化到大肠杆菌」g"6r的幼稚细胞中。将转化体在SOC培养基中回收1小时，离心，用0.85y。NaCl清洗，并用于 接种25mL上述培养基。3天后，将培养物在新鲜培养基中传代培养。 两天后，在含有25pg/mL卡那霉素的LB培养基上进行铺板，获得20，000 个菌落。从这些合并的菌落分离质粒DNA，并用乙酸铵和乙醇沉淀。 该文库被用于实施例3中的筛选。传代培养物也被稀释并铺板于含有5 mM(3-丙氨酸的基本培养基上，以获得个体菌落。将最大的个体菌落挑 到新鲜培养基中，将显示出最好生长的菌落挑到含有5 mM P-丙氨酸、 50 ng/mL水溶性对硝基苯胺和250 pg/mL NaHS04的基本培养基上。
从在染料培养基上显示出良好显色的三个菌落分离质粒DNA，转 化到大肠杆菌」g^r菌株的幼稚感受态细胞中。在液体生长测试中， 将重新转化的菌落在添加有5 mM p-丙氨酸或5 mM谷氨酸的上面给出 的M9基本培养基中进行试验。通过这种筛选方法分离到的改进的克隆 被测序，多个克隆显示出带有突变，导致24位的丝氨酸变成苏氨酸 (S24T)。这种变异被称为BAAT1 (SEQ ID NO: 5和6)。其它的改 进克隆组，尽管活性比S24T突变体低，但带有突变T83A、 S314T和 E348G (BAATlb; SEQIDNO:7和8)。
Purpald 分析
也使用Purpald (Aldrich)醛捕获染料直接测试克隆的丙二酰半 醛生产。反应混合物包含50 mM硼酸钠缓冲液，pH8.0， 0.035% |3-巯 基乙醇，lOmMa-酮戊二酸，0.5mM磷酸吡哆醛，50mM(3-丙氨酸， 以及50-500 pg细胞提取物或大约20 ng纯化的蛋白。或者，100 mM pH 8的磷酸钾缓冲液可用于代替硼酸缓冲液和(3-巯基乙醇。
反应在37°(:温育30分钟，然后通过加入等体积的含有10mg/mL Purpalcf的1NNaOH终止。 一旦紫色开始显现，在535 nm处使用分光 光度法读取反应物的吸光度。
第二轮诱变使用两种不同的第一轮突变体(SEQ ID NO: 5和7)和野生型阿 维链霉菌的(3-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO: 4)作为模板，制备了 诱变文库。文库按照上面的描述构建，不同之处是3.9%和5.5 %的诱变 缓冲液，以及模板被克隆到pPRONde载体中。PCR程序包括在94°C 起始变性2分钟；94。C30秒、55。C45秒和72°C 2分钟共30个循环； 以及在72°C最终延伸5分钟。将PCR产物凝胶纯化并按照上面的描述 克隆，加入Z)/wI消化步骤以消除任何残留的模板。
连接利用来自三种模板的等量DNA。将连接的多次转化物放入 BW25113」ga6r菌株中。转化物在SOC培养基中回收2小时，合并， 清洗，并重新悬浮在1 mL0.85%NaCl中。使用300 重新悬浮物接 种到含有25mL上述筛选培养基的瓶中，培养基含有lmM、 5 mM或 20mM(3-丙氨酸。培养物在37。C生长到OD6(K) 0.5-1.8后，将每种培养 物的大约6,000个菌落铺板于两块含有25ng/mL卡那霉素的LB平板 上。对于每种浓度的(3-丙氨酸，分别从平板刮取菌落，使用MiniSpin 质粒方法制备质粒DNA。将质粒DNA沉淀，获得350-372 ng/uL的浓 度。将每种亚文库2nL重新转化到BW25113」ga6r菌株中，以减少宿 主突变对培养物在P-丙氨酸上生长的作用。
转化物在SOC培养基中回收1小时，清洗，重新悬浮在0.85% NaCl 中。重新悬浮物被用于接种含有1 mM、 5mM或20mM卩-丙氨酸的液 体筛选培养基，并分布的菌落铺板在相同筛选培养基的平板上。在分 布铺板中生长良好的几个菌落被划线纯化，并进一步在液体生长试验 中测试。这些液体生长试验在玻璃培养管中进行，使用了3mL筛选培 养基。使用大约等量的接种物接种培养物，从有前景的培养物分离质 粒DNA，并重新转化到幼稚BW25113」ga6r中，将重新转化体在液体 生长试验中重新试验。将看起来有前景的重新转化体生长在丰富培养 基中，用1 mM IPTG在30°C诱导4小时。使用BugBuster提取试剂 (Novagen, Madison, WI)获得细胞提取物，使用以前描述的Purpald 试剂进行分析。从5 mM p-丙氨酸筛选中分离的最高效突变体，除了第一轮诱变 和筛选的S24T突变之外，还带有F113L突变；该变异体被称为BAAT2 (SEQ ID NO: 9和10)，被克隆到pET28b中以允许蛋白纯化和纯化 蛋白的动力学分析。
第三轮诱变
BAAT2 (SEQIDNO:9)被用作第三轮诱变的模板。诱变按照上 面的描述进行，使用3.9%和5.5%的诱变缓冲液。将突变的PCR产物 克隆到pPRONde载体中，将连接反应物转化到BW25113zlga6r菌株中， 在含有2和5 mM (3-丙氨酸的筛选培养基中进行生长。每两天在新鲜筛 选培养基中传代培养。将第三次传代培养物铺板于筛选培养基上，每 个平板获得大约250个菌落。将最大的菌落挑到新鲜的筛选平板上， 在液体生长试验中使用筛选培养基测试生长最快的菌落。从生长最快 的菌落分离质粒DNA，并重新转化到筛选宿主中。按照上面的描述， 将重新转化的克隆在液体生长试验中重新测试，并进行Purpald⑧分析。
从第三轮诱变获得的最好变异体(BAAT3， SEQIDNO: 11和12) 另外含有A133T突变，来自5 mM卩-丙氨酸筛选。该突变体被克隆到 pET28b中以允许蛋白纯化和纯化蛋白的动力学分析。
将P3H突变体定向诱变为BAAT2和BAAT3突变体 在实施例3中描述了基于用Purpald②试剂测量的活性增加，对改 进的(3-丙氨酸氨基转移酶进行高通量筛选。该筛选导致分离到了具有 附加的P3H变化(SEQIDNO: 13和14，分别为核酸和蛋白序列)的 变异体，并使用Quikchange 多位点定向诱变试剂盒(Multi Site-Directed Mutagenesis Kit , Stratagene)将该突变转移到BAAT2 (SEQIDNO:9)和BAAT3 (SEQIDNO:ll)变异体中。用于诱变
的 引 物 具 有 如 下 序 歹lj :
5，Phos-AAGGTACATATGACCCATCAGCCGAATCCC-3, (SEQ ID NO:15)。
Dpwl处理过的反应物被直接转化到BW25113zlga6r菌株中。通过 PCR鉴定含有所需突变的菌落，并通过测序证实。使用50mM底物， 用Purpald试剂对来自诱导细胞的提取物进行的分析，证实了由于P3H 突变，醛的生产增加了大约2.5倍。带有来自第三轮诱变和筛选的突变 以及P3H变化的变异体被命名为BAAT3ML(SEQIDN0: 16和17)。
第五轮诱变
BAAT3ML (SEQIDNO: 16)被用作第五轮诱变的模板。诱变按 照前面的描述进行，使用3.9%和5.5%的诱变缓冲液。将突变的PCR 产物克隆到载体pCEK/Pgaam8-l/PpmmsB/Spaat中，其中Pgaam8-1是 编码丙氨酸2,3-氨基变位酶的基因，PpmmsB是编码恶臭假单胞菌甲基 -丙二酰半醛脱氢酶的基因(参见实施例5) ， Spaat是编码粟酒裂殖酵 母(Sc/ /z(wacc/ aromj;cw;7om6e)的谷氨酸-丙酮酸氨基转移酶的基因。 清洁过的连接反应物被转化到大肠杆菌ElectromaxTM DH10B 细胞 中，通过从大约78,000个菌落的合并物制备质粒DNA来构建文库。将 2.3 ug文库转化到BW25113」ga6r或在yd/G基因前整合有启动子的 BW25113菌株中(BW25113々a677 Plac.ara>^/G)。后一种菌株被用于 减少丙二酰半醛生产的可能毒性效应，因为ydfG基因产物可以将丙二 酰半醛还原成3-羟基丙酸(实施例5)。
回收后，将转化物在筛选培养基中生长(不含NH4C1的M9基本 培养基，添加有lmMp-丙氨酸、1%葡萄糖、50 iiM吡哆醇-HCL、 500 ^MIPTG、 100 mM MOPS pH 7.0、 40 |ig/mL卡那霉素)。在新鲜筛选 培养基中2-3次传代培养后，将菌落铺板于筛选培养基上，每个平板上 获得了大约400个菌落。将最大的菌落挑到新鲜筛选平板上，在液体 生长试验中使用筛选培养基测试生长最快的菌落。
从生长最快的克隆分离质粒DNA，并重新转化到BW25113」ga677Plac.May"/G宿主中。将重新转化的克隆在液体生长试验中重新测试，从 重新转化体分离质粒以证实质粒稳定性。将最好的突变体克隆到 pET28b中，以允许蛋白纯化和纯化蛋白的动力学分析。
来自于第五轮诱变的最好变异体被命名为BAAT5-9 (SEQ ID NO: 18和19，分别为核酸和蛋白序列)，它含有额外的编码突变D110N和 沉默突变c207t、 c381g和t471c。
图2A-B显示了改进的p-丙氨酸氨基转移酶(SEQIDNO:6、 10、 12、 14、 17和19)与天然序列(SEQIDNO:4)比较的氨基酸序列比 对。
实施例3
筛选改进的p-丙氨酸氨基转移酶
本实施例描述了用于鉴定能够增加BAAT生物学活性的氨基酸变 化的高通量筛选。
各带有来自实施例2的第一轮PCR诱变文库的克隆的单个菌落生 长在具有透明底的384孔微量滴定板的单个孔中，以允许读取光密度。 培养基是含有卡那霉素(50ng/ml)和IPTG UmM)的LB培养基。将 带有接种菌落的板盖上盖子，在旋转装置上放在37。C培养箱中24小 时。使用了机械操作系统(Beckman-CoulterBiomeck，带有ORCA臂， 使用内部开发的软件运行，装备有界面分光光度计)来鉴定OD,超 过固定阈值的菌落，将45 nl这样的培养物转移到96孔板中。
在每个孔中加入5 nl Popculture (Novagen)溶液(100 nl Popculture , 10 pl rLyso ( 1/750稀释)和2 pl benzonase)，混合两次。 温育30分钟后，加入100 pi底物混合物(0.13 mM磷酸吡眵醛，66.5 mM 磷酸钾，13.3mMa-酮戊二酸，26.6 mM (3-丙氨酸)。然后将板从机械 传送带上取出，用自粘性铝膜密封，在37。C下以200 rpm混合。两小时后，除去铝封，将板放回到机械传送带上，加入140 ^
Purpald (Aldrich)溶液(10 mg Purpald 在1 ml 2M NaOH中)以检
测醛。将板在室温温育45分钟以显色。通过加入10^195%乙醇来除去 在Purpald 温育期间可能产生的气泡。自动化比色测试读数在540 nm 处进行。
将被鉴定为产生的醛量增加的克隆回收，纯化其质粒，对P-丙氨 酸氨基转移酶基因进行测序。这些克隆带有突变，导致3位的脯氨酸 另外变成组氨酸(P3H) (SEQIDNOS: 13和14，分别为核酸和蛋白 序列)。
实施例4
f3-丙氨酸氨基转移酶活性的分析
本实施例描述了用于测量BAAT生物学活性的体外方法。这种分 析方法可用于确定具体的BAAT变异体、融合物或片段是否保留了所 需的BAAT生物学活性。
使用金属亲和层析，按照制造商(Novagen)的描述对克隆到 pET28b中的p-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO: 3、 5、 9、 11、 16和 18)进行纯化。通过跟踪|3-丙氨酸和a-酮戊二酸产生L-谷氨酸来测量 纯化的酶的酶活性。反应混合物含有50mMHEPPS， pH 8.0， 10 mM a-酮戊二酸，0.2mM5-磷酸吡哆酸，以及不同量的(3-丙氨酸和酶。温育 在25°C下进行，以30秒的时间间隔取出0.05 mL的等份样，加入到 0.15 mL反应淬灭缓冲液中(50%甲酸/50% 50 mMHEPPSpH 8)。通 过在使用来自Pickering的pH 3.28和pH 7.48缓冲液作为流动相建立的 AMINOSep-511柱(Transgenomic)上进行高压离子交换层析，然后用 邻苯二甲醛进行柱后衍生以及荧光计检测，来测定L-谷氨酸。
改进的BAATs的比活和它们对P-丙氨酸的Km显示在表1中。1 U = 1 (xmol/min b对于P-丙氨酸来说
°未测定 实施例5
3-HP脱氢酶的克隆
本实施例描述了在例如细胞中克隆可用于将丙二酰半醛转变成
3-HP的3-HP脱氢酶的方法。
按照Gokarn等US 2004/0076982中的描述，从铜绿假单胞菌分离 了具有3-HP脱氢酶活性的蛋白(PammsB)的编码基因(SEQIDNO: 20)。纯化的酶(SEQIDNO:21)的比活为70U/mg，对丙二酰半醛 的Km为4.5 mM; NADH是优选的还原剂。
按照Liao等的PCT WO 03/062173 A2中的描述，从粪产碱杆菌 U/ca/Zge"^/aecafo) M3A分离了具有3-HP脱氢酶活性的蛋白(SEQ ID NO: 23)的另一个编码基因(SEQ ID NO: 22)。
通过从恶臭假单胞菌KT2440菌株的基因组DNA(ATCC 47054D) 扩增mm"基因，克隆了具有3-HP脱氢酶活性活性的蛋白的又一个编 码基因。扩增引物允许克隆(PpmmsB)，并在含有BAAT3ML卩-丙氨 酸氨基转移酶的pPRONde载体的7VWI和X^I位点中提供了导入的核 糖体结合位点。
表l:改进的B-丙氨酸氨基转移酶的性质 酶(突变)
_(Ua/mg)
野生型BAAT
BAAT1 (S24T)
BAAT2(S24T,F113L)
BAAT3 (S24T, F113L, A133T) 1.2
BAAT3ML (P3H, S24T, Fl 13L, A133T)
BAAT5-9 (P3H， S24T， D110N, F113L, A133T)
K
活^
比，§
3 J d
o 1 n MCATTCATTGGC-3, ( SEQ ID NO: 24 ) 禾口 5'誦CCTAGTCTAGATCAATCCTTCTTGCGATACCCCT-3' ( SEQ ID NO: 25)
SEQ ID NO: 26和27分别为恶臭假单胞菌3-HP脱氢酶基因的核 苷酸和蛋白序列。与铜绿假单胞菌3-HP脱氢酶(SEQ ID NO: 21)相 比，该酶显示出较高的生产，并且在带有BAAT3ML的大肠杆菌 BW25113 A;^/G宿主中以P-丙氨酸作为唯一氮源上允许更好地生长。
为了增加蛋白的生产，将通过Proteoexpert程序设计的含有密码子 2-7各种组合的文库，构建到pET28b/BAAT5-9载体中。使用的引物含 有简并的核苷酸，其中掺入了由Proteoexpert软件建议的变化(48种组 合)。
5' -GG AGGTATTTATATGCGT AT YGC WTT YAT YGGHCTGGGC AACATGGGCGCGCC-3， (SEQ ID NO: 28)。
引物在简并区的任一端还包含20个碱基的序列。紧靠简并区的上 游和下游但不包含简并区的基因片段被分别扩增。用于制造这些片段 的模板含有BAAT5-9基因，并且PpmmsB基因被克隆在其下游的 和A^el限制性位点中。上游片段包括BAAT5-9基因的一部分， 以简并区上游的20个核苷酸终止。下游片段从简并区下游的20个碱 基开始，并含有PpmmsB的3'末端。然后使用与片段的5'和3'末端同 源的引物，将简并引物用于在第二次DNA扩增中将这两个片段桥接起 来。从第二轮产物中用B"mM和A7zel切下含有3-7位氨基酸残基的简 并密码子文库的PpmmsB基因，克隆到pET28B/BAAT5-9载体的5amM 和7Vort位点中。
在转化到菌株BW25113 A;^wZ) (DE3)中后，将随机菌落转移 到含有100 ^MIPTG的LB中进行诱导。生长良好的菌落被转移到含有5 mM (3-丙氨酸的筛选培养基和含有卩-丙氨酸和醛捕获染料(副蔷薇苯 胺氯化物，Sigma P-3750)的筛选培养基中。筛选培养基包含不含NH4C1 的M9盐、100 mM MOPS pH 8.0、 100 吡眵醇-HCl、 1%葡萄糖、5 mM(3-丙氨酸、40 pg/mL卡那霉素、500 pM IPTG，以及微量元素。有 少数菌落在筛选培养基上生长得比平均情况好。其中，31号菌落的颜 色比其它的更深。两个菌落，包括31号菌落，在染料培养基上颜色较 浅，这是如果丙二酰半醛被快速转化成3-HP所预计的。
测试了几个克隆将卩-丙氨酸生物转化为3-HP。将克隆在含有25 pg/mL卡那霉素的LB培养基中于37C生长过夜，以1:24传代培养到 12mL含有25 pg/mL卡那霉素和10 pM泛酸盐的2YT培养基中。培养 物在37。C生长，在OD 0,4-0.6时用100 pM IPTG在34°C诱导5小时。 总OD为7200的培养物体积被旋转下来，重新悬浮在1.7 mL生物转化 培养基中。将1.5 mL重新悬浮物转移到2 mL的玻璃HPLC管中，置 于34°C下以225 rpm摇动。生物转化培养基含有不含NH4C1的M9盐、 100 mM MOPS pH 8.0、 100 吡卩多醇-HCl、 1%葡萄糖、5 mM p-丙氨 酸和20 |iM泛酸钙。将17小时后收集的样品通过加入5%体积的90% 甲酸进行酸化，并通过LC/MS测试3-HP的浓度。31号菌落给出了最 高百分率的(3-丙氨酸到3-HP的转化(35 mg/L 3HP对野生型PpmmsB 对照的2mg/L)，通过SDS聚丙烯酰胺凝胶中条带密度来判断，也显 示出最高的PpmmsB蛋白的表达。
SEQ IDNO: 29是PpmmsB31的核苷酸序列；蛋白序列与SEQ ID NO: 27 —致。使用标准的克隆、DNA扩增或定向诱变技术将 BAAT5-9/PpmmsB31序列结合到几种不同的操纵子中，以生产3-HP。
在另一个实施例中，使用基因组文库筛选来鉴定通过除去潜在有 害的丙二酰半醛来增加BAAT表达的蛋白。这通过将基因组文库克隆 到含有活性BAAT的载体中、并在含有(3-丙氨酸作为唯一氮源的基本 培养基上筛选来进行。含有编码增强BAAT活性的蛋白的插入片段的细胞将生长得更加有效，因此当生长于筛选培养基上时尺寸更大。
BAAT活性可以通过例如增加(3-丙氨酸的摄入、降低(5-丙氨酸的分泌、
增加辅因子利用、或增加丙二酰半醛的加工来增加。
将大肠杆菌zlgfl6r的基因组DNA用限制性内切酶^"^41消化， 使用来自Qiagen (Valencia, CA)的试剂盒将大小为1到3 Kb的片段 凝胶纯化。将纯化的DNA连接到含有改进的P-丙氨酸氨基转移酶 (BAAT2， SEQ ID NO: 9)的pPRONde载体中，转化到大肠杆菌」ga6r 细胞中。将转化反应物在1 mL SOC培养基中回收1小时，离心，用 0.85% NaCl清洗，重新悬浮在1 mL 0.85% NaCl中。将20pL重新悬浮 物铺于含有25貼/ml卡那霉素的LB培养基上，以获得菌落计数。将剩 余的转化反应物铺于M9基本培养基上，每个板获得大约600个菌落。 该M9培养基是基于标准的M9培养基，只是不含NH4C1，并添加有0.5% 甘油、50 nM吡眵醇-HCL、 lOO)iiMIPTG、 100 mM MOPS pH 7.0、 40 jig/mL卡那霉素、以及2mMP-丙氨酸。
生长两天后，看到8个大菌落(从总共大约7,000个中)比平板 上的其它菌落大几倍。将这些菌落进行菌落纯化，分离它们的质粒， 通过限制性酶消化比较插入片段。在8个菌落中，有6个带有独特大 小的插入片段。对这些克隆的插入DNA片段进行测序，使用BLAST 软件将序列结果与大肠杆菌基因组数据库进行比较。所有的6个克隆 都与大肠杆菌基因组的同样区域同源。其中包含所有插入片段中的基 因之一是；^/G基因(SEQIDNO:30和31)，它被注解为可能的脱氢 酶。因此，由于该基因在多拷贝质粒中的存在而增加表达的生长增强 效应，可能是由于它将丙二酰半醛转变成3-HP的能力，因此或者减轻 了丙二酰半醛的潜在毒性，或者通过除去了改进的P-丙氨酸氨基转移 酶催化的反应产物之一，而增加将氮从P-丙氨酸插入到L-谷氨酸中的 速度。
根据这些结果，少J/G编码的蛋白可以与BAAT组合使用以增加3-HP的生产。例如，表达ydfG的核酸分子可以与BAAT—起在细胞 中表达，以增加细胞的3-HP生产。
将y々G基因克隆到pET28b载体中(Novagen, Madison, WI)，以 允许纯化和对纯化蛋白的动力学研究。用于该克隆的引物具有加入的 限制性位点，以允许克隆到A^/el和5amM位点中。 GGTAGACATATGATCGTTTTAGTAACTGGAGCAAC (SEQ ID NO: 32)禾口 GTTCTCGGATCCTTACTGACGGTGGACATTCAGTC (SEQID NO: 33)。片段的扩增使用PfuDNA聚合酶来进行，以最小化扩增错 误，使用的退火温度为58°C。将大约750 bp的PCR产物条带进行凝胶 纯化，用Wc/el和Baw/n消化，并使用NEB快速连接方法(New England BioLabs, Waverly MA)连接到已经用同样酶消化的pET28B载体中。 将连接反应物转化到大肠杆菌ElectromaxTMDH10BTM细胞中，铺于含 有25 ng/ml卡那霉素的LB培养基上。将来自显示出正确插入大小的菌 落的质粒DNA进行测序，显示出与来自大肠杆菌MG1655的序 列一致。纯化的酶对丙二酰半醛的比活为48.5 U/mg， Km为3.7mM; NADPH是该酶使用的唯一辅因子，使用NADH没有获得活性。
脱氢酶的辅因子偏好性被扩展或改变的例子在本技术领域中是已 知的，这些方法可用于开发利用NADH的变异体ydfG蛋白。在BAAT 和诱变的^"/G基因的存在下，在本身的ydfG功能被缺失的宿主中(例 如」yd/G大肠杆菌菌株)，在含有P-丙氨酸作为唯一氮源的基本培养 基上进行生长筛选，是鉴定利用NADH的脱氢酶的一种方法。
实施例6
含有BAAT和3-HP脱氢酶的合成操纵子
本实施例描述了包含BAAT和3-HP脱氢酶的操纵子。这些操纵 子可以被转化到细胞中，以允许在细胞中生产3-HP或其衍生物，例如 通过将操纵子整合到细胞的染色体中。尽管描述了具体的BAAT和 3-HP脱氢酶，但本技术领域的专业人员将会认识到，类似的方法可用于其它的BAATs (例如SEQ ID NO: 5、 7、 9、 13、 16或19)和3-HP脱 氢酶(例如SEQ ID NO: 20、 22或30)。
含有BAAT (SEQ ID NO: 11)和3-HP脱氢酶(SEQ ID NO: 27) 的合成操纵子的整合使用Purvis等￡"w>ow. A/&ro6/o/. 71:3761-9， 2005)描述的基于Tn5的系统来实现。将质粒pCEK-B AAT3 ML-PpmmsB 用限制性内切酶禾口 JwII消化，将带有Plae/ara启动子和 BAAT3ML-PpmmsB基因的DNA片段连接到用^7wl和5) el消化的质 粒pLOI3472中。然后将获得的构建物pLOI-Bm3用消化，将带 有Piac/ara启动子、BAAT3ML-PpmmsB基因和旁侧带有FRT位点的卡 那霉素抗性标记连接到用同样的内切酶消化的pL013469中，以便来自 pLOI-Bm3的整个片段的旁侧为pLOI3469上存在的Tn5转座酶的外端 (OE)和内端(IE)识别位点。将连接混合物转化到大肠杆菌菌株 BW25141中(Datsenko和Wanner, iVoc.胸/. jcad 固97:6640-5， 2000; BW25141是^>+菌株，支持带有源自R6K的复制原点的质粒例 如pLOI3469的复制)。得到的质粒plnt-Bm3可以通过转化或接合导 入到非内rf的耙菌株中，转座酶的作用使得来自pLOI-Bm3的片段插 入到靶菌株染色体的随机位点中，而pLOI-Bm3本身不能在该宿主中复 制。
在一个实施例中，将pINT-Bm3转化到大肠杆菌11303 AW/z乂
A/w<c-D)Kiyw中(其中遗传标记Kiyw表示在yw乂基因前方插入了
合成的P^/^启动子)。筛选对卡那霉素具有抗性但对氨苄青霉素敏感 (表明失去了 pLOI-Bm3质粒)的转化体，获得了其中 BAAT3ML-PpmmsB构建物被整合到染色体中的菌株；带有整合基因的 菌株被命名为INT(BAAT3ML/PpmmsB)。这些基因的存在，通过如同 实施例2中描述的在卩-丙氨酸作为唯一氮源上生长、通过在p-丙氨酸 存在下生产3-HP、通过在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上观察到 BAAT3ML禾n PpmmsB蛋白条带的存在、或者通过提取物的酶法分析， 得到了证实。按照上面的描述还产生并整合了带有改进的变异体BAAT5-9 (SEQIDNO:18)和PpmmsB31 (SEQIDNO:29)的类似构建物。
通过基于P1的转导，使用卡那霉素抗性标记监测基因在受体染色 体中的整合，将整合的BAAT-mmsB基因导入了其它大肠杆菌菌株。
实施例7
克隆天冬氨酸脱羧酶基因
本实施例描述了用于从丙酮丁醇梭菌和阿维链霉菌克隆天冬氨酸 脱羧酶的方法。天冬氨酸脱羧酶可用于将天冬氨酸转化成P-丙氨酸(参 见图1)，例如在其中表达外源天冬氨酸脱羧酶的细胞中。本技术领域 的专业人员将会认识到，类似的方法可用于从其它所需物种克隆天冬 氨酸脱羧酶，例如其中需要3-HP生产的细胞物种中。
按照下述从丙酮丁醇梭菌和阿维链霉菌克隆编码天冬氨酸脱羧酶 (由pa"Z)基因编码)的基因。将丙酮丁醇梭菌(ATCC 824)细胞在5 ml强化的梭菌培养基(Oxoid CM149)中厌氧生长，使用基因组 "Puregene" DNA分离试剂盒(Gentra Systems; Minneapolis, MN)分 离基因组DNA。阿维链霉菌基因组DNA从ATCC获得(ATCC 31267D)。这两种基因组DNAs被用作模板扩增相应的/7a"D基因。
对于丙酮丁醇梭菌的pa"D设计了下列引物 5' -GGAATTCCATATGCATTTAAATATGTTAAAATC-3' (CapanNdeF; SEQ ID NO: 34 ) 和
5 ，隱ACCCAAGCTTTAGCCAATTGTCCCGTGCTTTTC-3' (CapanHdR; SEQ ID NO: 35)。丙酮丁醇梭菌在有100 ng基因组DNA、 CapanNdeF、 CapanHdR引物禾口 P/w Turbo聚合酶(Stratagene, La Jolla， CA)的100 |Ld PCR中扩增。PCR条件是94°C 2分钟；94°C 30秒，48°C 30秒和72°C 45秒共10个循环；94。C30秒，50°C 30秒和72°C 45秒共15个循环，结束时72°C最终延伸7分钟。
阿 维 链 霉 菌 的 引 物 是
5'-GGAATTCCATATGCTGCGTACCATGTTCAAGTC-3， ( SapanNdeF; SEQ ID NO: 36)和5，-ACACAAGCTTTAGGCGGTGACGGCCTGC-3， (SapanHdR; SEQIDNO:37)。阿维链霉菌DNA在有100 ng基因组 DNA、 SapanNdeF、 SapanHdR引物以及2 ul r77/ 聚合酶(Applied Biosystems, Foster City, CA)禾卩0.5 ul尸/w Turbo聚合酶(Stratagene， La JolIa，CA)的混合物的100 jilPCR中扩增。PCR条件是94。C2分钟； 94°C 30秒，52°C 30秒和70°C 45秒共10个循环；94°C 30秒，56°C 30 秒和70°C 45秒共15个循环，结束时70°C 7分钟。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen， Inc., Valencia, CA)，按照 制造商的说明书纯化获得的PCR产物。将纯化的PCR产物和pPRONde 载体用7Wfel和///mmi限制性酶在37°C消化过夜。然后将pPRONde 载体用牛肠碱性磷酸酶(New England BioLabs, Ipswich, MA)按照制造 商的说明书处理1小时，并使用Qiagen凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化。 将A^el和消化的PCR产物在75°C加热30分钟，使限制性酶 失活，直接用于与凝胶纯化的载体进行快速连接反应(New England Biolabs)。在5分钟的连接后，使用Qiagen PCR纯化试剂盒对反应混 合物进行缓冲液交换，并使用1 W连接反应物转化电感受态大肠杆菌 DH10B细胞。将转化的细胞铺于添加了 25 pg/ml卡那霉素的LB平板 上，对得到的菌落测试pa"D基因的存在。
对阳性克隆进行测序，以证实准确性，并重新转化到大肠杆菌五. co// 11303 AW/zA A/7awC-D K|/W中。得到的克隆被用于生物转化和天冬 氨酸脱羧酶分析。SEQ ID NO: 38和39分别描述了丙酮丁醇梭菌的天 冬氨酸脱羧酶基因(CapanD)的核苷酸和蛋白序列。SEQ ID NO: 40 和41分别描述了阿维链霉菌的天冬氨酸脱羧酶基因(SapanD)的核苷 酸和蛋白序列。对于生物转化来说，将带有pPROCapanD和pPROSapanD质粒的 细胞生长在添加有25 ^g/ml卡那霉素的2YT培养基中直到 OD6(K) 0.6-0.8，并用1 mM IPTG诱导6小时。诱导后，将细胞沉淀， 在添加有10 g/L葡萄糖、100mM MOPS pH 8.0、 100 pM吡哆醇-HCL 和10pM泛酸盐的M9培养基中，或在添加有0.4g/L葡萄糖、20 mM 天冬氨酸、100 mM MOPS和10 pM泛酸盐的不含氮源的M9培养基中， 重新悬浮到OD6oo为大约4。生物转化在含有1 ml培养基的14 ml Falcon 管(目录号2059)中，在37。C和225 rpm下进行20小时。在生物转 化结束时，将细胞沉淀，在上清液中加入甲酸到5%使其酸化，过滤， 按照实施例4中的描述通过HPLC分析从只有葡萄糖或从葡萄糖和天 冬氨酸产生的P-丙氨酸。
图表2所示，从只有葡萄糖产生的P-丙氨酸为大约2 mM。在生物 转化培养基中加入天冬氨酸使(3-丙氨酸的生产增加了 2-3倍。
表2:通过天冬氨酸脱羧酶生产的B-丙氨酸
质粒_培养基_p-丙氨酸(mM)
pPROC叩anD 葡萄糖 2.1 pPROSapanD葡萄糖 1.9
pPROCapanD葡萄糖+天冬氨酸 7.6 pPROSapanD葡萄糖+天冬氨酸_
通过测量天冬氨酸到P-丙氨酸的转化，分析了粗提取物中的天冬 氨酸脱羧酶活性。将带有质粒pPROEcpanD、 pPROCapanD和 pPROSapanD的细胞在2YT培养基中生长到OD, 0.4-0.6，并用1 mM IPTG和0.2。/。阿拉伯糖诱导6小时。诱导后，将细胞沉淀，重新悬浮在 50mMHEPPS (pH=8.0)缓冲液中。使用French压力器将细胞破碎。 标准反应混合物含有1.2 mM天冬氨酸、50 mM HEPPS (pH=8.0)和 0.4 mg粗酶液，终体积为1 mL。在37。C温育后，在定期的间隔取出 50 pl反应混合物，用150 pl终止溶液(10%甲酸)淬灭。沉淀的蛋白 通过离心除去，按照描述对每个样品中的|3-丙氨酸进行定量。粗提取物中天冬氨酸脱羧酶活性的比活显示在表3中。 表3:粗提取物中天冬氨酸脱羧酶的活性
质粒_比活(U/mga)
pPROEcpanD 0.004 pPROSapanD 0.074 pPROCaoanD 0.048_
a 1 U = 1 pmol/min
通过用每个细胞平均拷贝数为30~50的来自ColEl的复制原点代 替每个细胞平均拷贝数为15的质粒pPROSapanD的pl5a复制原点， 细胞提取物中天冬氨酸脱羧酶的比活增加到0.54U/mg。
实施例8
用表达panD、 BAAT和3-HP脱氢酶的细胞生产3-HP 本实施例描述了用于在体内通过在细胞中表达外源天冬氨酸脱羧 酶、P-丙氨酸氨基转移酶和3-HP脱氢酶生产3-HP的方法。尽管使用 了具体的酶序列，但本技术领域的专业人员将会认识到，本技术领域 已知的或本文公开的其它这样的序列也可以使用。
表达整合到染色体中或者存在于一种或多种质粒中的外源panD 基因(SEQIDNO:40)、外源BAAT5-9基因(SEQIDNO:18)和外 源PpmmsB31基因(SEQIDNO:29)的细胞，能够从葡萄糖生产3-HP (图1)。在这样的细胞的一个实施例中，将在染色体中整合了 BAAT5-9-PpmmsB31基因的宿主用质粒pCECSapanD转化。宿主源自 大肠杆菌菌株ATCC 11303 (B菌株)，并还带有遗传标记Apa"(r-DJ
将转化体生长在添加了氯霉素以维持质粒的LB培养基中，在30°C 生长6小时，然后稀释100倍到过夜表达培养基(Novagen/EMD Biosciences, Madison WI)中，按照制造商的描述，只是碳源(过夜表达试剂盒中的溶液1)用0.1% (w/v)葡萄糖和2 % L-阿拉伯糖代替， 并另外含有30 pg/ml氯霉素、20 ^M泛酸钙和1 mMIPTG。将细胞在 30°C生长大约18小时，然后将0.25-ml的部分用0.75 ml生物转化培 养基(M9盐，0.1 M MOPS, pH 8.0， 133 pM吡眵醇，2.67 %葡萄糖， 13.3 mMNaHC03)稀释，在30°C继续温育23小时。通过离心回收培 养上清液，用0.05体积的90%甲酸(终浓度大约1M)酸化。
按照WO 2005/118719 A2中的描述，通过LC/MS对上清液中的 3-HP进行定量。简单来说，层析在Waters 2690液相色谱系统中进行， 使用2.1 mm x 250 mm Phenomenex Aqua C18反向色谱柱，在45。C下 使用含有0.1% (v/v)甲酸的1%甲醇:水作为流动相，以0.18 ml/min的 流速进行等度洗脱。在电喷雾负离子状态(-ESI)下操作的Micromass
ZQ四极质谱仪的参数被设置如下毛细管2.0 kV;锥体25 V;提 取器4 V; RF透镜IV;源温度120°C;去溶剂化温度380°C; 去溶剂化气体600 L/h;锥体气体关闭；低质量分辨率15.0;高质 量分辨率15.0;离子能量0.2;放大器650。建立起选定的监测
MS参数的离子，以允许选择m々89，对应于3-HP的去质子分子离子 [M-H]-。
带有pCECSapanD上的天冬氨酸脱羧酶基因、以及整合在染色体 中置于合成的P^/^启动子的表达控制之下的BAAT和3-HP脱氢酶基 因的细胞，积累2.7g/L3-HP。
实施例9
乙酸和丙酮酸对p-丙氨酸氨基转移酶的影响
本实施例描述了用于确定乙酸和丙酮酸对p-丙氨酸氨基转移酶的 生物学活性的影响的方法，这种影响通过3-HP的生产测定。乙酸和丙 酮酸是大肠杆菌代谢的天然产物，在某些实施例中希望减少或消除它 们，因为它们可以在3-HP途径中消耗前体并抑制酶。乙酸在厌氧和好氧条件下都降低BAAT的体内生物学活性。将带 有载体pCEC/SapanD的大肠杆菌11303 A/7fa Aac^五A/h"BCD AW/z^ 4d朋(T-Z^ A/ ox5 INT(BAAT5-9/PpmmsB3 l)的培养物，在30。C下生长 在含有氯霉素的LB培养基中。该培养物被用于接种在125mL瓶中的 20 mL修改的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD6()()为0.05。对 培养基的修改包括用浓度为0.1%的葡萄糖和2%的阿拉伯糖代替溶液 1，以及添加20uM泛酸钙、25ug/mL氯霉素、100 uM吡眵醇-HCl和 1 mM IPTG。在诱导培养基中生长17小时后，OD,为8.4。将总共32,500 OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在7.313 mL葡萄糖或 P-丙氨酸生物转化培养基中。葡萄糖生物转化培养基由M9盐、100 mM MOPSpH8、 1%葡萄糖、500 uM IPTG和50 uM吡眵醇-HCl组成。p-丙氨酸生物转化培养基除了葡萄糖生物转化培养基的成分之外，还含 有16 mM p-丙氨酸。
对于好氧生物转化来说，分取900 uL重悬浮培养物到14 mL Falcon管中，用水和/或乙酸钠(pH7)将体积调整到1 mL。对于厌氧 生物转化来说，分取1.35mL重悬浮培养物到1.8mL玻璃小瓶中，用 水和/或乙酸钠(pH7)将体积调整到1.5mL。加入的乙酸钠的终浓度 是0、 20mM和100mM，生物转化温育在30°C下，以225 rpm摇动。 来自卩-丙氨酸的好氧培养物在生物转化后3小时获得样品，来自P-丙 氨酸的厌氧培养物和来自葡萄糖的好氧培养物在6.5小时后获得样品， 来自葡萄糖的厌氧培养物在28小时后获得样品。培养物上清液用0.05 体积的卯％甲酸酸化，离心，过滤，按照实施例8中的描述分析3-HP 的产生。
在好氧条件下，20 mM乙酸导致来自P-丙氨酸的3-HP减少22%， 来自葡萄糖的3-HP减少28%。在同样条件下100 mM乙酸导致来自(3-丙氨酸的3-HP减少47%，来自葡萄糖的3-HP减少52% (表3)。在 厌氧条件下观察到的3-HP的减少在8-29%的范围内，并且由于在所有 培养物包括没有添加乙酸的对照中都存在乙酸作为天然发酵产物而可能更低。尽管该生物转化在pox5和/7to基因都缺失的菌株中进行，但 在某些培养条件下，仍然可以观察到乙酸的产生。
表4:乙酸对3-HP生产的影响
底物条件_加入的乙酸(mM) 产生的3-HP (mg/L)
卩-丙氨酸好氧0180
20140
10095
厌氧071
2065
10061
葡萄糖 好氧088
2063
10042
厌氧038
2030
10022
还使用偶联分析测量了乙酸对细胞提取物中BAAT酶的体外生物 学活性的影响，其中BAAT催化的反应的丙二酰半醛产物被3-HP脱氢 酶还原。通过将离心收集的细胞用Bugbuster (EMD/Novagen, Madison WI )按照制造商的描述重新悬浮，制备了带有整合的 BAAT5-9/PpmmsB31的细胞提取物。在Costar 3635透紫外线的96孔 平底板(Corning Incorporated, Corning NY)的孔中形成了终体积为200 Hl的反应混合物，其中含有50 mM pH 8.0的磷酸钾、100nM磷酸吡 眵醛、7.5 mM a-酮戊二酸、20 mM卩-丙氨酸、1 mM NADH、 0.4 mg 细胞提取物蛋白。反应的进行监测为由于NADH的氧化而导致的A34() 的降低。乙酸或丙酮酸的影响通过加入最多20 mM的任一种化合物(作 为中性的Na+盐)而测定。
使用这种体外分析，在10 mM乙酸或丙酮酸的存在下， BAAT-3-HP脱氢酶系统的活性被减少了大约50%。
基于这些观察，当在体内通过表达BAAT的细胞生产3-HP时， 减少乙酸或丙酮酸的存在增加3-HP的生产。实施例10
通过减少乙酸生产增加3-HP生产的宿主突变 本实施例描述了在例如表达外源BAAT的细胞中减少乙酸的生 产，从而增加3-HP生产的方法。
在实施例9中获得的结果表明，当乙酸生产减少或不存在时，3-HP 的生产增加。这可以通过例如在Vemuri等五"v/ro". M/croWo/. 72:3653-61, 2006)中描述的发酵工艺控制、或通过使用由于不存在编 码催化乙酸产生的酶活性的基因而导致乙酸的生产减少的菌株、或这 两种方法的组合来实现。
任何减少乙酸产生的方法，不论是通过遗传操作还是通过控制培 养基和/或生长条件或是这二者，都可以从任何利用p-丙氨酸氨基转移 酶的途径增加3-HP的生产。通过大肠杆菌菌株减少乙酸生产的一种方 法是缺失poxB基因，该基因编码丙酮酸氧化酶。丙酮酸氧化酶将丙酮 酸代谢为乙酸和co2，主要在应激下的培养物中或在好氧条件下的稳 定期中表达。产生乙酸的另一个重要途径是从乙酰CoA的ad^"途径， 主要在厌氧条件下有活性。
下面的实施例说明了可破坏大肠杆菌中的基因、例如poxS基因的 方法。使用下面的引物从质粒pKD4 (Datsenko和Wanner, iVoc. A^/. Sc/.园97:6640-5， 2000)扩增了旁侧带有FRT的卡那霉素标记
AAACAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC -3' (poxBkoF; SEQ ID NO: 42)禾P 5，-TCATGGCATGTCCTTATTATGACGGGAAATGCCACCCTT TTTACCTTAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3' (poxBkoR; SEQ ID NO: 43)。
扩增使用rTthDNA聚合酶XL (Applied Biosystems)按照制造商 的说明书进行，使用了退火温度为52°C的8个循环和退火温度为60°C的22个循环，以及在68°C延伸2分钟。将扩增产物凝胶纯化(Qiagen)， 用限制性内切酶D/ wI消化3小时，使用Qiagen PCR纯化柱净化。将 纯化的DNA (100 ng)转化到带有诱导的Red辅助质粒pKD046 (Datsenko和Wanner， 2000)的BW25115感受态细胞中，将转化的细 胞铺于含有25吗/mL卡那霉素的LB培养基上。
将获得的菌落重新划线进行纯化，，使用了被置换区域上游 (poxBupF)和下游(poxBdnR)的引物检测单个菌落中所需的整合 5，-GGGATTTGGTTCTCGCATAATC-3' (poxBupF; SEQIDNO:44) 和5'誦GTAGGGTCGTCTCCGTAAAC -3， (poxBdnR; SEQ ID NO: 45)。
从BW25113A pox万::kan菌株制备Pl噬菌体裂解物，用于将突变 转移到带有AW" A"c^￡ A/h/ABCD AW/l4 Apa"fC-^)的大肠杆菌 ATCC11303中。按照Datsenko和Wanner (2000)中勾画出的方法消 除卡那霉素标记，不同之处在于pCP20转化体在30°C下含有羧苄青霉 素的液体培养基中筛选，并在42"C非选择性纯化两次。
在摇瓶中进行从葡萄糖到3-HP的生物转化，以测试ApoxB缺失 的影响。带有载体pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31的没有和具 有Apo;^的菌株的每一种的两个复制在含有卡那霉素的LB培养基中生 长。这些培养物被用于接种在125mL瓶中的15mL2YT培养基，培养 基中含有25吗/mL卡那霉素和10uM泛酸钙。在OD,为0.53时用1 mM IPTG和0.2%阿拉伯糖将细胞诱导6小时。对于每个培养物将总共 有4,000 OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在1 mL生物 转化培养基中，培养基由M9盐、100mMpH8的MOPS、 1%葡萄糖、 500 uM IPTG和100 uM吡眵醇-HCl组成。诱导和生物转化的培养物 都生长在30。C下，以225 rpm摇动。22.5小时后取出上清液样品，用 0.05体积的90%甲酸酸化，离心，过滤，并按照实施例8中的描述对 3-HP进行分析。将未酸化的上清液在BioRad Aminex HPX 87H离子交 换柱(Bio-Rad目录号125-0140)上分析有机酸，分析在60。C进行，0.01N硫酸作为系统流动相，流速为0.6 ml/min。根据折射率检测乙酸， 并根据已知浓度的标准品进行定量。
带有ApoxS的菌株与不带有A; o;cB的对照相比，显示出每OD的 3-HP增加了25。/。，，与对照产生的0.64 g/L乙酸相比，没有产生可检 测的乙酸。因此，减少乙酸的代谢生产或存在，将导致通过涉及BAAT 的途径增加3-HP的生产，例如增加至少20%，或至少25%。
可选的遗传方法可用于减少乙酸的生产，例如通过和/或ad 基因的缺失。
实施例11
通过增加前体或减少竞争性途径来增加3-HP生产的宿主突变 本实施例描述了其它的或可选的方法，通过该方法可以在例如表 达外源BAAT的细胞中增加3-HP的生产。可以通过增加途径中前体的 可用性或减少中间体消耗成其它代谢产物，来增加3-HP的生产。
ppc，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
可以通过例如选择启动子来增加前体的可用性。例如，可以构建 其中催化磷酸烯醇式丙酮酸和C02形成草酰乙酸的PEP羧化酶的活性 增加的菌株，这种增加是通过将合成的启动子放置在编码该功能的染 色体编码的基因ppc的前方。使用了将PCR产生的片段插入到大肠杆 菌基因组特定位点中的修改方法(Datsenko和Wanner， ZVoc. A^/. ^cgc/. Soc. 97:6640-5, 2000)。通过将pPRONde的P^/歸启动子区插入 到Datsenko和Wanner的质粒pKD3中，构建了新的质粒pKDprom。
质粒pKDprom在紧邻Plac/ a启动子的两个FRT区之间带有氯霉素 抗性标记(允许通过FLP蛋白切除标记)。使用下面带有紧接/^c基 因上游的区域同源的5'延伸区的引物，扩增了该含有pKDprom上的标 记和启动子的区段5'-AGGATACAGGGCTATCAAACGATAAGATGGGGTGTCTGGGGTAATGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO: 46)禾口 5'-GAGCATACTGACATTACTACGCAATGCGGAATATTGTTC GTTCATATGTACCTTTCTCCTCTTTAA (SEQ ID NO: 47)。按照 Datsenko和Wanner (2000)的描述，通过X噬菌体的i W重组酶功能 将PCR产物重组到大肠杆菌BW 25113基因组的/ ; c位点中。插入后 筛选氯霉素抗性，并通过PCR证实。
在基因前方带有人工启动子和氯霉素抗性盒的菌株被命名为 Kl;^c::cam，在ppc基因前带有人工启动子、从这里切除氯霉素抗性标 记的菌株被命名为Kip; c。通过P1噬菌体转导将KI; ; c::cam转移到带
2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)的大肠杆菌ATCC 11303中，该菌株含有 整合在基因组中的两个拷贝的改进的p-丙氨酸氨基转移酶(SEQ ID NO: 18)和恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶(SEQ ID NO: 29)。将抗性 标记从Kippc菌株中分解出来，用载体pCEC/SapanD转化该菌株。在 测量葡萄糖生产3-HP的生物转化中，对该菌株和没有Kij^c标记的对 照菌株进行了比较。
在含有氯霉素的LB培养基中生长的培养物被用于接种125 mL瓶 中的9 mL修改过的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD为 0.05-0.07。对培养基的修改包括用浓度为0.1%的葡萄糖和2%的L-阿 拉伯糖代替溶液l，以及添加20 iiM泛酸钙、25ng/mL氯霉素、5 吡哆醇-HCl和10 mM NaHC03。在生长2小时后，加入IPTG到浓度为 1 mM。在诱导培养基中生长19小时后，ODsoo在8.3 (KI卯c菌株) 到13.8 (对照)的范围内。将总共32,000 OD单位的每种菌株离心， 重新悬浮在8mL生物转化培养基中。生物转化培养基由M9盐、100 mM MOPS pH 8、 1%葡萄糖、500 uM IPTG、 5 uM吡哆醇-HCl和10 mM NaHC03组成。诱导和生物转化培养物都生长在30°C下，以225 rpm 摇动。在诱导后和生物转化7.5和23小时后取样，用0.05体积的90% 甲酸进行酸化，离心，过滤，并按照实施例8和4中的描述对3-HP、卩-丙氨酸和天冬氨酸进行分析。
经过23小时的生物转化后，所有的葡萄糖都已经被利用，只留下 了痕量的(3-丙氨酸，带有Kippc的菌株每OD产生的3-HP是对照的2.4 倍(表5)。因此，PEP羧化酶活性的增加为3-HP生产途径提供了增 加的前体草酰乙酸。增加草酰乙酸形成的可选实施方案包括在质粒上 克隆和表达PEP羧化酶，或克隆和表达丙酮酸羧化酶，该酶将丙酮酸 加C(VHCCV转化成草酰乙酸，同时消耗ATP。
表5: ddc表达增加对3-HP生产的影响
菌株时间点(h)_3-HP (mg/L-/OD) 卩-丙氨酸(mg/L/OD)
对照aONEXb 27 114
7.5 38 30
23 92 1
KIppc ONEX 41 126
7.5 40 84
__2JJ_0.8
a大肠杆菌 ATCC 11303 Apto AaW五厶^yWBCZ)厶W/l4 Apa"fC-A) A; oxB 2XINT(B AAT5-9/Ppmmsb31 )/pCECSapanD
bONEX=离心前在过夜表达培养物的上清液中存在的3-HP和p-丙氨酸。
w。C，天冬氨酸氨基转移酶
可用于增加前体可用性的另一个例子的遗传构建物，是其中催化 从草酰乙酸和谷氨酸形成天冬氨酸(图1)的天冬氨酸氨基转移酶的活 性被增加的菌株，这种增加是将合成的启动子放置在编码该功能的染
色体编码的基因wPC的前方。使用下面带有紧挨"^c基因上游的区
域同源的5'延伸区的引物，扩增了含有pKDprom上氯霉素抗性标记和 启动子的区段5'-CCCTGATAGCGGACTTCCCTTCTGTAACCATAAT GGAACCTCGTCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO: 48 )和
ATATGTACCTTTCTCCTCTTTAA (SEQIDNO:49)。
按照Datsenko禾tl Wanner (2000)的描述，通过X噬菌体的 重组酶功能将PCR产物重组到大肠杆菌BW25113基因组的a^C位点中。插入后筛选氯霉素抗性，并通过PCR证实。在"^C基因前方带有 人工启动子和氯霉素抗性盒的菌株被命名为KIa印C::cam，在w; C基 因前带有人工启动子、并且从这里氯霉素抗性标记被切除的菌株被命 名为Kkw/ C。通过Pl噬菌体转导将KIoypC::cam转移到带有AW/l4 Apa"fC-Z^ KI/ / c 2XINT(BAAT5-9/Ppmmsb31)的大肠杆菌ATCC 11303 中，该菌株含有整合在基因组中的两个拷贝的改进的P-丙氨酸氨基转 移酶 (SEQ ID NO: 18)和恶臭假单胞菌的3-HP脱氢酶(SEQ ID NO: 29)。将抗性标记从KIos; C菌株中分解出来，用载体pCEC/SapanD 转化该菌株。在测量葡萄糖生产3-HP的生物转化中，对该菌株和没有 Kkw户C标记的对照菌株进行了比较。
在含有氯霉素的LB培养基中生长的培养物被用于接种7 mL修改 过的过夜表达培养基(Novagen)。对培养基的修改包括用浓度为0.1% 的葡萄糖和2%的L-阿拉伯糖代替溶液1，以及添加10 ^M泛酸钙、30 叫/mL氯霉素和5 pM吡哆醇-HCl。在生长3小时后，加入IPTG到浓 度为1 mM。在诱导培养基中生长19小时后，将每种培养物2.5ml用 7.5 ml有M9盐、100 mM MOPS pH 8、 1%葡萄糖、100 uM吡眵醇-HCl 组成的生物转化培养基稀释。诱导和生物转化培养物都生长在30°C下， 以225 rpm摇动。在生物转化21小时后取样，用0.05体积的90%甲酸 进行酸化，离心，过滤，并按照实施例8中的描述对3-HP进行分析。
带有Kkw/ C的菌株产生441 mg/L.OD，与对照菌株产生的175 mg/L.OD的量相比增加了2.5倍。因此，天冬氨酸氨基转移酶活性的增 加为3-HP生产途径提供了增加的前体天冬氨酸。可用于增加天冬氨酸 生产的可选实施方案包括表达天冬氨酸氨基转移酶(例如在质粒上)。
g/"，柠檬酸合成酶
调节柠檬酸合成酶的表达以提高可用作天冬氨酸氨基转移酶反应 的底物的草酰乙酸以及用作丙酮酸羧化酶和/或PEP羧化酶的正激活剂 的乙酰CoA的水平，和减少在柠檬酸循环中变成二氧化碳而丢失的碳量。对于大肠杆菌来说，通过将ATG翻译起始密码子改变成GTG、以 及将核糖体结合位点改变成不是非常理想的序列，来减少柠檬酸合成
酶的产生，但是也可以使用对这些区域的其它突变、在启动子和编码 区的突变、掺入稀有密码子或二级结构、或RNA干扰技术来进行。在 下面用下划线显示的本实施例中使用的突变，结合到Warmer基因敲除 技术(Datsenko和Wanner, 2000)使用的下游引物中。上游引物 (gltAKDF)设计为一旦抗性标记被分解出来，留下的"疤痕"将代替 上游区域中同样数量的核苷酸。该区域不包含任何其它已知的基因， 并位于预领!)的g/"启动子的下游。5'-CTGTACCCAGGTTTTCCCCT
GCTTC-3' (gltAKDF; SEQ ID NO: 50)和5，-TCAACAGCTGTATCC CCGTTGAGGGTGAGTTTTGCTTTTGTATCAGCCAGATGAATATCC QCCTTAGTTC-3, (gltAKDR; SEQIDNO:51)。
SEQ ID NO: 52是分离的弱化菌株中修饰的g/"位点(Kdg/")的
所得序列。
使用gltAKDF和gltAKDR引物从质粒pKD4( Datsenko和Wanner, 2000)扩增旁侧带有FRT的卡那霉素标记。扩增使用rTth DNA聚合酶 XL (Applied Biosystems)按照制造商的说明书进行，使用退火温度为 52°C的8个循环和退火温度为60°C的22个循环，以及在68°C延伸 2.25分钟。将扩增产物凝胶纯化(Qiagen)，用限制性内切酶Z^"I消 化2小时，使用Qiagen PCR纯化柱净化。将纯化的DNA ( 100 ng)转 化到带有诱导的Red辅助质粒pKD046的BW25115感受态细胞中，将 转化的细胞铺于含有25吗/mL卡那霉素的LB培养基上。
将获得的菌落重新划线进行纯化，检测单个菌落的所需整合，所 述检测使用被置换区域上游的引物(gltAupF ; 5，-GATTCGCCATTTATTCGTCATC- 3，； SEQ ID NO: 53)和下游的引物 (gltAdwnR; 5'-CTGGGTCAAAGGTGAACAC-3，； SEQ ID NO: 54)，或者使用上游引物和特异针对改变的核苷酸的引物(gltAtestR; 5'-GTTTTGCTTTTGTATCAGCCACA-3,; SEQ ID NO: 55)。使用59.50C 的退火温度，gltAupF/gltAtestR引物使用野生型gltA模板时不能产生 PCR产物，但是使用纯化的转化体时产生了具有预期大小的产物。
然后从g/M已调节的菌株制备P1噬菌体裂解物，用于将突变转移 到带有A; ra Aa^le A/"W5CD AW/l4 Apaw「C-A) ApoxS和整合了 一个拷 贝BAAT5-9/PpmmsB31的大肠杆菌ATCC11303中。按照Datsenko和 Wanner (2000)中勾画的方法将卡那霉素标记分离，不同之处在于 pCP20转化体在30°C下在含有羧苄青霉素的液体培养基中筛选，并在 42°C非选择性纯化两次。
在摇瓶中进行从葡萄糖到3-HP的生物转化，以测试g/"调节 (Kdg/")的影响。将带有A/ " A^%￡ A/""j5CD AW/^ A; aw「C-A) △poxB INT的菌株11303和带有A; to AaW￡ A/h^BCZ) A; a"「C-Z^ △/70xB INT KDg/"的菌株11303的培养物，它们都带有载体 pCEC/SapanD，生长在含有氯霉素的LB培养基中。这些培养物被用于 接种125 mL瓶中的10 mL修改的过夜表达培养基(Novagen)，使起 始OD达到0.05-0.10。对培养基的修改包括用浓度为0.1%的葡萄糖和 2。/。的L-阿拉伯糖代替溶液1，以及添加20 pM泛酸钙、25 pg/mL氯 霉素、50 ^M吡眵醇-HC1和10mMNaHCO3。在生长1.25小时后，力口 入IPTG到浓度为lmM。在诱导培养基中生长18小时后，OD6oo在4.5 (KDg/")到11.2 (对照)的范围内。将总共32,000 OD单位(OD/ml 乘以ml)离心，重新悬浮在8mL生物转化培养基中。生物转化培养基 由M9盐、100 mM MOPS pH 8、 1%葡萄糖、500pM IPTG、 50 |iM吡 眵醇-HCl和10 mM NaHC03组成。诱导和生物转化培养物都生长在 30°C下，以225 rpm摇动。在诱导后以及生物转化6和24小时后取样， 并按照实施例8和4中的描述对3-HP和(3-丙氨酸进行分析。
带有已调节的KdgltA的菌株与对照相比，显示出每OD的3-HP增加了2.5到3.7倍(表6)，表明减少通过柠檬酸合成酶步骤的代谢 流对3-HP的生产有利。
表6:调节柠檬酸合成酶生产的影响
菌株时间点(h) 3-HP (mg/L/OD) B-丙氨酸(mg/L/OD)
对照aONEXb 26 106
6 22 57
24 卯 0
KDgltA ONEXb 95 159
6 77 34
_24___^
a大肠杆菌 ATCC 11303 Ao^Z^ A/raW5CX> AW/l4 Ap朋fC-Z)乂 Apo;c5
INT(BAAT5-9/Ppmmsb31)/pCECSapanD
bONEX =离心前在过夜表达培养物的上清液中存在的3-HP和(3-丙氨酸。
^ 尸i/， F^^ATP合成酶的FL和F^组分
W/7Fi/基因编码偶联F()F,-ATP合成酶的F,和F。组分的两种蛋白。 缺失了这两个基因的菌株不能通过将质子迁移通过复合物来合成 ATP，而是具有胞质FrATPase。 ATP突变体依赖底物水平的磷酸化， 从ADP再生ATP。流量的增加是通过糖酵解途径经磷酸转乙酰酶(产 生乙酸)产生ATP和通过TCA循环借助琥珀酰CoA合成酶产生ATP。 通过这些途径增加的流量导致NADH产生增加。胞质ATPase活性为 糖酵解提供ADP，突变体生长速度的降低减少了用于细胞生长的丙酮 酸利用。Causey等胸/. Xcad 园101(8): 2235-40, 2004) 显示，a^F//基因(AW/ F7/)的缺失导致了丙酮酸积聚，因为糖酵解 流量的增加大于乙酸途径的容量。
在3-HP的天冬氨酸途径中，Aa^F7/突变与丙酮酸或PEP羧化酶 过表达的组合将增加从丙酮酸到草酰乙酸的碳流，NADH可以被3-HP 脱氢酶用于驱动该途径。其它增加可用的丙酮酸库的突变是AW/l4、 Aac/t-^a、 △/WylBCZX Apox5和AaW五。atpFH缺失可以与柠檬酸合成 酶弱化组合使用，以减少通过TCA循环的流量，尽管NADH本身是拧 檬酸合成酶的变构抑制剂。使用了下面的引物来构建"0F7/基因的缺失5'-
ATCTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' (atpFHkoF; SEQ ID NO: 56) 禾口 5，- CGCTGATTTCGGTGGAATTCAGTTGCATGCTCCAGTCCCCTT AAGACTGCATATGAATATCCTCCTTAG - 3， ( atpFHkoR; SEQ ID NO: 57)。这些引物被用于从质粒pKD4扩增旁侧带有FRT的卡那霉素标 记(Datsenko和Wanner, 2000)。扩增使用rTth DNA聚合酶XL(Applied Biosystems)按照制造商的说明书进行，使用退火温度为52。C的8个 循环和退火温度为60。C的22个循环，以及在68。C延伸2分钟。将扩 增产物凝胶纯化(Qiagen)，用限制性内切酶Z); "I消化3小时，使用 QiagenPCR纯化柱净化。将纯化的DNA (lOOng)转化到带有诱导的 入Red辅助质粒pKD046的BW25115感受态细胞中，将转化的细胞铺 于含有25吗/mL卡那霉素的LB培养基上。将获得的菌落重新划线进 行纯化，使用被置换区域上游的引物(atpFHupF ; 5，-CTCTGCTGCGTACTCAGTTC- 3，； SEQ ID NO: 58)和下游的引物 (atpFH緒；5，-GATCATTTCACCCTGCATACAATC-3，； SEQ ID NO: 59)，检测单菌落的所需整合。然后从BW25113A。^F/f菌株制备PI 噬菌体裂解物，用于将突变转移到大肠杆菌ATCC 11303 Apto A^//^ A/nMBCD AW/l4 Apa"(T-"中。按照Datsenko和Wanner (2000)中 勾画的方法将卡那霉素标记分离，不同之处在于pCP20转化体在30°C 下在含有氨苄青霉素的液体和固体培养基中相继筛选，并在42°C非选 择性地纯化两次。
在摇瓶中进行从葡萄糖到3-HP的生物转化，以测试atpFH敲除的 影响。将均带有载体pPRONde/SapanD/BAAT5-9/PpmmsB31和 pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31的菌株11303 A/ to A^Z/z五 A/n^4BCD AW/l4 Apa"fC-i^ (对照)禾卩11303 A;^a Aad/z￡ A/hW5CD AWM A; ""(T-A) Aa&F/Z的培养物，生长在含有卡那霉素的LB培养基 中，允许生长较缓慢的A"&尸i/菌株生长较长的时间。培养物被用于接 种125 mL瓶中的20 mL含有25 pg/mL卡那霉素和10 泛酸钙的2YT培养基。细胞在OD6oo为0.29 (Afl&Fi/)或0.65 (对照)时用1 mM IPTG和0.2%阿拉伯糖都诱导6小时和22.5小时。将4,000 OD单位 (OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮在1 mL生物转化培养基中。生 物转化培养基由M9盐、100 mM MOPS pH 8、 1%葡萄糖、500|iM IPTG 和50 nM吡哆醇-HCl组成。诱导和生物转化培养物都生长在30°C下， 以225 rpm摇动。在大约23小时后取样，并按照实施例8中的描述对 3-HP进行分析。
带有Aa^F7/的菌株与对照相比显示出每OD的3-HP增加了 2到 3.4倍(表7)。
表7: Aflf。尸i/对3-HP生产的影响
菌株 panD_时间点(h)_3-HP (mg/L/OD)
对照a Ca 6 15
22.5 8 Sa 6 23
22.5 23
A,F/ZCa 6 32
22.5 16 Sa 6 60
_^!i_2￡
a大肠杆菌ATCC 11303 Apto Aa^W: A/raL45CZ) AW/l4 A/ a"fC-历/pPRONde/S叩anD/ BAAT5-9/PpmmsB31或pPRONde/CapanD/BAAT5-9/PpmmsB31
也进行了生物转化以测量带有质粒pCEC/SapanD的大肠杆菌 11303 Apfa Aac^i五A/^L4BCD厶W/^4 Apaw(T-Z^禾卩11303 ApM Aat^五 A々^4BCZ) △ W/^4 Apa" Aa/^F//菌株从葡萄糖生产的|3-丙氨酸。将 生长在含有氯霉素的LB培养基中的培养物用于接种125 mL瓶中的10 mL修改的过夜表达培养基(Novagen)，使起始OD达到0.05-0.15。 对培养基的修改包括用终浓度为0.1%的葡萄糖和2%的阿拉伯糖代替 溶液1，添加20 |iM泛酸钙、25 pg /mL氯霉素、50 |iM吡哆醇隱HC1禾口 10 mMNaHC03。在生长1.25小时后，加入IPTG到浓度为1 mM。在 诱导培养基中生长20小时后，ODs在1.8 (Aa^F//)至lj 13.2 (对照) 的范围内。将10,000 OD单位(OD/ml乘以ml)旋转下来，重新悬浮 在2.5mL生物转化培养基中。使用l和1.5mL重悬浮培养物在14 mLFalcon管中进行生物转化。生物转化培养基由M9盐、100 mM MOPS pH 8、 1%葡萄糖、500|iM IPTG、 50 pM卩比眵醇-HCl和10 mM NaHC03 组成。诱导和生物转化培养物都生长在30。C下，以225 rpm摇动。在 诱导后和生物转化24小时后取样，并按照实施例4中的描述对(3-丙氨 酸进行分析。
Aa^FiZ/pCECSapanD与对照相比，显示出每OD的(3-丙氨酸增加了 1.4 到2.2倍(表8)。因此，"^F/Z基因的缺失在从P-丙氨酸形成3-HP 的代谢途径的存在下，导致(3-丙氨酸和3-HP形成的增加。
表8: AW。Fi/对B-丙氨酸生产的影响 菌株 时间点(h) B-丙氨酸(mg/L/OD)
对照a ONEXb 113
24 113
厶,尸// ONEX 247
_24_112
3大肠杆菌ATCC 11303Aac M: A/;^4j5CD AW/ J A/ a^C-a)/pCECSapanD
bONEX:离心前在过夜表达培养物的上清液中存在的卩-丙氨酸。
尽管被命名为Kippc、 Kkw; C、 Kdg/"和AWp尸//的突变的影响 被分别确定，并且每种都显示出导致具有天冬氨酸脱羧酶、改进的 BAAT和3-HP脱氢酶活性的细胞增加3-HP生产，但这些突变中的两 种或多种的组合预计将进一步增加这些细胞的3-HP生产量。
实施例12 卩-丙氨酸的生产
本实施例描述了生产p-丙氨酸的方法以及能够生产(3-丙氨酸的细 胞。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但是
例如根据需要产生(3-丙氨酸的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及 所公开的酶的变异体)也可以使用。
卩-丙氨酸可以在例如天冬氨酸脱羧酶的存在下(图l)，在体外、体内(例如在细胞中)或其组合从天冬氨酸产生。例如，通过例如使 用重组技术在细胞中表达具有天冬氨酸脱羧酶活性的酶的编码核酸分 子，可以将产生天冬氨酸的细胞(例如微生物)工程化以制造P-丙氨
酸。示例的天冬氨酸脱羧酶核酸分子包括在SEQ ID NO: 38和40中显 示的，及其保留了编码可以将天冬氨酸转化成P-丙氨酸的酶的能力的 变异体(例如编码SEQ ID NO: 39或41的核酸)。细胞也可以具有PEP 羧化酶活性或丙酮酸羧化酶活性(或二者)，以及天冬氨酸氨基转移 酶活性，以允许从PEP或丙酮酸(或二者)生产天冬氨酸。这样的活 性对于细胞来说可以是内源的或外源的(例如由编码肽的外源核酸分 子提供)。
在具体的实施例中，细胞包含编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、 天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸脱羧酶的一种或多种外源核酸，其中 表达这些核酸分子的至少一种受到增加核酸分子表达的非天然启动子 的控制。在具体的实施例中，这种表达增加提高了细胞产生的|3-丙氨 酸量，例如增加至少20%。这样的细胞也可以包含增加可用的丙酮酸 库的突变，例如poxB、 ^//z￡、 a^FH的功能性缺失或它们的组合。在 某些实施例中，细胞还包含降低柠檬酸合成酶生产的突变或核酸分子 (例如SEQIDNO: 52的表达)。
因此，在体内生产(5-丙氨酸的方法包括将所公开的细胞在足以从 天冬氨酸生产P-丙氨酸的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样 的制造(5-丙氨酸的方法包括用编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬 氨酸氨基转移酶和天冬氨酸脱羧酶的一种或多种外源核酸转染细胞， 并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造(3-丙氨酸。产生的(3-丙氨酸可以从细胞培养基中分离，或从细胞中提取。
还提供了体外从天冬氨酸生产P-丙氨酸的方法。例如，可以通过 将天冬氨酸与具有天冬氨酸脱羧酶活性的酶相接触，来实现从天冬氨 酸到(3-丙氨酸的转化。这种转化也可以通过体内和体外方法的组合来 94进行。
在体内或体外发酵过程中形成的P-丙氨酸可以使用HPLC (参见 实施例4)或其它方法(参见实施例7)来分析。
实施例13
丙二酰半醛的生产
本实施例描述了生产丙二酰半醛的方法以及生产丙二酰半醛的细
胞。在具体的实施例中，这样的方法和细胞可以用作制造3-HP的起点。
本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但是例如 根据需要产生丙二酰半醛的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶 的变异体)也可以使用。
丙二酰半醛可以从P-丙氨酸经BAAT (图1)在体外、体内(例 如细胞中)或其组合生产。例如，通过例如使用重组技术在细胞中表 达具有BAAT活性的酶的一种或多种编码核酸分子，可以将产生P-丙 氨酸的细胞(例如微生物)(参见实施例12)工程化以制造丙二酰半 醛。示例的BAAT核酸分子包括在SEQIDNO: 5、 7、 9、 11、 13、 16 和18中显示的及其保留了编码能够将天冬氨酸转化成p-丙氨酸的酶的 能力的变异体(例如编码SEQIDNO:6、 8、 10、 12、 14、 17或19的 核酸)。
因此，在体内生产(3-丙氨酸的方法可以包括将所公开的细胞在足 以从P-丙氨酸生产丙二酰半醛的条件下进行培养。在具体的实施例中， 这样的制造丙二酰半醛的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙 酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶和BAAT的外源 核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造丙二 酰半醛。产生的丙二酰半醛可以用作制造其它产物例如3-HP的前体。 在具体的实施例中，丙二酰半醛可以从细胞培养基中分离，或从细胞
中提取以备使用。还提供了在体外从p-丙氨酸生产丙二酰半醛的方法。例如，可以 通过将p-丙氨酸与具有BAAT活性的酶相接触，来实现P-丙氨酸到丙 二酰半醛的转化。这种转化也可以通过体内和体外方法的组合来进行。
在体内或体外发酵过程中形成的丙二酰半醛可以使用HPLC或 Purpald⑧醛捕获染料(参见实施例1)来分析。
实施例14
从(3-丙氨酸生产3-HP
本实施例描述了生产3-HP的方法以及生产3-HP的细胞。在具体 的实施例中，这样的方法和细胞可以用作制造3-HP的衍生物、例如 3-HP的酯、1,3-丙二醇和聚合的3-HP(分别参见实施例14-16)的起点。 本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根 据需要产生3-HP的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶的变异体) 也可以使用。
3-HP可以从p-丙氨酸经丙二酰半醛(图1)在体外、体内(例如 细胞中)或其组合生产。例如，通过例如使用重组技术在细胞中表达 具有3-HP脱氢酶活性的酶的一种或多种编码核酸分子，可以将产生丙 二酰半醛的细胞(例如微生物)(参见实施例13)工程化以制造3-HP。 示例的3-HP脱氢酶核酸分子包括在SEQ ID NO: 20、 22、 26和29中 显示的及其保留了编码能够将天冬氨酸转化成(3-丙氨酸的酶的能力的 变异体(例如编码SEQIDNO:21、 23、 27或31的核酸)。
因此，在体内生产3-HP的方法可以包括将所公开的细胞在足以从 (3-丙氨酸和丙二酰半醛生产3-HP的条件下进行培养。在具体的实施例 中，这样的制造3-HP的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮 酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT和3-HP脱 氢酶的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造3-HP。产生的3-HP可以用作制造其它产物例如3-HP的酯、聚 合的3-HP和1，3-丙二醇的前体。在具体的实施例中，3-HP从细胞培养 基中分离或从细胞中提取以供使用。
还提供了在体外从丙二酰半醛生产3-HP的方法。例如，可以通过 将丙二酰半醛与具有3-HP脱氢酶活性的酶相接触，来实现从丙二酰半 醛到3-HP的转化。这种转化也可以通过体内和体外方法的组合来进行。
在体内或体外发酵过程中形成的3-HP可以使用US 20040076982A1中公开的方法(这些些方法在此引为参考)来分析。
实施例15
3-HP的酯的生产
本实施例描述了生产3-HP的酯的方法以及能够生产3-HP的酯的 细胞。3-HP酯的具体例子包括但不限于3-羟基丙酸甲酯、3-羟基丙 酸乙酯、3-羟基丙酸丙酯、3-羟基丙酸丁酯或3-羟基丙酸2-乙基己酯。 本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根 据需要产生3-HP酯的宿主细胞，来自其它物种的相同的酶(以及酶的 变异体)也可以使用。
3-HP的酯可以从3-HP产生。例如，通过表达编码具有脂肪酶或 酯酶活性(EC3丄l.-)的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞或微生物 (例如在实施例14中描述的)工程化以制造3-HP的酯。
例如，通过表达编码具有脂肪酶或酯酶活性的酶的基因，可以将 产生3-HP的细胞(例如微生物)工程化以制造3-HP的酯。在具体的 实施例中，产生3-HP的酯的转化细胞可以包含具有脂肪酶或酯酶活性 的蛋白的一种或多种编码核酸序列(例如外源核酸序列)，在某些实 施例中，细胞还包含具有PEP羧化酶活性、丙酮酸羧化酶活性、天冬 氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、BAAT活性和3-HP脱氢酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列。
因此，在体内生产3-HP的酯的方法可以包括将所公开的细胞在足
以从3-HP生产3-HP的酯的条件下进行培养。在具体的实施例中，这 样的制造3-HP的酯的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸 羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-HP脱氢 酶以及脂肪酶或酯酶的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养 以允许转染的细胞制造3-HP的酯。产生的3-HP酯可以从细胞培养基 中分离或从细胞中提取以供使用。
还提供了在体外从3-HP生产3-HP的酯的方法。通过将3-HP与 具有脂肪酶或酯酶活性的酶相接触以形成3-HP的酯，来实现从3-HP 到3-HP的酯的转化。这些转化也可以用体内和体外方法的组合来进行。
在体内发酵或体外分析过程中形成的3-HP的酯可以使用在US 20040076982A1中描述的方法来分析。
实施例16 /,3-两二,游仝产
本实施例描述了生产1,3-丙二醇的方法以及能够生产1,3-丙二醇 的细胞。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶， 但例如根据需要产生1,3-丙二醇的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以 及酶的变异体)也可以使用。
1,3-丙二醇可以从3-HP产生(图1)。例如，通过表达具有醛脱 氢酶活性(EC1.2丄-)和醇脱氢酶(ECl丄l.l)活性的酶的编码核酸 分子，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物)(例如在实施例14中 公开的)工程化以制造1,3-丙二醇。
例如，通过表达编码具有醛脱氢酶活性(EC 1.2丄-)和醇脱氢酶活性(EC l丄l.l)的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物) 工程化以制造1，3-丙二醇。在具体的实施例中，产生3-HP的转化细胞 可以包含具有醛脱氢酶活性(EC 1.2丄-)和醇脱氢酶活性(EC l丄l.l) 的蛋白的一种或多种编码核酸序列(例如外源核酸序列)，在某些实 施例中，细胞还包含具有PEP羧化酶活性、丙酮酸羧化酶活性、天冬 氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、BAAT活性和3-HP脱氢 酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列。
因此，在体内生产1，3-丙二醇的方法可以包括将所公开的细胞在 足以从3-HP生产1，3-丙二醇的条件下进行培养。在具体的实施例中， 这样的制造1，3-丙二醇的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙 酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-HP 脱氢酶、醛脱氢酶活性(EC1.2丄-)和醇脱氢酶活性(ECl丄l.l)的 外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造 1,3_丙二醇。产生的1，3-丙二醇可以从细胞培养基中分离或从细胞中提 取以供使用。
还提供了在体外从3-HP生产1,3-丙二醇的方法。可以通过将3-HP 与具有醛脱氢酶活性(EC1.2丄-)和醇脱氢酶活性(ECl丄l.l)的酶 相接触，将3-HP转化为1，3-丙二醇。或者，可以使用在体外从3-HP 生产1，3-丙二醇的化学方法，例如在Meng、 Tsobanakis和Abraham在 US 2005/0283029中公开的方法。
在发酵期间或体外加工中形成的1,3-丙二醇可以使用在高效液相 色谱(HPLC)来分析。色谱分离可以使用Bio-Rad 87H离子交换柱来 实现。0.01N硫酸的流动相以0.6 ml/min的流速流过，将柱子维持在 45-65。C的温度下。样品中1,3-丙二醇的存在可以使用折射率检测器来 检测(Skraly等，^p; /.五wv/ro". M/c 6/o/. 64:98-105, 1998)。
实施例17聚合的3-HP的生产
本实施例描述了生产聚合的3-HP的方法以及能够生产聚合的3-HP的细胞。本技术领域的专业人员将会认识到，尽管描述了具体的酶，但例如根据需要产生聚合的3-HP的宿主细胞，其它物种的相同的酶(以及酶的变异体)也可以使用。
聚合的3-HP可以从3-HP产生(图1)。例如，通过表达编码具有酯酶活性的酶的核酸分子，可以将产生3-HP的细胞(例如微生物)(例如在实施例14中描述的)工程化以制造聚合的3-HP。
例如，通过表达编码具有酯酶活性的酶的基因，可以将产生3-HP的细胞(例如在实施例14中描述的)工程化以制造聚合的3-HP。在具体的实施例中，产生聚合的3-HP的转化细胞可以包含具有酯酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列(例如外源核酸序列)，在某些实施例中，细胞还包含具有PEP羧化酶活性、丙酮酸羧化酶活性、天冬氨酸氨基转移酶活性、天冬氨酸脱羧酶活性、BAAT活性和3-HP脱氢酶活性的蛋白的一种或多种编码核酸序列。
因此，在体内生产聚合的3-HP的方法可以包括将所公开的细胞在足以从3-HP生产聚合的3-HP的条件下进行培养。在具体的实施例中，这样的制造聚合的3-HP的方法包括用一种或多种编码PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-HP脱氢酶和酯酶活性的外源核酸转染细胞，并将转染的细胞进行培养以允许转染的细胞制造聚合的3-HP。产生的聚合的3-HP可以从细胞培养基中分离或从细胞中提取以备使用。
还提供了在体外从3-HP生产聚合的3-HP的方法。可以通过将3-HP与具有酯酶活性的酶相接触以形成聚合的3-HP，来实现从3-HP到聚合的3-HP的转化。这些转化也可以使用体内和体外方法的组合来进行。在体内发酵过程或体外分析中形成的聚合的3-HP可以使用体积
排阻HPLC来分析。 肽的合成和纯化
本文公开的酶，例如PEP羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸氨基 转移酶、天冬氨酸脱羧酶、BAAT、 3-羟基丙酸脱氢酶、脂肪酶、酯酶、 醛脱氢酶和醇脱氢酶(及其保留了所需酶活性的变异体)，可以通过 本技术领域已知的多种手动或自动合成方法中的任何一种来化学合 成。这样的合成肽可以在体外反应中用于生产所需的终产物。
例如，固相肽合成(SPPS)在0.25毫摩尔(mmol)的规模上使 用Applied Biosystems Model 431A肽合成仪进行，并使用了 9-荷甲氧 羰基(Fmoc)氨基末端保护，与二环己基碳二亚胺/羟基苯并三唑或 2-(lH-苯并三唑-l-基)-l,l，3,3-四甲基脲六氟磷酸酯/羟基苯并三唑 (HBTU/HOBT)偶联，并对羧基末端的酸使用对羟甲基苯氧基甲基聚 苯乙烯(HMP)或Sasrin树脂，或对羧基末端的酰胺使用Rink酰胺树 脂。
按照Atherton等"o/Z(i尸/ cwe/Sy"//zei7'j, IRL Press: Oxford, 1989)的描述，通过将适当的前体氨基酸在三氟乙酸中的三苯基甲醇 中进行三苯甲基化，然后进行Fmoc衍生，制备Fmoc衍生的氨基酸。
使用1% TFA的二氯甲烷溶液，将Sasrin树脂结合的肽裂解以产 生被保护的肽。适合的话，在氨基酸侧链受到保护的新生肽中，使用 二甲基磷酸基叠氮化物通过氨基末端游离胺和羧基末端游离酸的反 应，在氨基和羧基末端之间将受保护的肽前体环化。
将HMP或Rink酰胺树脂结合的产物常规裂解，使用含有三氟乙酸(TFA)的溶液将含有受保护侧链的环化肽去保护，该溶液中任选还
包含水、茴香硫醚和乙二硫醇，比率为100:5:5:2.5，去保护在室温 进行0.5-3小时。
通过制备型高压液相色谱(HPLC)纯化粗肽，例如使用Waters Delta-PakC18柱，用乙腈调制的含有0.1% TFA的水进行梯度洗脱。 在柱洗脱后，将乙腈从洗脱的级份中蒸发，然后将其冷冻干燥。这样 生产和纯化的每种产物的身份可以通过快速原子轰击质谱(FABMS) 或电喷雾质谱(ESMS〉来证实。
鉴于本公开的发明的原理可用于许多可能的实施方案，因此应该
认识到，所说明的实施方案仅仅是本发明的例子，不应该被当作对本 发明范围的限制。相反，本发明的范围由所附的权利要求书限定。因 此，我们将所有位于这些权利要求的范围和精神内者要求为我们的发 明。
权利要求
1.分离蛋白，其与SEQ ID NO4、6、10、12、14、17或19具有至少80％的序列同一性，其中所述蛋白具有β-丙氨酸氨基转移酶(BAAT)活性。
2. 权利要求l的分离蛋白，其中所述蛋白含有与SEQIDNO:4、6、 10、 12、 14、 17或19具有至少95%序列同一性的序列，其中所述蛋白具有BAAT活性。
3. 权利要求l的分离蛋白，其中所述蛋白含有SEQIDNO:4、 6、10、 12、 14、 17或19中显示的氨基酸序列。
4. 权利要求1的分离蛋白，其中所述分离蛋白含有l-10个保守氨基酸取代并具有BAAT活性。
5. 权利要求1的分离蛋白，其中所述蛋白包含P3H取代、S24T取代、D110N取代、F113L取代、A133T取代或其组合。
6. 权利要求l的分离蛋白，其中所述蛋白含有SEQIDNO:4、 6、10、 12、 14、 17或19任何一个中显示的氨基酸序列的至少50个连续氨基酸，并且其中所述蛋白具有BAAT活性。
7. 分离的核酸分子，含有编码权利要求1的分离蛋白的核酸序列。
8. 权利要求7的分离核酸分子，其与启动子序列可操作连接。
9. 权利要求7的分离核酸分子，其中所述核酸序列与SEQ ID NO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18任何一个中显示的核酸序列具有至少80%或至少90%的序列同一性。
10. 权利要求7的分离核酸分子，其中所述核酸序列包含SEQIDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 16或18的任何一个。
11. 载体，其含有权利要求7的分离核酸分子。
12. 重组核酸分子，其含有权利要求7的分离核酸分子。
13. 分离细胞，其用权利要求12的重组核酸分子转化。
14. 权利要求13的分离细胞，其中所述细胞是原核细胞。
15. 权利要求13的分离细胞，其中所述细胞是植物细胞。
16. 转基因植物，其含有权利要求15的植物细胞。
17. 转基因植物，其含有权利要求12的重组核酸分子。
18. 权利要求13的分离细胞，其中分离的核酸序列含有与SEQ IDNO: 5、 7、 9、 11、 13、 16或18具有至少80%序列同一性的核酸序列，以及其中所述细胞从P-丙氨酸生产的丙二酰半醛比存在天然BAAT核酸序列时多至少50%。
19. 权利要求18的分离细胞，其中分离的核酸序列含有SEQ IDNO: 5、 7、 9、 11、 13、 16或18。
20. 权利要求18的分离细胞，其中所述细胞还含有编码3-HP脱氢酶的外源或内源核酸分子，其中所述细胞产生3-羟基丙酸(3-HP)。
21. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞还含有编码脂肪酶或酯酶的外源核酸分子，并产生3-HP的酯。
22. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞还含有编码酯酶的外源核酸分子，并产生聚合的3-HP。
23. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞还含有编码醇脱氢酶、醛脱氢酶或二者的外源或内源核酸分子，并且其中所述细胞产生1,3-丙二醇。
24. 权利要求20的分离细胞，其中编码3-HP脱氢酶的核酸分子编码与SEQ ID NO: 21、 23、 27或31具有至少95%序列同一性的蛋白。
25. 权利要求20的分离细胞，其中编码3-HP脱氢酶的核酸分子与SEQIDNO:20、 22、 26或29具有至少95%的序列同一性。
26. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞还含有编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子。
27. 权利要求26的分离细胞，其中编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子含有编码与SEQ ID NO: 39或41具有至少95%序列同一性的蛋白的核酸序列。
28. 权利要求26的分离细胞，其中编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子与SEQ ID NO: 38或40具有至少95%的序列同一性。
29. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞还含有编码PEP羧化酶的外源或内源核酸分子以及编码天冬氨酸氨基转移酶的外源或内源核酸分子。
30. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞还含有编码丙酮酸羧化酶的外源核酸分子。
31. 权利要求29的分离细胞，其中编码PEP羧化酶的核酸分子包含与PEP羧化酶可操作连接的合成启动子。
32. 权利要求29的分离细胞，其中编码天冬氨酸氨基转移酶的核酸分子包含与天冬氨酸氨基转移酶可操作连接的合成启动子。
33. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞含有将细胞形成的乙酸降低至少20%的ApoxB突变。
34. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞含有AadhE或AatpFH突变，并且其中所述细胞产生的3-HP与不存在AadhE或AatpFH相比增加至少20%。
35. 权利要求20的分离细胞，其中所述细胞含有与SEQIDNO: 52具有至少95%序列同一性的外源核酸分子。
36. 分离细胞，其含有编码SEQIDNO:6、 12、 17或19的外源核酸分子，其中所述核酸分子的表达导致细胞中的3-羟基丙酸(3-HP)与不存在外源核酸分子的细胞中3-HP的表达相比，增加至少2倍。
37. 权利要求36的分离细胞，其中编码BAAT的核酸分子的表达导致细胞中的3-HP与存在编码SEQ ID NO: 4的外源核酸分子的细胞中3-HP的表达相比，增加至少2倍。
38. 转化细胞，其含有编码权利要求1的蛋白的外源核酸分子。
39. 权利要求38的转化细胞，其中所述细胞从(3-丙氨酸生产丙二酰半醛。
40. 权利要求39的转化细胞，其中所述细胞产生3-HP、 3-HP酯、聚合的3-HP、 1,3-丙二醇或其组合。
41. 从(3-丙氨酸制造丙二酰半醛的方法，包括将权利要求13的细胞在允许细胞从p-丙氨酸制造丙二酰半醛的条件下进行培养。
42. 权利要求41的方法，其中所述细胞还含有编码天冬氨酸脱羧酶的外源核酸分子。
43. 权利要求42的方法，其中所述外源核酸分子编码与SEQ IDNO: 38或40具有至少95%序列同一性的天冬氨酸脱羧酶。
44. 权利要求43的方法，其中所述外源核酸分子具有与SEQ IDNO: 39或41至少95%的序列同一性。
45. 权利要求42的方法，其中所述细胞还含有编码PEP羧化酶的外源或内源核酸分子以及编码天冬氨酸氨基转移酶的外源或内源核酸分子。
46. 权利要求45的方法，其中所述细胞还含有编码丙酮酸羧化酶的外源核酸分子。
47. 权利要求45的方法，其中编码PEP羧化酶的核酸分子包含与PEP羧化酶可操作连接的合成启动子。
48. 权利要求45的方法，其中编码天冬氨酸氨基转移酶的核酸分子包含与天冬氨酸氨基转移酶可操作连接的合成启动子。
49. 权利要求45的方法，其中所述细胞含有将细胞形成的乙酸减少至少20%的ApoxB突变。
50. 权利要求45的方法，其中所述细胞含有AadhE或AatpFH，并且其中所述细胞产生的丙二酰半醛与不存在AadhE或AatpFH相比增加至少20%。
51. 权利要求45的方法，其中所述细胞包含与SEQIDNO:52具有至少95%序列同一性的外源核酸分子。
52. 制造3-HP的方法，包括将权利要求20的分离细胞在允许细胞从丙二酰半醛生产3-HP的条件下进行培养。
53. 制造3-HP的酯的方法，包括将权利要求21的细胞在允许细胞从3-HP生产3-HP的酯的条件下进行培养。
54. 制造聚合的3-HP的方法，包括将权利要求22的细胞在允许细胞从3-HP生产聚合的3-HP的条件下进行培养。
55. 制造1，3-丙二醇的方法，包括将权利要求23的细胞在允许细胞从3-HP生产1,3-丙二醇的条件下进行培养。
56. 制造3-HP的方法，包括从权利要求13的细胞中纯化丙二酰半醛；以及将丙二酰半醛与具有3-羟基丙酸脱氢酶活性的肽相接触以形成3-HP。
57. 制造3-HP的方法，包括用编码具有3-HP脱氢酶活性的肽的核酸分子转染权利要求13的细胞；以及培养转染的细胞以允许转染的细胞制造3-HP。
58. 权利要求57的方法，其中编码具有3-HP脱氢酶活性的肽的核酸分子与SEQ ID NO: 20、 22、 26、 29或30具有至少95%的序列同一性。
59. 从3-HP制造1,3-丙二醇的方法，包括使用权利要求56的方法分离产生的3-HP;以及将3-HP与具有醇脱氢酶活性的肽和具有醛脱氢酶活性的多肽相接触，从而产生1，3-丙二醇。
60. 制造聚合的3-HP的方法，包括使用权利要求56的方法分离产生的3-HP;以及将3-HP与具有酯酶活性的肽相接触，从而产生聚合的3-HP。
61. 制造3-HP酯的方法，包括使用权利要求56的方法分离产生的3-HP;以及将3_HP与具有脂肪酶或酯酶活性的肽相接触，从而产生3-HP酉旨。
62. 权利要求41的方法，其中所述细胞是原核细胞。
63. 特异性结合剂，其与权利要求1的蛋白特异性结合。
全文摘要
本发明提供了生物学活性增加的新的β-丙氨酸/α-酮戊二酸氨基转移酶的核酸和蛋白序列。还提供了含有这些酶的细胞，以及它们的使用方法，例如生产丙二酰半醛及其下游产物，例如3-羟基丙酸及其衍生物。
文档编号C12N9/10GK101528918SQ200780032449
公开日2009年9月9日 申请日期2007年8月17日 优先权日2006年8月30日
发明者史蒂文·约翰·戈特, 奥尔加·V·塞利福诺娃, 汉斯·H·利奥, 霍利·吉恩·耶森 申请人:诺沃奇梅兹A/S