专利名称：：用于在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸的制作方法用于在哺乳动物癌细胞中表达目的多核普酸的核酸发明领域本发明涉及癌症治疗领域。发明背景治疗癌症的方法逐年极大改善。改良的it断方法与更好的外科技术相结合使得外科医生能够通过去除最低限量的正常组织而更安全地去除肿瘤。患者的恢复时间缩短，并且因整容创伤所导致的心理影响降低。然而，尽管外科手术对于治疗患有局限性肿瘤或者仅具有最低程度扩散至例如局部淋巴结的患者是有用的，但对于患有转移性疾病或者全身性癌症如白血病或淋巴瘤的患者的效用有限。在美国，每年约有15，300人(男女比例为2:1)被诊断患有原发性肝癌。原发性肝癌在北美和欧洲相对罕见。据估计在美国发病率为每100,000人3例。然而，其在全球范围仍构成一个严重的健康问题。在流行区域，如非洲和亚洲，其发病率为每100,000人30例至超过每100,000人100例(AmericanCancerSociety,CancerFactsandFigures,1994，Atlanta,Ga.:AmericanCancerSocietyInc.)。在美国，虽然原发性肝癌在癌症的发病率排位中为低排位，但是被严格关注，因为其预后差，病例死亡率为0.8(每年罹患原发性肝癌的15，300名美国患者当中有约13，800名死亡)。在过去数十年里，对癌症分子机制的理解有了飞快地a。挑战是将对癌症分子基础的理解转变成对癌症治疗的改进。现在普遍公认的观点是，肿瘤在人体中的发展是一个多步骤过程。这些步骤对应于特异的基因改变，这种改变驱动了正常人细胞向高度恶性的衍生物的进行性转化，该衍生物的特征为细胞增殖增加，细胞死亡减少、基因组不稳定和持续性血管发生(HanahanD.，WeinbergR.A.2000;Cell100:57-70)。这些新的认识提示了新的治疗方法，即特异性地靶向在肿瘤细胞中被改变的分子相互作用和生物化学途径。药物递送系统通常涉及经设计能使药物緩慢释放入大解剖学区室，如胃肠道、泌尿生殖道或者血液循环中的装置或运载体。例如，可设计脂质体以便将药物释放入血液循环。此类系统存在的问题是无法将它们设计成特异性地向紳瘤细胞递送药物的形式(Schally&Nagy，EuropJEndoctinol1999;141:1)。药物被无差别地递送至正常细胞和肺瘤细胞。因此，必须使用大得多的药物剂量。由于抗癌药物具有毒性，z使用较大的药物剂量导致出现严重的临床问题。经常是癌症患者遭受的这些疗法的副作用几乎同癌症效果一^f"多。虽然如此，癌症治疗的主要趋势仍然是^L用更多的药物。药物毒性问题可以通过开发能够将抗癌药物仅仅递送至癌细胞而不递送至正常细胞的药物递送系统而解决。该问题的一种解决方法是使用识别癌细胞特异抗原并与之相互作用的药物负载抗体。存在许多此类抗原，其中一些已经用于癌症治疗范例中。例如，转铁蛋白受体抗原存在于癌细胞表面，而在大多数正常细胞表面不存在(Whitney等，Cancer1995;76:20)。已将抗癌药物偶联至抗转4失蛋白受体抗体，并因此被递送至脑癌患者(Laske等，Neurosurg1997;41:1039)。使用同位素标记抗体的相似策略也已经在淋巴瘤患者中应用(Vose等，Leukemia&Lymphoma2000;38:91)。这种抗体介导的药物递送方法也存在若干严重问题。在基因修饰动物中的产生抗体在患者中会造成非希望的反应(Muraszko等，CancerRes1983;53:3752)。解决抗癌治疗中药物递送的一个较安全的方法是使用癌细胞上受体的正常配体设计药物运载体。配体是独特地与特异受体匹配的分子，类似于一把钥匙独特地与一把特定的锁匹配。该方法的必要条件是受体要存在于仅癌细胞的表面。转铁蛋白受体就是一例，其结合参与血液中铁转运的蛋白质配体。该蛋白质配体已经被修饰以携带抗癌药物，并且这种配体-受体药物递送系统在治疗急性白血病中的有效性已经得以证明(Faulk等，7MolBiotherapy19卯；2:57)。携带药物的配体还能够通过不同类型的化学键(Kratz等，JPharmSci1998;87:338)运栽几种不同类型的抗癌药物(Berczi等，ArchBiochemBiophy1993;300:356，和Beyer等，JMedChem1998;41:2701)。然而，这种可能性限于参与重金属如铁转运的蛋白质配体。依赖于肿瘤细胞选择性转基因表达的抗癌治疗策略也处于研究当中(BinleyK.等，(1999)GeneTherapy6:1721-1727;HeiseC.等，(1997)NatureMedicine3:639-645;和ParrM.J.等，(1997)NatureMedicine3:1145-1149)。可用数个方法将转基因体内递送进入肿瘤，其中有基于腺病毒的载体和基于慢病毒的载体(BenihoudK.等，(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10:440-447)。因此，对于针对癌症、特别是肝癌的肿瘤细胞靶向疗法，需要备选系统或者改良系统。发明简述本发明涉及用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的新的核酸。更加具体而言，本发明涉及上面所定义的核酸，其包含至少一个待特异性地在癌细胞中表达的目的多核苷酸，该目的多核苷酸被置于能驱动其特异性地在癌细胞中表达的所谓癌细胞特异性调节多核苷酸的控制下。根据本发明，所述调节多核苷酸选自多种选择的、衍生自编码人AFP、大鼠AFP、人HIP/PAPI和大鼠PAPI蛋白质的基因的启动子区域的、多核苷酸。根据本发明，置于所述癌细胞特异性调节序列控制下的所述目的多核苷酸可以编码对抗癌有用的任何分子，包括核酸如RNA分子和蛋白质。本发明还包括包含用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的所述新核酸的载体，以及已净皮此类栽体转染或转导的宿主细胞。本发明还涉及包含作为活性成分的所述新核酸或所述载体的药物組8合物。附图简述图1描述栽体pShuttle-rAFPwt-rNIS图2描述载体pShuttle-hAFPt-rNIS图3描述载体pShuttle-hHIP/PAP-rNIS图4描述载体pShuttle誦rHIP/PAP-rNIS图5图示NIS在大鼠HIP/PAP调节序列控制下在肿瘤性肝细胞中的功能性表达。在不同感染复数(MOI)下用AdrHIPrNIS感染的HepG2细胞的体外1231摄取。NI:未感染的；DL324:MOI:10下的空载体;3;MOI:IO和100下的AdCMVrNIS;MOI:25，50，75;及100个感染性颗粒下的AdrHIPrNIS。每一数据点代表三次不同实验的平均值。-NaC104:没有用高氯酸钠抑制。+NaC104:用高氯酸钠抑制后。图6图示在细胞与白介素6和/或地塞米松孵育后，刺激在大鼠人HIP/PAP调节序列控制下的NIS在肿瘤性肝细胞中的表达。比较在不同刺激条件下MOI:100下AdrHIPNIS所感染的HepG2细胞与AdCMVrNIS所感染的细胞对1231的摄取。每一数据点代表三次不同实验的平均值。-NaC104:没有用高氯酸钠抑制。+NaC104:用高氯酸钠抑制后。图7图示患有肝脏肿瘤并且施用过包含与大鼠HIP/PAP调节序列有效连接的NIS序列的DNA构建体的大鼠的"TcSPECT/CT成像。AdrHIPNIS所感染的DEN大鼠的"TcSPECT/CT成像。肝脏中的强反差表明NIS在所转导的肿瘤结节中高水平表达。图8图示NIS在不同的AFP衍生调节序列控制下的功能性表达。以不同感染复数用AdhAFPt-rNIS和AdrAFPwt-rNIS所感染的HepG2细胞的体外'23l摄取。-NaC104:没有用高氯酸钠抑制。+NaC104:用高氯酸钠抑制后。每一数据点代表三次不同实验的平均值。发明详述本发明提供驱动目的多核苷酸特异性地在癌细胞中表达的新的调节性多核苷酸。因此，本发明提供用于更有效治疗的新治疗工具，该新治疗工具特异性地靶向癌细胞以主要或者甚至仅仅地在靼位点实现期望的生物学效果。同时，新近设计的该癌细胞靶向性治疗工具可以导致对身体中的非癌性细胞或器官的副作用降低或者甚至没有。令人惊讶地，本发明已经发现，衍生自人和大鼠AFP以及人和大鼠HIP/PAPI蛋白质的编码基因的上游启动子区域的一族调节序列具有指导目的多核苷酸特异性地在癌细胞中表达的能力。此外，由于本发明的调节序列具有高转录活性，因此可以实现与之有效连接的所述目的多核苷酸的强表达。根据本发明，已经构建了将(i)待于癌细胞中表达的目的多核苷酸，即碘化钠同向转运体NIS与(ii)来源于不同物种的几种不同的AFP、HIP/PAP调节序列相組合的病毒载体。已经利用几种方法在一系列人和鼠的肝脏和非肝脏正常细胞和转化细胞中评价过在用这些载体体外和体内感染后NIS蛋白质的表达和亚细胞定位以及NIS的功能，所述方法为基于纯化的膜蛋白提取物的免疫印迹；免疫荧光；免疫組织化学；放射性碘摄取和排出测定试验；使用连续闪烁扫描以及SPECT/CT成像的动力学研究。在Wistar大鼠的化学诱导肝细胞癌(HCC)模型中开展了体内研究。在施用致癌物二乙基亚硝胺(DEN)2个月之后，建立侵袭性极强的多结节性HCC。根据本发明已经证实，对于全部所研究的栽体而言，所诱导的NIS表ii^式在体内严格限制于肝脏胂瘤。NIS在所转导的肝癌细胞的质膜上强表达，并且使得放射性碘摄取的水平与使用重組腺病毒(AdCMV-NIS)所观察到的方文射性不典才聂取水平相当，或者甚至更高，在所述AdCMV-NIS中NIS处于遍在的强巨细胞病毒启动子控制下。在感染的原代肝细胞和转化的非肝细胞系中没有发现NIS表达。对于所研究的三种施用途径(门静脉、肝动脉、瘤内)，体内NIS转导效率高。肝动脉途径比门静脉途径更有效，因为肝肿瘤的血管形成大部分通过肝动脉分支发生。瘤内和肝动脉途径导致有利于肿瘤区域的明显NIS表达差异。大约30%注射的放射性碘集中于肝脏肿瘤中，其硪生物半衰期为2.5天。注射18mCi的^I破坏了所照射的转导肿瘤结节，而未注射的结节继续生长。此外，本发明人还使用本文所描述的HIP/PAPI调节序列将目的蛋白质、特别是NIS蛋白质靶向衍生自各种癌性器官、包括人癌性结肠和人癌性胰脏的转化细胞系。在这些转染的癌性细胞系中，诱导了NIS在质膜上的强表达，并且因此这些细胞显示出高水平的碘4聂取。总之，本发明证实，作为本申请发明目的的、包含人或大鼠AFP衍生调节序列或包含人或大鼠HIP/PAPI衍生调节序列的新NIS重组构建体，能够事实上诱导功能性NIS在肿瘤性肝细胞、肿瘤性结肠细胞和肿瘤性胰腺细胞中实现靶向表达，并且这种表达和摄取活性是强的，即与遍在CMV启动子所诱导的可比或者甚至更强。叔坊做虔本发明提供特异性地在癌细胞中发挥功能的新的调节性多核苷酸，以下为对其的一般描述和详细描述。这些新调节性多核苷酸在此用于特异性地在癌细胞中表达各种目的多核苷酸。如本文所预期的那样，目的多核苷酸尤其可以编码具有抗肿瘤效果的核酸或蛋白质。因此，本发明的一个目的是用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸，所述核酸包含(a)驱动所述目的多核苷酸在哺乳动物癌细胞中表达的调节性多核苷酸，其选自下列的调节性多核苷酸(i)调节性多核苷酸，从5，端至3，端包含-与选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第一核酸；和画与核酸SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸；ii-所述第一和第二核酸彼此直接连接，或-所述第一和第二核酸通过间隔核酸[具有1至3000个核苷酸长度彼此间接连接。(ii)与SEQIDNO:4中起始于第2200位核苷酸并终止于第2432位核苷酸的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；(iii)与SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；和(iv)调节性多核苷酸，从5，端至3，端包含画与选自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少90。/。核苷酸同一性的第一核酸；和-与SEQIDNO:8的核酸具有至少90。/。核普酸同一性的第二核酸；画所述第一和第二核酸彼此直接连接，或-所述第一和第二核酸通过间隔核酸[具有1至2000个核苷酸长度]彼此间接连接，和(b)所述目的多核苷酸。如本文所预期的那样，所定义的与参考多核苷酸具有至少90%核苷酸同一性的多核苷酸，将与所述参考多核苷酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%的核苷酸同一性。如本文所使用，"序列同一性百分数，，通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定，其中与参考序列(其不包含插入或者缺失)相比，多核苷酸或氨基酸序列在比较窗口中的片段可以包含插入或缺失(例如缺口或悬突)，以<吏于两个序列最佳比对。百分数如下计算(i)确定在两个序列中存在相同核酸碱基或者氨基酸残基的位置的数量，得到匹配位置数，(ii)将匹配位置数除以比较窗口中的总位置数，和(iii)将结果乘以100得到序列同一性百分数。用于比较的最佳序列比对可以通过如下方式进行Smith和Waterman的局部同源性算法(Add.Apl.Math.2:482(1981))、Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J.Mol.Biol.48:443(1970))、12Pearson和Lipman的相似性搜索方法(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85:2444(1988))、这些算法的计算机化执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDr.，Madison,Wis.)、或目检。在已经确定两个序列用于比较时，优选采用GAP和BESTFIT确定它们的最佳比对。有代表性地，使用缺口加4又默认值5.00和缺口长度加权默认值0,30。为了最佳比较，可以使用CLUSTALW(版本1.82)在下列参数下得到两个核酸序列的同一性百分数(1)CPUMODE=CIustalWmp;(2)ALIGNMENT=全长》;(3)OUTPUTFORMAT=alnw/个数》；(4)OUTPUTORDER=比对的》;(5)COLORALIGNMENT=无》;(6)KTUP(字长)=默认》;(7)WINDOWLENGTH=默认》;(8)SCORETYPE=《百分数》;(9)TOPDIAG=默认》;(10)PAIRGAP=默认》;(11)PHYLOGENETICTREE/TREETYPE=无》;(12)MATRIX=默认》;(13)GAPOPEN=默认》;(14)ENDGAPS=默认》;(15)GAPEXTENSION=默认》;(16)GAPDISTANCES=默认》；(17)TREETYPE=cladogram以及(18)TREEGRAPDISTANCES=隐藏》。本文包括作为调节性多核苷酸的下述任何多核苷酸，其与上述参考调节性多核苷酸具有至少卯％的核酸同一性并且能够驱动目的多核苷酸特异性地在哺乳动物癌细胞、包括人癌细胞中表达。在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中，例如在上面所定义的核酸中，所述调节性多核苷酸(a)有效连接至所述目的多核苷酸。如本文所使用，"有效连接"意味着这样一种连接，其中所述调节性多核苷酸与所述目的多核苷酸以目的多核苷酸的转录处于所述调节性多核苷酸的影响或控制下的方式连接。对于两个DNA序列(例如待转录的目的多核苷酸和连接至待转录目的多核苷酸5'端的调节性多核苷酸)而言，如果对调节性多核苷酸功能的诱导导致编码目的多核苷酸的mRNA转录，以及如果两个DNA序列之间的连接性质不(1)引入移码突变、(2)干扰调节性多核苷酸指导蛋白质、反义RNA或核酶表达的能力、或者(3)干扰DNA模板转录的能力，则这两个DNA序列称作彼此有效连接。因此，当调节性多核苷酸有效连接至目的多核苷酸序列时，所述调节性多核苷酸能够实现目的多核苷酸序列的转录。在上面所定义的本发明核酸中，有效连接至目的多核苷酸的调节性多核苷酸具有指导所述目的多核苷酸特异性地在癌细胞中转录的能力。上述调节性多核苷酸的特异性活性并不排除在正常的非癌细胞中也可能存在所述目的多核普酸的低水平表达。然而，本文描述的调节性多核苷酸指导所述目的多核苷酸高度优先地(包括排他性地)在哺乳动物癌细胞中转录。"高度优先，，意味着所述目的多核苷酸在癌细胞中的转录水平与正常的非癌细胞中的转录水平相比增加至少3倍、优选5倍、更优选至少10倍、仍更加优选至少20倍、50倍或100倍。如本文所使用，癌细胞指具有致癌细胞的典型特征的细胞，所述典型特征例如不受控增殖、永生化、转移潜能、快速的生长和增殖速度以及某些特异性形态特征。癌细胞通常为肿瘤的形式，但是此类细胞可以在身体内单独存在或者可以是非致瘤性癌细胞，例如白血病细胞。癌细胞可以与多种癌症相关，包括但不限于白血病、淋巴瘤、肝癌、脑癌、脑脊髓癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫颈癌、子宫癌、卵巢癌、肾癌、食道癌、肺癌、结肠癌、黑素瘤、神经母细胞瘤和胰腺癌。优选地，根据本发明，癌细胞为来自肝脏的癌细胞，包括癌性肝细胞。在所有情况下，在如上面所定义的本发明的核酸中，有效连接至调节性多核苷酸的目的多核苷酸相对于所述调节性多核苷酸而言为"异源的"。这意味着所述目的多核苷酸不包括编码人或大鼠AFP的多核苷酸，也不包括编码人或大鼠HIP/PAPI蛋白质的多核苷酸。包含于如上面所定义的用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中的调节性多核苷酸的优选实施方案在下文描述。衍生自人启动子的调节性多核苷酸的优选实施方案本发明已经证实，用于在哺乳动物癌细胞中特异性表达目的多核苷酸的、衍生自编码人AFP蛋白质的基因的启动子区域的、最短功能性调节多核苷酸是这样的调节性多核苷酸，其从5，端至3，端的组成是画与选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少卯％核普酸同一性的第一核酸；和-与核酸SEQIDNO:3具有至少卯％核苷酸同一性的第二核酸，所述第一核酸的3'端核苷酸共价连接至所述第二核酸的5，端核苷酸。编码人AFP蛋白质的基因的启动子区域已经为本领域所知。来自人AFP基因启动子的最小功能性序列已由Watanabe等公开(1987，J.Biol.,Chem.，Vol.282(10):4812-4818)。根据Watanabe等(1987)，对于增强子活性而言重要的序列位于AFP基因上游3.3和3.7千碱基对之间的400个碱基对区域。Watanabe等(1987)使用携带AFP5'侧翼序列的CAT构建体进行研究，表明使用缺乏位于AFP基因上游3.7千g对的远端增强子元件的较短AFP启动子片段时，不发生CAT编码序列的转录。值得注意的是，使用仅包含AFP基因上游2.9千g对的AFP启动子片段时，不能检测到CAT表达。十分令人惊讶地，本发明已经发现，包含不超过1000个核苷酸的、如上所述的人AFP启动子片段可以成功地指导目的多核苷酸特异性地在癌细胞中转录。此外，本文证实，从5，端至3，端包含与SEQIDNO:l(或SEQIDNO:2)具有至少90%核苷酸同一性的所述第一核酸和与SEQIDNO:3具有至少90。/。核普酸同一性的所述第二核酸、并且其中所述第一和第二核酸被间隔核酸分开的调节序列也具有指导目的多核苷酸特异性地在癌细胞中转录的能力。在本文中据信，分别为有义方向和反义方向的核酸SEQIDNO:l和SEQIDNO:2赋予在哺乳动物癌细胞中表达的特异性，而核酸SEQIDNO:3被认为AJ陚予启动子功能的最小序列。15因此，本发明的目的功能性调节多核苷酸包括这样的多核苷酸，其从5'端至3，端包含-与选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第一核酸；和-与核酸SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接连接，或-所述第一和第二核酸通过间隔核酸[具有1至3000个核苷酸长度彼此间接连接。其中所述第一和第二核酸彼此直接连接的此类调节性多核苷酸的一个实施方案在本文中以调节性多核苷酸SEQIDNO:9举例说明，该调节性多核苷酸SEQIDNO:9从5'端至3，端包含核酸SEQIDNO:2，核酸SEQIDNO:2直接连接至核酸SEQIDNO:3。其中所述第一和第二核酸通过间隔核酸彼此间接连接的此类调节序列的另一个实施方案在本文中以调节性多核苷酸SEQIDNO:10举例说明，调节性多核苷酸SEQIDNO:10从5，端至3，端包含核酸SEQIDNO:1,该第一核酸通过其3端连接至具有2835个核苷酸长度的间隔核酸上，并且所述间隔核苷酸通过其3，端连接至所述第二核酸SEQIDNO:3。如果调节序列中存在间隔核酸，则间隔核酸通常具有1至3000个核苷酸的核苷酸长度，每一核苷酸优选地选自腺苷(也称作"A")、胸苷(也称作"T，，)、鸟苷(也称作"G，，)、胞苷(也称作"C，，)并在某些情况下选自尿苷(也称作"U")。在某些实施方案中，间隔核酸具有多达2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2卯0、2950个核苷酸长度。在某些实施方案中，间隔核酸由来自人AFP启动子的连续核苷酸组成，例如来自人AFP启动子的至少2个至至少2500个连续核苷酸，如在本文调节序列SEQIDNO:10中那样。因此，本文包括调节性多核苷酸，其组成为-与选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第一核酸；-具有1至3000个核普酸长度的间隔核酸，和-与核酸SEQIDNO:3具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸。的确，衍生自人AFP启动子的本发明调节序列还可以包含画连接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文也可以称作5，侧翼序列；和/或-连接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文也可以称作3，侧翼核酸。所述5，附加核酸和所述3，附加核酸具有1至1500个核苷酸、优选1至1500个核苷酸的核苷酸长度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由被核酸酶、包括内切核酸酶识别的限制酶切位点序列组成，例如用于在适宜核酸构建体如克隆载体或表达载体中克隆。在某些实施方案中；所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300或1400个核苷酸长度。例证性地，调节性多核苷酸SEQIDNO:10包含604个核苷酸长度的5，附加多核苷酸。本发明包括与核酸SEQIDNO:9具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苦酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:9自身。本发明包括与核酸SEQIDNO:10具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:10自身。17衍^-入启动f时^伊#/裙茅^#说'逸^滋才隶本发明已经证明，用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的、衍生自编码人HIP/PAPI蛋白质的基因之启动子区域的、更短功能性调节多核苷酸，可以由SEQIDNO:4中起始于第2200位核苷酸并终止于笫2432位核苷酸的调节性多核苷酸，也即本文中的调节性多核苷酸SEQIDNO:11组成。HIP/PAP蛋白质是在肝细胞癌(HCC)中过表达的C型凝集素。该蛋白质具有多效生物学活性，但是对于HIP/PAP在肝脏中的功能知之甚少。如PCT申请号WO2004/112824中所公开，HIP/PAPI被证实对原代培养物中的肝细胞具有体外促有丝分裂和抗凋亡效果。在肝脏衰竭和肝脏再生过程中，HIP/PAP还是肝细胞的体内促有丝分裂和抗凋亡分子。PCT申请号WO2004/11824还公开了包含有效连接至(i)兔WAP基因启动子或(ii)小鼠白蛋白基因18启动子的HIP/PAPI编码序列的DNA构建体。在现有技术中还没有对编码人HIP/PAPI蛋白质的基因的启动子区域进行功能研究。现今根据本发明已证明，在人基因组中位于HIP/PAPI蛋白质编码序列上游的序列SEQIDNO:4是能够指导与其有效连接的目的多核苷酸特异性地在哺乳动物癌细胞中转录的调节序列。此外还证明，通过剪切核酸SEQIDNO:4而得到的多种核酸片段也具有指导与其有效连接的目的多核苷酸特异性地在哺乳动物癌细胞中转录的能力，所有这些核酸片段均包含核酸SEQIDNO:11。此外，本文还证明，核酸SEQIDNO:11自身具有指导与其有效连接的目的多核苷酸特异性地在哺乳动物癌细胞中转录的能力。因此，本发明功能性目的调节多核苷酸包括含有核酸SEQIDNO:11的那些多核苷酸。那些目的调节性多核苷酸包括在本文实施例中公开的HIP/PAPI启动子的多种功能性片段，包括核酸SEQIDNO:12、SEQIDNO:13和SEQIDNO:14。因此，在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中，所述调节性多核苷酸可以选自-与包含SEQIDNO:11的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与包含SEQIDNO:12的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与包含SEQIDNO:13的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与包含SEQIDNO:14的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸；和-与包含SEQIDNO:4的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸。此外，在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中，所述调节性多核苷酸还可以选自-与由SEQIDNO:11组成的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与由SEQIDNO:12組成的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与由SEQIDNO:13组成的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与由SEQIDNO:14组成的核酸具有至少90。/。核苷酸同一性的调节性多核苷酸;和-与由SEQIDNO:4组成的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸。通常，在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中，所述调节性多核苷酸具有核酸SEQIDNO:4中的至少2"个连续核苷酸并且包含核酸SEQIDNO:11。例证性地，调节性多核苷酸SEQID19NO:12包含SEQIDNO:4中的573个连续核苷酸并且包含SEQIDNO:11。仍为例证性地，调节性多核苷酸SEQIDNO:13包含SEQIDNO:4中的1332个连续核苷酸并且包含SEQIDNO:11。仍为例证性地，调节性多核苷酸SEQIDNO:14包含SEQIDNO:4中的2056个连续核苷酸并且包含SEQIDNO:11。此类调节性多核苷酸可以包含SEQIDNO:4中的多达2426个连续核苷酸。因此此类调节性多核苷酸可以包含SEQIDNO:4中的至少233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、2卯、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、3卯、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、410、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、2013卯、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、14卯、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、15卯、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、19卯、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、22卯、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410或2420个连续核苷酸并且包含核酸SEQIDNO:11。还包括与上面所定义的调节性多核苷酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸。的确，衍生自人HIP/PAPI启动子的本发明调节序列还可以包含-连接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文中也可以称作5，侧翼序列；和/或-连接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文中也可以称作3，側翼核酸。所述5，附加核酸和所述3，附加核酸具有1至2500个核苷酸、优选1至1500个核苷酸的核苷酸长度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由核酸酶、包括内切核酸酶识别的限制酶切位点序列组成，例如用于在适宜核酸构建体，例如克隆载体或表达载体中克隆的目的。在某些实施方案中，所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、卯0、950、1000、1100、1200、1300或1400个核苷酸的长度。例证性地，调节性多核苷酸SEQIDNO:4包含调节性多核苷酸SEQIDNO:11上游的长度超出2200个核苷酸的5，附加多核苷酸。衍生自大鼠HIP/PAPI启动子的调节性多核苷酸的优选实施方案本发明已经证明，衍生自大鼠HIP/PAPI启动子的调节性多核苷酸能够指导目的多核苷酸特异性地在哺乳动物癌细胞中表达。值得注意的是，本文证明核酸SEQIDNO:5能够指导目的多核苷酸特异性地在癌细胞中表达。本领域已知，在胰腺炎的急性期，大鼠HIP/PAPI基因表达增加超过200倍(1991,Iovanna等，JBiolChem，Vol.266:24664-24669)。大鼠HIP/PAPI基因启动子区域本身是现有技术中已知的。在本领域中，通过使用经带有融合至CAT基因的大鼠HIP/PAPI启动子的不同缺失片段的DNA构建体转染的胰腺细胞，已经证明，当所转染细胞与IL-6和地塞米松的混合物孵育时，所测试的几种启动子片段能够诱导CAT报告基因表达(1995，Dusetti等，JBiolChem，Vol.270(38):22417-22421)。由于大鼠HIP/PAPI启动子对IL-6和地塞米松混合物的诱导敏感，故Dusetti等(1995)提出大鼠HIP/PAPI基因应该归为2类的急性期蛋白，其表达通过IL-6与糖皮质激素的联合作用而增加。因此，根据本发明现以证明，在大鼠基因组中位于大鼠HIP/PAPI蛋白质编码序列上游的序列SEQIDNO:5为能够指导与其有效连接的目的多核苷酸特异性地在哺乳动物癌细胞中转录的调节序列。不希望被任何特定理论所束缚，据认为，以前证明于特定诱导条件下在胰腺细胞中具有功能的大鼠HIP/PAPI启动子的任何一个核酸片段也能够用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸。因此，在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的本发明核酸中，所述调节性多核苷酸也可以选自包含衍生自大鼠HIP/PAPI启动子的最短功能性核酸片段，或者包含与其具有强核苷酸同一性的核酸片段的调节性多核苷酸。因此，本发明另一个目的是如上面一般定义的用于特异性地在哺乳动22物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸，在该核酸中所包含的调节性多核苷酸由与SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸(所述核酸是以前被证实于特定诱导条件下在胰腺细胞中具有功能的衍生自大鼠HIP/PAPI启动子的最短核酸片段)具有至少90%核苷酸同一性的核酸组成。因此，这些调节性多核苷酸涵盖如何核酸，所述核酸包含核酸SEQIDNO:5中至少274个连续核苷酸并且含有SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核普酸的核酸。例证性地，这些调节性多核苷酸包括含有核酸SEQIDNO:5中317个连续核苷酸并且含有SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸的核酸。进一步例证性地，这些调节性多核苷酸包括包含核酸SEQIDNO:5中379个连续核苷酸并且含有SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸的核酸。仍然例证性地，这些调节性多核苷酸包括包含核酸SEQIDNO:5中444个连续核苷酸并且包含SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸的核酸。在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中，可以包括与包含SEQIDNO:5中至少274、275、276、277、278、279、280、290、291、292、93、294、295、96、297、298、299、00、301、302304305、306、307、308、309、310、311、312、313、314315、31617、318、319、320、21、、、32526、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、歸、870、880、890、卯0、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240或1250个连续核苷酸并且包含SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核香酸的核酸的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸。的确，衍生自人HIP/PAPI启动子的本发明调节序列还可以包含-连接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文中也可以称作5，侧翼序列；和/或画连接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文中也可以称作3，侧翼核酸。所述5，附加核酸和所述3'附加核酸具有1至2500个核苷酸、优选1至1500个核苷酸的核苷酸长度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由核酸酶、包括内切核酸酶所识别的限制酶切位点序列組成，例如用于在适宜核酸构建体例如克隆载体或表达载体中克隆的目的。在某些实施方案中，所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900或950个核苷酸的核苷酸长度。例证性地，调节性多核苷酸SEQIDNO:5包含位于SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的调节性多核苷酸上游的、超过950个核苷酸长度的5，附加多核苷酸。衍生自大鼠启动子的调节性多核苷酸的优选实施方案本发明已经证明，用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的、衍生自大鼠AFP蛋白质编码基因启动子区域的最短功能性调节多核苷酸，是从5，端至3，端具有如下组成的调节性多核苷酸-与选自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少90。/o核苷酸同一性的第一核酸；和-与SEQIDNO:8的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸，所述第一核酸3'端的核苷酸共价连接至所述第二核酸5，端的核苷酸上。非常令人惊讶地，本发明已经发现，如上所述的包含不超过1100个核苷酸的大鼠AFP启动子片段成功地指导目的多核苷酸特异性地在癌细胞中转录。此外，本文证明，下述调节序列也具有指导目的多核苷酸特异性地在癌细胞中转录的能力，所述调节序列从5，端至3，端包含与SEQIDNO:6(或SEQIDNO:7)具有至少90。/。核苷酸同一性的所述第一核酸和与SEQIDNO:8具有至少90。/。核苷酸同一性的所述第二核酸，并且其中所述第一和第二核酸通过间隔核酸分开。在此相信，分别为有义方向和反义方向的核酸SEQIDNO:6和SEQIDNO:7赋予在哺乳动物癌细胞中表达的特异性，而核酸SEQIDNO:8据信为赋予启动子功能的最小序列。因此，本发明的目的功能性调节多核苷酸包括这样一些多核苷酸，其从5，端至3，端包含画与选自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的第一核酸；和画与SEQIDNO:8的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接连接，或-所述第一和第二核酸通过间隔核酸[具有1至2000个核苷酸长度l彼此间接连接。其中所述第一和第二核酸通过小间隔核酸彼此间接连接的此类调节序列的一个实施方案在本文中以调节性多核苷酸SEQIDNO:15例证，所述的调节性多核普酸SEQIDNO:15从5，端至3，端包含核酸SEQIDNO:257、该所述第一核酸通过其3'端连接至具有106个核苷酸长度的间隔核酸上、所述间隔核苷酸通过其3'端连接至所述第二核酸SEQIDNO:8上。其中所述第一和第二核酸通过长间隔核酸彼此间接连接的此类调节序列的另一个实施方案在本文中以调节性多核苷酸SEQIDNO:16例证，所述的调节性多核苷酸SEQIDNO:16从5'端至3，端包含核酸SEQIDNO:6、该所述第一核酸通过其3，端连接至具有1857个核苷酸长度的间隔核酸上、所述间隔核苷酸通过其3，端连接至所述第二核酸SEQIDNO:8上。如果调节序列中存在间隔核酸，间隔核酸通常具有1至2000个核苷酸的核苷酸长度，每一核苷酸优选地选自腺苷(也称作"A，，)、胸苷(也称作"T，，)、鸟苷(也称作"G，，)、胞苷(也称作"C")并且在某些情况下选自尿苷(也称作"U")。因此，本文包括由下列核酸组成的调节性多核苷酸-与选自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的笫一核酸；-具有1至2000个核苷酸的核苷酸长度的间隔核酸，和-与SEQIDNO:8的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸。在某些实施方案中，间隔核酸具有不超过2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、l糊、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、l卯0、1950或2000个核苷酸的长度。在某些实施方案中，间隔核酸由来自大鼠AFP启动子的连续核苷酸，例如来自大鼠AFP启动子的至少2个至至少1800个连续核苷酸组成，正如在本文调节序列SEQIDNO:16中一样。的确，衍生自大鼠AFP启动子的本发明调节序列还可以包含國连接至所述第一核酸5，端的5，附加核酸，其在本文中也可以称作5，侧翼序列；和/或-连接至所述第二核酸3，端的3，附加核酸，其在本文中也可以称作3，侧翼核酸。所述5'附加核酸和所述3'附加核酸具有1至1500个核苷酸、优选1至1500个核苷酸的核苷酸长度。值得注意的是，所述5，附加核酸和所述3，附加核酸可以由核酸酶、包括内切核酸酶识别的限制酶切位点序列组成，例如用于在适宜核酸构建体例如克隆载体或表达载体中克隆的目的。在某些实施方案中，所述5，附加核酸和/或所述3，附加核酸具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、卯、100、150、200、250、300、350、400、1450、500、1550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300或1400个核苷酸的长度。例证性地，调节性多核普酸SEQIDNO:16包含346个核苷酸长度的5，附加多核苷酸，该5，附加多核苷酸位于SEQIDNO:16中所包含的SEQIDNO:6的上游。仍为例证性地，调节性多核苷酸SEQIDNO:16包含76个核苷酸长度的3，附加多核苷酸，该3，附加多核苷酸位于SEQIDNO:16中所包含的SEQIDNO:8的下游。本发明包括与核酸SEQIDNO:15具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:15本身。本发明包括与核酸SEQIDNO:16具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸，并且因此包括核酸SEQIDNO:16本身。在用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸中所包含的优选目的多核苷酸在用于特异性地在哺乳动物细胞中强表达目的多核苷酸的核酸中，例如如本说明书中所定义的核酸中，所述目的多核苷酸可以是任何类型，只要其可以用于癌症的预防性或治疗性目的即可。换言之，当所述目的多核苷酸在所述调节性多核苷酸控制下在癌细胞中特异性地表达时，在任何情况下，所述目的多核苷酸均应在细胞水平和27/或组织水平和/或器官水平和/或更加全身性地在整个哺乳动物有机体水平上诱导抗癌活性。本领域已知的大量具有抗癌活性的多核苷酸均可用作本发明核酸中的目的多核苷酸。抗癌活性可以定义为破坏癌细胞和/或抑制其增殖和/或促进其分化。癌细胞是恶性转化的细胞，本领域技术人员已知其是在生长调节性基因和途径上带有已知或未知的异常的细胞。此类细胞具有以不受控的方式生长的能力，并且可以在天然疾病条件下或实验条件下引起肺瘤形成。肿瘤定义为同质或异质的癌细胞团。抗癌活性包括对体外生长的癌细胞或者人或非人动物受试者体内的癌细胞的破坏和/或抑制其增殖和/或促进其分化。对癌细胞进行破坏和/或抑制其增殖和/或促进其分化，可涉及本领域技术人员已知的机制，包括但不限于各种分化、细胞凋亡(程序性细胞死亡)或者坏死途径。此外，抗癌活性可包括对扩散的癌细胞进行破坏和/或抑制其增殖和/或促进其分化，扩散的癌细胞也称作转移性癌细胞，其具有移动离开最初肿瘤位点的能力，并且可以在一个或多个远离起源肿瘤的位点^J^现。此外，抗癌活性可以包括减少、完全消除包含同质或异质癌细胞群体的局限性肿瘤或扩散性肿瘤，或抑制其生长。具有抗癌活性的多核苷酸包括这样的多核苷酸，当该多核苷酸在细胞中表达时其直接或间接诱导细胞死亡。这些目的多核苷酸在本文中称作"自杀多核苷酸"。自杀多核苷酸包括(i)编码具有细胞毒性的蛋白质的多核苷酸；(ii)编码在其它物质存在时能诱导细胞毒性的蛋白质的多核苷酸；(iii)编码RNAi的多核苷酸，所述RNAi改变或阻断细胞生存所必需的蛋白质的表达，或者导致癌基因沉默；(iv)编码细胞毒性核糖核酸酶的多核苷酸；(v)编码抗癌活性所需的核酶的多核苷酸，所述核酶靶向蛋白质的表达；28(Vi)编码抗癌活性所需的有义或反义核酸的多核苷酸，所述有义或反义核酸改变或阻断蛋白质的表达。薦Z^拔膚差厉^^W,yj"茅^具有抗癌作用的目的多核苷酸的例证性实例包括具有抗增殖活性、抗转移活性、抗血管生成活性或促凋亡活性的基因，例如mda-7/IL-24(Sarkar等，(2002)BiotechniquesSuppl:30-39;Fisher等，(2003)CancerBiolTher2:S23画37)、TNF-a.(Anderson等，CurrOpinPharmacol(2004)4(4):314-320)、IFN画p(Yoshida等，(2004)CancerSci95(11):858-865)、p53(Haupt等，CellCycle(2004)3(7):912-916)、BAX(Chan等，ClinExpPharmacolPhysiol(2004)31(3):119-128)、PTEN(Sansal等，JClinOncol(2004)22(14):2954-63)、可溶性成纤维细胞生长因子受体(sFGFR)(Gowardhan等，(2004)Prostate61(1):50-59)、RNAi或反义-ras(Liu等，CancerGeneTher(2004)11(11):748-756.)、RNAi或反义VEGF(Qui等，HepatobiliaryPancreatDisInt(2004)3(4):552-557)、反义或RNAimda-9/内居蛋白(Sarkar等，PharmacolTher(2004)104(2):101-115)。具有抗癌作用的目的多核苷酸的其它例证性实例包括增强放疗的那些，包括但不限于，p53(Ha叩t等,CellCycle(2004)3(7):912-916)、GADD34(Leibermann等，Leukemia(2002)16(4):527-41)、碘化钠同向转运体(对于甲状腺癌)(Mitrofanova等，ClinCancerRes(2004)10(20):6969-6976)或者Na+/K+ATP酶(PCT申请号WO98/45443)。具有抗癌作用的目的多核苷酸的再其它例证性实例包括编码单纯疱渗病毒l型胸苷激酶基因(HTK)的那些，其与药物更昔洛韦(GCV)组合施用。HTK是迄今在实验模型中和临床试验中最常用的癌基因治疗系统。参见J.Gomez國Navarro等，"Genetherapyforcancer,"EuropeanJournalofCancer,vol.35，pp.867-885(1999)。HTK的底物特异性区别于细胞胸苷激酶的，HTK可以将GCV转化成毒性的鳞酸化形式，从而特异性地杀死表达HTK的细胞。自HTK/GCV系统的概念首次描述以来，已经证明其作为肿瘤消除策略在多种实验模型中取得了很好的成功。此外，基于该模型的超过两打的临床基因治疗试验已经于最近7年启动。参见J.A.Roth等，"癌症基因治疗我们已作了什么以及我们将去何方？"("Genetherapyforcancer:whathavewedoneandwherearewegoing")JournaloftheNationalCancerInstitute,vol.89(1),pp.21-39(1997);D.Klatzmann等，"单纯疱渗病毒1型胸普激酶"自杀，，基因疗法对复发性转移性黑素瘤的I/II期剂量递增研究，，("APhaseI/IIdose-escalationstudyofherpessimplexvimstype1thymidinekinase"suicide"genetherapyforrecurrentmetastaticmelanoma,")HumanGeneTherapy,vol.9，pp.2585-2894(1998);和J.R.Herman等，"前列腺的腺癌的原位基因治疗I期临床试验，，("Insitugenetherapyforadenocarcinomaoftheprostate:AphaseIclinicaltrial,")HumanGeneTherapy,vol.10，pp.1239-1249(1999)。薦竭/A^/成WiA^^《的/核茅^具有抗癌作用的目的多核苷酸的其它例证性实施方案包括编码siRNA的那些，所述siRNA可以用于沉默目的基因(包括细胞存活所需的基因和癌基因)以引起抗癌活性(参见(i)Borkhardt，A"BlockingoncogenesinmalignantcellsbyRNAinterference:NewhopeforahighlyspecificcancertreatmentCancerCell,2002.2(3):p.167-8;(ii)Wilda，M,等,KillingofleukemiccellswithaBCR/ABLfusiongenebyRNAinterference(RNAi).Oncogene,2002.21(37):p.5716-24;(iii)Brummelkamp，T.R"R.Bernards,和R.Agami，Stablesuppressionoft腿ourigenicitybyvirus-mediatedRNAinterference.CancerCell,2002，2(3):p.243-7)。为了本发明的目的，术语"RNA干扰"或"RNAi"作广义定义并且包括所有转录后机制和转录机制的RNA介导的基因表达抑制，例如描述于P.D.ZamoreScience296，1265(2002)中的那些。RNA干扰可以由双链RNA(dsRNA)介导，其可以在真核生物中诱导许多不同的外遗传基因沉默过程，包括同源mRNA的降解——在动物中称作RNA千扰(RNAi)和在植物中称作转录后基因沉默(PTGS)的过程。RNA干扰(RNAi)由AndrewFire和CraigMello于1998年在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中首次发现。已经证明，双链RNA通过称作RNA千扰的过程抑制具有互补序列的基因的表达(参见HammondetaI.Nat.Rev.Genet.2:110-119(2001))。根据本发明，对应于待下调基因的区域的dsRNA复合体可以通过rAAV介导的RNAi表达盒而转移在细胞中表达。为了本发明的目的，如本文所使用的术语"小干扰RNA"(或"siRNA")意思是指短的干扰RNA，其为长度小于30个M对(即60个核苷酸或碱基)并且优选21-25个碱基对(即42-50个碱基或核苷酸)的双链RNA复合体。更普遍地，负责诱导RNAi的双链RNA称作"干扰RNA"。因此，"小干扰RNA"或"siRNA，，是能够降低与其具有同源性的基因表达的双链RNA复合体。同源性覆盖的基因区域或者其它核苷酸序列称作"RNAi靶区域"、"靶区域"、"RNAi乾序列"或者"靼序列"。在一个实施方案中，siRNA可以是包含有义区、环区和反义区的"发夹"或"茎-环RNA分子"，其中反义区与有义区互补并因此能够形成诱导RNAi的dsRNA复合体。在其它实施方案中，siRNA包含两个不同的RNA分子，它们非共价结合以形成dsRNA复合体。可以通过表达自目的多核苷酸的RNAi打靶而被沉默的癌基因包括选自ABLI、BCL1、BCL2、BCL6、CBFA2、CBL、CSFIR、ERBA、ERBB、EBRB2、ETS1、ETS1、ETV6、FGR、FOS、FYN、HCR、HRAS、JUN、KRAS、LCK、LYN、MDM2、MLL、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、NRAS、PIM1、PML、RET、SRC、TAL1、TCL3和YES的癌基因。为了本发明的目的，如本文所使用的术语"RNAi表达盒"意思是指编码一个或一个以上RNA分子的核酸组合物，其中所述RNA分子能够形成双链RNA复合体并因此能够诱导RNA干扰。在本发明上下文中，所述RNAi表达盒是rAAV载体或rAAV基因组的一部分。因此，本发明提供用于在mRNA水平体内降低或者下调哺乳动物受试者癌细胞内基因表达的方法。该方法包括向哺乳动物受试者(的细胞)体31内施用重组腺伴随病毒载体，所述载体包含RNA干扰("RNAi")表达盒，其RNA表达产物通过形成能诱导"RNA介导的干扰，，或者"RNA干扰"("RNAi")(—种转录后基因沉默机制)的双链RNA复合体而直接或间接导致相应RNAi粑基因表达降低。该dsRNA复合体包含在细胞的生理条件下能杂交至待下调基因(即RNAi耙基因)的mRNA转录物的至少部分核苷酸序列上的核苷酸序列。特别地，RNAi表达盒的RNA表达产物将降低RNAi靶基因的mRNA转录物的细胞浓度，由此导致哺乳动物受试者内RNAi乾基因所编码的蛋白质的浓度降低。基因表达的下调是特异性的，这是因为在设计待通过rAAV-介导的基因转移而体内转移入哺乳动物受试者细胞内的RNAi表达盒的RNA编码区的序列特性时，选择了来自RNAi靶基因的一部分的核苷酸序列；备选地，也就是说，抑制是序列特异性的，这是因为对应于双链RNA复合体双链区的核苷酸序列是RNA千扰所耙向的。本发明还提供编码RNA分子的RNAi表达盒，其中所述的RNA分子在有效连接至本文所公开的衍生自人或大鼠AFP、人和大鼠HIP/PAPI的调节性多核苷酸时能够在癌细胞中形成双链RNA复合体并因此能够诱导RNA干扰。此类RNAi表达盒可以由单一DNA分子組成作为rAAV基因组的一部分，当引入细胞内后其产生能够分子内形成dsRNA复合体的单一RNA分子。然而，可以同时或者相继地向细胞内引入一种以上的rAAV基因组或RNAi表达盒或RNA编码区，以产生两种或两种以上能够分子间形成dsRNA复合体的RNA分子。典型地，能够分子内或者分子间形成dsRNA复合体的两个RNA结构部分是待下调或者降低表达的基因或核酸序列的至少部分有义序列和至少部分反义序列。RNAi表达盒的设计并不限制本发明的范围。可以采用不同的策略设计RNAi表达盒，并且基于不同设计的RNAi表达盒将能够体内诱导RNA千扰。(虽然RNAi表达盒的设计不限制本发明的范围，但是在本发明详述中和下面包括一些RNAi表达盒设计。)所有RNAi表达盒共有的一个特性是它们包含RNA编码区，所述RNA编码区編码的RNA分子能够单独或者与另一RNA分子联合通过形成分子内或者分子间双链RNA复合体而诱导RNA干扰。可以采用不同的设计原理来实现同样的目标，并且这些设计原理也是本领域技术人员所已知的。例如，RNAi表达盒可以编码一个或一个以上RNA分子。在自RNAi表达盒表达RNA之后或者过程中，可以通过单一自身互补的RNA分子或者通过两个互补的RNA分子形成双链RNA复合体。dsRNA复合体的形成可以起始于细胞核内或者细胞核外。在一个方面，本文提供双链RNA复合体，其包含能够在生理条件下杂交至mRNA分子的至少一个部分上的第一RNA部分和第二RNA部分，其中第二RNA部分的至少一个部分能够在生理条件下杂交至第一部分。优选地，第一和第二部分是同一RNA分子的部分并且能够在生理条件下，如细胞内所存在的那些条件下杂交，并且当第一和第二部分杂交时形成双链RNA复合体。在另一方面，本文提供用于形成双链RNA复合体的线性RNA分子，其包含(优选在细胞内)能够杂交至mRNA分子的至少一个部分上的第一部分和第二部分，其中第二部分的至少一个部分能够杂交至第一部分上以形成发夹dsRNA复合体。再一个方面，本发明方法包括具有部分或全部双链特征的RNA的体内AAV介导表达。包含与RNAi乾基因的一部分相同的核苷i^列的dsRNA复合体优选用于抑制。还发现相对于RNAi靶序列而言具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也可有效实现抑制。因此，可以通过本领域已知的比对算法并通过计算核苷酸序列间差异百分数而优化序列同一性。备选地，dsRNA复合体的双链区可以功能性地定义为能够与部分靶基因转录物杂交的核苷酸序列。在优选实施方案中，RNAi表达盒包含至少一个RNA编码区。优选地，RNA编码区是能充当模板用于在宿主细胞中表达期望RNA分子的DNA序列。在一个实施方案中，RNAi表达盒包含两个或两个以上RNA33编码区。RNAi表达盒还可以包含本文所公开的衍生自人或大鼠AFP或人或大鼠HIP/PAPI的调节性多核苷酸，以致使RNAi产物特异性地在哺乳动物癌细胞中表达。在某些实施方案中，本发明采用包含核酶的RNA分子产生dsRNA复合体，由此克服了与产生dsRNA相关的某些已知困难。例如，可以使用核酶的功能性以去除多腺苷酸化信号，由此阻止RNA分子自细胞核的释放或者使释放最小化。在另外的实施方案中，本发明基于RNA分子的一部分能够编码增强dsRNA特异性活性的RNA或蛋白质的能力。在本发明的另一方面，RNA编码区的表达导致靶基因的下调。优选地，靶基因包含与RNA编码区具有至少约90%同一性、更优选至少约95%同一性并且甚至更优选至少约99%同一性的序列。RNAi乾基因不限制本发明的范围，并且可以是细胞存活所需的任何基因，包括癌细胞存活所需的任何基因。因此，RNAi把基因的选择对于本发明而言是非限制性的本领域技术人员知道如何设计RNAi表达盒以下调任何目的RNAi靶基因的基因表达。依赖于具体的RNAi靶基因和所递送的rAAV病毒体的剂量，该方法可以造成RNAi靶基因功能的部分丧失或者完全丧失。竊码细應##^^#核凝雜的《的多核夯^为了本发明的目的，有效连接至衍生自人或大鼠AFP或者人或大鼠HIP/PAPI启动子的调节性区域的目的多核苷酸可以是编码细胞毒性核糖核酸酶的多核苷酸。多种细胞毒性核糖核酸酶为本领域已知，包括人RNA酶1的变体，例如相对于天然人RNA酶1氨基酸序列而言具有一个或一个以上选自N88CL86E、N88R、G89D、R91DR4C、L86E、N88R、G89D、R91D、V118CL86E、N88C、R91DR4C、L86E、N88C、R91D、V118CR4C、醒C、V118CK7A、L86E、N88C、R91DK7A、L86E、N88R、G89D、R91DR4C、K7A、L86E、N88C、R91D、V118CR4C、K7A、L86E、N88R、G89D、R91D、V118C的氨基酸替代的那些变体。本发明目的多核苷酸所编码的细胞毒性核糖核酸酶还包括相对于天然人RNA酶1氨基酸序列而言具有一个或一个以上选自下列的氨基酸替代的那些-7赖氨酸(K)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)-85精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)-86亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、色氨酸(W)-87苏氨酸(T)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)-88天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)-89甘氨酸(G)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)-90丝氨酸(S)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)-91精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)-92酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)-93脯氨酸(P)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)-94天冬酰胺(N)、赖氨酸(K)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。本发明目的多核苷酸所编码的细胞毒性核糖核酸酶还包括相对于天然人RNA酶1M酸序列而言具有一个或一个以上选自下列的氨基酸替代的那些-1赖氨酸(K)、半胱氨酸(C)-2谷氨酸(E)、半胱氨酸(C)-3丝氨酸(S)、半胱氨酸(C)画4精氨酸(R)、半胱氨酸(C)-5丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)-6赖氨酸(K)、半胱氨酸(C)誦116缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)-117脯氨酸(P)、半胱氨酸(C)-118缬氨酸(V)、半胱氨酸(C)-119组氨酸(H)、半胱氨酸(C)-120苯丙氨酸(F)、半胱氨酸(C)、和-121天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)多种细胞毒性核糖核酸酶，包括上述那些，描述于美国专利申请号US2005261232中，其在此并入作为参考。薦码凝雄^耳核酶以及它们的构建和用途为本领域已知。参见例如Norris等，2000,"Designandtestingofribozymesforcancergenetherapy,"Adv.ExpMed.Biol,465:293-301。还可参见Cech,美国专利号5,093,246;Cech，美国专利号5,116,742;Haselhoff等，1988,Nature334:585-591。一般地，采用已知的金属硫蛋白mRNA分子的核苷酸序列与已知的核酶特性，可以设计和产生在本发明中有用的多种不同的核酶或编码核酶的载体。可以通过本发明目的多核苷酸编码的核酶包括干扰金属硫蛋白基因表达的那些，例如公开于美国专利申请号US2003105(M3中的那些，该美国专利申请号US2003105043在此整个地并入作为参考。此类核酶在所乾向的癌细胞中诱导细胞凋亡。此外，核酶4吏所靶向的癌细胞对辐射、活性氧类别和化疗剂更敏感。因此，此类核酶在哺乳动物癌细胞中的特异表达可以单独使用或者与常规it射疗法或化学疗法組合使用。耙向n种人金属硫蛋白基因中的一种或多种的mRNA的核酶可以用于治疗多种人类36癌症，包括前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌。此类核酶破坏金属硫蛋白编码mRNA,而非仅仅是与它们杂交。核酶4象酶一样起作用，并且每一分子可以被"重复利用，，以降解多个mRNA分子。另外的优势是，为破坏耙RNA，核酶不需要与耙mRNA具有完全互补性。杂交仅仅需要满足使核酶催化位点能断裂靶mRNA即可。因此，可以设计单一核酶以破坏编码不同金属硫蛋白的几种相关mRNA,这比设计常规反义分子以有效针对不同mRNA更容易。本文还包括编码特异性断裂基质金属蛋白酶13(MMP-13)mRNA的核酶的那些目的多核苷酸，例如描述于美国专利申请号2003195164中的那些，美国专利申请号2003195164在此完整地并入作为参考。薦码^"乂成'^:乂^"虔W原付^凝茅^本发明目的多核苷酸还可以编码干扰特异靶基因表达而诱导抗癌活性的有义或反义多核苷酸。此类目的多核苷酸包括编码美国专利申请号2005261249或2005113328中所公开的反义多核苷酸的那些，该两个美国专利申请在此全文并入作为参考。此类目的多核苷酸还包括编码与核仁素mRNA互补的并公开于美国专利申请号200526860中的反义多核苷酸的那些，美国专利申请号200526860在此全文并入作为参考。此类目的多核苷酸还包括编码与BRCA-1mRNA互补的并>^开于美国专利申请号200526857中的反义多核苷酸的那些，美国专利申请号加0526857在此全文并入作为参考。此类目的多核苷酸还包括编码与WT-1mRNA互补的并公开于美国专利申请号200443950的反义多核苷酸的那些，美国专利申请号加0443在此全文并入作为参考。此类目的多核苷酸还包括编码与驱动蛋白mRNA互补的并公开于美国专利申请号20049156的反义多核苷酸的那些，美国专利申请号20049156在此全文并入作为参考。此类目的多核苷酸还包括编码与睾酮阻抑信使-2(TRPM-2)mRNA互补的并公开于美国专利申请号2003158130的反义多核苷酸的那些，美国专利申请号2003158130在此全文并入作为参考。此类目的多核苷酸还包括编码由ADNF-III寡核苷酸组成的并公开于美国专利申请号200336521的反义多核苷酸的那些，美国专利申请号200336521在此全文并入作为参考。本发明目的多核苷酸的最优选实施方案在最优选实施方案中，有效连接至衍生自人AFP启动子、大鼠AFP启动子、人HIP/PAPI启动子或大鼠HIP/PAPI启动子的调节序列上的目的多核苷酸，由编码催化碘细胞摄取的大鼠碘化钠同向转运体(Symporter)(NIS)蛋白质的多核苷酸组成。本领域已经表明，在it^达NIS基因的大鼠细胞中，达到了高水平的放射性碘的细胞纟聂取。当将表达NIS的重组载体直接注射入荷有肝癌的大鼠的癌结节内时，测定到肿瘤生长的抑制(2004，Faivre等，CancerResearch,Vol.64:8045-8051)。然而，Faivre等(2004)所设计的重组载体不能够使NIS蛋白质特异性地在癌细胞中表达，因此其不能够用于治疗。相反，当使用包含编码NIS的多核苷酸作为目的多核苷酸的本发明核酸时，NIS蛋白质可以特异性地在所靶向的癌细胞中表达。此外，当使用包含有效连接至一种本说明书所述调节性多核苷酸上的目的NIS-编码多核苷酸的核酸时，高水平的放射性碘细胞摄取本身足以特异性杀死肿瘤细胞并且抑制肺瘤生长，而无需同时表达一种或多种如下基因，所述基因编码可以在细胞水平上保留细胞毒性放射性核素的蛋白质，例如，编码甲状腺过氧化物酶的基因(TPO)或者编码甲状腺球蛋白的基因(TG)。在目的多核苷酸的某些实施方案中，所述目的多核苷酸编码Faivre等(2004，Faivre等，CancerResearch,Vol.64:8045-8051)所公开的NIS38蛋白质。在目的多核苷酸的某些实施方案中，所述目的多核苷酸编码PCT申请号WO97/28175中所公开的NIS蛋白质。如本文所-使用，"表达盒"由核酸組成，所述核酸包含至少下列两种多核苷酸，分别为(i)由衍生自人或大鼠AFP启动子或者人或大鼠HIP/PAPI启动子的本文所定义调节性多核苷酸组成的第一多核苷酸，和(ii)由直接或间接诱导抗癌活性的本文所定义目的多核苷酸组成的第二多核苷酸。因此，基于上面所给出的表达盒的一般定义，本发明的"核酸"也可以是表达盒的一种特殊实施方案。本发明的表达盒还可以包含有效连接至目的多核苷酸的多腺苷酸化信号。多腺苷酸化序列有效连接至待转录的多核苷酸时，其允许转录终止。它优选地位于目的多核苷酸的3'(下游)。适宜的多腺苷酸化信号包括P生长激素(bGHpA)、SV40和(5-珠蛋白的多腺苷酸化信号。本发明的一个优选表达盒从5，端至3，端包含(i)如本文所定义的一种调节性多核苷酸和(ii)编码NIS蛋白质的一种目的多核苷酸。本发明最优选的表达盒从5'端至3'端包含(i)衍生自人HIP/PAPI启动子的如本文所描述的一种调节性多核苷酸和(ii)编码NIS蛋白质的一种目的多核苷酸。表达盒此外还可以包含标记基因。表达盒可以包含在载体中。重逸戎糸本发明提供载体和用于栽体介导的抗癌因子(所述抗癌因子在癌症治疗中有效)递送和表达的方法。具体而言，本发明涉及重组病毒载体和非病毒载体的用途，其用于向受试者递送用于特异性地在癌细胞中表达目的多核普酸的核酸，以治疗癌症。因此，本发明的另一个目的是在其中插入了用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苦酸的核酸的重组载体。为了本发明的目的，"载体"、"转移载体"、"基因转移载体"或"核酸组合物转移载体"意思是指能够转移和/或运输核酸组合物至宿主细胞、I宿主细胞和/或至宿主细胞内的特定位置和/或区室的任何元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒等。因此，该术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载体和非病毒载体以及可能的棵DNA或复合DNA。然而，该术语不包括生产基因转移载体的细胞，例如逆转录病毒包装细胞系。提供了用于哺乳动物宿主细胞的、基于病毒的表达系统和非病毒表达系统。非病毒载体和系统包括通常带有包含本发明核酸的表达盒的质粒和游离型载体，AA工染色体(参见例如，Harrington等，1997，NatGenet15:345)。例如，可以用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达本发明核酸的非病毒载体包括pcDNA3.1/His、pEBVHisA、B、C(Invitrogen，SanDiegoCalif.)、MPSV栽体、Invitrogen1997产品目录(其在此全文并入作为参考)(InvitrogenInc,SanDiegoCalif.)中描述的其它载体和本领域已知的用于其它蛋白质的众多其它载体。有用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒的栽体、基于SV40、乳头瘤病毒、HBP埃巴病毒、痘苗病毒载体和Semliki森林病毒(SFV)的载体。SFV和痘苗病毒载体一般性地讨论于Ausubel等(同前)16章中。虽然病毒载体有时以棵形式引入或者以病毒蛋白质之外的蛋白质包被，但是通常地这些载体由两个組分构成，即修饰的病毒基因组和包绕它的衣壳结构(一般描述参见Smith,1995，Annu.Rev.Microbiol.49:807)。然而，可以以多种方式改变载体中的病毒核酸，例如在设计用于基因治疗时。这些改变的目的是使病毒丧失在靶细胞中生长的能力而同时保留其在可用的包装细胞或者辅助细胞中以载体形式生长的能力，以及在病毒基因组中提供插入外源DNA序列的空间和并入编码目的基因和使目的基因适当表达的新序列。因此，载体核酸一般包含两个组分，即在辅助细胞系中复制和包装所必需的顺式作用病毒序列和用于外源基因的转录单位。其它的病毒功能可以以反式表达于特定包装或者辅助细胞系中。腺病毒载体(例如用于人基因治疗)描述于例如Rosenfeld等，1992，Cell68:143;PCT出版物WO94/12650;94/12649;和94/12629中。在以腺病毒用作表达载体的情况下，本发明的核酸可以克隆入由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。在病毒基因组的非必需El或E3区域中的插入将导致产生能够在感染的宿主细胞中表达治疗性多核普酸序列的活病毒(LoganandShenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:3655)。带有治疗性多核苷^列作为逆转录病毒基因组的一部分的复制缺陷型逆转录病毒载体描述于例如Miller等，1990，Mol.Cell.Biol.10:4239;Kolberg，1992,J.NIHRes.4:43;和Cornetta等，1991，Hum.GeneTher.2:215中。靡病毒戎沐在本发明中优选使用腺病毒栽体作为基因运载体。腺病毒是DNA病毒，其基因组DNA约36kbp大小。腺病毒不伤害人，但是腺病毒基因组的El基因在啮齿动物中具有转化潜能。因此，该区域必须去除以增强治疗的安全性。为了构建作为基因递送载体的重组腺病毒，E1A和E1B区域被目的基因替换，这使得其成为称作第一代腺病毒栽体的复制缺陷型腺病毒。当插入基因长于3.5kbp时，可附加去除E3区域。没有E1区域的重组腺病毒可以在组成型表达E1A和E1B蛋白质的293细胞中繁殖。为了构建能够特异性地在癌细胞中表达上面所定义的目的多核苷酸的重组腺病毒，可以从腺病毒基因组DNA中去除E1区域并且替代地插入包括本发明核酸的表达盒。靡伴魔病#我#41在一个实施方案中，重组载体为含有如本说明书中所定义的用于特异性地在癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸的AAV载体。为了本发明的目的，"AAV栽体"、"基于AAV的栽体"、"基于腺伴随病毒的载体"、"腺伴随病毒载体"、"rAAV载体"或者"重组腺伴随病毒载体"意思是指衍生自腺伴随病毒血清型(包括但不限于AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8等)或者其衣壳蛋白质序列与AAV2或AAV5衣壳蛋白质序列基本上同源的任何其它病毒或血清型的载体。该术语还包括组合了一种以上AAV血清型的特征的杂合载体。AAV载体中可以有一个或一个以上的AAV野生型基因全部或者部分缺失，优选rep和/或cap基因缺失，但是保留功能性侧翼ITR序列。功能性ITR序列是拯救、复制和包装AAV病毒体所必需的。因此，AAV载体在本文中定义为至少包括病毒复制和包装所需的那些顺式序列(例如功能性ITR)。ITR无需是野生型核普酸序列，可以改变此序列，例如通过核苷酸的插入、缺失或替代而改变，只要序列提供功能性拯救、复制和包装即可。为了本发明的目的，"AAV栽体构建体"或"rAAV载体构建体"意思是指在生产rAAV病毒体(rAAV载体)中使用的核酸组合物。更加具体而言，rAAV载体构建体产生待包装入rAAV壳体中的rAAV基因组。AAV载体构建体可以使用已知技术构建，以提供如下在转录方向上有效连接的组份(a)衍生自人或大鼠AFP启动子或者人或大鼠HIP/PAPI启动子的调节性多核苷酸，(b)目的多核苷酸(例如编码细胞毒性蛋白质、包括NIS蛋白质或毒性核糖核酸酶的序列，编码核酶，反义多核苷酸等的序列)，和(c)转录终止区域。所得到的包含这些有效连接的组分的构建体以功能性AAVITR序列为边界(5'和3')。例如，AAV载体构建体可以是双链DNA质粒。为了本发明的目的，"重组病毒"、"重组病务本"、"重组载体"或"重组病毒载体"意思是指已经通过例如向病毒颗粒中添加或者插入异源核酸组合物而,皮遗传改变的病毒。为了本发明的目的，"AAV病毒体"意思是指完整的病毒颗粒，例如野生型(wt)AAV病毒颗粒(包含与AAV衣壳蛋白外壳结合的线性单链AAV核酸基因组)。在此方面，4壬何互补意义的单链AAV核酸分子，如"有义，，或者"反义"链，均可以包装入任何一个AAV病毒体中，并且两条链同样地是感染性的。。为了本发明的目的，"重组AAV病毒体"或"rAAV病毒体"在本文定义为由包裹目的异源DNA分子的AAV蛋白质壳构成的感染性复制缺陷型病毒，所述的异源DNA分子的一侧或两侧为AAVITR。rAAV病毒体可以在其中引入了AAV载体构建体、AAV辅助功能(helperfunctions)和附助功能(accessoryfunctions)的适宜宿主细胞中生产。以该方式，宿主细胞4皮赋予了编码如下AAV多肽的能力，所述AAV多肽是将AAV载体(包含目的重组核普酸序列)包装入重组病毒体颗粒以便以后进行基因递送所需的AAV多肽。除非上下文明确另有指明，术语"rAAV病毒体"及其同义词和术语"rAAV载体"及其同义词可互换使用。为了本发明的目的，"假型，，(r)AAV指其中衣壳蛋白质的血清型与该小基因的ITR的血清型异源的重組AAV。例如，假型rAAV可以由携带AAV5ITR的小基因和AAV2、AAV1、AAV3、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8或者另一适宜AAV血清型的壳体构成，其中小基因包装在异源壳体中。备选地，假型rAAV可以由AAV5壳体构成，在其中包装入包含来自至少一种其它血清型的ITR的小基因。特别指出的由AAV5构成的rAAV描述于2000年4月28日提出的美国专利申请系列号60/:200，409和2001年4月23日提出的国际专利申请号PCT/USO1/13000中，该两篇专利申请在此并入作为参考。處说'逸的,逸我伴本发明的最优选载体为腺病毒载体，所述腺病毒载体包含插入其DNA物质中的用于特异性地在癌细胞中表达目的多核苷酸的至少一个本文所定义的核酸或者至少一个本文所定义的表达盒。在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体可以才艮据Tong-Chuan等43(1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.95:2590-2514)描述的技术制备，相同的4支术也描述于美国专利号US5,922,576中，该专利号US5,922,576在此全文并入作为参考。在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体可以z使用本文所定义的核酸或表达盒作为DNA插入物并根据Faivre等(2004，CancerResearch，Vol.64:8045-8051)公开的一般技术制备。，凉i细虑包含用于特异性地在癌细胞中表达目的多核苷酸的本发明核酸的上述任何一种重组载体均可以用于体内施用给需要其的哺乳动物，特别是人。在一些情况下，这些栽体还可以用于体外转染癌细胞，以便例如在临床使用前通过体外测定确保所确定的目的多核苷酸的抗癌效力。因此，本发明另一个目的重组宿主细胞，所述重组宿主细胞已经被本发明核酸转染，包括使用上面所定义的重组载体的细胞转染。为了本发明的目的，"转染"用于指核酸组合物被细胞摄取。当外源核酸组合物已经跨过了细胞膜，则细胞已经被"转染"。许多转染技术是本领域普遍公知的。参见例如Sambrook等，(1989)MolecularCloning,alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratories,NewYork,Davis等，(1986)BasicMethodsinMolecularBiology,Elsevier。此类技术可以用于向适宜宿主细胞中引入一种或一种以上核酸组合物，例如质粒载体和其它核酸分子。该术语指遗传物质的稳定和瞬时4聂取两者。为了本发明的目的，"转导"是经病毒载体的"转染"的特殊形式。为了本发明的目的，"转导，，意味着通过病毒或病毒载体如重組AAV病毒体，体内、体外或者离体地将核酸组合物递送至、进入或达到受体细胞内。转导是转染的特殊形式，即术语转染包括术语转导。因此，一般而言，本发明的重组宿主细胞为在细胞内携带有上面所定义的重组载体并表达目的多核苷酸的癌细胞，其中目的多核苷酸在其中的表达处于衍生自人或大鼠AFP启动子或者人或大鼠HIP/PAPI启动子的调节性多核苷酸的控制下。药物组合物和治疗性方法
技术领域：
：本发明另一个目的是药物组合物，所述药物组合物至少包含选自下列的活性成分(i)用于特异性地在癌细胞中表达目的多核苷酸的本文所定义核酸，(ii)包含所述本发明核酸的表达盒，和(iii)插入有所述核酸或所M达盒的重组载体。本发明还涉及抗癌治疗性方法，包括将如上面一般定义的药物组合物施用给需要其的哺乳动物体、特别是人体的步骤。因此，本发明另一个目的是药物組合物，所述药物组合物包含(i)选自下列的活性成分-如本文所定义的核酸或表达盒；和-如本文所定义的重组载体；和(ii)任选地，一种或一种以上可药用赋形剂。本发明还涉及如本文所述的核酸或表达盒在制造药物组合物中的用途。本发明还涉及如本文所定义的重组载体用于制造药物组合物的用途。递送核酸分子的方法描述于Akhtar等，1992，TrendsCellBio.，2,139;以及DeliveryStrategiesforAntisenseOligonucleotideTherapeutics,ed.Akhtar，1995中，该两篇文献在此并入作为参考。Sullivan等(PCTWO94/02595)进一步描述了递送酶性RNA分子的一般方法。这些方法可以用于递送实际上任何核酸分子。核酸分子可以通过本领域熟知的多种方法施用于细胞，包括但不限于，包封在脂质体中、离子电渗或者并入其它运载体中，例如水凝胶、环糊精、生物可降解纳米嚢和生物粘附性微球体。备选地，核酸/运载体的组合可以通过直接注射或者通过使用输液泵局部递送。其它递送途径包括但不限于口服(片剂或丸剂形式)和/或鞘内递送(Gold,1997,Neuroscience，76，1153-1158)。另外的方法包括使用各种运输和运载系统，例如使用缀合物和生物可降解聚合物。有关药物递送策略，包括CNS递送，的全面综述参见Ho等，1999，Curr.Opin.Mol，Ther.，1，336-343和Jain,DrugDeliverySystems:TechnologiesandCommercialOpportunities，DecisionResources,1998和Groothuis等，1997，JNeuroVirol.，3，387-400。关于核酸递送和施用的更详细的描述提供于Sullivan等，同上，Draper等,PCTW093/23569,Bdgdman等，PCTWO99/05094,和Klimuk等，PCTWO99/04819中，所有这些文献在此并入作为参考。本发明的核酸、表达盒和重组载体可以用作药剂。本发明的核酸、表达盒和重组载体可通过任何标准方法施用并引入患者体内，并可以与或可以不与稳定剂、緩冲液等一起形成药物组合物。当希望〗吏用脂质体递送机制时，可按照用于脂质体形成的标准方法进行。本发明的组合物还可以被配制成可用于注射施用的无菌溶液；混悬液；以及本领域已知的其它组合物，并使用。本发明还包括所述活性物质的可药用制剂。药物组合物或制剂指具有适宜向细胞或患者、优选人施用，例如全身施用的形式的組合物或制剂。适宜形式部分地取决于用途或进入途径。例如，注射入血流的药物组合物应该是可溶的。其它因素为本领域已知并且包括种种因素，例如毒性和会阻止组合物或制剂发挥效果的形式。"全身施用，，意思是指药物的体内全身性吸收或者累积在血流中随后分布于整个身体。导致全身吸收的施用途径包括但不限于静脉内、皮下、自内、吸入、口服、肺内和肌内。这些施用途径中的每一种都可以将带负电荷的期望聚合物如核酸暴露于可接近的患病组织。已经证明药物进入循环的速率是分子量或者大小的函数。使用包含本发明化合物的脂质体或者其它药物运栽体可以潜在地将药物局限于如某些组织类型中，例如网状内皮系统(RES)的组织。脂质体制剂也是有用的，它可以利于药物与细胞表面，包括癌细胞表面结合。可药用制剂意思是指允许本发明核酸分子或重组载体有效分布于最46适宜发挥其期望活性的身体部位的组合物或制剂。适宜用本发明核酸分子配制的药剂的非限定性实例包括PEG缀合的核酸、磷脂缀合的核酸、包含亲脂部分、硫代磷酸酯、P-糖蛋白抑制剂(例如PluronicP85)的核酸，其可以增强药物i^A各种组织，例如CNS(Jolliet-RiantandTillement，1999，Fundam.Clin.Pharmacol.,13，16-26);生物可降解聚合物，例如用于植入后持续释放递送的聚(DL-丙交酯-共乙交酯)微球体(Emerich，DF等，1999，CellTransplant,8，47-58)Alkermes,Inc.Cambridge,Mass.;和荷载的纳米孩史粒，例如由聚氰基丙烯酸丁酯构成的那些，它们可以递送药物跨过血脑屏障并且可以改变神经元摄取机制(ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,23，941-949,1999)。递送策略,包括本发明核酸分子的CNS递送，的其它非限定性实例包括Boado等，1998，J.Pharm.Sci.，87，1308-1315;Tyler等，1999,FEBSLett.，421,280-284;Pardridge等，1995，PNASUSA.，92，5592-5596;Boado，1995，Adv.DrugDeliveryRev.，15，73-107;Aldrian-Herradaetal"1998，NucleicAcidsRes.，26，4910-4916;以及Tyler等，1999，PNASUSA.，96，7053-7058中描述的材料，所有这些参考文献在此整合作为参考。本发明还涉及使用组合物，所述组合物包含含有聚(乙二醇)脂质的表面修饰的脂质体(PEG-修饰的或长循环性脂质体或者隐形脂质体)。本发明核酸分子还可以包含共价连接的各种分子量的PEG分子。这些制剂提供了增加药物在靶组织中积累的方法。这类药物运载体抵抗单核巨噬细胞系统(MPS或RES)的调理作用和清除，由此4吏血液循环时间更长并且增加了组织与所包封药物的接触(Lasic等，Chem.Rev.1995，9S,2601-2627;Ishiwata等，Chem.Pharm.Bull.1995，43，1005-1011)。已经表明，此类脂质体选择性地在肿瘤中积累，推测是通过外渗及捕^新形成血管的靶組织中来实现的(Lasic等，Science1995，267，1275-1276;Oku等，1995，Biochim.Biophys,Acta,1238,86-90)。长循环性脂质体增强了DNA和RNA的药物代谢动力学和药效学，特别是与已知在MPS组织中积累的常规阳离子脂质体相比时(Liu等，J.Biol.Chem.1995，42，24864-24870;Choi等，国际PCT公布号WO96/10391;Ansell等，国际PCT公布号WO96/103卯；Holland等，国际PCT公布号WO96/10392;所有这些文献在此整合作为参考)。长循环性脂质体还可以比阳离子脂质体更大程度地保护药物不被核酸酶降解，这是基于长循环性脂质体具有能够避免在代谢强的MPS组织如肝脏和肾脏中累积的能力。所有这些参考文献在此整合作为参考。本发明还包括制备用于储存或施用的组合物，其包括在可药用栽体或者稀释剂中的药物有效量的期望化合物。用于治疗性用途的可接受的栽体或稀释剂在制药领域是众所周知的，并且描述于例如Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCo.(A.R.Gennaroedit.1985)，其在此整合作为参考。例如，可提供防腐剂、稳定剂、着色剂和矫味剂。这包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯曱酸酯。此外，可使用抗氧化剂和助悬剂。药物有效量是预防、抑制相应患者的癌症状况发生或者治疗相应患者的癌症状况所需的剂量。药物有效量取决于癌症类型、癌症发展状态、所使用的组合物、施用途径、被治疗的哺乳动物类型、考虑施用的特定哺乳动物的身体特征、并行施用的药物以及医药领域技术人员会意识到的其它因素。通常，依赖于负电荷聚合物的效力，施用0.1pg/kg至10mg/kg体重/天活性成分量的核酸、表达盒或重組载体。本发明的核酸分子和重组载体及其制剂可以以包含常规无毒性可药用载体、助剂和赋形剂的单位剂量形式经肠胃外施用。如本文所使用的术语肠胃外包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌内或鞘内注射或输注技术等等。在本发明的药物组合物中，可以存在多种本发明的核酸分子或重组栽体以及一种或一种以上无毒性可药用栽体和/或稀释剂和/或助剂以及如期望的话其它活性成分。水性混悬剂包含与适宜制造水性混悬剂的赋形剂混合的活性物质。此类赋形剂是助悬剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或湿润剂可以是天然磷脂，例如卵磷脂、或环氧烷烃与脂肪酸的缩合产物如聚氧乙烯硬脂酸酯、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物如heptadecaethyleneoxycetanoe、或环氧乙烷与f汴生自脂肪酸的部分脂和己糖醇的缩合产物如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯、或环氧乙烷与衍生自脂肪酸的部分脂和己糖醇酐的缩合产物如聚乙烯失水山梨醇单油酸酯。水性混悬剂还可包含一种或一种以上防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯、一种或一种以上着色剂、一种或一种以上调p木剂和一种或一种以上甜味剂，例如蔗糖或糖精。本发明的核酸分子和重组载体可以在无菌介质中经肠胃外施用。依赖于所使用的赋形剂和浓度，药物会悬浮或溶解于赋形剂中。有利地，助剂如局部麻醉药、防腐剂和緩冲剂可以溶解于赋形剂中。应当理解，用于任何具体患者的具体剂量水平取决于多种因素，包括所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、施用途径和排泄率、药物联合以及所治疗的特定癌症的严重程度。本发明的核酸分子和重组载体还可以与其它治疗性化合物联合施用于患者以增加总体抗癌治疗效果。本发明的药物组合物可用于治疗包括实体瘤和白血病在内的任何类型的癌症，包括胺前体摄取与脱羧细胞瘤、迷芽瘤、鳃原瘤、恶性类癌综合征、类癌性心脏病、癌(例如Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、Ehrlich肿瘤、原位癌、Krebs2、梅克尔细胞癌、粘液癌、非小细胞肺癌、coatcell癌、乳头状癌、硬癌、细支气管肺泡癌、支气管癌、鳞状细胞癌和移行细胞癌)、组织细胞功能紊乱、白血病(例3口B细胞白血病、'混合细胞白血病、nullcell白血病、T细胞白血病、慢性T细胞白血病、HTLV-II-相关白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、肥大细胞白血病和髓性白血病)、恶性组织细胞病、霍奇金病、免疫增生性非霍奇金小淋巴瘤、浆细胞瘤、网状内皮组织增生、黑素瘤、成软骨细胞瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、纤维瘤、纤维肉瘤、巨细胞瘤、组织细胞瘤、脂肪瘤、脂肉瘤、间皮瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、骨瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤、滑膜瘤、腺纤维瘤、腺)^巴瘤、癌肉瘤、软骨瘤、颅咽管瘤、无性细胞瘤、错构瘤、间叶瘤、中肾瘤、肌肉瘤、成釉细胞瘤、牙骨质瘤、牙瘤、畸胎瘤、胸腺瘤、滋养细胞肿瘤、腺癌、癌、腺瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、嚢腺癌、嚢腺瘤、粒层细胞瘤、两性胚细胞瘤、肝细胞性肝癌、汗腺瘤、胰岛细胞瘤、莱迪希细胞瘤、乳头瘤、塞尔托利细胞瘤、卵泡膜细胞瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、横紋肌瘤、横统肌肉瘤、室管膜瘤、神经节细胞瘤、神经M瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经鞘瘤、神经母细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤、神经瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤、血管角质瘤、血管淋巴样增生伴嗜酸粒细胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、血管球瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、松果体瘤、癌肉瘤、软骨肉瘤、叶状嚢性肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、白血病性淋巴肉瘤、月旨肉瘤、淋巴管肉瘤、肌肉瘤、粘液肉瘤、卵巢癌、横紋肌肉瘤、肉瘤(例如尤因肉瘤、实验性肉瘤、卡波西肉瘤和肥大细胞肉瘤)、赘生物(例如骨赘生物、乳腺赘生物、消化系统赘生物、结肠直肠赘生物、肝脏赘生物、胰脏赘生物、垂体赘生物、睾丸赘生物、眼眶赘生物、头颈赘生物、中枢神经系统赘生物、听觉系统赘生物、骨盆赘生物、呼吸道赘生物和泌尿生殖系统赘生物)、神经纤维瘤病和宫颈上皮结构不良，并且可用于治疗其中的细胞已永生化或者转化了的其它疾病。本发明可与其它治疗方式，例如化学疗法、冷疗法、热疗法、放射疗法等等联合使用。通过下面的实施例进一步阐迷本发明。实施例实施例1:包含f;f生自人HIP/PAPI和大鼠PAPI启动子的调节性多核苷酸的核酸的制备人和大鼠HIP/PAPI(肝癌-肠-胰腺/胰腺炎相关蛋白质I)启动子突变体如下产生。包含人HIP/PAPI基因全长调节序列的2.44kb片段(包含外显子l)通过EcoRI-BamHI消化从pCL6载体释放。不同缺失突变体用Klenow聚合酶平端化、激酶处理并连接入pLuciferase292载体(pL292，Promega)的Sfl/I位点，产生质粒pL292-EcoRI-HIP/PAPI、pL292-Xmnl-HIP/PAPI、pL292-Pstl-HIP/PAPI、pL292-StuI-HIP/PAPI和pL292-Bsu36I画HIP/PAPI。这些萤光素酶才艮告基因构建体分别包含人HIP/PAPI启动子区域的2092至+348、1714至+348、987至+348、238至+348和+106至+348位核苷酸(转录起始位点编号为+l)。然后开展萤光素酶测定，以确定带有最高转录活性的缺失突变体。通过聚合酶链反应分别4吏用质粒p-1253/+10PAPI-CAT(p画1253Z+10PAPI-CAT载体先前由Dusetti等，1995,JBiolChem,Vol.270(38):22417-22421公开)和pL292-Xmnl-HIP/PAPI作为模板扩增大鼠HIP/PAPI启动子的1.253Kb片段和所选择的人HIP/PAPI启动子的2Kb片段。扩增在IX聚合il^反应緩冲液中开展，IX聚合酶链反应緩冲液包含0.2mMdNTP、每种引物各0.2pmol和2.5单位Expand高保真Taq聚合酶(Roche),终体积50pL。PCR反应如下进行94°C，60s;55。C,30s;72°C，120s;35个循环。使用下列寡核苷酸-带有Kpnl限制酶切位点的有义引物5-CGGGGTACCACTGCAGCCTTGAACTCCTGG-3，[SEQIDNO:17'，-带有Sail限制酶切位点的反义引物5画ACGGTCGACTGTCTGCGACTTGAGGAGGCA-3'[SEQIDNO:18；-带有Sail限制酶切位点的有义引物5'-CCGCGTCGAGCTGCAGATTTTCCAGTTAGTC-3'[SEQIDNO:19，-带有Mlul限制酶切位点的反义引物5，-TCGACGCGTGTGAGGACAGAGATGGCTGTG-3"[SEQIDNO:20]。pSVSport-rNIS和pShuttle分别由N.Carrasco教授(AlbertEinsteinCollegeofMedicine,Bronx,NewYork)和thevectorcoreoftheUniversityHospitalofNantes惠赠。使用Sall-EcoRV(NewEnglandBiolabs)平末端消化从pSVSport-rNIS中切下大鼠NIScDNA、在琼脂糖凝胶上纯化并连接入(14DNA连接酶，Roche)经SalI-BglII平端化的pShuttle，得到pShuttle-rNIS。人和大鼠HIP/PAPIPCR产物插入到pShuttle-rNIS中。pShuttle-rNIS和hHIPPCR产物经Kpnl(每IO照DNA加10单位酶)于37。C消化2小时、在无水乙醇和3M醋酸钠中于-20。C沉淀过夜、并经SalI于37。C消化2小时。在琼脂糖凝胶(QiaExII，Qiagen)上迁移和纯化之后，使用T4DNA连接酶于16。C将DNA连接过夜，产生pShuttlehHIP國rNIS。使用同样的实验程序产生pShuttlerHIP-rNIS，在用Sall-Mlul消化pShuttle-rNIS和rHIPPCR产物之后纯化和连接。实施例2:包含衍生自人AFP启动子的调节性多核苷酸的核酸的制备pShuttlerAFPwt-和hAFPt-rNIS使用常规限制酶构建。为了产生pShuttlerAFPwt-rNIS(图1)，带有大鼠a-甲胎蛋白(rAFP)转录调节序列的EcoRI-Sall3.2Kb片段从pBluescript-rAFPwt中释放、插入至EcoRI-Sall消化的pSVSport-rNIS中，然后插入至KpnI-NotI消化的pShuttle中。为了产生pShuttlehAFPt-rNIS(图2)，带有人a-甲胎蛋白(hAFP)增强子元件的Kpnl-Xhol0.8Kb片段从pGL3-hAFPt中释放并插入至Kpnl-Sall消化的pShuttle-rNIS中。实施例3:重组病毒载体的构建pShuttlehHIP-(图3)、rHIP-rAFPwt-(图l)和hAFPt-rNIS(图2)被完全测序。通过同源重组在大肠杆菌(E.Coli)中使用pAdEasy系统产生重组腺病毒质粒以及腺病毒的生产由Nantes的VectorDevelopmentLab按照He等(P.N.A.S,1998;95.2509-14)说明的方法开展。所有重组腺病毒均从单噬菌斑中分离、在293细胞中扩大培养并且通过双氯化铯离心纯化。纯化的病毒以等分试样储存于-80。C。通过噬菌斑试验确定病毒滴度。实施例4:本发明核酸的体外和体内抗癌活性A.材料和方法A/.权賴縱HepG2细胞以5xl()6细胞接种于10cmPetri皿。次日，使用磷酸钓DNA共沉淀方法以每一才艮告质粒10照和1pg编码P-半乳糖苷酶基因的pCH110载体共转染这些细胞。P-半乳糖苷酶共转染用作内部对照以便将转染效率标化。对照质粒包括在内，即pCMV-萤光素酶和pGL3-GFP。转染12h之后，IL-6(100单位/mL)和地塞米松(100nM)单独或者组合地加入到培养基中。转染48h之后，以磷酸緩冲盐(PBS)洗涤细胞两次并且在水上刮下细胞。在包含蛋白酶抑制剂的等渗緩冲液(20mMTris-HCl，pH7.5，137mMNaCl,1%NonidetP-40)中制备用于萤光素酶活性测定的细胞提取物。50jaL上清液与萤光素孵育，并且^f吏用发光计测定萤光素酶活性。启动子活性表示为通过P-半乳糖苷酶活性标化的萤光素酶活性。53细應系人肝细胞性肝癌HepG2、人结肠腺癌HT29和乳腺癌T47D细胞培养于补加有10。A胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培养基glutamax(DMEM)/F12KHam's(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)的50/50混合物中。人乳腺癌细胞MCF7和大鼠肝细胞性肝癌BCXL3维持在补加有10%FCS的DMEM中。AML12(a小鼠肝12)细胞系维持于补加有5|iig/mL胰岛素、5]Lig/mL转铁蛋白、40ng/mL地塞米松和10%FCS的F12KHam培养基中。人原代成年肝细胞来自肝转移行部分肝切除术后得到的肝小片，使用胶原酶H(RocheMolecularBiochemicals)灌注(500g/mL，HEPES緩沖液pH7.4中2.4mg/mLCaCl2)分离，在分离前4吏用插入到所切除块的切面上的血管中的导管以HEPES/乙二胺四乙酸(EDTA)緩冲液pH7.4充分洗涤肝组织。灌注的流速为15至18mL/min。通过温和离心洗涤细胞两次(100g，2min)，并且使用Percoll分级分离(30%等渗Percoll溶液)将肝细胞与非实质组织分离。活细胞通过台盼蓝排除法确定并生长于添加有10%FCS的完全William培养基(lmg/mL牛血清白蛋白、25nmol/L地塞米松和5照/mL牛胰岛素)中。齡4凝妙抛微感染前一天，3xl()5细胞接种于24-孔皿。细胞与肝脏肿瘤特异性NIS重组病毒载体或对照载体(即空载体Ad-DL324和AdCMV-NIS)以不同感染复数(每个细胞10、50、100和200个感染性颗粒)孵育24h。对于HIP-NIS腺病毒感染的细胞，在感染后48小时，将IL-6(100单位/mL)和地塞米松(100nM)单独或组合加入培养基中。然后，如先前所述(Faivre等，2004)开展碘摄取和排出研究。简言之，细胞用B-Hank平衡盐溶液(B-HBSS,LifeTechnologies,Inc)洗涤两次，然后每孔在包含l|nCi(37kBq)1231和0.5|UMNal(Fluka，Sigma-Aldrich)的放射性B-HBSS中于37。C孵育60分钟。在确定的时间，细胞用冷B-HBSS洗涤一次，然后在1mL冷无水乙醇中孵育20分钟。在碘外排研究中，细胞孵育在与摄取实验相同的放射性培养基中60分钟。然后去除访文射性培养基。细胞以B-HBSS洗涤一次，并且加入0.5ml无硤化物的B-HBSS。在指定的时间，去除B-HBSS,并将细胞孵育于冷的无水乙醇中。细胞内的放射性活性使用孔Y计数器定量。细胞数量确定为三个孔的平均细胞含量。对于NIS抑制研究，NaCK)4以30^M的浓度加入。A4动參雄性Wistar大鼠(CharlesRiver,法国)依照欧盟动物福利规定处理。通过每日摄取饮用水中的二乙基亚硝胺(Sigma-Aldrich，St-Louis，MO)(IOOmg/L)8周，在重150-180g的6周龄雄性Wistar大鼠中诱导肝细胞癌。通过々欠用水，大鼠曾接受过甲状腺素(T4)补充物(50iag/L)以降低不想要的甲状腺彿摄取。A5.沐力差^脊移大鼠用1mL/kg氯胺酮/赛拉嗪的70:30混合物(Imalgene1000，Merial，Rompun，BayerAG)麻醉，然后开腹。评估了三种施用途径的基因转移效率肝门内、经肝动脉的选择性注射和向肿瘤内的直接注射。表达NIS的腺病毒载体经肝门内或肝动脉内施用于不同批的大鼠(健康的和经DEN处理过的大鼠(带有直径小于10mm的肿瘤结节))中。使用30号注射针头将rNIS载体直接注射入DEN处理过的大鼠的5至10mm直径肿瘤结节中。评估了不同量的病毒，从每只大鼠5xl(^至10"个感染性颗粒。A6.体力橫凝承其發a6./."f面A7糸厲;^4'谬Na123I(ScheringAG,Berlin,德国)腹膜内注射(每只大鼠6至12MBq)。使用分别用于mI或1311成像的低能或高能高分辨率平行准直仪对两只至四只大鼠同时成像。使用DSXy照相机(GE)得到256x256闪烁图像。所施用的等份示踪物作为内部标准也进行成像。连续使用同一程序以进行动力学研究。使用4mm孔的针孔型准直仪并增加采集次数和数字化(numerization)，得到更高分辨率的图像。在此图像采集后，每一大鼠内注射50mg高氯酸钠(活跃硪运输的有利抑制剂)，并以1分钟的间隔采集图像60分钟。卓^f尤射V"^^辟^i^和C7Y57^CT/CTJ成^。["，c高锝酸盐静脉内注射(每一大鼠37MBq)。注射后15分钟，将大鼠垂直放置，肝脏位于采集窗前。使用4mm厚x120mm直径的CsI(Na)连续晶体和位置敏感性光电倍增管开展SPECT采集，产生2mm的固有空间分辨率和10cm的视野。CT系统包含与透镜偶联至冷却的CCD上的闪烁板(scintillatingsheet)，产生250jim空间分辨率。SPECT/CT(BiospaceMesures，Paris)开展实时成像同时SPECT和CT数据采集使得能够对SPECT图像、CT图像进行断层显像重构、并且在采集过程中能够对两个图像进行配准(registration)。在40分钟过程中采集SPECT和CT图像。重构的图寸象4吏用Amira3.1.1分析工具(MercuryComputerSystems,Inc)分析。窗鎵定量我们使用感兴趣区域(ROI)方法和适当背景校正以计算特异性活性。在给定器官内绝对的有效120-分钟摄取按如下计算用该器官内经背景校正后的计数除以准直系统的计数效率和0时间的施用活性。123I和131I的物理衰变分别为13.2h和8.05d。生物学纟聂取计算为有效纟聂取除以对应于腹膜内注射与成4象之间的时间间隔的同位素物理衰变。在自120分钟后的图56像中测量标化的校正后的计数率和特定ROI的活性，并且使用单指数拟合计算器官半衰期。A".mi伊遽为、浙。在病毒感染后一天制备细胞蛋白质提取物。刮下细胞并在包含50mmol/LTrispH8.0、150mmo!/LNaCl、1%NonidetP-40、100ng/mL苯甲基磺酰氟、l照/mL抑酶肽和l照/mL亮抑酶肽的裂解緩冲液中匀浆然后，裂解物在4。C于12，000g离心IO分钟，在96。C加热10分钟溶解于2XLaemmli緩冲液中。蛋白质浓度通过Bradford方法测定。蛋白质经SDS-9。/。聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移至硝酸纤维素膜上。Western印迹分析如下开展将膜与稀释在含有0.1%Tween-20和5%脱脂干奶粉的Tris緩冲盐水中的抗rNIS肽多克隆抗体pAb-10(l:2000)室温孵育1小时，然后与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(1:1000)室温孵育1小时。使用增强化学发光Western印迹检测系统(SuperSignal,Pierce)开展检测。对于去糖基化测定，蛋白质在变性緩冲液(0.5。/。SDS和1。/。15-巯基乙醇)中于37。C变性30分钟。变性的蛋白质与肽基:iV-糖苷酶F(PNGaseF;NewEnglandBiolabs，Inc.,Beverly,MA)以500U/照蛋白质的浓度于37°C孵育过夜。A6乂逸织夢、^建炎^、i微放射《i多福尔马林固定的组织切片包埋在石蜡中，H&E染色并在光学显微镜下观察。对于免疫荧光，水冻切片(4卞m)在4。/。多聚甲醛中固定15分钟并与以1:200稀释的初级抗NIS多克隆抗体孵育1小时。通过UV-荧光显微镜观察荧光。1311标记的肝切片用Micro-Imager(视野为24x32mm2，分辨率为25pM，BiospaceMesures)分析。A6.5.薪凝承将器官样品称重，在孔Y计数器中测定放射性活性并且结果表示为每克组织所注射剂量的百分数(。/。ID/g)。针对所用的体积和y发射体扣除自身吸收。A7.^##。使用方差分析和5%风险值的PLSDFischer检验开展统计学比较(StatView5.0软件SAS系统)。B.结果在本实施例中开展的实验的目的是，使得可以以相对低的全身照射剂量通过内部放射疗法破坏肝脏肺瘤，以避免副作用，例如骨髓清除。因此该目的旨在确定这样的病毒或非病毒重组载体，其在转移后能够通过在肿脏肿瘤细胞内积累。如图5中所示，大鼠HIP/PAP调节序列成功地诱导NIS在人肿瘤性肝细胞中表达。此外，使用转染有腺病毒载体AdrHIPrNIS的H印G2细胞开展的抗NIS免疫荧光测定表明，NIS表达于所转染细胞的质膜水平上。如图6中所示，人HIP/PAP调节序列也成功地诱导NIS在人肿瘤性肝细胞中表达。此外，如图7中所示，大鼠HIP/PAP调节序列诱导特异地在肝脏肿瘤结节中的强的NIS体内表达。此外，如图8中所示，自人和大鼠AFP衍生的调节序列两者均诱导NIS在人肿瘤性肝细胞中表达。此外，当用包含有效连接至人AFP衍生的调节序列的GFPDNA序列的病毒载体转染人细胞时，证明GFP专门地并且强烈地表达于人肝脏癌症细胞中。此外，使用转染有腺病毒载体AdAFPrNIS的HepG2细胞开展的抗NIS免疫荧光测定表明NIS表达于所转染细胞的质膜上。成功的NIS靶向表达使得人们能够强烈照射实体肿瘤而同时使全身照射剂量最小化。过去必须克服的主要障碍是可利用的、能够调节潜在治疗性基因表达的肿瘤特异性启动子数量少并且转录活性弱。因此，通过这些先前启动子调节的NIS蛋白质表达，对于摄取细胞裂解性浓度的放射性同位素是不够的。根据本发明，已经通过选择肝脏肿瘤特异性基因AFP和HIP/PAPI的截短调节序列构建NIS重组栽体，解决了该问题。根据该实施例的实验结果，已经表明在体内这些载体在荷有HCC的动物模型的肝脏肿瘤内表现出足够高的NIS转录活性，如通过1311治疗后肺瘤生长的明显抑制所证明的。因此，本文已经实验性开展了-构建与报告基因融合的a曱胎蛋白(AFP)基因的截短调节序列或肝癌肠胰腺/胰腺炎相关蛋白质1(HIP/PAPI)基因的截短调节序列，并从这些构建体中选择出具有最高转录活性的构建体；-构建了带有所选择的调节序列AFP和HIP/PAPI的大鼠NIS重組腺病毒和慢病毒，并通过测序检查之；-在体外证明，感染AFP-NIS和HIP/PAPI-NIS后，NIS蛋白质的表达强烈并正确地靶向转化的肝细胞的质膜，而在原代正常肝细胞中其不表达；-在体外证明，感染AFP-NIS和HIP/PAPI-NIS的细胞中碘的摄取水平强(与通过CMV-NIS诱导的硪摄取水平相当)；-通过荷有HCC的动物中的系列放射性同位素成像，在体内证明，放射性硪被肝脏肿瘤结节强烈摄取并且不被周围的非肿瘤组织摄取，这表明NIS在实体肺瘤肝细胞中的强功能性表达源于调节序列AFP和HIP/PAPI;-在体内证明，在AFP-NIS或HIP/PAPI-NIS转导后，响应于1311放射治疗，荷有HCC的动物中肿瘤消退显著。59才艮据本文已经得到的实验结果表明，器官内的局部条件非常不同于移植肿瘤内的局部条件，特别是因为密集的血管形成、纤维化-炎性(fibro-inflarnmatory)瘤周反应以及肝脏癌症中所存在的基础疾病(肝硬化和慢性肝炎)。因此，将在移植肺瘤中观察到的急剧碘外排外推至患者是不恰当的。本发明人已经证明，肝脏肿瘤中放射性碘的长期保留(这是放射治疗效力的必要条件)源于摄取、外排和再摄取的动态过程，其中通过AFP-NIS或HIP/PAP-NIS载体诱导的肺瘤性肝细胞质膜上的高NIS蛋白质浓度和高的肝脏血流(允许血浆中放射性碘向肝脏的快速再循环)利于再摄取。60序列列表<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>权利要求1.用于特异性地在哺乳动物癌细胞中表达目的多核苷酸的核酸，所述核酸包含(a)驱动所述目的多核苷酸在哺乳动物癌细胞中表达的调节性多核苷酸，其选自下列调节性多核苷酸(i)调节性多核苷酸，从5’端至3’端包含-与选自SEQIDNO1和SEQIDNO2的核酸具有至少90％核苷酸同一性的第一核酸；和-与核酸SEQIDNO3具有至少90％核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接连接，或-所述第一和第二核酸通过间隔核酸[具有1至3000个核苷酸长度]彼此间接连接；(ii)与SEQIDNO4中起始于第2200位核苷酸并终止于第2432位核苷酸的核酸具有至少90％核苷酸同一性的调节性多核苷酸；(iii)与SEQIDNO5中起始于第979位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸具有至少90％核苷酸同一性的调节性多核苷酸；和(iv)调节性多核苷酸，从5’端至3’端包含-与选自SEQIDNO6和SEQIDNO7的核酸具有至少90％核苷酸同一性的第一核酸；和-与SEQIDNO8的核酸具有至少90％核苷酸同一性的第二核酸；-所述第一和第二核酸彼此直接连接，或-所述第一和第二核酸通过间隔核酸[具有1至2000个核苷酸长度]彼此间接连接；和(b)所述目的多核苷酸。2.根据权利要求l的核酸，其中所述调节性多核苷酸从5，端至3，端包含國与选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的核酸具有至少卯％核普酸同一性的第一核酸；-具有1至3000个核苷酸长度的间隔核酸，和-与核酸SEQIDNO:3具有至少90%核普酸同一性的第二核酸。3.根据权利要求l的核酸，其中所述调节性多核苷酸与选自SEQIDNO:9和SEQIDNO:10的核酸具有至少90%核苷酸同一性。4.根据权利要求1的核酸，其中所述调节性多核苷酸包含核酸SEQIDNO:4中的至少233个连续核苷酸并且包含核酸SEQIDNO:11。5.根据权利要求l的核酸，其中所述调节性多核苷酸选自-与包含SEQIDNO:11的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与包含SEQIDNO:12的核酸具有至少90。/。核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与包含SEQIDNO:13的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；-与包含SEQIDNO:14的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸；和-与包含SEQIDNO:4的核酸具有至少90%核苷酸同一性的调节性多核苷酸。6.根据权利要求l的核酸，其中所述调节性多核苷酸与包含SEQIDNO:5中的至少274个连续核苷酸并且包含SEQIDNO:5中起始于第980位核苷酸并终止于第1253位核苷酸的核酸的核酸具有至少90%核苷酸同一性。7.根据权利要求6的核酸，包含SEQIDNO:5中的275至1250个连续核普酸。8.根据权利要求l的核酸，其中所述调节性多核苷酸从5，端至3，端包含-与选自SEQIDNO:6和SEQIDNO:7的核酸具有至少卯％核苷酸同一性的第一核酸；-具有1至2000个核苷酸长度的间隔核酸，和-与SEQIDNO:8的核酸具有至少90%核苷酸同一性的第二核酸。9.根据权利要求l的核酸，其中所述调节性多核苷酸与选自SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的核酸具有至少卯。/。核苷酸同一性。10.根据权利要求1至9中任何一项的核酸，其中所述目的多核苦酸编码蛋白质。11.根据权利要求10的核酸，其中所述目的多核苷酸编码治疗上用于抗癌症的蛋白质。12.根据权利要求1至9中任何一项的核酸，其中所述目的多核苷酸编码碘化钠同向转运体(NIS)蛋白质。13.根据权利要求1至9中任何一项的核酸，其中所述目的多核苷酸编码目的RNA。14.根据权利要求13的核酸，其中所述目的多核苷酸编码核酶。15.根据权利要求13的核酸，其中所述目的多核苷酸编码与特定mRNA分子杂交的反义RNA。16.根据权利要求13的核酸,其中所述目的多核苷酸编码与特定DNA分子杂交的有义RNA。17.根据权利要求1至16中任何一项的核酸，其插入至表达栽体中。18.在其中插入了权利要求1至16中任何一项的核酸的重组载体。19.根据权利要求18的重组载体，其能在细菌细胞中复制。20.根据权利要求18的重组载体，其能在哺乳动物细胞中复制。21.根据权利要求18的重组载体，其由重组病毒栽体组成。22.根据权利要求21的重组载体，其由重组腺病毒组成。23.根据权利要求21的重组载体，其由重组慢病毒组成。24.重组宿主细胞，其已经被根据权利要求18至23中任何一项的重组载体转染。25.根据权利要求24的重组宿主细胞，其是细菌细胞。26.根据权利要求24的重组宿主细胞，其是哺乳动物细胞。27.药物組合物，包含(i)活性成分，选自-根据权利要求1至16中任何一项的核酸；和-根据权利要求18至23中任何一项的重组载体；和(ii)一种或一种以上的可药用赋形剂。28.根据权利要求1至16中任何一项的核酸用于制造药物组合物的用途。29.根据权利要求18至23中任何一项的重组载体用于制造药物组合物的用途。全文摘要本发明涉及衍生自(i)大鼠和人AFP启动子序列和(ii)大鼠和人HIP/PAPI启动子序列的调节性多核苷酸，该调节性多核苷酸可以用于特异性地在哺乳动物癌细胞，包括哺乳动物癌性肝细胞中表达目的核酸。文档编号C12Q1/68GK101516908SQ200780033837公开日2009年8月26日申请日期2007年9月12日优先权日2006年9月12日发明者C·布雷绍,J·克莱克,J·费尔,J·赫维申请人:国立健康与医学研究所