专利名称：：活性细胞分裂素合成酶基因的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及活性细胞分裂素合成酶基因的应用。更具体地，本发明涉及使用具有催化从核苷酸型细胞分裂素(nucleotidecytokinin)合成活性细胞分裂素的反应的活性的酶基因生产转化植物的方法。
背景技术：
：细胞分裂素具有多种类型的生理活性，例如促进细胞分裂、调节细胞周期、延迟衰老或激活腋芽生长，因此其是用于控制农作物的数量生产率的非常重要的植物激素。作为细胞分裂素的基本结构在腺嘌呤6位氮原子上具有含有5个碳原子的异戊二烯基。根据测链结构的不同，细胞分裂素包括反式玉米素(tZ)、异戊烯基腺嘌呤(iP)等。基于以往关于细胞分裂素-代谢系统的常规研究，认为活性细胞分裂素(碱基形式(baseform))的合成是通过至少下列3个反应步骤进行的。首先，在细胞分裂素合成的第一反应中，通过腺噤呤核苷酸和二曱基烯丙基二磷酸酯(DMAPP)之间缩合反应生成核苷酸型细胞分裂素。这种核苷酸形式不具有作为细胞分裂素的活性。然而，在第二反应中，这种核苷酸形式通过去磷酸化酶的作用转化为核苷细胞分裂素。之后，通过核苷酶的作用核苷解离，由此转化成碱基形式的活性细胞分裂素分子(非专利文献1;综述Sakakibara，H.(2006)Cytokinins:Activity，biosynthesisandtranslocation.A醒.Rev.PlantBiol.57:431-449.)。事实上，在20世纪80年代的酶水平的研究中，已经暗示了催化前述每种反应的酶。在2001年鉴定了催化第一反应(缩合反应)即核苷酸型细胞分裂素合成反应的酶基因(IPT)(专利文献1:WO2002/072818)。然而，催化由剩余2个步骤构成的第二反应(激活反应)的酶基因还未被鉴定。即使鉴定了这些基因的实体，为了人工调节所产生碱基形式的细胞分裂素的量，将核普酸形式转化为核苷形式的步骤和将核苷形式转化为碱基形式的步骤，这两个步骤必须同时被修饰。因此，有必要鉴定催化这两种反应的酶基因，并同时调节所鉴定的酶基因。这种操作不容易。5另一方面，也可能通过调节催化细胞分裂素降解反应的酶基因(CKX)调节活性细胞分裂素的量(非专利文献2:WernerT,MotykaV，StrnadM,SchmullingT.(2001)Regulationofplantgrowthbycytokinin.ProcNatlAcadSciUSA98:10487-10492.;非专利文献3:Ashikari,M.,Sakakibara，H.，■Lin，S.-Y.,Yamaraoto,T.,Takashi,T.,Nishimura,A.，Angeles,E.R.，Qian,Q.,,Kit.an6,H.andMatsuoka,M.(2005)Cytokininoxidaseregulatesricegrainproduction,Science,309:741-745.)。然另外，通过过表达IPT碱:形式的量得以提高，但这种方法也存在问题，因为过表达IPT使细胞分裂素的总量极度提高，但同时植物体的形式也^皮显著？文变(非专利文献4:ZubkoE,AdamsCJ，Machaekova.I，MalbeckJ，ScollanC，MeyerP.2002.ActivationtaggingidentifiesagenefromPetuniahybridaresponsiblefortheproductionofactivecytokininsinplants.PlantJ.29:797-808.)。
发明内容本发明的目的是阐明能够直接调节所合成的活性细胞分裂素的量的酶基因，并提供利用前述基因转化的植物，其具有经调节的细胞分裂素的量。本发明的发明人为达到前述目的进行了深入的研究。发明人着重于在水稻茎端分生组织中的基因表达，并且已经分析了其结构和功能。根据数据库，已经预期前面所提到的酶基因与赖氨酸的脱羧作用相关。然而，作为分析结果，本发明人发现上述基因不具有赖氨酸脱羧酶活性，而具有催化从核苦酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性(细胞分裂素活化反应)。而且，本发明的发明人还发现前述的酶基因能够通过一步进行这种细胞分裂素活化反应，而之前认为需要通过2步进行。基于上述发现完成了本发明。，即，本发明包括下列特征。(1)转化体，其中导入了下列(a)-(d)中任一项的基因(a)由SEQIDNO:1，3，5,7,9,11,13,15中任一项所示的核苦酸序列组成的DNA所组成的基因；NO:1,3,5,7,9，11,13,15中任一项所示的核普酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4,6，8,10，12,14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6,8,10,12，14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。(2)根据上述(l)的转化体(l),其中，所述的转化体是转化植物。(3)根据上述(2)的转化体(2)，其中所述植物是植物体、植物器官、植物组织或经培养的植物细胞。(4)重组载体，其包含下列(a)-(d)中任一项的基因(a)由SEQIDNO:1,3，5，7，9,11,13，15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3，5，7,9，11，13,15中任一项所示的核苦酸序列组成的DNA相互补的核普酸序列所组成分裂素的反应的活性的蛋白质的DNiT所:且成的基因；'、(c)编码SEQIDNO:2，4，6,8，10,12,14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6，8，10,12，14,16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。(5)制备转化植物的方法，其特征在于，其包括将下列(a)-(d)中任一项的基因或者上述(4)的重组载体导入到植物细胞中，以及从所述植物细胞再生植物体(a)由SEQIDNO:1,3，5,7，9，11,13,15中任一项所示的核普酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3,5,7，9,11，13，157中任一项所示的核香酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4,6，8，10,12，14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6,8,10，12，14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核香酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。(6)调节植物中活性细胞分裂素的量的方法，其特征在于其包括调控下列(a)-(d)中任一项的基因在植物中的表达水平(a)由SEQIDNO:1,3,5,7，9,11，13，15中任一项所示的核普酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13，15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4，6,8，10,12,14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6，8，10，12,14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。(7)制备活性细胞分裂素的方法，其特征在于其包括在添加了作为底物的核苷酸型细胞分裂素的培养基中培养上述(l)的转化体，以及从培养物中收集活性细胞分裂素。(8)通过在植物体中过量表达下列(a)-(d)中任一项的基因改变植物特征的方法(a)由SEQIDNO:1，3，5，7,9，11,13,15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3，5，7，9,11,13,15中任一项所示的核普酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4,6，8，10,12,14，16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6,8,10,12，14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。(9)根据上述(8)的方法，其中植物特征的改变包括花茎数目的增加、形成大种子、形成厚叶脉或花序的改变。图1为LOG蛋白质纯化样品的电泳图(泳道l:分子量标记；泳道2:LOG蛋白质的纯化样品(3pg蛋白质))。图2A显示各底物样品混合物的色谱图；图2B,2C和2D分别显示通过将iPRMP(2B),tZRMP(2C)和tZ(2D)用作底物与纯化的LOG蛋白质反应所得的反应产物的色语图(上面仅底物；下面反应产物)。图3A显示尸胺样品的色谱图；图3(B)显示采用L-赖氨酸作为底物与纯化的LOG蛋白反应所获得的反应产物的色谱图((B)-1:仅底物；(B)-2:反应产物)。图4显示LOG蛋白的底物特异性。(将iPRMP作为底物时所获得的活性定义为1，在相同的条件下，各化合物与LOG蛋白反应所得到的活性以相对值表示)图5显示LOG蛋白催化的从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的合成反应式。图6显示通过对纯化的样品AtLOG1,2,3,4，5，7和8蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳所获得的结果(最左泳道分子量标记；每条泳道在分子量31kDa附近所观察到的带都是AtLOG蛋白衍生的带)。图7显示AtLOGl,2，3,4，5,7和8蛋白的底物特异性。(将iPRMP作为底物时所获得的活性定义为100%,在相同条件下，各化合物与前述各蛋白质反应所获得的活性以相对值表示。误差条显示基于在相同条件下进行3次操作所获得的结果的标准偏差)图8显示在35S::AtLOG4和35S::AtLOG7转化体中AtLOG4和7基因的半定量RT-PCR分析结果。图9显示在35S::AtLOG7转化体中所观察到的莲座叶(rosetteleaves)的异常。在立体显微镜下观察，在萌芽后1.5个月时的野生型植物和35S::AtLOG7转化体(谱系#6;Tl代)的莲座叶(标尺lmm)图IO显示在35S::AtLOG4转化体中所观察到的莲座叶的异常。将在萌芽后1.5个月时的野生型植物和35S::AtLOG4转化体(谱系#26;Tl代)的莲座叶进行脱色并使用70%乙醇固定，接着在立体显微镜下进行观察。(标尺左0.5cm;右2mm)。图11显示35S::AtLOG7转化体的维管束的畸形。将在萌芽后1个月时的野生型植物和35S::AtLOG7转化体(谱系#26;T2代)进行脱色并使用70%乙醇固定，接着使用Technovit树脂固定，随后使用超薄切片机进行切片，以便产生横断切片。使用曱苯胺蓝对横断切片进行染色，接着在光学显微镜下进行观察。在暗视野下变成白色的部分表示维管(标尺50|im)。图12显示35S::AtLOG4转化体叶子老化的延迟。使用在萌芽后70天时的野生型植物和35S::AtLOG4转化体(谱系#6;Tl代)的莲座叶沐尺lcm)。图13显示促进35S::AtLOG4转化体侧芽的形成。在立体显微镜下观察在萌芽后3星期时的野生型植物和35S::AtLOG4转化体(谱系#13;T2代)的于地面之上部分。(箭头长花茎；三角发育的侧芽；标尺1mm)。图14显示35S::AtLOG7转化体花序的异常。观察在萌芽后3周时的野生型植物和35S::AtLOG7转化体(谱系#6;Tl代)的花序(标尺1cm)。图15显示35S::AtLOG4转化体种子大小的增加。在立体显微镜下观察野生型植物和35S::AtLOG4转化体(谱系#26;T2代)的种子(标尺左1cm;右0.2mm)。图16显示35S::AtLOG7转化体种子重量的增加。测量来自野生型植物和35S::AtLOG7转化体(谱系#6;T2代)的各100颗种子的10重量，计算每个颗粒的重量。误差条表示基于3种不同类型的种子集合所获得的结果而计算的标准偏差。本申请要求2006年9月4日提交的日本专利申请No.2006-238691的优先权；通过参照将其描述的公开内容并入本文。下面详细描述本发明。(1)活性细胞分裂素合成酶基因分裂素的反应的活性的酶蛋白的基因^的应用。、'上述编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的酶蛋白的基因(以下称作"LOG基因，，)是由具有如SEQIDNO:1所示的核普酸序列的DNA组成的基因，或者编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。LOG基因的序列信息在国际核苷酸序列数据库中已有报道(索取号AK071695)(核苷酸)；BAD52880(蛋白质)；Tigr位置(locus):LOC—Os01g40630;RAP位置Os01g0588900)。由NCBI数据库个氨基酸组成蛋白质具有赖氨酸脱羧酶的功能。然而，本发明的发明人认为，由于LOG基因是在位于水稻茎端分生组织尖端、称作干细胞的未分化细胞群及其周边组织所表达的，因此其可能与水稻茎端分生组织的维持相关。因此，本发明的发明人分析了该基因的功能。结果发现前述的基因不具有赖氨酸脱羧酶活性，而具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。在本发明中所使用的LOG基因可以是编码下述蛋白质的基因，该蛋白质由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列组成，只要其保持催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性即可。可以被缺失、替代或添加的氨基酸的数目优选是1~多个。例如，可以从SEQIDNO:2中所示氨基酸序列缺失1~10个，并优选1~5个氨基酸；可以向SEQIDNO:2中所示氨基酸序列添加1~10个，并优选15个氨基酸；或者SEQIDNO:2中所示氨基酸序列中110个，并优选1~5个氨基酸可以被其他氨基酸替代。另外，本发明中所使用的LOG基因可以是编码下述蛋白质的基.gov)预测,本发明的基因所编码的、由242ii因，该蛋白质由与SEQIDNO:2中所示氨基酸序列具有80%或更高同源性的氨基酸序列组成、且具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。前述80%或更高同源性优选指90%或更高的同源性，更优选指95%或更高的同源性。本文所使用的术语"催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性"是指"催化从核苦酸型细胞分裂素除去5，-单磷酸并合成碱基形式的活性细胞分裂素的反应的活性"。在本发明中，"核苷酸型细胞分裂素"包括异戊烯基腺嘌呤核苷5，-单磷酸(iPRMP)、反式玉米素核苷5'-单磷酸(tZRMP)、二氢玉米素核苷5'-单磷酸(DZRMP)和顺式玉米素核苷5'-单磷酸(cZRMP)。另一方面，"活性细胞分裂素"包括从上述各核苷酸型细胞分裂素除去5，-单磷酸而产生的、N气(a-2-异戊烯基)腺嘌呤(iP)、反式玉米素(tZ)、二氬玉米素(DZ)和顺式玉米素(cZ)。用语"具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性"用于表示前述活性基本上与具有SEQIDNO:2中所示氨基酸序列的蛋白质的活性等价。本发明的LOG基因也可以是编码与SEQIDNO:1所示的核苷酸裂素的反交、且编应活性的蛋白质的基因。术语"严格条件"是指形成特异性杂交但不形成非特异性杂交的条件。这些严格条件的例子包括由与SEQIDNO:1中所示核苷酸序列高度同源的核酸(即表现出80%或更高，优选90%或更高，更优选95%或更高同源性)组成的DNA的互补链杂交，与具有低于前述水平同源性的核酸不杂交的条件。更具体的条件有钠盐浓度为15mM750mM,优选50mM~750mM,更优选300mM750mM;温度为25。C70。C,优选50。C70。C，更优选55。C65。C;曱酰胺浓度为0%~50%,优选20%~50%,更优选35%45%。而且，在更严格的条件下，例如在杂交后清洗过滤器的条件，钠盐的浓度为15mM600mM,优选50mM600mM,更优选300mM600mM，温度为50。C70。C,优选55。C70。C,更优选60。C65°C。可以通过进行PCR扩增以核酸片段的形式获得本发明中所使用的LOG基因，其中所述PCR扩增使用基于SEQIDNO:1或2中所示序列设计的引物，用来自cDNA文库、基因组DNA文库等的核酸作为模板。还可以通过进行杂交以核酸片段的形式获得LOG基因，其中所述杂交使用来自前述文库等的核酸作为模板，用LOG基因的一部分的DNA片段作为探针。另外，还可以通过本领域中已知的各种核酸序列合成方法，例如化学合成方法以核酸片段的形式合成LOG基因。可以通过本领域已知的技术修饰前述编码蛋白质的基因来进行前述氨基酸的缺失、添加和替代。通过常规技术，例如Kunkel法或Gappedduplex法或通过与其等价的技术向基因引入突变。例如，使用利用定点诱变的诱变试剂盒(例如Mutant-K(TAKARA制)或Mutant画G(TAKARA制))或TakaraLAPCR体外诱变系列试剂盒引入突变。可以用于本发明的LOG基因还包括下面几组被认为与前述LOG基因(索取号AK071695)属于相同的基因家族的基因。这些基因也包括在本发明的LOG基因中。拟南齐(^4raZ^V/o戸/51//^/^wa)AGI编号Nuc索取号Atlg50575NM一103939At2g28305NM」28389At2g35990NM—129158At2g37210NNL129277At3g53450NM—115205At5g03270NM一120405At5g06300NM—120713At5gl1950NM—203039At4g35190画—119685At5g26140NM一122515牙舀fOyzasa"vaJ(7K牙舀)tigr位置NUC索取号L0CJ)s01g40630AP003243L0C—Os01g51210AP003273蛋白质索取号BAD52880NP一91657213L0CJ)s02g41770AP005000XP__473199L0CJ)s03g018.80XM—468563XP—_468563LOC_Os03g49050AC123974XP——469379L0C一0s03g64070AC096690XP__47Q489LOC—0s04g43840AL731629XP——473199LOC一Os05g51390AC136216XP_陽476015LOC—0s05g46360AC104713XP_.475809L0C_Os09g3754OAP005862BAD46468LOC—0sl0g33900AC037425NP一—922006LOC—Os03g39010AC133003AAT76323在前述组基因中，7个基因,即At2g28305，At2g35990,At2g37210,At3g53450，At4g35190,At5g06300和At5gl1950是编码与前述稻(OyzflM"va)LOG蛋白具有高度同源性的氨基酸序列的、拟南芥LOG同源基因(其分别被称作AtLOG1，2,3，4,5，7和8)。正如在后面实施例中所示的、与前述稻("Oyza^"vaJLOG蛋白一样，这些拟南芥LOG同源基因具有催化从核普酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。而且在过表达前述基因的植物中，观察到了由于所合成的活性细胞分裂素的量提高而引起的植物特征的变化，例如促进侧芽延伸。AtLOG1,2,3,4,5，7和8基因的核普酸序列分别示于SEQIDNO:3,5,7，9,11,13和15中。其编码分别示于SEQIDNO:4,6，8,10,12,14和16中的氨基酸序列。另夕卜，这些拟南芥LOG同源基因还可以是突变基因，只要它们具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性即可。序列同源性的范围，以及所缺失、替代或添加的氨基酸数目的范围如上所述。(2)植物转化中所使用的重组载体用于植物转化的本发明的重组载体可以通过将前述LOG基因引入适当的载体构建。例如，优选能够通过农杆菌将靶基因引入到植物中的pBI，pPZP和pSMA载体。pBI双元载体或中间载体是特别优选的，例如pBI121，pBI101，pBI101.2和pBI101.3等。双元载体是能够在大肠杆菌和农杆菌中复制的穿梭载体。当将含有双元载体的农杆菌感染植物时，在载体上夹在由LB序列和RB序列构成的边界序列14之间的DNA可以被掺入到植物细胞核DNA中。pUC载体能够直接将基因引入到植物中。其例子包括pUC18,pUC19和pUC9载体。也可以使用植物病毒载体，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金花叶病毒(BGMV)和烟草花叶病毒(TMV)载体。当使用双元载体质粒时，靶基因被插入到双元载体的边界序列(LR和RB序列)之间，接着在大肠杆菌中扩增该重组载体。随后，通过电穿孔或其他手段将所扩增的重组载体导入到根癌农杆菌(力graki["m'謂咖e/編'冊)C58，LBA4404，EHA101,EHA105,发根农杆菌(」gn6a"en'cw2r/^zogew^)LBA1334等中，并将前述农杆菌用于植物的基因转导。为了将靶基因插入到载体中，首先将纯化的DNA用适当的限制性酶切割，并将切割片段插入到适当载体DNA的限制性位点或多克隆位点，将其连接到载体上。需将靶基因以可发挥其基因功能的形式插入到载体中。因此，在载体中可以在耙基因的上游、内部或下游位点被连接启动子、增强子、终止子、对于使用双元载体必要的复制起点(来自Ti或Ri质粒的复制起点等)、选择性标记基因等。"启动子"可能并非来自植物，只要其是能够在植物细胞中发挥作用，并且能够在特定的植物组织或特定的生长阶段诱导表达的DNA即可。其具体的例子包括水稻LOG基因自身的启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、胭脂^威合成酶基因启动子(Pnos)、玉米遍在蛋白启动子、水稻肌动蛋白启动子以及烟草PR蛋白质启动子。作为增强子，例如用于提高靶基因表达效率的、包含CaMV35S启动子中的上游侧序列的增强子区域等。可以使用任何终止子，只要其能够终止启动子所转录的基因的转录。例如胭脂碱合成酶(NOS)基因终止子、章鱼碱合酶(OCS)基因终止子以及CaMV35SRNA基因终止子。选择性标记基因的例子包括氨千青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、除草肽(bialaphos)抗性基因以及二氢叶酸还原酶基因。选择性标记基因和把基因可以连接到相同的质粒以制备重组载体。可选择地，分别制备将选择性标记基因连接到质粒而获得的重组载体，以及将靶基因连接到质粒而获得的重组载体。当分别制备重组载体时，将两种载体共转染到宿主内。(3)转基因植物及其制备方法可以通过将前述基因或重组载体引入到靶植物中制备本发明的转基因植物。术语"基因...导入"在本发明中指应用，例如已知的基因工程技术，将靶基因以可表达的形式导入到前述宿主植物的细胞中。所引入的基因可以掺入到宿主才直物的基因组DNA中，也可以以包含在外源载体中的形式存在。适当地，可以使用多种已报道和已建立的方法将前述基因或重组载体引入到植物中。这些方法的例子包括农杆菌法、PEG-磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、微粒枪法以及微注射法等。农杆菌法可以采用原生质体、组织切片或植物体本身(inplanta法)。当采用原生质体时，将原生质体连同具有Ti质粒或Ri质粒(分别为根癌农杆菌或发根农杆菌所具有)的农杆菌共同培养，或者将其与原生质球化的农杆菌融合(原生质球法)。当采用组织切片时，用农杆菌感染对象植物的无菌培养叶片(叶盘)或胼胝体(callus)(未分化的培养细胞)。在采用利用种子或植物的inplanta法(即不是通过加入植物激素的组织培养而进行的方法)时，农杆菌可以被直接应用于吸水种子、新生幼苗(秧苗)、盆栽植物等中。可以根据通用的教科书例如"Newedition,Experimentalprotocolsofmodelplants,Fromgeneticengineeringtogenomeanalysis(2001)，editedbyIsaoShimamoto&KiyotakaOkada，Shujunsha的描述进行这些植物转化方法。可以通过PCR、Southern杂交、Northern杂交、Western印迹或其他方法确认是否基因已经掺入到植物中。例如，从转基因植物制备DNA，设计LOG基因-特异性引物，接着进行PCR。在进行PCR之后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，并使用溴化乙锭、SYBRGreen溶液等进行染色，由此4全测作为扩增产物的带，可以确认转化。可选择地，可以使用预先经荧光染料等标记的引物的PCR检测扩增产物。另夕卜，可以将扩增产物结合到固相，例如微孔板上，以通过荧光或酶反应确认扩增产物。另外，从植物细胞提取蛋白质，通过二维电泳对其进行分级。通过检测LOG基因编码的蛋白质带，以确认被引入到植物细胞中的LOG基因已经得到表达，即植物已经被转化。接着，通过Edman降解等确定所检测蛋白质N-末端的氨基酸序列。之后，确认是否所测定的氨基酸序列与SEQIDNO:2N-末端的序列相同，这样进一步证明了植物细月包的转化。可选择地，将多种报告基因，例如(3-葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素酰基转移酶(CAT)或p-半乳糖苷酶(LacZ)连接到靶基因的下游区以制备载体。将已导入了上述载体的农杆菌以与上述相同的方式转化植物，并检验报告基因的表达。由此可以确认基因掺入植物中。在本发明中，可以使用单子叶植物或者双子叶植物进行转化。这类才直物的例子包括术语下列的十字花科(Bra^/cace"e)(例如拟南芥f^ra脇o拜、^a"朋a，、甘蓝或油菜籽)、禾本科(O扁z."eae)(例如水稻、玉米、大麦或小麦)、茄科(So/"mzceae)(例如番茄、茄子、马铃薯或烟草)以及豆科(Z^gwm!'wosae)(例如大豆、豌豆或矮菜豆(bushbean),但不限于此。在本发明中，待转化的植物材料的例子包括植物器官，例如茎、叶、种子、胚、胚珠、子房或茎尖；植物组织例如花粉嚢或花粉或其切片；未分化的胼胝体；以及培养的植物细胞，例如从未分化的胼胝体通过酶处理除去细胞壁而制备的原生质体。当采用inplanta法时，还可以使用吸水种子或整个植物体。本发明中所使用的术语"转基因植物"的是指整个植物体、植物器官(例如叶、花瓣、茎、根或种子)、植物组织(例如表皮、韧皮部、软组织、木质部或维管束)以及培养的植物细胞(例如胼胝体)的任一种。在转化培养的植物细胞时，为了从所获得的转化细胞获得转化体，可以通过传统的组织培养技术从所获得的转化细胞再生器官或者个体。本领域技术人员能够通过已知作为从植物细胞再生植物的公知方法容易地进行。例如，可以下面的方式从植物细胞再生植物。首先，在将植物组织或原生质体用作进行转化的植物材料时，它们可以培养在经灭菌并加入例如无机元素、维生素、>碳源、作为能源的糖或植物生长调节剂(植物激素例如苗长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯或油菜素类固醇)的形成胼胝体的培养基中培养，并使17得形成无限增殖的去分化胼胝体(后面，该过程被称作"骄胝体诱导")。将这样所形成的胼胝体转移到含有植物生长调节剂例如茁长素的新培养基中，进一步增殖(传代培养)。在固体培养基例如琼脂上进行胼胝体诱导，并在例如液体培养基中进行传代培养。这能够有效并大量进行两种培养。之后，在适于诱导器官再分化的适当条件下通过前述传代培养使得胼胝体增殖(后面称作"诱导再分化")，并且最终再生完整的植物。再分化诱导可以通过适当确定培养基中茁长素等植物生长调节剂、碳源等各种成分的种类和量和、光线、温度和其他条件进行。这种诱导再分化导致形成不定胚、不定根、不定芽以及不定茎叶等，这可以导致生长成完整的植物。作为选择，保存它们变成完整的植物之前的适合的状态(例如封装人造种子、干胚或冻干细胞和组织等)。性繁殖或无性繁殖而获得的后代植物体，以及后代植物的部分组织或器官(种子、原生质体等)。可以由导入了LOG基因的转基因植体的种子或原生质体等繁殖材料进行栽培并培养量化生产本发明的转基因植物。在所获得的转基因植物中，活性细胞分裂素的量由于LOG基因的表达而局部或系统性提高。结果，在转基因植物中，观察到了由于细胞分裂素的作用所导致的侧芽延长的促进(抑制顶端优势)、促进种子萌发、打破休眠、促进细胞分裂、促进叶绿素合成、防老化、促进果实增大、柄节数目的增加、大种子的形成、厚叶脉的形成、叶子老化的延迟、花序的改变等。而且，由目前的研究结果已知LOG基因在茎端分生组织的有限区域中表达，LOG基因破坏抹中水稻颗粒数目显著降低，花分化阶段的茎端分生组织中细胞分裂素的含量与谷类粒数目之间存在关联。因此，可期待，例如LOG基因在茎端分生组织特异表达的转化水稻中谷粒的数目得到提高。而且，植物体中LOG基因的表达水平可使用启动子例如LOG启动子、细胞分裂素氧化酶2(OsCKX2)启动子或者衰老相关基因(SAG)启动子局部地或系统性调节(促进或抑制)，由此可以调节植物中活性细胞分裂素的量。结果，可以调节与细胞分裂素相关的多种植物生长和生理活动，例如谷粒的数目、侧芽(腋芽)的形成和延长、老化、休眠、落果、细胞周期、光合作用量或蒸腾作用。(4)制备酶蛋白可以通过使用导入了前述LOG基因的重组载体转化植物获得转化体，培养转化体，接着从培养物中获得前述LOG基因编码的蛋白质。本文中使用的"培养物，，是指培养上清、培养的细胞或培养的细胞群以及所培养的细胞或细胞群的破碎产物的任何一种。这里，可以使用任何类型的重组载体，只要其能够在宿主中复制即可。所述重组载体的例子包括质粒DNA和噬菌体DNA。所述质粒DNA的例子包括来自大肠杆菌的质粒(例如pBR322,pBR325，pUC118，pUC119,pUC18,pUC19，pBluescript等)、来自枯草芽孢杆菌(5鎖.〃附"Mto)的质粒(例如pUB110,pTP5等)以及来自酵母的质粒(例如YEpl3,Yep24,YCp50等)。噬菌体DNA的例子包括i嗟菌体(例如Charon4A,Charon21A，EMBL3,EMBL4，人gtlO,Xgtll,人ZAP等)。进一步地，还可以使用反转录病毒和牛痘病毒之类的动物病毒载体，以及昆虫病毒载体，例如杆状病毒。前述载体可以包含复制起点、启动子以及选择性标记物。如果必要，载体还可以包含增强子、终止子、核糖体结合位点、多聚腺苷酸信号等。作为复制起点，例如可以在大肠杆菌载体中使用来自ColEl、R因子或F因子的复制起点。例如，可以在酵母载体中来自2iamDNA或ARS1的复制起点。例如可以在动物载体中使用来自SV40或腺病毒的复制起点。作为启动子，trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子、cspA启动子等可以用于大肠杆菌载体中。gall启动子、PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、AOXl启动子等可以用于酵母载体中。SRoc启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV启动子等可以用于动物细胞的载体。作为选择性标记，卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因等可以用于大肠杆菌载体中。Leu2、Trpl或Ura3基因等可以用于酵母载体中。新霉素抗性基因，胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因等可以用于动物细胞载体中。作为宿主，可以使用原核细胞或真核细胞。这类原核细胞的例子19包括属于埃希氏菌属例如大肠杆菌，芽孢杆菌属，例如枯草杆菌，以及假单胞菌属，例如恶臭假单胞菌(尸"w^mo"w;w"^)。另一方面，真核细月包的例子包4舌酵母，例如p卑酒酵母(iSaccAaram;;cMce^v/w'ae)或裂殖酵母(5W^cwzcc/^n附);cespcw6e);动物纟田胞，例如COS细胞、CHO细胞、Vero或C123细胞；昆虫细胞，例如Sf9或SF12。通过在宿主培养中通常采用的方法培养前述转化的细胞。作为培养从微生物宿主例如大肠杆菌或酵母所获得的转化体的培养基，可以使用天然或合成培养基，只要其含有能被微生物体吸收的碳源、氮源和无机盐，并且能够有效培养转基因植物即可。碳源的例子包括糖类，例如葡萄糖、果糖、蔗糖和淀粉；有机酸，例如醋酸和丙酸；以及醇类，例如乙醇和丙醇。氮源的例子包括氨；无才几酸或有才几酸的铵盐，例如氯化铵、硫酸铵、醋酸铵和磷酸铵；其他含氮化合物；蛋白胨；肉提取物；以及玉米浆。无机物质的例子包括磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。通常在振荡培养或通气搅拌培养等有氧条件下进行培养，例如于25。C35。C下进行约12~48小时。使用无机或有机酸、碱溶液等调节pH。如果必要，在培养过程中，可以向培养基中加入抗生素，例如氨苄青霉素或四环素。如果耙蛋白是在相关的细胞群或细胞中产生的，则通过超声处理、重复冻融循环或使用勻浆器处理破碎所培养的微生物体或细胞而提取靶蛋白质。如果靶蛋白被分泌到微生物体或细胞外，则可以使用该培养液本身，或者通过离心或其他程序除去微生物体或细胞。之后，独立地或者以适当地组合应用传统的分离/纯化蛋白质的生化技术，例如硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析或亲和层析从上述培养物产品中分离本发明的蛋白质。(5)活性细胞分裂素的合成在本发明中，在培养基中培养经含有前述LOG基因的重组载体转化而获得的转化体时，向培养基中加入核苷酸型细胞分裂素作为底物，以在培养物中合成活性细胞分裂素。用作底物的核普酸型细胞分裂素如上所述。此外，使用具有高增殖能力的转化体可提供每单位培养物溶液和每单位时间更高的活性细胞分裂素产量。因此，优选首先通过预培养20激活转化体，接着将其接种到培养基中进行用于生产活性细胞分裂素的主要培养(mainculture)。预培养以及主要培养用培养基中底物的含量以培养基中固形物换算，为大约0.1%~1.0%。例如，在其中接种细胞群时，在培养基中所使用的转化体的量可以大约是每1L培养基大约1100mg。如果适合，根据底物的含量，转化体的量可以提高或降低。这类底物可以在培养开始时一次性加入，也可以在培养过程中连续或间歇地加入。此外，可以在完成培养后一次性收集再生的活性细胞分裂素，也可以在培养的过程中连续或间歇地收集。当培养物溶液中所产生的期望活性细胞分裂素的量达到最大值时，终止培养。在完成培养后，根据公知方法纯化培养物溶液中所包含的活性细胞分裂素。可以通过本领域的^^知手段进行纯化，例如过滤、离心、离子交换或吸附层析或溶剂萃取。必要时这些操作可以适当组合。本发明的最佳实施方式通过下述的实施例对本发明进行更具体的描述。但这些实施例并非旨在限制本发明的范围。(实施例l)在大肠杆菌中大量表达重组LOG蛋白并纯化预计LOG基因(索取号AK071695(核普酸)；BAD52880(蛋白质)；Tigr位置(locus):LOC—Os01g40630;RAP位置Os01g0588900)编码由242个氨基酸组成的蛋白质，并且通过NCBI数据库0lttp:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)预测该蛋白质具有赖氨酸脱羧酶的功能。然而，显示与LOG基因具有同源性的基因，在束红球菌(i^odococa^/"5^'ew)的fas^f立置或者在发才艮农4干菌(^gro^a"en'owW^'zogewe5^的Ri质粒上，位于非常靠近催化细胞分裂素生物合成的起始反应的异戊烯基转移酶(IPT)的位置。因此，进行下列实验以分析LOG蛋白的功台匕首先，将LOG基因cDNA的蛋白质编码区域插入到pCOLD-I(TaKaRa)(—种在大肠杆菌中使用的His-标签蛋白质表达载体)，以构建质粒(pCOLD-LOG)。之后，使用该质粒转化大肠杆菌(￡.co")BL21(DE3)[pG-Tf2]，再将其涂布于含有50(ig/ml氨千青霉素和20|ug/ml氯霉素的Luria-Bertani琼脂培养基上，以获得转化的大肠杆菌集落。将该大肠杆菌集落在含有50pg/ml氨节青霉素和20pg/ml氯霉素的Luria-Bertani培养基中于37。C下培养过夜。之后，将30ml过夜培养获得的培养物溶液加入到270ml含有100pg/ml氨苄青霉素、20|ag/ml氯霉素和1ng/ml四环素的改良M9培养基(M9盐，1M山梨醇，1%酪蛋白水解物、2%蔗糖、lmMMgS04、0.1mMCaCl2、10fig/mL硫胺素-HCl和2.5mM甜菜碱)中，接着在37。C下进行摇瓶培养，直到OD600达到约0.5。将液体培养基转移到15。C水浴中，静置30分钟。之后，以0.5mM终浓度加入1MIPTG到培养基中，并接着将所获得的混合物进一步在15。C下进行摇瓶培养25小时。之后，通过离心回收大肠杆菌细胞。通过下列方法从大肠杆菌提取蛋白质，通过镍NTA顶流(superflow)树脂纯化LOG蛋白。首先，将大肠杆菌沉淀悬浮在6ml裂解緩冲液[50mMNaHP04,300mMNaCl，10mM咪唑，1mMMgCl2，0.5mM二硫苏糖醇(DTT),pH8.0]中。之后，将60jal蛋白酶抑制剂混合物(XIOO,Sigma)和6mg氯化溶菌酶加入到悬浮液中，于水上静置30分钟。其后将大肠杆菌细胞用超声粉碎器(TIETECHCo.,Ltd.)进行破碎。破碎条件为微芯片20秒x8次，工作循环(dutycycle)为50%,输出为5。将经破碎的溶液在4。C下30,000g离心50分钟。将上清液通过由预先已经裂解緩冲液(柱体积1ml)平衡的镍NTA顶流树脂(Qiagen)形成的柱。再使用20ml清洗緩沖液[50mMNaHP04,300mMNaCl，20mM咪唑，lmMMgCl2，0.5mMDTT,15%(w/v)甘油，pH8.0]清洗柱子2次，并使用洗脱緩沖液[50mMNaHP04,300mMNaCl，250mM咪哇，lmMMgCl2,0.5mMDTT，15%(w/v)甘油，pH8.0]洗脱His-标签LOG蛋白。通过SDS聚丙烯酰胺电泳确认最终纯化的样品的纯度(图1)，将该样品用于后续实验中。(实施例2)4全测重组LOG蛋白的酶活性将实施例1中获得的3(ig重组LOG蛋白与用作底物的各种类型的细胞分裂素进行反应。使用下列8类细胞分裂素底物N、(5-2-异戊烯基)腺嘌呤(iP)、反式玉米素(tZ)、顺式玉米素(cZ)、iP核苷(iPR)、tZ核苷(tZR)、cZ核苷(cZR)、iPR5，-单磷酸(iPRMP)和tZR5，-单磷酸(tZRMP)。反应条件为，将lOOpl含有50mMTris-HCl、1mMMgCl222和50(iM底物，pH7的反应溶液在30。C下孵育2小时。之后，将1020%醋酸加入到反应溶液中终止反应，接着在室温下以15,000rpm将反应溶液离心20分钟。再利用HPLC(WatersAlliance2695/PDA探测器2996)通过液相色谱对20(il上清液进行分析。使用SymmetryC18,3.5iam,2.1x100mm筒(Waters)柱。使用溶剂C(100%乙腈)和溶剂D(2。/。醋酸)进行洗脱。洗脱条件和溶剂浓度梯度程序如表1所示。表l时间(分钟)流速(ml/分钟)Aft)BOt)c(wD04)曲线0.25001的i0.2500199630.25007936.90.250010906250.250040606260.250060柏6320.250060406330.25001的6400.25001996根据270nm的吸收监控底物和反应产物。分析的结果是，发现当使用iP,tZ,cZ，iPR，tZR或cZR作为底物时，没有观察到与底物的反应性，但使用iPRMP或tZRMP作为底物时，各底物均完全分别转化成iP或tZ。图2显示各底物样品混合物的色谱图，以及在使用tZ,iPRMP或tZRMP作为底物时获得的反应产物的色谱图。在使用iP,cZ，iPR，tZR或cZR作为底物时所获得的结果与使用tZ时获得的结果相同。因此，省略了这些结果。(实施例3)L0G蛋白对赖氨酸的反应性之前预计LOG蛋白为赖氨酸脱羧酶。因此，检测了其对赖氨酸的反应性。在40。C下，将3(ig重组LOG蛋白于100|il，pH6.0的由500mM醋酸钠緩冲液和5mML-赖氨酸构成的反应溶液中温育60分钟。之后，将34|il20%三氯醋酸加入到反应溶液中，并10,000g离心20分钟。再将lOOial上清液用于苯甲酰化。具体的操作如下所述。将100ial的2NNaOH加入到100nl反应溶液中，并进一步向其加入0.5)il苯甲酰氯。在室温下静置20分钟。之后，将200^d饱和NaCl溶液和200fil二乙醚加入到反应溶液中，将所获得的混合物搅拌、离心，回收上清。将其减压干燥后溶解在100pl甲醇中，接下来利用23HPLC(WatersAlliance2695/PDA探测器2996)通过液相色镨进行分析。使用SymmetryCI8，3.5(im，2.1x100mm筒(Waters)柱。使用溶剂A(MilliQ水)和溶剂B(100%曱醇)进行洗脱。洗脱条件和溶剂浓度梯度程序如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>根据226nm的吸收监控底物和反应产物。由赖氨酸脱羧酶产生的纯化的物质估计为尸胺。因此，分别注射1nmol尸胺样品，并确定反应产物的洗脱时间。如图3所示，LOG蛋白未显示出对赖氨酸的反应性。因此，确定LOG蛋白不具有赖氨酸脱羧酶的功能，这与基于数据库的估计是不同的。(实施例4)针对核苷酸型细胞分裂素的底物特异性有无的分析分析LOG蛋白对核苷酸型细胞分裂素形式的反应特异性。同时，还分析了对AMP有无反应性。使用下列7类底物iPRMP、tZRMP、二氢玉米素核苷5，-单磷酸(DZRMP)、cZR5，-单磷酸(cZRMP)、iPR5，-二磷酸(iPRDP)、iPR5，-三磷酸(iPRTP)和AMP。反应条件如下将0.02貼LOG蛋白用于单次反应，在200pl含有50mMTris-HCl,1mMMgCl2,1mMDTT,pH6.5的反应溶液中，与100^M底物反应。在开始反应后0分钟和4分钟，将600iil冷丙酮加入到反应溶液中终止反应。将反应溶液于-80。C下静置30分钟，接着在15，000rpm下离心20分钟。用离心浓缩机干燥上清。将生成物溶解在100(il、2%的醋酸中，接着在与实施例2的液相色谱中相同的条件下对反应产物进行冲全测和定量。只是注射量变为50nl。在iPRDP和iPRTP的情况中，反应溶液的量为100|Lll，所使用的蛋白质的质量为O.Ol)Llg,反应时间为2分钟。图4中所示的结果显示LOG蛋白以细胞分裂素核苷5，-单磷酸，例如tZRMP、DZRMP或cZRMP以及iPRMP作为底物。然而，LOG蛋白对AMP、iPRDP和iPRTP没有反应性。上述结果显示，尽管在数据库中预计LOG蛋白具有赖氨酸脱羧酶的功能，但实际上，其是催化完全新型的、从核苷酸型细胞分裂素除去核糖5，-单磷酸并产生碱基形式活性细胞分裂素的反应的酶。图5中显示了LOG蛋白所催化的反应。从这些结果可以说，将LOG蛋白的俗名称作细胞分裂素核苷5，-单磷酸磷酸核糖水解酶是适当的。(实施例5)测定LOG蛋白对iPRMP和tZRMP的Km值为了获得LOG蛋白对典型的底物iPRMP和tZRMP的Km值，进行下列实验。将0.02jigLOG蛋白用于单次反应，并将其在200nl含有50mMTris-HCl，1mMMgCl2,1mMDTT，pH6.5的反应溶液中与底物浓度为5，8,15,30和100iiM的底物反应。在开始反应后0分钟、2分钟、4分钟，将600|al冷丙酮加入到反应溶液中终止反应。将反应溶液于-80。C下静置30分钟，接着在15,000rpm下离心20分钟。之后，用离心浓缩机干燥上清。将生成物溶解在100^1、2%的醋酸中，接着在与实施例2的液相色谱中相同的条件下对反应产物进行检测和定量。只是注射量变为50]il。进行前述实验3次，并计算Km值。结果，发现对iPRMP的Km值为11.7±1.4|iM，比活性为5.6pmolmin".mg"蛋白质。对tZRMP的Km值为22.0±3.6|aM,其比活性为4.2(imol.min".mg"蛋白质。(实施例6)分离拟南芥LOG同源基因(AtLOGs)的cDNA检验是否具有与LOG蛋白相同功能的细胞分裂素-激活酶不仅存在于水稻而且存在于拟南芥中。首先，根据LOG蛋白的氨基酸序列，通过NCBI数据库(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行蛋白质BLAST检索，以便在拟南芥中检索其同源基因。结果，发现了预测编码显示与LOG蛋白高度同源的蛋白质的9种拟南芥基因AtLOG1-9GiraZ^op^^/^"朋aLOG1-9;表3)。检验是否这些基因在拟南芥植物体中被转录为在TAIR数据库(http:〃www.arabidopsis.org/)中预测的mRNA序列。即，从拟南芥植物体中提取mRNA，并使用反转录反应合成的cDNA作为模板、使用为扩增推测蛋白质编码区而设计的引物1，2,3,4，5，7和8，成功获得了具有与在TAIR数据库预测的cDNA序列相同序列的扩增片段。如同水稻LOG蛋白，预测这7种基因产物具有作为细胞分裂素-激活酶的功能。因此，关于这7种基因的cDNA序列，通过与水稻LOG蛋白相同的方法在大肠杆菌中诱导蛋白质表达并纯化。通过SDS聚丙烯酰胺电泳确定最终纯化的样品的纯度(图6),并将产物用于后续实验中。表3显示与LOG蛋白高度同源的拟南芥基因组中的基因推测分子量与L0G的基因名称AGICode推测氨基酸长度(kDa)同源性(WAtLOG1At2g2830521323.276.1AtLOG2At2g3599021325.370.6AtL0G3At2g3721021523.679.9AtLOG4At3g5345021523.581.0AtLOG5At4g351抑22825.267.4AtL'OG6At5g0327022925.067.6AtLOG7At5g0630021723.972.2AtLOG8At5g1195021623.B65.6AtLOG9At5g2614014316.163.7(实施例7)确定拟南芥LOG同源蛋白(AtLOGs)的LOG酶活性在与实施例2相同的反应条件下，评估每种纯化的AtLOG蛋白的酶活性。结果，与在LOG蛋白的情况相同，AtLOG蛋白也以细胞分裂素核苷5，-单磷酸，例如iPRMP，tZRMP,DZRMP或cZRMP作为底物(图7)。进一步，与LOG蛋白相同地，这类AtLOG蛋白显示对AMP、iPRDP和iPRTP几乎没有反应性。此外，以与实施例5相同的方式测定每种AtLOG蛋白对iPRMP的酶性质(表4)。在表4中，根据在每种AtLOG蛋白的最适pH条件下的反应计算Km、Vmax和Kcat值。符号"士"显示基于在相同条件下进行3次操作所获得的结果的标准偏差。表426具有iPRMP作为底物的AtLOG1,2，3，4，5,7和8蛋白的酶性质酵Km最适pHymol分钟-W，蛋白质分钟—'分钟—'M"1PHAtLOG116±22.1±0.154±43.5x1。，6.5AtLOG2126±16.6.1±2.0166±551.3x1Qs6.5AtLOG314±21.5±0.037±12.8x10s6.5AtLOG48.6±0.64,4±0.2"3±66.5AtLOG511±1OJ340.0320±11.8x10s5.4AtLOG76.7±0.8'3，8±0.2诉±61.5x10T6.5AtLOG817±10.053±0.0091.4±028.3x1047.0(实施例8)制备过表达拟南芥LOG同源基因(AtLOGs)的转化体检验在拟南芥中过表达细胞分裂素-激活酶基因AtLOG对植物体的影响。关于已经确认存在转录产物的酶活性的AtLOG1,2，3,4,5，7和8基因中的AtLOG4和7，将根据酶活性分离的cDNA插入到已经去除GUS基因的质粒pBI121(Ckmtech)烟草花叶病毒35S启动子的下游位点。将合成的质粒导入到根癌农杆菌中，接着使用已经通过PCR确认导入了质粒的根癌农杆菌感染野生型拟南芥。将所收集的种子接种到含有50ng/ml卡那霉素的MS培养基中。利用存在于pBI121的T-DNA区的卡那霉素抗性基因(NPTII)选择表现出对卡那霉素抗性的个体。选择26个成功导入了基因的卡那霉素抗性语系(后面称作35S::AtLOG4和35S::AtLOG7)。所选择的Tl代35S::AtLOG4和35S:丄OG7转化体表现出彼此相似的表型。将从莲座叶提取的、Tl代35S::AtLOG4(谙系#6和#26)和35S::AtLOG7(语系#3和#26)转化体mRNA反转录合成cDNA为模板、使用用于扩增AtLOG4,7基因以及肌动蛋白2(Actin2)基因的引物，进行半定量RT-PCR反应。使用来自野生型莲座叶的cDNA(WT)作为对照。在RT-PCR反应中，对AtLOG4进行25个循环，对肌动蛋白2和AtLOG7则进行35个循环。结果，在2个镨系的植物体中，确认了AtLOG4和AtLOG7基因的过表达(图8)。石^认35S::AtLOG4^35S::I^:、7转化体表现出彼此相似的表型，这些表型从Tl代遗传到T2代。直到萌芽之后大约1周，35S::AtLOG4和35S::LOG7转化体未表现出与野生型植物相比显著的形态异常。然而，从形成并生长许多莲座叶的萌芽后大约2星期开始，观察到显著的形态异常。35S::AtLOG4和35S::LOG7转化体沿着叶脉形成深绿色莲座叶(图9)。在使用70%乙醇固定叶子并进行脱色时，观察到，与野生型植物相比叶子上维管束显著发达(图10)。观察了这类叶子的横断面。结果，在维管束系统中观察到了显著的形态异常，例如维管的异位形成(图11)。而且，还观察到了叶子老化延迟的现象(图12)。在野生型植物中，在伸出柄节之后，暂时没有产生侧芽。然而，在35S::AtLOG4和35S::LOG7转化体中，产生了多个侧芽，并且在伸出柄节之后立即产生了叶子(图13)。而且，拟南芥通常表现出总状花序形式。然而，在35S::AtLOG4，35S::LOG7转化体中，花序的轴不成直线，而是表现出蝎尾状聚伞花序类形式(图14)。此外，将这类转化体中所包含的种子的大小和重量与野生型植物进行比较，结果，确认这类转化体的种子的大小和重量比野生型植物显著增加(图15和16)。通过参照将本文所引用的所有出版物、专利和专利申请以其整体并入本文中。工业实用性根据本发明明确了之前被认为是编码赖氨酸脱羧酶蛋的基因的水稻基因具有在细胞分裂素的生物合成途径中催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的功能(细胞分裂素激活反应)。因此，使用本发明的基因能够指导原先仅是通过细胞分裂素分解反应的修饰而实现的活性细胞分裂素(碱基形式)的量的调节。而且，在过表达本发明基因的植物体中，观察到了植物的特征发生了改变，例如柄节数目的增加、大种子的形成、厚叶脉的形成或花序的改变。因此，可以预见使用本发明的基因使得谷物商业价值提高，例如谷物产率的提高，或者剪下的花(cutflower)或叶子植物(foliageplants)的特征的多样化。28权利要求1.导入了下列(a)-(d)中任一项的基因的转化体(a)由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。2.根据权利要求1的转化体，其中，所述的转化体是转化植物。3.根据权利要求2的转化体，其中所述植物是植物体、植物器官、植物组织或经培养的植物细胞。4.重组载体，其包含下列(a)-(d)中任一项的基因(a)由SEQIDNO:1,3，5，7,9,11,13,15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3,5,7,9,11,13,15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4,6,8，10,12，14，16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6，8,10,12，14,16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。5.制备转化植物的方法，其特征在于，其包括将下列(a)-(d)中任一项的基因或权利要求4的重组载体导入植物细胞，以及从所述才直物细力包再生纟直物体(a)由SEQIDNO:1，3,5，7，9,11,13,15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3，5，7,9,11，13，15中任一项所示的核普酸序列组成的DNA相互补的核香酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4，6,8，10,12，14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6，8，10，12,14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。6.调节植物中活性细胞分裂素的量的方法，其特征在于，包括调控下列(a)-(d)中任一项的基因在植物中的表达水平(a)由SEQIDNO:1，3,5，7,9，11,13,15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1,3,5,7，9,11,13,15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2，4，6,8，10,12,14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2，4，6，8,10，12,14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。7.制备活性细胞分裂素的方法，其特征在于其包括在添加了作为底物的核普酸型细胞分裂素的培养基中培养权利要求1的转化体，以及从培养物中收集活性细胞分裂素。8.通过在植物体中过表达下列(a)-(d)中任一项的基因改变才直物特征的方法(a)由SEQIDNO:1,3，5,7,9,11，13，15中任一项所示的核普酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO:1，3，5，7,9,11，13，15中任一项所示的核苦酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO:2,4,6,8，10，12,14,16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO:2,4,6,8，10,12，14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。9.根据权利要求8的方法，其中植物特征的改变包括花茎数目的增加、形成大种子、形成厚叶脉或花序的改变。全文摘要本发明的目的是阐明一种酶基因，其能够直接调节合成的活性细胞分裂素的量，并提供利用前述基因调节的细胞分裂素量的转化植物。本发明所提供的转化植物中导入了在下列(a)-(d)中任一项的基因(a)由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA所组成的基因；(b)在严格条件下与由SEQIDNO1，3，5，7，9，11，13，15中任一项所示的核苷酸序列组成的DNA相互补的核苷酸序列所组成的DNA杂交、且编码具有催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性的蛋白质的DNA所组成的基因；(c)编码SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一项所示的氨基酸序列组成的蛋白质的基因；或者(d)编码通过在SEQIDNO2，4，6，8，10，12，14，16中任一项所示的氨基酸序列中缺失、替代或添加一个或者多个氨基酸所得的序列所组成、且具有下述活性的蛋白质的基因，所述的活性为催化从核苷酸型细胞分裂素合成活性细胞分裂素的反应的活性。文档编号C12N15/09GK101511999SQ200780032158公开日2009年8月19日申请日期2007年9月4日优先权日2006年9月4日发明者上田七重,榊原均,黑羽刚申请人:独立行政法人理化学研究所