提高真菌细胞中基因表达的方法

专利名称：：提高真菌细胞中基因表达的方法提高真菌细胞中基因表达的方法
背景技术：
：发明领域本发明涉及提高真菌细胞中编码多肽的基因的表达的方法。相关技术描述在真菌宿主细胞(例如酵母或丝状真菌细胞)中重组产生天然或外源多肽可以为以商业相关量制备多肽提供更理想的运载体(vehicle)。天然或外源多肽的重组产生通常通过构建表达盒(expressioncassette)来完成，在所述表达盒中将编码所述多肽的DNA置于启动子的表达调控之下，该启动子来自一种受调节的基因。通常通过质粒介导的转化将表达盒引入宿主细胞。然后通过在使表达盒中所含启动子正确发挥功能所必需的诱导条件下培养受转化的宿主细胞来实现多肽的产生。用于在真菌宿主细胞中重组产生多肽的新表达构建体和载体的开发通常要求高效启动子的可用性，所述高效启动子适合用于在所述宿主细胞中调控所述多肽的表达。然而，即使是最广为人知的启动子对于表达感兴趣的基因也可能是低效的(ine伍cient)。许多启动子对于受到的能够提高它们的效率的调节是敏感的。指名为Ct/尸7的酿酒酵母(Sacc/wram少cescwevWae)金属辟u蛋白基因由铜通过特异性启动子区UASCW7(上游激活序列)转录激活，据报道UASo;w位于相对于Ct/尸/转录激活位点的-105和-230之间(Thiele和Hamer,1986,Mo/.CW/.说o/.6:1158-1163;Zhou和Thiele，1993,所o/actow4:105-115)。酿酒酵母的Ace1蛋白(Acelp)负责在铜离子(Thiele,1988，Mo/,Ce〃.所o/.8:2745-2752)或银离子(Furst等，1988，Ce//55:705-717)的存在下诱导酵母金属硫蛋白基因C77P7。Acelp氨基末端的一半富含碱性氨基酸残基和半胱氨酸，并且在Cu(I)或Ag(I)存在下与C77尸7上游激活序列特异性地结合，而在不存在Cu(I)或Ag(I)时则不与Ct/尸7上游激活序列特异性地结合(Furst等，1988，见上文)。Thiele和Hamer,1986，A/o/ecw/wfl"dCW/w/ar历o/o^y6:1158-1163乂>开了串联重复上5;摔调4空序歹'J(tandemlyduplicatedupstreamcontrolsequences)介导酉良酒酵母^同-金属硫蛋白基因的铜诱导型转录，并且这些元件之一的合成形式(syntheticversion)当以两个串联拷贝存在时为异源启动子赋予铜诱导性。Gralla等，1991,PA^S腦88:8558-8562公开了Acelp激活酵母铜、锌的超氧化物歧化酶基因的表达。Lapinskas等，I993,O^remGe"eri"24:388-393公开了Acelp激活酿酒酵母胞质过氧化氪酶基因的表达。Mehra等，1989，历o/o&ca/CT/em/^y264:19747-19753描述了对来自光滑念珠菌(Ca"^^ag/a6rato)金属硫蛋白基因的克隆和该基因的序列。Zhou和Thiele,1991,/WAS88:6112-6116描述了来自光滑念珠菌的由金属激活的转录因子基因的分离。Thorvaldsen等，1993,/所o/og!'ca/CTzew^^y268:12512-12518公开了通过对指名为M7Y、M7Y/a和M777Z的光滑念珠菌金属硫蛋白基因的调节。Mascorro-Gallardo等，1996，172:169-170公开了调节酿酒酵母中基因表达的基于CT/户/启动子的载体的构建。Macreadie等，1989,P/wmzW21:147-150公开了一系列利用酿酒酵母Cf/P/基因的酵母表达载体。Hottiger等，1994,10:283-296公开了CT/尸7启动子的生理学特征和过表达它的转录激活子Acelp的后果。本发明的一个目的是提供改进的在真菌宿主细胞中产生多肽的方法。发明概述本发明涉及用于产生多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核芬酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。多肽对于真菌宿主细胞可以是天然的或外源的。本发明还涉及真菌宿主细胞，其包含含有编码多肽的核酸序列的第一6连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核香酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因。本发明还涉及核酸构建体和载体，所述核酸构建体和载体包含含有编码多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核普酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录。附图简述图1显示pBM128a的限制图谱。图2显示pMB1537的限制图语。图3显示pBM126a的限制图语。图4显示pMB1539的限制图谱。图5显示p几inl68的限制图谱。图6显示pBM142c的限制图谱。图7显示pBM143b的限制图谱。图8显示pMB1682的限制图谱。图9显示pJLinl95的限制图谱。图10显示pBM163a的限制图i昝。图11显示pBM65a的限制图谱。图12显示pBM168a的限制图i普。图13显示pBM69a的限制图谱。图14显示pBM171a的限制图谱。图15显示pBM70a的限制图i昝。发明详述本发明涉及产生多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苦酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养真菌宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源、氮源、无机盐和铜离子(和/或银离子)。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。当培养基中存在铜离子时，所述培养基含有至少10iiM铜离子，优选至少50pM铜离子，更优选至少100pM铜离子，甚至更优选至少250pM，并且最优选至少500iiM铜离子。可以将铜离子以CuS04、CuCl2的形式，或以任何其它合适的形式添加至培养基。培养基可以还含有银离子，或者可以替代铜离子而(alternatively)含有银离子。当培养基中存在银时，所述培养基含有至少10^M《艮离子，优选至少50juM银离子，更优选至少100pM银离子，甚至更优选至少250^M银离子，并且最优选至少500pM银离子。可以将银离子以Ag2S04、AgCl的形式，或以任何其它合适的形式添加至培养基。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、高效液相层析、毛细管层析(capillarychromatography)、酶产物的形成、酶底物的消失或SDS-PAGE。例如，在多肽是酶的情况下，酶测定法(enzymeassay)可用于测定所迷酶的活性。对于许多酶用于测定酶活性的方法是本领域已知的(参见，例如，D.Schomburg和8M.Salzmann(编),￡，附Z/aw必ooA:,Springer-Verlag，NewYork,1990)。如果多肽分泌到营养培养基中，那么该物质能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，那么其能够从细胞裂解物(celllysate)回收。可以使用本领域已知的方法分离所得多肽。例如，可以通过常规方法从培养基分离多肽，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发和/或沉淀。随后可以通过多种本领域已知的方法将分离的多肽进一步纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦(IEF))、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、或^是取(参见，例如，尸w7yc""o",丄-C.JansonandLarsRyden,editors,VCHPublishers,NewYork,1989)。本发明的真菌宿主细胞，其包含含有编码所述多肽的核酸序列的第一连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核普酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因，所述真菌宿主细胞与不含第二多核苷酸(其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列)和/或第三多核苷酸(其包含至少一个拷贝的编码同依赖性反式作用转录因子的基因)的真菌宿主细胞相比，多产生至少10%，优选至少25°/。，更优选至少50°/。，甚至更优选至少75%,最优选至少100%,并且甚至最优选至少200%的所述多肽。启动子术语"启动子"在本申请中定义为这样的DNA序列，其结合RNA聚合酶并且将所述聚合酶引导至正确的下游多核苦酸转录起始位点以起始转录，所述多核香酸包含编码多肽的核酸序列。RNA聚合酶有效地催化信Y吏RNA的装配，所述信使RNA与编码区适当的DNA链互补。术语"启动子"还应理解为包括在转录成mRNA后用于翻i奪的5'非编码区(在启动子和翻i,起点之间)、顺式作用转录调控元件如转录激活子，和其它能够与转录因子相互作用的核苷酸序列。9术语"铜诱导型启动子序列"在本申请中定义为这样的启动子，该启动子通过作为其组成部分的顺式作用元件受到铜离子的诱导，所述启动子含有转录调节因子的结合位点，所述转录调节因子负责该启动子的铜诱导型转录。术语"串联启动子"在本申请中定义为两个或更多个启动子序列，它们中的每个均与编码序列可操作地连接并且介导该编码序列转录为mRNA。串从编码胞外或胞内多肽的基因获得，所述多肽对于宿主细胞可以是天然的或外源的。串联启动子中所含启动子中的至少一个是铜诱导型启动子。在优选的方面，串联启动子由铜诱导型启动子构成。术语"杂合启动子"在本申请中定义为由两个或更多个启动子的部分组成的启动子序列，其与编码序列可操作地连接并且介导该编码序列转录为mRNA。所述启动子可以从编码胞外或胞内多肽的基因获得，所述多肽对于宿主细胞可以是天然的或外源的。杂合启动子的至少一个部分是铜诱导型启动子的部分。在优选的方面，杂合启动子由两个或更多个铜诱导型启动子的部分构成。术语"可操作地连接"在本申请中定义为这样的构型，其中将调控序列(例如启动子序列)置于相对于编码序列的适当位置，使得该调控序列指导由该编码序列编码的多肽的产生。术语"编码序列"在本申请中定义为这样的核酸序列，当置于适当调控序列的控制之下时，其转录成mRNA,该mRNA被翻译为多肽，例如酶。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可替换的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG和TGA结束。编码序列可以包括，但不限于，基因组DNA、cDNA、半合成的、合成的和重组的核酸序列。在本发明方法的实践中，铜诱导型启动子可以获得自酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酿酒酵母胞质过氧化氢酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因(copperresistantsuppressorgene)、光滑念J朱菌金属石克蛋白基因、粗糙脉孢菌(A^wra^oracra^a)金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉(Ksrrawz'a/z;po(y"ca)金属石克蛋白基因、只又孑包蘑菇(^gan'cwZ^/on^)金属石克蛋白基因、灰梨孢菌(Magna/o"/7e金属硫蛋白基因和鹅柄孢壳菌(/Wo5/orafl""r/we)金属石克蛋白基因。在优选的方面，铜诱导型启动子序列是从酿酒酵母金属硫蛋白基因获得的。在更优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母CC/i37基因(登录号P07215)(Butt等，1984,/WAS"C/"76:3332-3336)(DNA为SEQIDNO:1,推定的氨基酸序列为SEQIDNO:2)。在另一个优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母超氧化物歧化酶基因。在更优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母5V9D/基因(登录号P00445)(Gralla等，1991,尸A^固88:8558-8562)(DNA为SEQIDNO:3，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:4)。在另一个优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母胞质过氧化氬酶基因。在更优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母CT77基因(登录号P06115)(Lapinskas等，1993，Cw/re"fGe"e"cs24:388-393)(DNA为SEQIDNO:5,推定的氨基酸序列为SEQIDNO:6)。在另一个优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母铜耐受抑制基因。在更优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自酿酒酵母C7^5基因(登录号P41902)(Culotta等,1994，/嵐(3em.269:25295-252302)(DNA为SEQIDNO:7,推定的氨基酸序列为SEQIDNO:8)。在另一个优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自光滑念珠菌金属硫蛋白基因。在更优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自光滑念珠菌MT基因。在最优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自光滑念珠菌M77基因(登录号P15113)(Mehra等，1989,/5z.o/ogz'ca/C/^抓.W7264:19747-19753;Mehra等,1992，114:75-80;Mehra等,1990,G潔265:6369-6375)(DNA为SEQIDNO:9，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:10)。在另一个最优选的方面，铜诱导型启动子序列获得自M77/基因(登录号J05398)(Mehra等，1989,见上文；Mehra等，1992，见上文；Mehra等，1990，见上文)(DNA为SEQIDNO:11，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:12)。在本发明的方法中，铜诱导型启动子也可以是包含两个或更多个启动子的串联启动子，或包含两个或更多个启动子的部分的杂合启动子，其中的至少之一是铜诱导型启动子或铜诱导型启动子的部分。子或杂合启动子的启动子实例包括，但不限于，从下列各项的基因获得的启动子米曲霉(v^/e^/〃z^wjzae)TAKA淀粉酶、曼赫才艮毛霉(i/n'zowwcwlim/e/^')天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Ap^gz7/^w'gw)中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(A^wg/〃wawamon')葡糖淀粉酶(g/^4)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(y^;erg77/us1m^w/(37M)乙酰胺酶、《裏片镰孑包(尸wran'wmvewewafwm)淀4分葡4唐香酶、镶片镰孢Daria启动子、镶片镰孢Quinn启动子、尖镰孢CPwsan'wmox;^pwww)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉(7h'c/zofife^^)3一葡糖苦酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉p-木糖苷酶、酿酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶；以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。其它对于酵母宿主细胞有用的启动子由Romanos等，1992，FeaW8:423-488描述。在本发明的方法中，杂合启动子或串联启动子应理解为对于编码多肽的核酸序列是外源的，即使作为所述串联启动子或杂合启动子组成部分的野生型启动子或其部分对于该核酸序列是天然的。例如，在由至少两个启动子组成的串联启动子中，一个或多个(几个)启动子可以是编码多肽的所述核酸序列的野生型启动子。上游激活序列(UAS)术语"铜响应性上游激活序列"在本申请中定义为包含名为顺式作用元件的DNA序列的启动子区，其充当转录调节因子的结合位点，所述转录调节因子负责启动子的铜诱导型转录。对于酵母和丝状真菌基因，将含有这种顺式作用元件的启动子区称为上游激活序列，缩写为UAS。(Thiele，1992,iVwc/e/c爿c/Aie化arc/220:1183-1191)。这种UAS的鉴定和分离能够根据由Thiele和Hamer，1986，见上文；Zhou和Thiele,1993,见上文；和Thiele,1992，见上文描述的方法来完成。在本发明的方法中，可以使用负责铜诱导型基因转录的任何顺式作用启12动子酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酿酒酵母胞质过氧化氢酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因、光滑念珠菌金属硫蛋白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉金属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属硫蛋白基因和鹅柄孢壳菌(尸o^w;oraamen'"e)金属石克蛋白基因。在优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母金属硫蛋白基因的启动子。在更优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母C77尸/基因(登录号P07215)(Butt等，1984，见上文)的启动子。在另一个优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母胞质过氧化氬酶基因的启动子。在更优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母CT77基因(登录号P06115)(Lapinskas等，1993，见上文)的启动子。在另一个优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母超氧化物歧化酶基因。在更优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母SOD/基因(登录号P00445)(Gmlla等，1991,见上文)的启动子。在另一个优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母铜耐受抑制基因。在更优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自酿酒酵母C7^5基因(登录号P41902)(Culotta等，1994,见上文)的启动子。在另一个优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自光滑念珠菌金属硫蛋白基因。在更优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自光滑念珠菌MT基因。在最优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自光滑念珠菌M7Y基因(登录号P15113)(Mehra等，1989，见上文；Mehra等，1992，见上文；Mehra等，1990，见上文)。在另一个最优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自光滑念珠菌M77/a基因(登录号P15113)(Mehra等，1989，见上文；Mehra等，1992,见上文；Mehra等，19卯，见上文)。在另一个最优选的方面，铜响应性上游激活序列获得自光滑念珠菌基因(登录号P15114)(Mehra等，1989,见上文；Mehra等，1992,见上文；Mehra等，1990,见上文)。在本发明的方法中，一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列(UAS)可操作地连接于铜诱导型启动子的上游。应理解的是铜诱导型启动子应含有它自身的铜响应性上游激活序列，并且，因此，可操作地连接于该启启动子中所含相同的UAS区，可以是与该启动子中所含不同的UAS区，或者可以是它们的组合。依赖于与上游激活序列相联的铜响应性元件的数目，即，铜响应性元件的数目和铜依赖性转录效力的关系，可以将多于一个上游激活序列置于启动子的上游。因此，依赖于上游激活序列中包含的铜响应性顺式作用元件的数目，可以使用多拷贝的特异性上游激活序列，可以使用不同上游激活序列的组合，或者可以使用前述各项的组合。铜响应性顺式作用元件的总数是至少2，优选至少3，更优选至少4，甚至更优选至少5，并且最优选至少6。在优选的方面，额外的铜响应性上游激活序列之一是SEQIDNO:46。在另一个优选的方面，额外的铜响应性上游激活序列之一是SEQIDNO:47。转录激活子基因术语"铜依赖性反式作用转录因子基因"在本申请中定义为编码转录因子的基因，所述转录因子藉由与铜诱导型启动子序列偶联的铜响应性上游激活序列(UAS)以铜依赖性的方式激活基因转录。这些基因也称为铜金属调节转录因子(MRTF)基因。应理解的是如用于本申请，术语"铜依赖性反式作用转录因子基因"中涵盖这种基因的截短的和/或突变的形式。在本发明的方法中，可以使用编码转录因子的任何转录激活子基因，所因可以选自下组酿酒酵母」C五/基因、光滑念珠菌^M77基因、解脂西洋蓍霉CRF1基因(登录号P45815)、栗酒裂殖酵母OSb/^osacc/7ara附;;c&y/70w&)CUF2基因(登录号094588)、酿酒酵母HAA1基因(登录号Q12753)和烟曲霉(J^ergzY/M^/wm/ga^s)铜拳DNA结合域蛋白基因(copperfistDNAbindingdomainproteingene)(登录号Q4WN33)。在优选的方面，转录激活子基因是酿酒酵母^C5/基因(登录号P15315)(Thiele和Hamer，1986，Mo/.Ce〃.Ao/.6:1158-1163)(DNA为SEQIDNO:13,推定的氨基酸序列为SEQIDNO:14)。在另一个优选的方面，转录激活子基因是光滑念珠菌基因(登录号P41772)(Zhou和Thide,1991,尸tN^S1WS^88:6112-6116)(DNA为SEQIDNO:15，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:16)。在另一个优选的方面，转录激活子基因是解脂西洋蓍霉CRF1基因(登录号P45815)(DNA为SEQIDNO:17，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:18)。在另一个优选的方面，转录激活子基因是栗酒裂殖酵母CUF2基因(聲录号094588)(DNA为SEQIDNO:19，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:20)。在另一个优选的方面，转录激活子基因是酿酒酵母HAA1基因(登录号Q12753)(DNA为SEQIDNO:21，推定的氨基酸序列为SEQIDNO:22)。在另一个优选的方面，转录激活子基因是烟曲霉铜拳DNA结合域蛋白基因(登录号Q4WN33)(DNA为SEQIDNO:23,推定的氨基酸序列为SEQIDNO:24)。在本发明的方法中，真菌宿主细胞包含至少一个转录激活子基因。所述转录激活子基因对于该宿主细胞可以是天然的或外源的。在优选的方面，宿主中存在转录激活子基因的多个拷贝。或者，真菌宿主细胞中可以存在至少两种不同的转录激活子基因的组合，这两种不同的转录激活子基因各自以一个或多个(几个)拷贝存在。转录激活子基因的拷贝数的增加可以通过如下获得将至少一个额外拷贝的所述基因整合入宿主细胞基因组；或将可扩增选择性标记基因包括在转录激活子基因内，其中可通过在适当的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，并且因此含有转录激活子基因的额外拷贝的细胞。转录激活子基因可以整合入宿主细胞的染色体，或可以作为染色体外元件存在，或这些情况的组合。在优选的方面，将转录激活子基因整合入宿主细胞的染色体。多肽所述多肽对于感兴趣的真菌宿主细胞可以是天然的或异源的。术语"异源多肽"在本申请中定义为这样的多肽，其对于宿主细胞不是天然的；或在其中进行了改变该天然多肽的结构修饰的天然多肽。所述多肽可以是具有感兴趣的生物学活性的任何多肽。术语"多肽"在本文不指特定长度的编码产物，并且因此包括肽、寡肽和蛋白质。术语"多肽，，还包括杂合多肽，其包含部分和/或全部多肽序列的组合，所述多肽序列从至少两种不同的多肽获得，其中一个或多个(几个)对于所述真菌细胞可以是异源。多肽还包括多肽的天然存在的等位基因变异和工程的变异。在优选的方面，所述多肽是抗体、抗原、抗微生物肽、酶、生长因子、15激素、免疫讽节^(immunodilator)、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。在更优选的方面，多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在最优选的方面，所述多肽是a-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶(chitinase)、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、(3-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、a-葡糖苷酶、p-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变位酶(mutanase)、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、尿激酶或木聚糖酶。在另一个优选的方面，所述多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明月交。编码多肽的核酸序列可以获得自任何原核、真核或其它来源。就本发明而言，用于本申请与给定的来源有关的术语"获得自"，应该表示所述多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的基因的细胞产生。用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，并且包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用聚合酶链式反应(PCR)实现从这种基因组DNA克隆所述核酸序列。参见，例如，Innis等,1990,尸Ci/Votoco/s:jfoAfeAodi^pp/Zcado",AcademicPress,NewYork。所述克隆方法可以包括切下和分离包含编码所述多肽的核酸序列的期望核酸片段，将所述片段插入载体分子，和将重组载体并入真菌细胞，其中所述核酸序列的多个拷贝或克隆将被复制。所述核酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。核酸构建体本发明还涉及核酸构建体，其包含含有编码感兴趣多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与通过铜依赖性反式作用转录因子激活的铜诱导型启动子序列可搡作地连接；和第二多核苷酸，其包含至少一个在所述启动子上游的铜响应性上游激活序列(UAS)，和一个或多个(几个)调控序列，该调控序列在与之兼容的条件下指导所述多核苷酸的编码序列在合适的宿主细胞中表达。表达应理解为包括多肽产生中涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转16录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。"核酸构建体"在本申请中定义为单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或者所述核酸分子经修饰而含有以本来不存在于(nototherwiseexist)自然中的方式组合和并置的核酸区H当所述核酸构建体含有编码序列和表达该编码序列所需的所有调控序列时，术语核酸构建体与术语表达盒同义。行操作来为所述多肽或转录因子提供改进的表达。依赖于表达载体，在将核酸序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰核酸序列的技术是本领域熟知的。在本发明的方法中，为了改进宿主细胞中编码序列的表达，编码多肽或铜依赖性反式作用转录因子的核酸序列可以包含一个或多个(几个)天然调控序列，或者一个或多个(几个)天然调控序列可能被对于所述核酸序列是外源的一个或多个(几个)调控序列替代。术语"调控序列，，在本申请中定义为包括对多肽的表达是必需的或有利的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核酸序列可以是天然的或外源的。除本申请描述的铜诱导型启动子和铜响应性上游激活序列之外，这样的调控序列还包括，但不限于，启动子、前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括铜诱导型启动子、铜响应性上游激活序列和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和目的在于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核酸序列编码区的连接。在本申请中已经讨论了对编码感兴趣多肽的多核苷酸的启动子的搡作。对于铜依赖性反式作用转录因子，调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码该转录因子的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导转录因子表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动<曰狄付。用于指导在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(g/a4)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、镶片镰孢Daria(WO00/56900)、镶片镰孢Quinn(WO00/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)、里氏木霉p-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉卩-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性a-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是从以下各项的基因获得的启动子酿酒酵母烯醇化酶(五;V07)、酿酒酵母半乳糖激酶(04丄/)、酿酒酵母醇脱氬酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶04Z)i^，^D7/2/G/lP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(7P7)、酉良酒酵母金属硫蛋白(C77尸/)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。其它对于酵母宿主细胞有用的启动子由Romanos等，1992,8:423-488描述。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核酸序列的3'末端可操作地连接。可以将在所选的真菌宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从以下各项的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞优选的终止子从以下各项的基因获得酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CTC7)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氬酶。其它对于酵母宿主细胞有用的终止子由Romanos等，1992,见上文描述。调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核酸序列的5'末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉丙糖磷酸异构酶、镶片镰孢胰蛋白酶和镶片镰孢葡糖淀粉酶。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母a因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶010//2/04巧。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核酸序列的3，末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为信号以将聚腺苷残基添加至转录的mRNA。可以将在所选真菌宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯曱酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mo/ecw/orCe/Zw/ar5z'o/ogy15:5983-5990描述。调控序列还可以是信号肽编码区，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核酸序列的编码序列5，端可固有地包含信号肽编码区，其与编码分泌多肽的编码区片段一起天然地连接在翻译阅读框中。可供选择的是，编码序列5，端可含有对于所述编码序列外源的信号肽编码区。外源信号肽编码区在编码序列不天然地含有信号肽编码区时可为必需的。或者，外源信号肽编码区可以简单地替代天然信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选真菌宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从如下酶的基因获得的信号肽编码区米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶和疏棉状腐质霉脂肪酶。对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母a因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码区由Romanos等，1992,见上文描述。调控序列还可以是前肽编码区，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或在某些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从酿酒酵母a因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(MycWo;/^oraAermo;^z7a)漆酶(WO95/33836)的基因获得前肽编码区。当信号肽和前肽区二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽区置于紧接着(nextto)多肽氨基末端，并且将信号肽区置于紧接着前肽区的氨基末端。同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽或铜依赖性反式作用因子的表达。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉葡糖淀粉酶启动子和镶片镰孢葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨曱蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(withheavymetal)扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核酸序列将与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含含有编码感兴趣的多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，所述铜响应性上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录。上文描述的多种核酸和调控序列可以结合在一起产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入所述第一多核苷酸和第二多核苦酸来表达核酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与铜诱导型启动子、铜响应性上游激活序列和一个或多个适当的用于表达的调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生核酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段20(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA(totalDNA),或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选4奪经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophytoauxotrophs)等。对于酵母宿主细胞合适的标记是^D五2、//ZS3、丄￡^72、丄F52、M￡73、77尸/和WM3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于am必(乙酰胺酶)、arg^(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、6ar(膦丝菌素(phosphinothricin)乙酰转移酶)、/zygB(潮霉素磷酸转移酶)、m'aZ)(硝酸还原酶)(nitratereductase)、(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶)(orotidine-5'-phosphatedecarboxylase)、sC(石克酸腺苦酰转移酶)、//7C(邻氨基苯曱酸合酶(anthranilatesynthase)),以及它们的等价物。优选用在曲霉属C^pwg/〃w)细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的am必和；,G基因和吸水链霉菌(5^eptowyces/7ygrasco//cws)的基因。优选用在镰孢属CFwan'ww)纟田月包中的是6w、awdS、或/2少g5基因。本发明的载体优选含有元件，其允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或允许载体在所述细胞中独立于基因组自主复制。为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10,000碱基对，优选400至10，000碱基对，并且最优选800至10,000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核普酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以还包含复制起点，其使载体能够在宿主细胞中自主地复制。可用于酵母细胞的质粒复制子(replicator)的实例是2微米复制起点，ARS1,ARS4,ARS1和CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。可用于丝状真菌细胞的质粒复制子的实例是AMA1和ANSI(Gems等,1991，G認98:61-67;Cullen等，1987，泡由'cie廳rc/z15:9163-9175;WO00/24883)。分离AMA1基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO00/24883中的方法完成。复制的起点可以是一种具有突变的复制起点，该突变使该复制起点在宿主细胞中发挥温度敏感性的功能(参见，例如，Ehrlich,1978,尸raceWwgsq/"AeyV加'owa/^4ca<iew_y。/5WewceyC7S^75:1433)。可以将多于一个拷贝的编码多肽的核酸序列插入宿主细胞以增加该基因产物的产生。核酸序列拷贝数的增加可如下方法获得通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或者通过将可扩增选择性标记基因包括在所述核酸序列内，其中可通过在合适的选择剂(selectableagent)存在下培养细胞来选择含有所述选择性标记基因的扩增拷贝的细胞，和由此得到核酸序列的额外拷贝。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。真菌宿主细胞本发明还涉及重组真菌宿主细胞，其包含含有编码感兴趣多肽的核酸子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；并进一步包含第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因。将如本文所述的表达载体或核酸构建体引入宿主细胞，从而使所述载体或构建体作为如前文所述的染色体整合体或自复制染色体外载体保留。术语"宿主细胞，，涵盖亲本细胞的任何子代，其由于复制过程中发生的突变而与该亲本细胞不同。宿主细胞的选择将很大程度上依赖于编码所述多肽的多核苷酸及其来源，以及编码铜依赖性反式作用转录因子的多核苷酸。宿主细胞可以是可用于本发明的方法中的任何真菌细胞。"真菌，，如用在本文包括以下门子嚢菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口才妄合菌门(Zygomycota)(3口由Hawksworth等，于A,似衡rt/75W_y》D/Wowa^yy7Tze尸w"g7'，第8版，1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上,171页中所引用),和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfiingi)(Hawksworth等，1995,见上)。在优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。"酵母'，如用在本申请中包括产子囊酵母(ascosporogenousyeast)(内孑包霉目(Endomycetales))、产4旦子酵母(basidiosporogenousyeast)禾口属于半^口菌类(FungiImperfecti)(芽孑包纟冈(Blastomycetes》的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，^j寻酵母定义为如历o/ogyJcHvto'ayo/I^aW(Skinner,F.A.,Passmore,S,M.，禾口Davenport,R.R.，eds，5bc.Bacten.o/.iS戸pos/謂iSen'esNo.9，1980)中所述。在更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属(Cam/Wa)、汉逊酵母属(Harae"w/fl)、克鲁维酵母属(幻炒vmw7ycas)、毕赤酵母属(Pfc/z/a)、酵母属((Sacc/2"raw少cas)、裂殖酵母属(5"c/2/zosacc/wram^yces)或西洋蓍霉属(Kj7r。w/a)细胞。在最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母OSacc/^rawyc^car&6erge""'s)、酉良酒酵母、jf唐4匕酵母(Sacc/7aram少c&sfiz'osto/7'cz^)、道格4立氏酵母(iS"acc/2"raw;Kcesdowg/os")、克鲁弗酵母CSacc/7flf厂0附7casA/w_yv￡"〕、诺地酵母(5^ccA0!ram7c&swo^)era/s)或卵形酵母(5^cc/zi3raw77casovi/b/7m.力细月包。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(幻w，eram，yc^/ac他)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉细胞。在甚至最优选的方面，酵母宿主细胞是酿酒酵母(Sacc/zaraw;/c&ycar/Aergms/scerev&Zae)JG169(M4r-oc,wra3-52，/ew2-3,p印m37'/2&3zl2,p^/.'.7ew2,4^e/.v/z/d)(美国专利No.5,770,406)。在另一个优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌，，包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995,见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属G4cmo"/wm)、曲霉23属、短梗霉属(Jt^oZosWwm)、烟管霉属(掛eAa"c^ra)、拟蜡菌属(CenJDcWo/w》、金孑包子菌属(C7zo^o^PO"'Mw)、鬼伞属(Co/W"w)、革盖菌属(Cbr/o/w力、隐J求菌属(Oy/tococc"力、i^7/6(2wWM附、镰孑包属、腐质霉属(//wm/co/a)、梨孢菌属(Magwopo^/ze)、毛霉属(Mwco。、毁丝霉属(MycWo;/z^2ora)、新考玛月旨霉属(iVeoca〃fmari;c)、脉孑包菌属(iVeMmspora)、拟青霉属(尸aec77o附ycas)、青霉属(Pew/c/〃/ww)、平革菌属(户/^"￡/-0(^"6&)、射月永菌属(尸/z/e6/a)、瘤胃壶菌属(尸/romyc&y)、侧耳属(尸/ewrafw》、裂褶菌属(5*c/H'zo//z_y〃wm)、3果节菌属(7^/aramyces)、p耆热子嚢菌属(77zermo^yctw)、才发孑包壳属(J7z/e/謂'fl)、弯颈霉属(7b/，oc/flc/,訓)、检菌属(Trawefes)或木霉属(7Hc/70<ierma)纟田月包。在最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉(/4^spe《,〃z^》ef油力、曰本曲霉(A/erg7.〃y'apow'c—、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fw^n'wm6flcfn'fife)/(ies)、禾谷镰孑包(Fws(3〃wwcerea/fs)、库威镰孑包(Fwsan'wwcrooAwe〃ew5^)、大刀嫌3包(尸Msar/wwcw/附or"w)、禾本考牛嫌;包(Fwxan'wwgram/"earwm)、禾赤镰孑包(Fwsan'wmgraw/"wm)、异孑包镰孑包(尸wsfln'ww7/z￡feras/7orww)、合欢木镰孑包(Fwran'w附"egw"6/)、尖镰孑包、多枝镰孢(Fw^n'wwreft'cw/afwm)、4分纟工镰孑包(Fwsan'wmrasewm)、才妻骨木镰孑包(Fuyar/wmsam6wc〖"wm)、月夫色镰孑包(Fwsar/wmsarcoc/zrawm)、^以分才支孑包镰孑包(Fws(ar/wms/oraWc/n'oz'dfes)、石危色镰孑包(Fusan'ww、圓镰孑包(/^rar/wwtonY/oswm)、拟、丝孑包镰孑包(尸z^077'Mwm'c/zc^eczbz'ofey)或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌C6)erAa"(5feraadwsto)、干拟蜡菌(Cen^on'o戸^awe/n>za)、干才以错菌、Cen)oWo/w7'scaregr'ea、Ce")on'ops^gZ/vasrera、Ce"》or/o/wz\y/a朋oc,"to、Cm》on'o戸-sn'vw/osa、Ce一o"'o戸isw6n^、虫拟蜡菌(CenjoWo/757'ssw6verm/jpora)、嗜角质金孑包子菌(C7z^sos/on'MwA:era"wo_p/z//wTW)、C7w3^o^spon'w附/wc^wowe/we、带金3包子菌(C723^05poWw附fra//cwm)、CT^ysospor/ww附eraan'w附、C7wy^w/on'w附/"o/w、植金孑包子菌zcwaf騰、灰盖鬼伞(Cb戸'"iwc/"erea)、毛革盖菌(Con'o/船/z/raw加)、特异腐质霉(Z/w附/co/a/rao/em1)、3危才帛^)犬腐质霉(//"附/<%>/<3/a"wg/"asa)、米黑毛霉(Afwcorm/e/ze/)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉(尸em'c/〃/wm/wr;Mragewwm)、黄孑包平革菌(尸/za"erac/zaefec/z/^^o^pon'wm)、丰S射射菌(尸/z/eZ)/ara&ato)、刺芽侧耳CP/ewro/iwe^ywgf/)、土生冲炎孑包雾(77'e/av/flerresfn.s)、长纟成毛一全菌(7h3wefesW〃cwa)、变色^全菌(rn3metesverw'co/or)、口合茨木霉(7Wc/7o^fe，a/mtz/""騰)、康亍木霉(7h'c/zO(ie/7w"^o"/"g")、长技木霉(7Hc/zo<5ferma/oMg7'Zrac/zz'afem)、里氏木霉或纟录色木霉(7HcAo(iermavzWcfe)纟田月包。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和Yelton等,1984，尸raceW打gso/AeAto/o""/爿cflde，。/5We"c&s81:1470-1474中描述。用于转化里氏木霉宿主细胞的合适方法在Penttila等，1987,67:155-164,和Gruber等，1990,C^r18(1):71-6中描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989,78:147-156和WO96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母Becker和Guarente,于Abelson，J.N.和Simon,M.I.(编者)，GWcfeto肠WGWWcsa"<iM/ecw/ar^z.o/ogy,Afef/zo(isz'w五"^ywo/c^y,Volume194,pp182-187，AcademicPress,Inc.,NewYork;Ito等，1983,Towma/o/Bac&Wo/ogy153:163;和Hinnen等，1978,尸raceW"g5o/f/zejVa/7'owa/」cacfe，。/5Wewcest/5L475:1920。通过以下实施例进一步对本发明进行描述，但不应将其理解为对本发明范围的限制。实施例作为緩冲液和底物使用的化学品是至少试剂等级的商业产品。DNA测序DNA观'J序4吏用AppliedBiosystemsModel3130XGeneticAnalyzer(AppliedBiosystems3130X型遗传分斗斤<义)(AppliedBiosystems，FosterCity,CA，USA)使用染料终止子化学(dyeterminatorchemistry)(Giesecke等，1992,Jozww/o/Mra/,MeAoA38:47-60)进行。使用Phred/Phrap/Consed程序(UniversityofWashington,Seattle,WA，USA)用序列特异性引物装配序列。菌抹使用酉良酒酵母JG169(M4r-a,wra3-52，/e"2-3，/ep/-7"7，A/dzU25/rW:.7ez^，4^eU/d)(美国专利No.5,770，406)作为本申请实施例中的宿主菌抹。培养基每升YPD培养基由10g酵母提取物、20g细菌用蛋白胨和2。/。葡萄糖组成。每升CUP减ura培养基(CUPminusuramedium)(pH7.0)(原始培养基)由1ml的100mMCuS04.5H20、1.7g不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮碱基(yeastnitrogenbase;YNB)(BIO101,Carlsbad,CA,USA)、0.8g含40mg腺噤呤的CSM-um(BIOIOI，Carlsbad,CA,USA)、5g酪蛋白氨基酸(Becton,DickensonandCompany,Sparks,MD，USA)、100ml50%葡萄糖、50ml0.5MK2HP04和1ml100mg/ml氨千青霉素。每升酵母减ura优化培养基(最优培养基)由1ml100mMCuS04-5H20、6.7g含硫酸铵的酵母氮碱基(YNB)、0.8g含40mg腺噤呤的CSM-ura、5.9g琥珀酸(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO,USA)、20g半乳糖、10g葡萄糖和1ml100mg/ml氨千青霉素。每升酵母减ura选择培养基由6.7g含硫酸铵的酵母氮碱基(YNB)、5g酪蛋白氨基酸、100ml0.5M琥珀酸pH5、40ml50%葡萄糖和2ml10mg/ml氯霉素。酵母减ura选择平板由每升补充了20g純化琼脂(Nobleagar)的酵母减ura选择培养基组成。每升SC减ura培养基由7.5g不含氨基酸的酵母氮碱基(Fluka,Buchs，Switzerland),11.3g琥珀酸、6.8g氬氧化钠、5.6g酪蛋白氨基酸和0.1gL画色氨酸，以及100ml50%果糖的无菌溶液和400pi250mg/ml氨千青霉素的无菌溶液，二者均在高压灭菌之后添加。SC减ura平板由SC减ura培养基组成，只是使用100ml无菌的20%果糖和20g琼脂(SigmaChemicalCo.,St.Louis，MO，USA)。每升SDMUA培养基由1.7g不含氨基酸的酵母氮碱基、5.0g酪蛋白氨基酸、0,8g含40mg/lADE的CMS-Ura(MPBiomedicals,Irvine,CA,USA)、10ml10mMCuS04.5H20和10ml的1MK2HP04,以及100ml无菌50%果糖和400pi无菌250mg/ml氨千青霉素，二者均在高压灭菌之后添加。每升LB培养基由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠组成。LB平板由LB培养基和每升15g细菌用琼脂组成。SOC培养基由2%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物、10mMNaCl、2.5mMKC1、10mMMgCl2和10mMMgSO4组成，通过高压灭菌法灭菌，然后添加过滤除菌的葡萄糖至20mM。每升2XYT平板由16g胰蛋白胨、10g酵母提取物、5gNaCl和15g细菌用琼脂组成。实施例1:铜诱导型启动子(CM0/启动子)的PCR扩增设计了下文所示的PCR引物997247和997248用于从质粒pCu426(Labbe和Thiele，1999，MeAoA五"z少mo/ogy306:145-153)扩增酿酒酵母铜诱导型启动子(0/尸/启动子)。为了克隆到酿酒酵母表达质粒pMB1537(参见实施例2)中，在引物设计中纳入了限制酶位点I和￡coRI。引物997247:5，-CACCGGTGCATGCCTGCAGGAGCTCCTAGTTAGAAA-3，(SEQIDNO:25)I引物997248:5，-AACTA^OTGAA^GGAAITCTAGTCGA^GACT^CT-3,(SEQIDNO:26)使用EXPANDHighFidelityPCRSystem(EXPAND高保真PCR系统)(Roche，Indianapolis,IN,USA)通过PCR扩增了CC/尸启动子片段。所述PCR的扩增反应混合物含有约50ngpCu426质粒DNA、1pi引物997247(50pmol/pl)、1pi引物997248(50pmo寧)、5pi含15mMMgCl2的10XPCR缓沖液(Roche,Indianapolis,IN，USA)、1pidNTP混合物(每种10mM)、40,25|il水和0.75pi(3.5U/fil)DNA聚合酶混合物(Roche，Indianapolis,IN,USA)。使用EPPENDORFMASTERCYCLER5333(Eppendorf,Westbury,NY，USA)扩增所述片段，程序为1个循环的94。C2分钟；10个循环每个为94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15个循环每个为94°C15秒、55°C30秒和72。C15秒(在每个连续循环递加5秒延长)；1个循环的72。C7分钟；和在10。C保温。通过使用TAE緩沖液(每升4.84gTris碱、1.14ml水醋酸和2ml0.5M27EDTApH8.0)的1.5%琼脂糖凝胶电泳来纯化246bp的PCR产物，并使用QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA,USA)进一步纯化。使用pCR2.1-TOPO(InvitrogenCorporation,Carlsbad，CA,USA)根据制造商的说明书连接所述246bpPCR产物。温育后，使用2pl混合物转化ONESHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA,USA)。将2pi体积的连接混合物添加至大肠杆菌细胞并在水上温育5分钟。随后，将细胞在42。C热休克30秒，然后在水上放置2分钟。将250pl体积的SOC培养基添加至细胞并将混合物在37。C和250rpm温育1小时。温育后，将菌落涂布在每毫升补充有100iig氨千青霉素的2XYT平板上并在37。C温育过夜，以进行质粒选择。用无菌牙签挑取在平板上生长的8个菌落并在装有3ml每ml补充有100|ig氨苄青霉素的LB培养基的15mlFALCON⑧管中在37。C、250rpm培养过夜。使用BioRobot9600(QIAGENInc.:Valencia,CA，USA)分离质粒。用&oRI消化4pl体积的所得质粒微量制备物。通过琼脂糖凝胶层析和UV分析来分析消化反应物，如先前关于PCR反应所述。使用1W质粒^^莫板、1.6ngM13引物(正向的或反向的)(MWGBiotech,HighPoint,NC，USA),并补水至6pl，对包含插入物的分离的质粒测序。将具有正确序列的所得质粒命名为pBM128a(图1)。实施例2:表达载体pMB1537的构建表达载体pMB1537包含驱动编码细毛嗜热霉(772ermowycasto"wg/"ows)脂肪酶的野生型基因表达的酵母TPI启动子(SEQIDNO:27是DNA序列，SEQIDNO:28是推导的氨基酸序列；登录号059952)、CYC1终止子和作为选4奪性标记的17^43基因。使用EXPAND长模板PCR系统(Roche，Germany)PCR扩增酵母表达质粒pSTED226(WO05/045018)，其中使用作为模板的pSTED226和如下两种引物。引物319137:5'-TCTAGAGGGCCGCATCATGTAATTAG-3，(SEQIDNO:29)引物19138:5，-GACGCCATGGTGAAGCTTTCTTTTAATCGT-3，(SEQIDNO:30)PCR扩增反应混合物含有约50ng的pSTED226质粒DNA、1|il引物319137(50pmol/|il)、1pl引物19138(50pmol/|il)、5pl含15mMMgCl2的10XPCR緩冲液(Roche，Indianapolis,IN,USA)、1pidNTP混合物(每种10mM)、40.25|il水和0,75pi(3.5U/pl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier热循环仪(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA,USA)来扩增片段，程序为1个循环的94°C2分钟；10个循环每个为94°C15秒、55。C30秒和72°C15秒；15个循环每个为94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒(在每个连续循环递加5秒延长)；1个循环的72°C7分钟；和在10。C保温。PCR规程终止后，使用GFX⑧PCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒根据制造商的i兌明书(AmershamBiosciences,UnitedKingdom)纯化和洗脱5826bp的PCR片段。使用EXPAND高保真PCR系统PCR扩增包含细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因的基因片段，其中使用作为模板的pENI1298(WO00/24883)和如下两种引物引物349699:5，-CAAGAAGAITACAAACTArCAArTTCArACACAArArAAACGArTAAAAGAAAGCTCACCATGAGGAGCTCCCTTGTGCTGTTCnTGTCTCTG-3，(SEQIDNO:31)引物353031:5,-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACATAACTAAITACArGArGCGGCCCTCTAGATTArCAAAGACArGTCCCAAITAACCCGAAGTAC-3，(SEQIDNO:32)PCR扩增反应混合物含有约50ngpENI1298质粒DNA、1jil引物349699(50pmol/pl)、1pi引物353031(50pmol/nl)、5pi含15mMMgCl2的10XPCR緩沖液(Roche,Indianapolis,IN，USA)、1pidNTP混合物(每种10mM)、40.25|il水和0.75fil(3.5U/nl)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier热循环仪来扩增片段，程序为1个循环的94°C2分钟；10个循环每个为94°C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15个循环每个为94°C15秒、55。C30秒和72。C15秒(在每个连续循环递加5秒延长)；1个循环的72。C7分钟；和在10。C保温。PCR规程终止后，使用GFXPCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒依照制造商的说明书纯化和洗脱927bp的PCR片段。将所得两种片段(5826bp和927bp)通过电穿孔转化入酿酒酵母JG169,其中根据制造商的规程使用设定为1.5千伏(kvolts)的GENEPULSER⑧和脉沖控制仪(Bio-Rad,Hercules，CA，USA)及2mm缝隙的电击杯(cuvette)。转化反应物含有混合的100ngPCR扩增的载体DNA及100ng包含脂肪酶基因的PCR产物。将转化反应物涂布到酵母减ura选择平板上并在30°C温育5天。将来自上述规程的一个酵母克隆在SC减ura平板上再划线(restreak)，并将一个酵母单菌落接种入50ml摇瓶中的10mlSC减ura培养基并在30°C、250rpm温育过夜。使用2ml培养液进行质粒制备，其中使用用于酵母质粒制备的QIAPREP⑧旋转微量制备试剂盒(QIAGENInc.,Germany)。稍后将质粒测序并^r证了预期的DNA序列。将该质粒命名为pMB1537(图2)。实施例3:表达载体pBM126a的构建用爿geI和￡coRI消化质粒pBM128a,并且用五coRI和M/eI消化质粒pMB1537,并分别通过使用TAE缓沖液的1.8%和0.7%琼脂糖凝胶电泳联合QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒来纯化分别为265bp和661bp的片段。为了创建载体片段，用爿geI和A^eI消化pMB1537。通过使用TAE緩冲液的0.7%琼脂糖凝胶电泳联合QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒来纯化所得5148bp片段。随后<吏用快速DNA连4妻i式剂盒(RocheDiagnosticsCorporation,Indianapolis,IN,USA)连接所有三种片段。根据制造商的说明书，使用2^反应物转化大肠杆菌XL10-GOLD⑧超感受态细胞(Stratagene，LaJolla，CA，USA)。使用BioRobot9600自大肠杆菌转化体制备质粒DNA。对包含插入物的分离的质粒测序，其中使用1iil质粒模板、1.6ngM13引物(正向的或反向的)，并且补水至6|al。将鉴定出具有正确序列的所得质粒命名为pBM126a(图3)。实施例4:表达载体pMB1539的构建构建了质粒pMB1539以包含在TPI启动子控制下的编码细毛嗜热霉脂肪酶变体的基因(SEQIDNO:33是DNA序列，而SEQIDNO:34是推导的氨基酸序列)。使用EXPAND⑧高保真PCR系统通过PCR制备了包含细毛嗜热霉脂肪酶变体基因的基因片段，其中使用包含细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因(SEQIDNO:27)的pENil298(WO00/24883)作为模板，和下文所示引物349699和353031。30引物349699:5，-CAAGAAGAnACAAACTArCAAnTCATACACAATATAAACGAnAAAAGAAAGCT^CACCA^GAGGAGCTCCCT^GTGCTG^^C^TGTCTCTG陽3,(SEQIDNO:35)引物353031:5，-GAGGGCGTGAATGTAAGCGTGACArAACTAArTACATGArGCGGCCCTCTAGATTATCAAAGACATGTCCCAAnAACCCGAAGTAC-3，(SEQIDNO:36)PCR扩增反应混合物含有约50ngpENil298质粒DNA、1pl引物349699(50pmo關、1pi引物353031(50pmol/pl)、5pl含15mMMgCl2的10XPCR緩冲液(Roche,Indianapolis,IN,USA)、1^dNTP混合物(每种10mM)、40.25pi水和0.75pi(3.5U/|il)DNA聚合酶混合物(Roche，Indianapolis,IN,USA)。用PTCPeltier热循环仪来扩增片段，程序为94°C2分钟的1个循环；10个循环每个为94。C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15个循环每个为94°C15秒、55。C30秒和72。C15秒(在每个连续循环递加5秒延长)；72°C7分钟的1个循环；和在10。C保温。PCR扩增后，使用GFXPCRDNA和凝胶条带純化试剂盒纯化993bp的DNA片段。将所得片段(IOOng)与实施例2中所述pSTED226载体片段(IOOng)混合，并通过电穿孔转化入电感受态酿酒酵母JG169细胞，其中才艮据制造商的规程使用设定为1.5kvolt的GENEPULSER⑧和脉冲控制仪及2mm缝隙的电击杯。然后将经过转化的细胞涂布到酵母减ura选择板上并在30°C溫育5天。将来自上述规程的一个酵母克隆在SC减ura板上再划线，并用一个酵母单菌落接种50ml摇瓶中的10mlSC减ura培养基并在30。C、250rpm温育过夜。使用来自此培养物的2ml培养液进行质粒制备，其中使用用于酵母质粒制备的QIAPREP⑧旋转微量制备试剂盒。稍后将质粒测序并验证了预期DNA序列。将该质粒命名为pMBl539(图4)。实施例5:表达载体pJLinl68的构建利用C77/^启动子的细毛嗜热霉脂肪酶变体表达载体的构建是通过将pBM126a(包含在C77/^启动子控制下的细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因)中的细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因用来自pMB1539的细毛嗜热霉脂肪酶变体基因更换(swap)来实现的。首先，用///"dill和MwI消化pBM126a和pMB1539二者，并使用QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒凝胶纯化来自pBM126a的5kb片段和来自pMB1539的1.1kb片段。随后使用快速DNA连接试剂盒连接两片段，其中载体:插入物的摩尔比为1:2、1:3和l:4且载体量定为50ng。命名为pJLinl68(图5)的所得质粒包含在C77尸/启动子控制下的细毛嗜热霉脂肪酶变体基因。实施例6:表达载体pBM142c和pBM143b的构建设计了如下引物，用于使用QUIKCHANGE⑧定点诱变试剂盒(Stratagene:LaJolla,CA，USA)自pJLinl68中细毛嗜热霉变体脂肪酶的前肽序列消除编码氨基酸SPIRR的最后五个密码子引物998570:5,-CTCTGCGTGGACGGCCTTGGCCGAGGTCTCGCAGGA^CTGT^AAC-3,(SEQIDNO:37)引物998571:5，-TrAAACAGArCCTGCGAGACCTCGGCCAAGGCCGTCCACGCAGAG-3，(SEQIDNO:38)在含有73ngpJLinl68、IXQUIKCHANGE⑧反应緩冲液(Stratagene,LaJolla，CA，USA)、4jnlQUIKSOLUTION(Stratagene，LaJolla，CA，USA)、1plXLdNTP混合物(Stratagene，LaJolla,CA,USA)和1jil2.5U1PfUUltraTMDNA聚合酶(Stratagene,LaJolla,CA,USA)的PCR反应液中，使用100皮摩尔每种引物，终体积为50pl。EPPENDORFMASTERCYCLER⑧编程为95°C1分钟的1个循环；18个循环每个为95。C50秒、60°C50秒、和68°C6分钟；和在10°C保温。将1|ilDp"I直接添加至扩增反应物并在37。C温育1小时。根据制造商的说明书，使用2pl体积的D;wI消化反应物转化大肠杆菌XL10-GOLD⑧超感受态细胞(Stratagene,LaJolla,CA,USA)。通过DNA测序确认了不含对应于SPIRJR编码区的15bp的一个克隆，并命名为pBM142c(图6)。为了避免在pBM142c中产生别的突变，将来自pBM142c的细毛嗜热霉变体脂肪酶基因的5，区克隆回到pJLinl68中。用///"dill和M/eI消化质粒pBM142c，并通过使用TAE緩冲液的1.5%琼脂糖凝胶电泳联合QIAQUICK凝胶提取试剂盒来纯化0.6kb片段。用历>^/111和AWeI消化质粒pJLinl68,32并通过使用TAE緩冲液的0.7%琼脂糖凝胶电泳联合QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒来纯化所得5.5kb片段。随后使用快速DNA连接试剂盒连接两片段。命名为pBM143b(图7)的所得表达质粒包含驱动细毛嗜热霉变体脂肪酶基因表达的Cf/尸7启动子。如此，22个氨基酸的信号/前肽序列通过消除最后五个氨基酸(SPIRR)变成了17个氨基酸。实施例7:表达载体pMB1682的构建使用包含细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因的质粒pMB1537构建细毛嗜热霉脂肪酶信号肽的随机诱变文库。使用EXPAND⑧高保真PCR系统和以下引物(DNA-Technology,Aarhus，Denmark)通过PCR扩增了信号肽编码序列和侧翼DNA区的随机诱变PCR片段。引物309787:5'-CTAGGAACCCATCAGGTTGGTGGAAG-3，(SEQIDNO:39)引物373172:NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN丽CATGGTGAAGCTTTCTTTTAA-3，(SEQIDNO:40)其中，在SEQIDNO:40的位置41、50、51、60、64、66、68、70、71、72、74、75、77、80、82、83和87的N99%是A,而1%是G、C或T;在SEQIDNO:40的位置40、46、47、52、53、56、62、65、67、73、78、84、85、86和88的N99%是G，而1。/。是A、C或T;在SEQIDNO:40的位置42、43、45、48、49、54、55、58、59、61、63、69、76、79、81、89、91和92的N99%是C,而1。/。是A、G或T;和在SEQIDNO:40的位置44、57、90和93的N99%是T，而1%是A、C或G。遵循以下规则设计了引入多样性的引物在随机位置野生型碱基始终以99%几率出现，而其它三种碱基以1%几率出现，并且全部三种石咸基出现几率相等(equallyrepresented)。使用EXPAND⑧高保真PCR系统通过PCR扩增信号肽编码序列的诱变片段。PCR扩增反应混合物含有约50ngpMB1537、1pl引物309787(50pmol/jul)、1pi引物373172(50pmol/jul)、5|il含15mMMgCl2的10XPCR33緩冲液(Roche，Indianapolis,IN,USA)、1dNTP混合物(每种10mM)、40.25pi水和0.75pi(3.5U/)il)DNA聚合酶混合物(Roche,Indianapolis,IN,USA)。使用PTCPeltier热循环仪来扩增片段，程序为94°C2分钟的1个循环；10个循环每个为94。C15秒、55°C30秒和72°C15秒；15个循环每个为94°C15秒、55。C30秒和72。C15秒(在每个连续循环递加5秒延长)；72°C7分钟的1个循环；和在10。C保温。通过PCR制备细毛嗜热霉野生型脂肪酶基因的基因片段，其中在使用EXPAND高保真PCR系统的PCR反应中使用pMB1537作为模板。所述PCR中使用的引物是上文所述的引物309787和373172。PCR扩增后，使用GFX⑧PCRDNA和凝胶条带纯化试剂盒根据制造商的方案纯化600bp的PCR片段，并在50pi10mMTris-HClpH8.0中洗脱。通过在信号肽编码序列内的DNA位置用&cI消化将质粒pMB1537线性化。使用线性化载体作为酿酒酵母JG169转化中的受体DNA，其中使用信号肽编码序列及侧翼DNA区(与受体质粒的受体DNA100%同源)的PCR片段作为供体DNA。具体而言，将约3吗经&cI消化的pMB1537与约1600bpPCR片段一起电穿孔入100pi电感受态酿酒酵母JG169细胞，其中使用设定为1.5kvolt的GENEPULSER⑧和脉沖控制仪及2mm缝隙的电击杯。电穿孔后，给经转化的细胞提供1ml1M山梨醇，并在30。C温育1小时，之后将1.1ml涂布到每ml补充有100pg氨千青霉素的SC减ura平板上。自每ml补充有100|ug氨节青霉素的SC减um平板挑取总共8400个菌落并转移至96孔聚苯乙烯微孔板，即将挑取的克隆施加至B-H行1-12列的孔，让A行空着，在A行接种酿酒酵母JG169中的野生型质粒构建体作为野生型参照。所有孔装有每升添加40mg腺嘌呤的SD培养基-URA(称为SDMUA)(遵循制造商的推荐，Qbiogene，Inc.,BIO101系统，由AHDiagnostics,Aarhus,Denmark提供)。将平板在30。C和250rpm温育5天。5天后，在使用下文所述对硝基苯基戊酸酯测定法测量脂肪酶活性之前将平板保持在4°C。在如下测定法中使用对硝基苯基戊酸酯作为底物测量了培养物上清液的脂肪酶活性。在50mMTrispH7、10mMCaCl2、0.4%TritonX陽100緩冲液(稀释緩沖液)中稀释培养物上清液。采用两倍步骤(two-foldstep)在样品緩34冲液中稀释LIPOLASETM标准品(NovozymesA/S,Bagsv2erd，Denmark),自1.0LU/ml浓度开始，到0.125LU/ml浓度结束。在聚苯乙烯微孔板中，将10pl上清液与90pl稀释緩冲液混合。将100(!l对硝基苯基戊酸酯底物溶液(U7^对硝基苯基戊酸酯溶解于10ml异丙醇)添加至每个孔，简单混合，然后在3分钟里每12秒测量405nm吸光度。评估测定数据以鉴定活性比酿酒酵母JG169中pMB1539构建体(A行的孔)高的所有样品。收集活性比参照高的所有克隆作为阳性命中(positivehit)，并在相同设置中再次分析它们，将活性仍比参照高的所有克隆作为接种材料用于微孔板中的新鲜SDMUA培养基。A行再次用于参照菌抹。如上所述接种平板，并如上所述分析。取出活性比参照高的所有克隆并在SC-琼脂平板上再划线。收集所有克隆的单菌落用于在微孔板中在200SDMUA培养基中和在装有10mlSDMUA培养基的50ml管中在30。C再培养5天，之后使用上文所述对硝基苯基戊酸酯测定法将产物与参照菌抹的产物进行比较。在3个邻近的^f鼓孔和3个单独的50ml管中培养每个克隆。使用这3个培养实验的平均值来比较活性水平。最后，将在微孔板和50ml管中都具有最高脂肪酶活性的克隆接种至装有10mlSDMUA培养基的摇瓶(带有两个挡板的250ml圆锥型带挡板摇瓶)并在30°C以250rpm温育5天。使用上文所述对硝基笨基戊酸酯测定法对上清液测定脂肪酶活性。对具有最高脂肪酶活性的克隆进行DNA测序。将显示出最高活性的克隆命名为MB1665,其在脂肪酶信号肽中具有R2K取代(信号肽的第二个密码子自AGG变成AAG)。通过使用与实施例4所述相同的原理，将编码这种信号肽的DNA转移至编码细毛嗜热霉脂肪酶变体的pMB1539构建体。在这种情况中使用与实施例4中所述相同的规程制备了更小的PCR片段。然而，也根据实施例4，但是使用来自MB1539的质粒DNA作为模板制备了更大的片段。如上所述实施了酿酒酵母JG169的GAP修复和转化。此克隆产生了具有更高细毛嗜热霉脂肪酶变体表达的克隆。将此克隆命名为酿酒酵母MB1681。将来自SC-琼脂平板(在30。C培养5天)的酿酒酵母MB1681细胞材料用于接种50ml摇瓶中的10mlSC减ura培养基并在30°C和250rpm温育过夜。使用来自此培养物的2ml培养液进行质粒制备，其中使用用于酵母质粒制备的QIAPREP⑧旋转微量制备试剂盒。根据制造商的说明书，将经过纯化的质粒转化入大肠杆菌ToplOF，(Invitrogen,Carlsbad，CA,USA)。将经过转化的大肠杆菌细胞涂布到每ml补充有100pg氨节青霉素的LB平板上。分离单菌落，再划线，接种入LB培养基，并在30。C温育过夜。使用1ml过夜培养物进行质粒制备，其中使用QIAPREP⑧旋转微量制备试剂盒。最后，将分离的质粒作为模板用于DNA测序，验证了变体信号序列(SEQIDNO:41)和细毛嗜热霉脂肪酶变体编码区(SEQIDNO:33及推导的氨基酸序列SEQIDNO:34)的序列。将所得质粒命名为pMB1682(图8)。质粒pMB1682包含TPI启动子和细毛嗜热霉脂肪酶变体编码区(不含SPIRR、具有R2K变化)。实施例8:表达载体pJLin195的构建构建了质粒pJLin195以包含利用酿酒酵母CW37启动子的细毛嗜热霉脂肪酶变体(具有含R2K变化且不含SPIRR的信号序列)表达载体。将pMB1682的///"dm-A^/eI片段克隆入用历"dIII和iVcfeI消化的pBM143b，即将第二个氨基酸Arg的编码序列(AGG)替换成Lys的编码序列(AAG)。将pMB1682和pBM143b二者用历"dIII和I消化，并用QIAQUICK⑧凝胶提取柱凝胶提取来自pMB1682的1kb片段和来自pBM143b的5kb片段。使用快速DNA连接试剂盒根据制造商的说明书将片段连接到一起，其中载体对插入物的摩尔比为1:2、1:1和3:1且载体量为50ng。将通过DNA测序确认的所得质粒命名为p几inl95(图9)。实施例9:表达载体pBM165a的构建使用以下引物来生成用于构建含有四个酿酒酵母上游激活序歹'J(UAS)的表达载体的PCR片段引物999003:5，-CCGGTGCATGCCTGCAGGAGCTCCT-3，(SEQIDNO:42)I引物999005:5，-ACCGGTCTTTTTTGCTGGAACGGTTCA-3'(SEQIDNO:43)々"使用EXPAND高保真PCR系统通过PCR扩增所述片段。PCR混合物36含有0.5nl约25ngpBM143bDNA、1|il引物999003(50pmol/(al)、1引物999005(5Opmo11)、5nl含有15mMMgCl2的10XPCR緩沖液、1(ildNTP混合物(每种10mM)、40.25pl水和0.75plDNA聚合酶混合物(3.5U/pl)。使用EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧扩增所述片段，程序为94°C2分钟的l个循环；10个循环每个为94。C15秒、55。C30秒和72。C30秒；15个循环的94°C15秒、55°C30秒和72°C30秒(在每个连续循环递加5秒延长)；72°C7分钟的1个循环；和在10。C保温。通过使用TAE緩沖液联合QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒的1.8%琼脂糖凝胶电泳纯化所得147bpPCR片段，并且根据制造商的说明书将所述147bpPCR产物与pCR2.1-TOPO⑧连接。将lpl体积的新鲜PCR产物、3|il的双蒸水和1pi的TOPO⑧克隆载体用移液器混合，并且在室温温育5分钟。温育之后，使用2^的所述混合物转化ONESHOTTOP10化学感受态大肠杆菌细胞。将2nl体积的连接混合物添加至大肠杆菌细胞并且在冰上保温5分钟。然后，将细胞在42。C热激30秒，其后置于冰上2分钟。将250j^1体积的SOC培养基添加至细胞，并且将混合物在37。C和250rpm温育1小时。温育之后将菌落涂布在每ml补充有100pg氨千青霉素的2XYT平板上并且在37。C温育过夜，以进行质粒选择。用无菌牙签挑取在平板上生长的8个菌落并在装有3ml每ml补充有100|ag氨苄青霉素的LB培养基的15mlFALCON⑧管中在37°C、250rpm培养过夜。使用BioRobot9600分离质粒。用￡coRI消化4jal体积的所得质粒微量制备物。通过琼脂糖凝胶层析来分析消化反应物，如先前关于PCR反应所述。使用1pl质粒模板、1.6ngM13引物(正向的或反向的)，并补水至6pl，对包含插入物的分离的质粒测序。将通过DNA测序确认的所得质粒命名为pBM163a(图10)。为了制备含有四个UAS序列的最终表达载体，将pBM163a用I和爿geI消化，并且将质粒pJLinl68用^geI和历"dIII消化。将132bpSp/zUgeI片段和340bp^geIII片段克隆入之前已经经过Sp/zI和///"dIII消化的细毛嗜热霉变体脂肪酶表达载体pBM143b。将所得质粒命名为pBM165a(图11)。实施例10:JC￡/过表达载体的构建设计了以下PCR引物自酿酒酵母菌抹S288C(ATCC20458)的基因组DNA扩增」C￡/基因。将HI限制位点并入，用于克隆进入表达质粒pBM143b和pJLin195。引物999262:5，-TCATGATACGATCGTGAAAGAATAT-3，(SEQIDNO:44)%别引物999263:5，-TCATGAGGATGATGACAAAGAAGAC-3，(SEQIDNO:45)使用EXPAND⑧高保真PCR系统通过PCR扩增了爿C五/基因片段。使用YEASTARtm基因組DNA试剂盒(ZYMOResearch,Orange,CA，USA)根据制造商的说明书自酿酒酵母菌林S288C分离基因组DNA。PCR反应含有0.1吗酿酒酵母S288C基因组DNA、1]il引物999262(50pmol/nl)、1pi引物999263(50pmol/Vl)、5pi含有15mMMgCl2的10XPCR缓沖液、1^dNTP混合物(每种10mM)、40.25jal水和0.75pi(3.5U/pl)DNA聚合酶混合物，终体积为50nl。使用EPPENDORF⑧MASTERCYCLER⑧扩增所述片段，程序为94°C2分钟的1个循环；10个循环每个为94°C15秒、55。C30秒和72°C1分45秒；15个循环每个为94°C15秒、55°C30秒和72°C1分45秒(在每个连续循环递加5秒延长)；72。C7分钟的1个循环；和在10°C保温。通过使用TAE緩冲液的1.8%琼脂糖凝胶电泳联合QIAQUICK⑧凝胶提取试剂盒纯化所得1589bpPCR片段。将所述1589bpPCR产物与pCR2.1-TOPO根据制造商的说明书连接。通过核苷酸测序确认了命名为pBM168a(图12)的所得质粒。将质粒pBM168a用^s/HI消化，并且将^C￡/基因片段(1583bp)克隆入已经用相同的酶消化的表达载体pBM143b、pJLinl95和pBM165a。用QIAQUICK⑧凝胶提取柱凝胶提取片段。使用快速DNA连接试剂盒根据制造商的说明书将片段连接到一起，其中载体与插入物的摩尔比为1:2、1:1和3:1且载体量为50ng。将所得质粒命名为pBM169a(图13)、pBM171a(图14)和pBM170a(图15)。实施例11:使用pBM143b、pJLinl95、pBM165a、pBM169a、pBM170a和pBM171a的酵母转4H38将质粒pBM143b、pJLin195、pBM165a、pBM169a、pBM170a和pBM171a各自转化入酿酒酵母JG169细胞，其中根据制造商的说明书使用YEASTMAKERtm酵母梓化系统(Clonetech,PaloAlto,CA,USA)。简单来说，使用一个酿酒酵母JG169的菌落接种50ml的YPD培养基，并且在定轨摇床(250rpm)上在30°C温育过夜。当细胞达到0.4-0.5的600nm吸光度时，将细胞在700离心5分钟，弃去上清，并且将沉淀物重悬在30ml去离子水中。在SorvallRT6000D离心机中以700xg离心5分钟之后，将细胞沉淀物重悬于1.5ml1.1XTE/醋酸锂溶液(110mM醋酸锂、11mMTris，pH8、l.lmMEDTA)。在微型离心机中以12,000xg离心15秒之后，将细胞沉淀物重悬在600plUXTE/醋酸锂溶液中。在向50pl感受态细胞添加了约0.5jugpBM143b、pJLinl95、pBM165a、pBM170a或pBM171a,250plPEG/醋酸锂溶液(40。/。PEG4000、0.1M醋酸锂、10mMTris-HCl,pH8、1mMEDTA)和5pl10mg/ml变性HerringTestes(绯鱼精巢)载体DNA之后，将混合物以550rpm在30°C摇动30分钟，并且通过每10分钟进行的颠倒来混合细胞。向每个转化混合物添加总体积20)il的DMSO，并且在42°C温育15分钟，并且每5分钟对混合物进行颠倒。将转化混合物在微型离心机中以12，000xg离心15秒，并且将细胞重悬在1mlYPDPLUSTM液体培养基(YEASTMAKERTMYeastTransformationSystem,Clonetech,PaloAlto,CA,USA)中并且在550rpm和30°C摇动90分钟。离心之后，将细胞用1ml0.9%NaCl溶液洗涤，并且重悬在1ml酵母减ura选择培养基中，其中存在15%甘油。将每个转化反应的50微升一式两份涂布到酵母减ura选择平板上，并且在30。C温育直到菌落出现。使用包含pBM143b、pJLinl95、pBM165a、pBM169a、pBM170a或pBM171a的酿酒酵母JG169转化体接种96孔板中180pl的减ura选择培养基，并且在30°C、250rpm温育过夜。然后将过夜培养物在180pl铜诱导"原始"或"最优，，培养基中稀释100倍，并且在30。C培养5天。使用对硝基苯基丁酸酯(pNB)作为底物在以下测定法中测量培养物上清的脂肪酶活性首先将培养物上清以1/15倍稀释在0.1MMOPS、4mMCaCl2、0.01%TritonX-100緩冲液、pH7.5(样品緩冲液)中，接着是从稀释样品的0倍到1/3倍到1/9倍的系列稀释。将LIPOLASETM标准品(NovozymesA/S,Bagsv《rd，Denmark)在样品缓冲液中使用两倍步骤稀释，从1.0LU/ml39浓度开始，至0.125LU/ml浓度结束。将总共20ial的每种稀释液(包括标准品)转移至96孔平底板。向每孔添加200^f鼓升对硝基苯基丁酸酯底物溶液(对硝基苯基丁酸酯:DMSO:0.1MMOPSpH7.5的比例为1:99:400),然后在25°C温育15分钟。温育完成之后，测量96孔平板在405nm的吸光度。通过从生成的标准曲线进行外推来确定样品浓度。对于摇瓶分析，将代表转化体接种入2ml减ura选择培养基并且在30。C、250rpm温育过夜。然后将过夜培养物在125ml玻璃摇瓶中的25mlCUP减ura培养基中稀释200倍，并且在30。C培养6天。收获样品，在微型离心机中以12,000xg离心10秒，并且使用上文所述的对硝基苯基丁酸酯测定法测试上清液的脂肪酶活性。将IO微升的培养物上清与Laemmli样品緩冲液(Bio-RadLaboratories,Inc.:Hercules,CA,USA)以1:2比例混合。煮沸2分钟之后，将样品连同15|ilPRECISIONPLUSPROTEIN"TM标准品(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA:USA)加载到10-20%SDS-PAGE凝胶(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)上。在IXTris-甘氨酸-SDS电泳緩冲液(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)中以200V运行凝胶1小时。然后将凝胶用水漂洗3次，每次5分钟，并用BIO-SAFETM考马斯染料(Bio-RadLaboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)染色1小时，接着用水脱色至少30分钟。将包含pBM143b、pJLinl95、pBM169a或pBM171a的酿酒酵母JG169转化体(每种质粒24个)在96孔板中的"原始"含铜培养基中培养5天。使用对硝基苯基丁酸酯作为底物如上所述测定培养液样品中的脂肪酶活性。pBM143b、pBM169a、pJLinl95和pBM171a转化体的平均相对脂肪酶活性分别是100、202、196和506，如表I所示。表I.<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表I中显示的结果说明了通过用高拷贝质粒过量产生Acelp转录激活子，使细毛嗜热霉变体脂肪酶表达水平加倍。已经显示对于生长在含有琥珀酸作为緩沖剂和半乳糖和葡萄糖的混合物作为主要碳源的"最优"培养基中的转化体，酵母转化体中的细毛嗜热霉变体脂肪酶活性得到了改进。为了测试过量产生Acelp的转化体中细毛嗜热霉变体脂肪酶表达水平是否能够在"最优，，培养基中进一步提高，从生长在96孔平板中"原始"或"最优"含铜培养基中的含有pBM143b、pJLinl95、pBM169a或pBM171a的酿酒酵母菌林JG169转化体测量了细毛嗜热霉变体脂肪酶活性。如上所述评估全部四种表达质粒。在"原始"培养基中pBM143b、pBM169a、pJLinl95或pBM171a转化体的平均相对脂肪酶活性分别为100、190、170和402。生长在"最优"培养基中的pBM143b、pBM169a、pJLinl95或pBM171a转化体的平均相对脂肪酶活性分别为240、318、285和266,如表II所示。从全部质粒观察到了生长在"最优"培养基中的转化体的整体表达较高。将质粒pBM143b与质粒pBM169a比4交时，Acelp过表ii^"细毛嗜热霉变体脂肪酶的产生的作用高大约30%。然而，在"最优"培养基中从pBM171a过表达爿C5/基因与p几inl95相比导致细毛嗜热霉变体脂肪酶表达的少量降低。表II<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>在摇弁瓦中评估了细毛嗜热霉变体脂肪酶自pBM143b、pJLinl95、pBM169a或pBM171a的表达。将每种质粒的两个代表转化体培养在一式两份25ml摇瓶培养基中，其中使用"原始"或"最优，，培养基。在第4曰、第5日和第6日收获摇瓶样品。使用上文所述的对硝基苯基丁酸酯测定法测定第5日样品的上清的细毛嗜热霉变体脂肪酶活性。在摇瓶中，由于」C￡7基因过表达的作用，在将"最优培养基"中的pBM143b与pBM169a比较时，细毛嗜热霉变体脂肪酶的表达高大约U倍，相比之下，在将"原始，，培养基中的pBM143b与pBM169a比较时，细毛嗜热霉变体脂肪酶的表达高大约1.6倍。此外，"原始"培养基中自pBM171a过表达的」C57基因与自pJLinl95相比产生了表达上大约3.5倍的增加，而在"最优"培养基中观察到了表达上1.6倍的减少，如表m所示。在两种培养基中pBM171转化体的相对表达水平是相同的，而在pJLinl95转化体中脂肪酶表达水平在"最优"培养基中明显更高。通过增加的培养物浊度(OD600)监控培养，并且通过涂布在琼脂培养基上来测定总CFU/ml。通常，"原始"培养基中的细胞的生长至少是"最优"培养基中生长的细胞的两倍那么快，可能是由于对葡萄糖作为碳源的偏好。通过显微观察，"最优"培养基中生长的酵母细胞表现出因大液泡而膨胀(bloat),与"原始，，培养基中生长的酵母细力包相比液泡大小增加为至少三4咅。表m质粒野生型启动子额外的信号ACE1培养基相对UAS序列UAS序列序列活性pBM143b20野生型无原始100pJLinl9520变体无原始162pBM169a20野生型有原始162pBM171a20变体有原始566pBM143b20野生型无最优174pJLinl9520变体无最优240pBM169a20野生型有最优190pBM171a20变体有最优465如上所述，进行了SDS-PAGE，对于来自代表性摇瓶的上清和细毛嗜热霉变体脂肪酶条带的强度与对硝基苯基丁酸酯测定法结果一致。将质粒pBM165a和pBM170a转化入酿酒酵母JG169细胞，如上所述。选择转化体(每种质粒24个)并且如上所述在％孔板中的"原始"培养基中培养。结果证明了在"原始，，培养基中pBM165a、pBM170a和pBM169a转化体的平均相对脂肪酶活性分别为100、277和173，如表IV所示。42表IV<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>通过加倍Acelp转录因子的主要结合位点，并且通过从多拷贝质粒增加爿C^/基因的表达，在96孔板中观察到了细毛嗜热霉变体脂肪酶表达1.6倍的;t曽力口。本文描述和要求保护的发明并不受限于本文所公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案意欲作为本发明几个方面的说明。任何等价的实施方案意欲在本发明的范围之内。实际上，从前面的说明中，除本文所显示和描述的之外，本发明的多种修改对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这些修改也意欲落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，将以包括定义部分的本7>开为准。本文引用了包括登录号的多篇参考文献，其公开的内容通过引用整体并入。权利要求1.一种用于产生多肽的方法，其包括(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。2.权利要求1的方法，其中所述铜诱导型启动子序列是从选自下组的基因获得的酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酉良酒酵母胞质过氧化氢酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因、光滑念珠菌金属硫蛋白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉(Jamw'aZ^o/,'ca)金属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属疏蛋白基因和鹅柄孢壳菌金属硫蛋白基因。3.权利要求l的方法，其中所述一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列是从选自下组的基因获得的酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酿酒酵母胞质过氧化氬酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因、光滑念珠菌金属硫蛋白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉金属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属硫蛋白基因、鵝柄孢壳菌金属硫蛋白基因，和它们的组合。4.权利要求l的方法，其中所述一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列是SEQIDNO:46和/或SEQIDNO:47。5.权利要求l的方法，其中所述铜依赖性反式作用转录因子基因选自下组酿酒酵母^CW基因、光滑念珠菌^M77基因、解脂西洋蓍霉CRF1基因(登录号P45815)、粟酒裂殖酵母CUF2基因(登录号094588)、酿酒酵母HAA1基因(登录号Q12753)和烟曲霉(A/e^7/w/wm/ga^s)铜拳DNA结合域蛋白基因(登录号Q4WN33)。6.权利要求l的方法，其中所述真菌宿主细胞包含一个或多个(几个)拷贝的第一多核苷酸。7.权利要求l的方法，其中所述多肽选自下组抗原、酶、生长因子、激素、免疫调节剂、神经递质、受体、报道蛋白、结构蛋白和转录因子。8.权利要求1的方法，其中所述多肽是白蛋白、胶原、原弹性蛋白、弹性蛋白或明胶。9.权利要求1的方法，其中所述多肽对于所述真菌宿主细胞是天然的或外源的。10.权利要求l的方法，其中所述第一和第二多核苷酸包含在所述真菌宿主细胞的染色体中或在染色体外元件上。11.权利要求1的方法，其中所述第三多核香酸包含在所述真菌宿主细胞的染色体中或在染色体外元件上。12.权利要求1的方法，其中所述真菌宿主细胞是丝状真菌或酵母细胞。13.通过权利要求1-12中任一项的方法获得的多肽。14.一种核酸构建体，其包含含有编码多肽的核酸序列的第一多核苷该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源15.权利要求14的核酸构建体，其中所述铜诱导型启动子序列是从选自下组的基因获得的酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酿酒酵母胞质过氧化氬酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因、光滑念珠菌金属硫蛋白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉(&m3w/a/^0/^/ca)金属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属硫蛋白基因和鵝柄孢壳菌金属硫蛋白基因。16.权利要求14的核酸构建体，其中所述一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列是从选自下组的基因获得的酿酒酵母金属硫蛋白基因、酿酒酵母超氧化物歧化酶基因、酿酒酵母胞质过氧化氬酶基因、酿酒酵母铜耐受抑制基因、光滑念珠菌金属硫蛋白基因、粗糙脉孢菌金属硫蛋白基因、解脂西洋蓍霉金属硫蛋白基因、双孢蘑菇金属硫蛋白基因、灰梨孢菌金属硫蛋白基因、鵝柄孢壳菌金属硫蛋白基因，和它们的组合。17.权利要求14的核酸构建体，其中所述一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列是SEQIDNO:46和/或SEQIDNO:47。18.—种重组表达载体，其包含权利要求14-17中任一项的核酸构建体。19.一种重组真菌宿主细胞，其包含权利要求14-17中任一项的核酸构建体和第三多核苷酸，所述第三多核苷酸包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因。20.权利要求19的重组真菌宿主细胞，其中所述铜依赖性反式作用转录因子基因选自下组酿酒酵母^CS/基因、光滑念珠菌^W77基因、解脂西洋蓍霉CRF1基因(登录号P45815)、粟酒裂殖酵母CUF2基因(登录号094588)、酿酒酵母HAA1基因(登录号Q12753)和烟曲霉(^"/e/^7/w/ww'go^s)铜拳DNA结合域蛋白基因(登录号Q4WN33)。全文摘要本发明涉及产生多肽的方法，包括(a)在有益于产生所述多肽的培养基中培养真菌宿主细胞，其中所述真菌宿主细胞包含含有编码所述多肽的核酸序列的第一多核苷酸，其与包含铜响应性上游激活序列的铜诱导型启动子序列可操作地连接，该上游激活序列通过铜依赖性反式作用转录因子激活；和第二多核苷酸，其包含可操作地连接于所述启动子序列上游的一个或多个(几个)额外的铜响应性上游激活序列，其中所述启动子序列对于编码所述多肽的核酸序列是外源的，并且所述铜响应性上游激活序列负责该启动子序列的铜诱导型转录；和第三多核苷酸，其包含至少一个拷贝的编码铜依赖性反式作用转录因子的基因；和(b)从培养基分离所述多肽。文档编号C12N15/81GK101512001SQ200780033608公开日2009年8月19日申请日期2007年7月13日优先权日2006年7月14日发明者巴巴拉·彻里,戴比·亚弗,马兹·E·比约恩瓦德申请人:诺维信股份有限公司;诺维信公司