利用蛋白酶和蛋白酶抑制剂分析预测心肌梗塞后的心力衰竭的制作方法

专利名称：利用蛋白酶和蛋白酶抑制剂分析预测心肌梗塞后的心力衰竭的制作方法
利用蛋白酶和蛋白酶抑制剂分析预测心肌梗塞后的心力衰竭相关申请的交叉引用
本申请要求享有2006年7月11日提交的美国临时申请No. 60/819, 988和2007年3月8日提交的美国临时申请No. 60/893, 807的权益，上述申请均通过引用的方式全文纳入本申请。
联邦资助研究相关声明
本发明是在美国国立心肺血液研究所资助的第P01-HL48788、R01-HL-59165和M01-RR-01070-251号合同以及退役军人事务部(Department of Veterans Affairs )研究部门资助的第VA Grant Spinale001号合同的政府资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术：
心肌梗塞(MI)后一个重要的结构事件是LV重构，其一般可被定义为导致心肌几何形状改变从而随后导致LV容积改变的心肌壁细胞和胞外构成的改变(Erlebacher JA， et al. 1984; Pfeffer MA， et al. 1990; St.John Sutton M, et al. 1994)。已经确i人该MI后重构过程的速率和程度为发病率和死亡率的独立预测指标(White HD， et al. 1987;Chareonthaitawee, P, et al. 1995)。因此，识另'J出现MI后重构的最大危险的那些患者和认清导致MI后重构的基本机理具有重大的诊断/治疗相关性。然而，此前还没有可识别出现MI后重构的最大危险的患者的可用方法。

发明内容
根据本发明的目的，如本文所具体体现并广泛描述的，本发明涉及一种检测或预测受试者舒张性心力衰竭的方法，包括从受试者体液中鉴定基质金属蛋白酶(醒P)和基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMP)的镨，所述语
4在本文中与可能发生左心室扩张(LVD)相关。
本申请公开的方法和组合物的其他优点将部分通过下述说明书加以阐释，部分通过说明书理解得到，或者可通过实施本申请公开的方法和组合物获悉。本申请公开的方法和组合物的优点可通过随附的权利要求中特别指出的要素和组合实现和获得。应理解，前文的总体描述和下文的具体描述均仅为示例性和解释性的，对所要求保护的发明并无限制作用。


附图被纳入本说明书并构成本说明书的一部分，附图示出了所公开的方法和组合物的几个实施方案，并与说明书相结合以阐明所公开的方法和组合物的原理。
图1示出了在MI后患者(n-32)中检测的LV舒张末期容积(上图)和射血分数(下图)。LV舒张末期容积在MI后第1天就相对参照对照受试者增大并在整个180天的研究期间保持提高。至MI后第28天，LV舒张末期容积相对于MI后第1天的值有所增加(p=0. 027)。尽管LV扩张发生在MI后，但是LV射血分数在MI后的早期有轻微但是明显地增加，然后在MI后研究期间下降到参照对照值范围内。灰度表示参照对照范围(平均值+SEM) 。 *相对于参照对照值，p<0. 05。
图2示出了在MI后患者中进行一 系列测量得到的代表性醒P的血浆水平。在MI后患者的血浆中醒P-2的前体形式(proform)相比参照正常受试者下降。血浆醒P-7在整个随访期间都保持在正常范围内。腿P-8水平在初始测量时间点增加，然后在MI后第3天再次出现波峰。醒P-9水平在MI后的28天中是提高的。(相对于正常参照范围，p<0.05)
图3表示对血浆样本进行的明胶酶谱法，表明指示醒P-9的92 kDa的条带在MI后28天中相对增加(上图)。在所有血浆样本中都检出了代表醒P-2的较低分子量的72 kDa的条带。在MI后的第28天观察到其相对水平微小但明显的增加(下图)。(*相对于被设定为100%的正常值，p<0. 05)
图4示出了血浆TIMP-1水平在所有MI后时间点都相对参照正常值增加。TIMP-2水平在MI后第28天增加并在剩余的随访期间保持提高。TIMP-4水平在MI后第5天明显降低，之后也未恢复到参照正常值范围内。MMP-9/TIMP-4比值在MI后的28天中证明是增加的。(相对于正常参照范围，p<0.05)
图5示出了从MI后第l天到第5天血浆醒P-9水平变化的各个反应曲线图(上图)。在此期间出现了各个薩P-9水平的混杂反应，因此各个反应被计算为相对MI后第1天的值的变化百分比。然后将这些值与MI后第28天的LV舒张末期容积的变化联系起来(下图)。对于丽P-9水平在MI后第5天持续提高或增加的患者，LV舒张末期容积在第28天有极大的增加。"相对于醒P-9水平无变化，p<0. 05)
图6示出基于MI后第l天到第5天MMP-9水平增加35。/。，将血浆醒P-9水平的早期变化的相对幅度分级。对于血浆MMP-9水平相对于MI后第一天的值进一步增加的那些患者，LV舒张末期容积更大的变化百分比出现在MI后第90天。"相对于醒P-9水平变化<35%， p<0. 05)
图7(上图)示出了对HOCM患者的中隔动脉穿支(septal perforatorartery)进行酒精注射后血浆总肌酸激酶(CK)浓度的变化百分比。血浆CK水平的峰值出现在注射后10-20小时。图7 (下图)示出了酒精注射后CK MB1同种型血浆浓度的变化百分比。在酒精注射后4小时检出CK-MB1血浆水平的明显增加，并一直增加至24小时。(*相对于时间为0的基线值，p<0. 05)
图8 (上图)示出在酒精注射后4小时观察到顧P-2血浆水平相对于基线微小但明显的改变。图8 (下图)示出血浆醒P-9水平在酒精注射后发生了明显的增加，并且在注射后出现最长达50小时的平台期。(*相对于时间为O的基线值，p<0. 05)
图9 (上图)示出血浆醒P-8水平在对HOCM患者的中隔动脉穿支进行酒精注射后以时间依赖的方式增加最长达24小时，且在酒精注射后的平台期的时间更长。(下图)在酒精注射后的早期检出了血浆醒P-13水平的下降，这在24小时时很明显。(*相对于时间为0的基线值，p<0. 05 )
图10 (上图)示出血浆TIMP-1水平在酒精注射后没有立即改变，但在晚一些的时间点有增加的趋势，但是这种趋势没有统计学意义。=0.15)。图IO(下图)示出对每位患者都计算出其血浆醒P-9/TIMP-l水平的比值，并标绘成相对基线值的变化。到酒精注射后6小时，该比值出现明显的增加。(*相对于时间为0的基线值，p<0.05)
6图ll示出对每名患者(n=51)的血浆肌酸激酶MBl部分和醒P-9水平计算血浆浓度-时间曲线下的面积(AUC)。在这两个参数之间发现有明显的线性关系。
图12A示出代表性免疫印迹结果，其示出了三个正常患者(Nl、 N2和N3 )和两个H0CM患者(H0CM1和H0CM2 )在酒精注射后基线(0) 、 10、20、 30和60小时其血浆样本中TIMP-4的相对水平。人类TIMP-4重组标准品(S)被用作抗体特异性的阳性对照。所述免疫印膜同5 pg/mL与糖基化(29kDa)和非糖基化(23kDa)形式TIMP-4的Loop 2的肽序列相对应的抗血清一起赙育。图12B示出两份免疫印膜与一抗的替代物一起孵育，导致对应TIMP-4的条带完全消除。图12C示出制备血浆样本的电泳胶，并对糖基化蛋白染色。在29 kDa可识别出糖基化条带。
图13示出HOCM患者的血浆TIMP-4水平相对于参照正常值的变化百分比。插图是非糖基化(23kDa)和糖基化(29 kDa)形式TIMP-4的代表性免疫印迹结果。不管非糖基化还是糖基化形式的TIMP-4,在HOCM患者中都观察到TIMP-4水平相对于参照正常值增加(正常11=18; H0CMn=16)。数据以平均值士SEM表示。(*相对正常水平，p<0. 05)
图14示出在酒精注射前后取得的H0CM患者血浆样本的TIMP-4水平的光密度分析结果。值以相对基线的变化百分比的形式给出。插图是非糖基化(23kDa)和糖基化(29 kDa)形式TIMP-4的代表性免疫印迹结果(n=16)。图14A示出非糖基化TIMP-4水平在酒精注射后30小时相对基线和10小时的时间点出现降低。图14B示出糖基化TIMP-4水平在30和60小时相对基线降低。图14C示出综合糖基化和非糖基化形式的TIMP-4，总TIMP-4的柱状图说明TIMP-4水平在酒精注射后30小时出现相似的降低。数据以平均值士SEM表示。(*相对基线，p<0.05。 #相对10小时，p<0.05。)
图15示出以标准化TIMP-4 IOD值的平均值表示的按性别分组比较的免疫印迹结果。柱状图代表非糖基化和糖基化形式TIMP-4的性别差异。图15 (左图)示出不管性别，H0CM组的非糖基化TIMP-4 IOD值都较高。TIMP-4水平在H0CM女性和H0CM男性之间也有显著差异。图15 (右图)示出不管性别，H0CM组与正常组相比其糖基化TIMP-4水平都较高。还观察到正常男性与正常女性相比其糖基化TIMP-4水平较高。数据以平均值士SEM表示。(*相对正常女性组，p<0. 05。 #相对正常男性组，p<0.05。
+相对冊04女性组，p<0. 05。)
图16表示对心肌梗塞预后和治疗的薩P和TIMP算法。
图17表示通过多重分析测定的醒P-9、醒P-13、 TNF-oc和IL-6的校
准曲线。
具体实施例方式
参照以下对纳入本文中的具体实施方案和实施例的详细描述，并参照 附图和其相关的前后文描述，可更容易地理解所公开的方法和組合物。
公开了可用于所公开方法和组合物的、可与所公开方法和组合物一 起使用的、可用于制备所公开组合物的和作为所公开方法和组合物的产 品的物质、组合物和组分。在本文中7>开了这些物质和其他物质，应当 理解的是，在公开这些物质的组合、子集、相互作用和群组等时，尽管 关于这些化合物的每种具体的不同的个体和集体的组合和排列可能并未 明确地公开，但每种都在此^L特别地考虑和描述。例如，如果公开和讨 论了 一种肽，并且讨论了可以对包括该肽在内的许多分子进行的许多修 饰，则除非特别相反指明，肽的每种和各种组合和排列以及可能的修饰 均得到特别地考虑。因此，如果公开了一类分子A、 B和C，并且还公开 了 一类分子D、 E和F以及一个组合分子的实例A-D，则即使没有每个逐 一列举，每个组合分子也单独和共同得到考虑。因此，在这个实例中， 组合A-E、 A-F、 B-D、 B-E、 B-F、 C-D、 C-E以及C-F中的每种也被特别 地予以考虑，并且认为上述每一个组合也因为A、 B和C; D、 E和F;以 及实例组合A-D的公开而被公开。同样，这些分子的任何子集或组合也 被特别地予以考虑和公开。因此，例如，A-E、 B-F和C-E的子群也被特 别地考虑，并被认为因为A、 B和C; D、 E和F;以及实例组合A-D的公 开而被公开。将这一概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于制备 和应用所^Hf组合物的方法中的步骤。因此，如果有可以实施的多个其 他步骤，则应当理解的是，所述其他步骤的每一步都可以用于所公开方 法的任何具体实施方案或实施方案的组合，并且每种这样的组合都被特 别地予以考虑和被认为公开了 。
本领域技术人员仅仅通过常规实验就可意识到或者能确定本文所述方法和组合物的具体实施方案的许多等同方案。下文的权利要求意在涵盖 这类等同方案。
应理解，所公开的方法和组合物不限于所描述的具体方法、方案和试 剂，它们可以有变化。还应理解，本文所用术语旨在仅描述特定的实施方 案，而非意在限制本发明的范围，本发明的范围只由随附的权利要求限定。
除非另外清楚说明，本文所述的任何方法都不应被解释为，需要按特 定的顺序实施其步骤。因此，当一个方法权利要求未实际述及其步骤所遵 循的顺序，或者未在权利要求或说明书中特别说明该步骤限于特定顺序， 则在任何方面都不应认为存在某种顺序。这一点适用于任何可能的用于解
释的未说明的基础，包括步骤或操作流程设置相关的逻辑关系、源于语 法结构或标点的明显语义，以及说明书中记载的实施方案的数目和类型。 更具体而言，已被测量含量的醒P和TIMP的测量值可以是以任何顺序测 得。
A.定义
除非另有定义，本文使用的所有技术术语和科学术语均具有与所公开 的方法和组合物所属领域技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在实
或等同的任何方法和材料，但特别有用的方法、装置和材料如所描述的那
入本说明书。本文的任何内容均不应被解释为承认本发明未被赋予优先于 现有技术中的这类公开内容的权利。未承认任何参考文献构成现有技术。 参考文献中的讨论陈述了其作者所声称的内容，申请人保留质疑所引用的 文献的准确性和相关性的权利。
应注意，除非上下文中另外明确指出，本文以及后附权利要求书中使 用的单数形式的"一"、"一种"和"该"包括复数指代对象。因此， 例如，"一种肽"的指代对象包括多种这类肽，"该肽"的指代对象指 代一种或更多种肽及本领域技术人员已知的其等同物等等。
"任选的"或"任选地"意为后面描述的事件、情况或物质可能或 也可能不出现或存在，这样的描述包括所述事件、情况或物质出现或存 在的情况和所述事件、情况或物质不出现或不存在的情况。
9本文中范围可以表示为从"大约" 一个具体的数值，和/或至"大约" 另一个具体的数值。当表示为这种范围时，另一个实施方案包括从所述 的一个具体的数值和/或至所述的另一个具体的数值。类似地，当通过在
前面使用"大约"将数值表示为近似值时，应当理解的是，该具体的数 值构成另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点在与另 一个端点相关和独立于另一个端点时都是有意义的。还应当理解的是此 处公开了许多数值，且除了数值本身外每一个数值在此还被公开为"大
约"该具体数值。例如，如果公开了数值"10"，那么也公开了 "大约 10"。还应当理解的是，当公开了一个数值时，也公开了 "小于或等于"
该数值，"大于或等于该数值"以及数值间可能的范围，这正如本领域
技术人员所恰当理解的。例如，如果公开了数值"10"，也就公开了 "小 于或等于10"以及"大于或等于10"。还应理解，在整个本申请中，以
多种不同格式提供数据，该数据代表了端点和起点，以及这些数据点的
任何组合的范围。例如，如果公开了具体数据点"10"和具体数据点15， 应该理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15，以及 10和15之间的数值也认为已经被公开。还应理解的是两个特定单元之间 的每个单元也都被>^>开了。例如，如果10和15被^^开了，那么11、 12、 13和14也都被公开了。
在本申请的说明书部分和权利要求部分的通篇中，词语"包括"及其 变形(例如"包含，，和"含有")的含义为"包括但不限于"，并不意在 排除例如其它的添加物、组分、整数或步骤。
"受试者"包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生虫和任何 其他具有核酸的生物或实体。所述受试者可以是脊堆动物，更具体而言 可以是哺乳动物(例如，人类、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人类 灵长类、牛、猫、豚鼠或啮齿动物)、鱼、鸟或爬行动物或两栖动物。 所述受试者可以是无脊推动物，更具体而言可以是节肢动物(例如，昆 虫和曱壳动物)。该术语并不指明特定的年龄和性别。因此，该术语意 欲涵盖雄性或雌性的、成年的和新生的受试者以及胎儿。患者是指患有 一种疾病或病症的受试者。术语"患者"包括人类或兽医学的受试者。
本文定义的"样本"是指由一种生物体获得的任何样本。生物样本 的实例包括体液和组织标本。所述样本的来源可以是生理介质，例如血
10液、血清、血浆、母乳、脓、组织刮屑、洗液、尿、组织，例如淋巴结 等等。
本申请通篇引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用的方 式全文纳入本申请，以便更充分地描述与本发明所属的现有技术状况。所 公开的参考文献中倚赖所述参考文献的句子中所论述的素材也通过引用 的方式单独地并特别地纳入本说明书。
B.方法
1. 舒张性心力衰竭
本发明提供一种检测或预测患者舒张性心力衰竭的方法，包括从受试 者体液中鉴定基质金属蛋白酶(醒P)和基质金属蛋白酶的组织抑制剂 (TIMP)的镨，所述谱在本文中与可能发生左心室扩张(LVD)相关。
心肌梗塞(MI;心脏病发作)后的一个基本事件是被称为LV重构的 左心室(LV)结构组成的改变。这是一个涉及细胞和胞外过程的复杂过 程，它是LV中的几何形态改变的综合结果，因此可通过若千影像方法检 测。在MI后的时期中的时间点对某些蛋白质水解酶的血浆谱进行测量， 可提供这一基本重构过程相关的诊断和预后信息。 一种更常见的检测LV 重构的显像模式是超声波心动描记。因此，为了验证本申请所述的血浆 谱，对MI后患者进行一系列超声波心动描记并通过一个常见的临床量度 LV容积来估计LV重构程度。如果MI后患者发生明显的基本LV重构，那 么LV容积会增加，这通常被称为LV扩张。因此，对于本申请而言，这 些血浆试验能够预测MI后患者的基本LV重构的根本证据是通过超声波 心动描记检测的LV扩张。然而，LV重构的结果量度也可包括其他显像模 式例如放射性核素成像、心室造影、磁共振、正电子发射断层扫描、CT 扫描。
2. 醒P
基质金属蛋白酶(醒P)是锌依赖性内肽酶；其他的家族成员有蛇毒 蛋白酶、沙雷菌蛋白酶(serralysin)、虾红素。醒P属于一个被称为 metzincin超家族的较大的蛋白酶家族。
醒P之间共享一种共有的结构域结构。三种共有结构域为前肽、催化 结构域和通过柔性铰链区与催化结构域相连的血红素结合蛋白样
ii((haemopexin-like ) ) C末端结构域。
MMP最初是作为具有前肽结构域的无活性酶原合成的，所述前肽结构 域须在酶激活前除去。所述前肽结构域是"半胱氨酸开关"的一部分， 所述"半胱氨酸开关"包含可与活性位点中的锌相互作用并阻止底物结 合和切割以保持酶处于无活性形式的保守性半胱氨酸残基。多数醒P中， 所述半胱氨酸残基位于保守序列PRCGxPD中。某些匪P具有激素原转化 酶切割位点(弗林蛋白酶样)作为该结构域的一部分，它在被切割时会 激活该酶。醒P-23A和醒P-23B在该结构域(PMID 10945999 )中包括跨膜区段。
多种MMP的催化结构域的X射线晶体结构已证明该结构域是测量值为 35 x 30 x 30 A (3. 5 x 3 x 3 nm)的扁圆球体。活性位点是一个穿过催化结 构域的20 A(2 nm)的沟。在所述催化结构域的形成该活性位点的部分中 存在催化上非常重要的Zn2+离子，该离子与存在于保守序列HexxHxxGxxH 中的三个组氨酸残基结合。因此，该序列为锌结合基序。
明胶酶(例如醒P-2)含有插入到该催化结构域(PMID 12486137)中锌 结合基序正前位的II型纤连蛋白结构功能域(module)。
所述催化结构域通过柔性铰链区或接头区与C末端结构域连接。它最 多达75个氨基酸长并且具有不确定的结构。
所述C末端结构域具有与血清蛋白质血红素结合蛋白类似的结构。它 有四个叶片状P螺旋浆结构。P螺旋浆结构提供了一个大的平坦表面，该 表面被认为参与蛋白-蛋白的相互作用。这也决定了底物特异性，并且成 为与TIMP相互作用的位点。MMP-7、醒P-23和醒P-26以及植物和线虫中 不存在血红素结合蛋白样结构域。MT-醒P通过该结构域锚定在质膜上，某 些MT-醒P具有胞质结构域。
MMP可以,皮以多种不同方式细分。通过将生物信息学方法用于比较 MMP的一级序列，可提出以下醒P的演化分组匪P-19;醒P 11、 14、 15、 16和17;腿P-2和醒P-9;所有其他醒P。
对各催化结构域的单独分析表明，当主要类别分化时，催化结构域也 会进一步演化，这也称之为酶的底物特异性。(醒P生物学研究人员)最 常用的分类，部分地基于对醒P底物特异性的组织学评价，部分地基于对 醒P的细胞定位。这些类别有胶原酶、明胶酶、基质降解酶和膜型醒P
12(MT-醒P)。逐渐地发现这些分类有一定的人为因素，因为还存在许多不 适于分到任何常规类别的MMP。
胶原酶能够将三螺旋纤维胶原降解为有区别的3/4和1/4片段。这些 胶原是骨和软骨的主要成分，并且MMP是唯一 已知的能降解所述胶原的哺 乳动物酶。 一般地，所述胶原酶为醒P-1 (小肠胶原酶)、MMP-8 (中性粒 细胞胶原酶)、MMP-13 (3型胶原酶)、MMP-18 (4型胶原酶，xco14,非 洲蟾蜍胶原酶。未知的人类正向同源物)、MMP-14 (MT1-醒P)也已经被 表明可切割纤维胶原，更有争议的是，有证据表明醒P-2能够溶解胶原。
基质降解酶显示出广泛地切割胞外基质蛋白的能力，但它不能切割三 螺旋纤维胶原。这类酶的三个标准成员为醒P-3 (基质降解酶1 )、醒P-IO (基质降解酶2)和醒P-ll (基质降解酶3)。醒P-ll显示出与MT-醒P 更相似，它可被转化酶激活，因此其分泌通常与转化酶可激活的醒P相关。
基质溶解素类包括醒P-7 (基质溶解素，PUMP)和應P-26 (基质溶解 素-2， endometase)。
明胶酶的主要底物为IV型胶原和明胶，这些酶的特点在于在催化结 构域中插有附加的结构域。明胶结合区位于锌结合基序正前方，并形成独 立的折叠单元，该单元不会破坏该催化结构域的结构。这一亚类的两个成 员是醒P-2 (72 kDa明胶酶，明胶酶-A)和MMP-9 (92 kDa明胶酶，明胶
分泌的腿P包括醒P-ll (基质降解酶3 ) 、 MMP-21 ( X-醒P )和MMP-28 (上皮水解素(Epilysin))。
膜结合MMP包括II型跨膜半胱氨酸阵列醒P-23、糖基磷脂酰肌醇结 合的應P 17和25 (分别为MT4-醒P和MT6-MMP )以及I型跨膜MMP14、 15、 16、 24 (分另'J为MT卜MMP、 MT2-MMP、 MT3-MMP和MT5-醒P )。
所有6种MT-醒P在前肽中均有弗林蛋白酶切割位点，MMP-ll也具有 这一特征。
其他的MMP包括醒P-12 (巨噬细胞金属弹性蛋白酶)、薩P-19 (RASI-I 有时也称为基质降解酶-4)、釉质溶解素(En認elysin )(醒P-20)和醒P-27 (MMP-22， C-醒P)， MMP-23A (CA-醒P)和醒P-23B。
3. TIMP
醒P可被特定的内源金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)抑制，TIMP包
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说明书第ll/75页
括一个四种蛋白酵抑制剂的家族TIMP-1、 TIMP-2、 TIMP-3和TIMP-4。 总地来说，所有的醒P—旦被激活，都可被TIMP抑制，但明胶酶(醒P-2 和醒P-9 )处于其前体形式时可与TIMP形成复合体。前体形式的醒P-2 (醒P-2酶原)与TIMP-2的复合体可促进一种膜锚定醒P即MT卜醒P (醒P-14)激活细胞表面的醒P-2酶原。
4. 醒P/TIMP之比
心肌梗塞和高血压性心脏病的匪P-TIMP作谱的一个独特特征是，利 用了心脏特异性TIMP即TIMP-4，并将其置于含有在心肌梗塞和高血压性 心脏病患者中发生更显著变化的醒P的环境中。还公开了丽P(例如醒P-9 或醒P-13)与TIMP (例如TIMP-1、 TIMP-2或TIMP-4 )的比值。具体地， 腿P-9/TIMP-4之比在心肌梗塞患者中增加了超过100%，而在高血压性患 者中则降低了超过50%。而且，如实施例l所示，醒P-8水平在MI后的早 期增加。TIMP-4水平的实际情况是在该MI后的早期降低。因此， 醒P-8/TIMP-4之比会增加，并提供关于在这些患者中发生的不利心肌重构 的相对程度的进一步定量信息。这些比率和TIMP-4在本发明中被首次用 作诊断鉴别工具，并且被用来鉴别具有明显不同疾病状态的患者。
5. 血浆筛选
本发明教导的主要优点是，该血浆筛选提供了一种识别在MI后有出 现不利LV重构的风险的患者以及识别该过程正加速出现的患者的更快速 简单的方法。因此，本文公开的方法可包括检测受试者体液中的醒P和 TIMP，所述体液例如有血、尿、血浆、血清、目艮泪、淋巴、胆汁、脑脊液、 间质液、房水或玻璃体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛门和阴道分泌物、 汗、精液、漏出液、渗出物和滑液。
血浆是血液的液体成分，其中悬浮有血细胞。血浆是血液最主要的 单一成分，它占总血液体积的约55%。血清是指已去除凝血因子(例如纤 维蛋白)的血浆。血浆含有许多重要的蛋白质，包括血纤蛋白原、球蛋 白和人血清白蛋白。有时，血浆可能含有必须通过病毒处理来除去的病
毒杂质。
至少有2种方法可评价体液(如血浆)中特异醒P或TIMP的水平。 例如，得自MI后患者的醒P/TIMP水平可与参照正常值比较。然后将相对 于正常值的变化百分比用于一种预测算法(predictive algorithm),如图5和图6所示。例如，MMP-9在MI后早期的升高可用于预测患者是否将 要发展为更为严重形式的心室重构和心力衰竭。
实施例1中给出的一种替代但不必然互相排斥的方法是在MI后以特 定的时间间隔检测醒P/TIMP水平。这需要在MI后早期时间点(72小时 内)检测，然后进行后续临床例行检测(5-7天)。这些很容易获得，因 为在MI后患者的这些时间点采集血样是作为日常临床化学检测的一部分 例行的。随后廳P/TIMP水平改变的相对幅度可用于预测算法。
在特定时间点获得检测结果和使用参照对照的方法、或评价个体患 者的系列检测结果的方法可应用到所有识别的MMP/TIMP分析物。
就这种针对MI后的时期里对MMP进行分析的方法的临床应用而言， 有三类主要的用途诊断、预后和指导治疗干预。
6.免疫测定
本领域中存在许多已知的或新发现的用于检测例如蛋白质(如腿P 和TIMP)的分析物的方法，它们可用于本文公开的方法中。例如，可用 标准免疫检测法检测醒P和TIMP。各种有用的免疫检测法的步骤已在科 技文献中有描述，例如，Maggio et al.， Enzyme-Immunoassay， (1987) 和Nakamura， et al" Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1: I隱nochemistry， 27.1-27.20 (1986)，通过引用的方式将它们的全 文一一特别是其关于免疫检测的方法的教导一一纳入本文。从最简单直接 的意义上来说，免疫测定是涉及抗体和抗原之间结合的结合测定法。许多 类型和形式的免疫测定都是已知的，它们都适于检测所公开的生物标记。 免疫测定的实例有酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、 放射免疫沉淀测定UIPA)、免疫珠捕获测定、蛋白质印迹、点印迹、凝 胶移动检测、流式细胞术、蛋白质阵列、多珠粒阵列、磁捕获、体内成像、 荧光共振能量转移(FRET)和光漂白后荧光恢复/定位(FRAP/ FLAP)。
一般而言，免疫测定包括使被怀疑含有目的分子(例如本文公开的生 物标记)的样本与该目的分子的抗体相接触，或者使目的分子的抗体(例 如，本文公开的生物标记的抗体)与可被该抗体结合的分子相接触，所述 接触过程可能是在有效使得能够形成免疫复合体的条件下进行。在有效形 成免疫复合体(一级免疫复合体)的条件下且在足以使得免疫复合体形成的时间段内，样本与目的分子的抗体之间的接触或者与可被目的分子的抗 体结合的分子之间的接触，通常只是简单地使所述分子或抗体与所述样本 接触，并在足以使抗体与所存在的任何可与该抗体结合的分子(例如抗原) 形成(即与其结合)免疫复合体的时间段内，孵育上述混合物。在许多形
式的免疫测定中，随后可洗涤样本-抗体组合物(例如组织切片、ELISA 板、点印记或蛋白质印迹)以除去任何非特异性结合的抗体种类，从而只 允许与待检测的一级免疫复合体特异性结合的那些抗体存在。
免疫测定可包括用于检测样本中的目的分子(例如本文公开的生物 标记或它们的抗体)或对其定量的方法，所述方法通常包括检测在结合 过程中形成的任何免疫复合体或对其定量。通常，对免疫复合体形成的 检测是本领域公知的，这可应用多种方法实现。这些方法一般是基于检 测一种标记物或标记，例如任何放射性标签、焚光标签、生物标签或酶 标签或者任何其他已知的标记物。参见例如，美国专利3, 817, 837、 3， 850， 752、 3， 939， 350、 3， 996， 345、 4， 277， 437、 4， 275， 149和4， 366， 241， 通过引用的方式将上述每篇文献全文一一特别是与免疫检测方法或标记 相关的教导一一纳入本文。
本文所使用的标记可包括荧光染料、结合对的其中之一(例如生物素 /链亲和素)、金属(例如金)或能与可被检测的分子特异地相互作用(例 如通过产生有色底物或荧光)的表位标签。适用于可检测地标记蛋白的底
如辣根过氧化物酶)反应的酶。实施本发明的过程中， 一般优选使用荧光 染料，因为它们能够在# 少量时,皮检测到。此外，当多个抗原与单个阵列 反应时，每个抗原可被不同的荧光化合物标记以便同时检出。可使用荧光 计检测阵列上的标记点，当存在信号时就表明抗原与特异性抗体结合。
荧光团是能发光的化合物或分子。通常，荧光团在一个波长处吸收 电磁能，在另一个波长处发射电磁能。代表性的荧光团包括但不限于 1，5-IAEDANS、 1，8-ANS、 4-甲基伞形酮、5-羧-2， 7-二氯荧光素、5-羧基 荧光素(5-FAM)、 5-g萘荧光素、5-羧基四曱基罗丹明(5-TAMRA)、 5-羟 色胺(5-HAT)、 5-R0X (羧基-X-罗丹明)、6-羧罗丹明6G、 6-CR 6G、 6-J0E、 7-氨基-4-曱基香豆素、7-氨基放线菌素D (7-AAD)、 7-羟基-4-I甲基香 豆素、9-氨基-6-氯-2-甲氧吖啶(ACMA)、 ABQ、酸性品红、吖啶橙、吖啶
16红、吖啶黄、锥虫黄(Acriflavin)、锥虫黄孚尔才艮SITSA (Acriflavin Feulgen SITSA)、水母发光蛋白(发光蛋白)、AFP-自主荧光蛋白-(量子 生物技术)(参见sgGFP、 sgBFP) 、 Alexa Fluor 350 、 Alexa Fluor 430 、 Alexa Fluor 488 、 Alexa Fluor 532 、 Alexa Fluor 546 、 Alexa Fluor 568 、 Alexa Fluor 594 、 Alexa Fluor 633 、 Alexa Fluor 647 、 Alexa Fluor 660 、 Alexa Fluor 680 、茜素齡酮、萏素红、别藻蓝蛋白(APC)、 AMC、 AMCA-S、氨曱基香豆素(AMCA)、 AMCA-X、氨基放线菌素D、 ^J^香豆 素、苯胺蓝、硬脂酸蒽(Anthrocyl stearate) 、 APC-Cy7、 APTRA-BTC、 APTS、阿司屈拉崇(Astrazon)亮红4G、阿司屈拉崇橙R、阿司屈拉崇红 6B、阿司屈拉崇黄7 GLL、米帕林(Atabr ine) 、 ATTO- TAG CBQCA、 ATT0-TAG FQ、金胺、Aurophosphine G、 Aurophosphine、 BAO 9 (双氨基苯基噁二 唑)、BCECF (高pH)、 BCECF (低pH)、石危酸黄连素、P内酰胺酶、BFP蓝 移GFP (Y66H)、蓝色荧光蛋白、BFP/GFP FRET、 Bimane、双苯酰亚胺
(Bisbenzemide )、双苯酰亚胺(赫斯特)、双BTC、布兰科福尔(Blancophor ) FFG、布兰科福尔SV、 B0B0 -1、 B0B0 -3、氟硼焚(Bodipy) 492/515、 氟硼荧493/503、氟硼荧500/510、氟硼焚505/515、氟硼荧530/550、氟 硼荧542/563、氟硼荧558/568、氟硼荧564/570、氟硼荧576/589、氟硼 荧581/591、氟硼荧630/650-X、氟硼荧650/665-X、氟硼荧665/676、氟 硼焚F1、氟硼荧FL ATP、氟硼荧F1-神经酰胺、氟硼荧R6G SE、氟硼荧 TMR、氟硼荧TMR-X缀合物、氟硼荧TMR-XSE、氟硼荧TR、氟硼荧TRATP、 氟硼荧TR-XSE、 BO-PR0 -1、 BO-PRO -3、 Brilliant Sulphoflavin FF、 BTC、 BTC-5N、钓黄绿素、4丐黄绿素蓝、Calcium Crimson-、 Calcium Green、 Calcium Green-l Ca2+染料、Calcium Green-2 Ca2+、 Calcium Green-5N Ca2+、 Calcium Green-C 18 Ca2+、 Calcium Orange、 Calcofluor White、 I^^-X-罗丹明(5-R0X)、 Cascade BlueTM、 Cascade Yellow、儿茶酚胺
(Catecholamine) 、 CCF2 (GeneBlazer) 、 CFDA、 CFP (氰基焚光蛋白)、 CFP/YFP FRET、叶绿素、色霉素A、色霉素A、 CL-NERF、 CMFDA、腔肠素
(Coelenterazine)、腔肠素cp、腔肠素f 、腔肠素fcp、腔肠素h、腔 肠素hcp、腔肠素ip、腔肠素n、腔肠素0、香豆素毒伞素(Couniarin Phalloidin) 、 C-藻蓝蛋白(C-phycocyanine) 、 CPM I曱基香豆素、CTC、 CTC甲臜(Formazan) 、 Cy2 、 Cy3. 1 8、 Cy3. 5 、 Cy3 、 Cy5. 1 8、 Cy5, 5 、
17Cy5 、 Cy7TM、氰基GFP、 cAMP焚光传感器(Fluorosensor ) (FiCRhR)、 4-(4，-二曱对胺基偶氮苯)苯甲酸(Dabcyl)、丹酰(Dansyl)、丹酰胺、 丹跣尸胺、丹酰氯、丹酰DHPE、丹酰氟、DAPI、 Dapoxyl、 Dapoxyl 2、 Dapoxyl 3'DCFDA、 DCFH (二氯二氢荧光素二乙酯)、DDA0、 DHR (二氢罗丹明123)、 二-4-ANEPPS、 二+ANEPPS (非定比(non-ratio )) 、 DiA (4-Di 16-ASP)、 二氯二氢荧光素二乙酯(DCFH)、 DiD-亲脂示踪物(Lipophilic Tracer)、 DiD (DilC18(5))、 DIDS、 二氬罗丹明123 (MR) 、 Dil (DilC18(3))、 I 二硝基苯酚、Di0 (DiOC18(3))、 DiR、 DiR (DilC18(7))、 DM-NERF (高pH)、 DNP、多巴胺、DsRed、 DTAF、 DY-630-NHS、 DY-635-NHS、 EBFP、 ECFP、 EGFP、 ELF97、伊红、藻红、藻红ITC、溴化乙锭、乙啡啶同型二聚体-l(Ethidium homodimer-1) (EthD-1)、吖咬橙、EukoLight、氯化铕(111)、 EYFP、速 蓝(Fast Blue)、 FDA、孚尔根(副品红)、FIF (曱醛诱导的荧光)、FITC、 FlazoOrange、 Fluo-3、 Fluo-4、荧光素(FITC)、荧光素二乙酯、荧光祖 母绿(Fluoro-Emerald)、荧光金(Fluoro-Gold )(羟基二脒替)、 Fluor-Ruby、 FluorX、 FM 1-43 、 FM 4-46、 Fura Red (高pH) 、 Fura红 /Fluo-3 、 F眼-2、 Fura-2/BCECF、 Genacryl Brilliant Red B、 Genacryl Brilliant Yellow IOGF、 Genacryl Pink 3G、 Genacryl Yellow 5GF、 GeneBlazer、 (CCF2) 、 GFP (S65T)、红移GFP (rsGFP)、非UV激发的野生 型GFP (wtGFP)、 UV激发的野生型GFP (wtGFP) 、 GFPuv、 Gloxalic Acid、 粒状蓝(Granular blue )、血p卜啉(Haematoporphyrin)、赫斯特33258、 赫斯特33342、赫斯特34580、 HPTS、羟基香豆素、羟基二脒替(荧光金)、 羟色胺、Indo-l(高钓)、Indo-l(低钧)、吲咮二碳胥(Indodicarbocyanine ) (DiD)、巧l咮三碳菁(Indotricarbocyanine) (DiR) 、 Intrawhite Cf 、 JC-l、 J0J0-1、 J0-PR0-1、 LaserPro、 Laurodan、 LDS 751 (DNA) 、 LDS 751 (RNA)、 雷可福(Leucophor) PAF、雷可福SF、雷可福WS、丽丝胺(Lissamine ) 罗丹明、丽丝胺罗丹明B、钙黄绿素/乙啡啶同型二聚体、L0L0-1、L0-PR0-1、 萤黄(Lucifer Yellow)、溶酶体蓝色荧光探针(Lyso Tracker Blue)、 溶酶体蓝白色荧光探针(Lyso Tracker Blue-White)、溶酶体绿色荧光 探针(Lyso Tracker Green)、溶酶体红色荧光探针(Lyso Tracker Red)、 溶酶体黄色荧光探针(Lyso Tracker Yellow) 、 LysoSensor Blue、 LysoSensor Green、 LysoSensor Yellow/Blue、 Mag Green、 麦塔喇红
18(MagdalaRed) (PhloxinB)、 Mag-Fura Red、 Mag-Fura-2、 Mag-Fura-5、 Mag-lndo-l、镁绿(Magnesium Green)、镁橙(Magnesium Orange)、 孑L雀石绿、海蓝(Marina Blue) 、 I Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF、 Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF、部花青(Merocyanin)、曱氧香豆素、 线粒体绿色荧光探针(Mitotracker Green) FM、线粒体橙色荧光探针
(Mitotracker Orange)、线粒体红色荧光探针(Mitotracker Red)、 光神霉素、Monobromobimane、 Monobromobimane (mBBr-GSH)、 Monochlorobimane、 MPS (曱基氯焦宁芪(Methyl Green Pyronine St i lbene )) 、NBD、NBD胺、尼罗红、硝基苯并噁二哇(Ni trobenzoxedidole )、 去曱肾上腺素(Noradrenaline)、核速红(Nuclear Fast Red ) 、 i核黄
(i Nuclear Yellow) 、 Nylosan Brilliant lavinE8G、俄勒冈绿(Oregon Green尸、俄勒冈绿"488、俄勒冈绿"500、俄勒冈绿m514、太平蓝(Pacific Blue)、副品红(孚尔根)、PBFI、 PE-Cy5、 PE-Cy7、 PerCP、 PerCP-Cy5. 5、 PE-德克萨斯红(613红)、根皮红(Phloxin)B (麦塔喇红)、PhorwiteAR、 Phorwite BKL、 Phorwite Rev、 Phorwite RPA、膦3R、光致抗蚀剂
(PhotoResist)、藻红蛋白B [PE]、藻红蛋白R [PE] 、 PKH26 (Sigma)、 PKH67、 PMIA、 Pontochrome Blue Black、 P0P0-1、 P0P0-3、 P0-PRO-l、 P0-I PRO-3、樱草灵(Primuline)、普施安黄(Procion Yellow)、缺 化丙咬(P1) 、 PyMP0、芘(Pyrene)、派洛宁(Pyronine )、派洛宁B、 Pyrozal Brilliant Flavin 7GF、 QSY 7、芥查吖因(Quinacrine Mustard)、试 囟灵(Resorufin) 、 RH414、 Rhod-2、罗丹明、罗丹明110、罗丹明123、 罗丹明5 GLD、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明B 200、碱性玫瑰精(Rhodamine B extra )、罗丹明BB、罗丹明BG、罗丹明绿、罗丹明毒伞素(Rhodamine Phallicidine)、罗丹明、鬼笔环肽(Phalloidine)、罗丹明红、罗丹 明WT、玫瑰红、R-藻蓝蛋白(R-phycocyanine ) 、 R-藻红蛋白(PE) 、 rsGFP、 S65A、 S65C、 S65L、 S65T、深蓝色GFP、 SBFI、 5-羟色胺、塞夫隆亮红(Sevron Brilliant Red) 2B、塞夫隆I亮红4G、塞夫隆亮红B、塞夫隆橙、塞 夫隆黄L、 sgBFP (超发光(super glow) BFP) 、 sgGFP (超发光GFP)、 SITS (櫻草灵，1，2-二苯乙烯异硫代硫酸)、SNAFL钙黄绿素、SNAFL-1 、 SNAFL-2、 SNAR钓黄绿素、SNARF1、钠绿(Sodium Green ) 、 SpectrumAqua、 SpectrumGreen、 Spectrum0range、 Spectrum Red、 SPQ (6-曱氧一N-(3磺丙基)喹啉铵)、1，2-二苯乙烯、磺罗丹明B和C、 SulphoRhodamienExtra、
SYT011、SYT012、SYT013、SYT0 14、 SYT0 15、SYT0 16、 SYT017、
SYT018、SYT020、SYT021、SYT0 22、 SYT0 23、SYT0 24、 SYT025、
SYT040、SYT041、SYT042、SYT0 43、 SYT0 44、SYT0 45、 SYTO59、
SYT060、SYT061、SYT062、SYT0 63、 SYT0 64、SYT0 80、 SYT081、
SYT082、SYT083、SYT084、SYT0 85、 SYT0X蓝、SYT0X绿、SYTOX橙、四环素(Tetracycline )',四曱基罗丹明(TRITC)、德克萨斯红"、德克
萨斯红-XTM缀合物、硫代二羰花青(Thiadicarbocyanine) (DiSC3)、噢 唤红R(Thiazine Red R)、參喳橙、硫磺素5 (Thioflavin)、硫磺素S、 硫磺素T0N、 Thiolyte、 Thiozole 0range、 Tinopol CBS (Calcof luor White)、 TIER、 T0-PR0-1、 TO-PRO-3、 T0-PR0-5、 T0T0-1、 T0T0-3、 TriColor (PE-Cy5)、 TRITC四曱基罗丹明异硫氰酸酯、正蓝(True Blue)、 正红(TruRed) 、 Ultralite、焚光素钠(Uranine ) B、 UvitexSFC、 wtGFP、 WW 781、 X-罗丹明、XRITC、 二甲^^ (Xylene 0rgange) 、 Y66F、 Y66H、 Y66W、黄色GFP、 YFP、 Y0-PR0-1、 Y0-PR0 3、 Y0Y0-1、 Y0Y0—3、 Sybr Green、 噢唑橙(内螯合染料(interchelating dye))、例如量子点的半导体纳 米粒或(可被光或其他电磁能源激活的)封闭荧光团(caged flurophore), 或者它们的组合。
标记可以直接或间接进行。在直接标记中，检测的抗体(目的分子的 抗体)或检测的分子(可被目的分子的抗体结合的分子)包括标记物。检 测到标记物就表明存在所述检测的抗体或所述检测的分子，这又分别表明 存在目的分子或存在目的分子的抗体。在间接标记中，使其他分子或部分 与免疫复合体接触，或者在免疫复合体处生成其他分子或部分。例如，可 使产生信号的分子或部分(例如酶)附着到或者结合到所述检测抗体或所 述检测分子上。之后，产生信号的分子可在免疫复合体处产生可检测信号。 例如，在向一种酶提供合适的底物时，该酶可在免疫复合体处产生可见的 或可检测的产物。ELISA应用了这种间接标记。
间接标记的另一个实例是，使可结合目的分子或结合目的分子的抗体 (一抗)的其他分子(可称之为结合剂)一一例如与一抗结合的二抗一一 与免疫复合体相接触。所述其他分子可带有标记物或产生信号的分子或部 分。所述其他分子可以是抗体，由此它可被称为二抗。二抗与一抗的结合可与所述第一抗体(或一抗)和目的分子形成所谓的三明治。该免疫复合 体可与经标记的二抗在有效使得二级免疫复合体形成的条件下相接触，且 接触时间足以使得二级免疫复合体形成。然后，通常可洗涤该二级免疫复 合体以除去任何非特异结合的经标记的二抗，随后可检测该二级免疫复合 体中余下的标记物。所述其他分子也可以是或包括一对彼此结合的分子或 部分(例如生物素/链亲和素对)的其中之一。在这种模式中，所述检测 抗体或检测分子应包括该配对中的另一成员。
其他的间接标记模式包括通过两步骤法检测一级免疫复合体。例如， 如上所述， 一种对目的分子或相应抗体具有结合亲和性的分子(它可被称 为第一结合剂)例如一种抗体可用于形成二级免疫复合体。洗涤后，也是 在有效使得免疫复合体形成(由此形成三级免疫复合体)的条件下，在足 以使得免疫复合体形成的时间内，可使所述二级免疫复合体与另一种对所 述第一结合剂具有结合亲和性的分子(它可被称为第二结合剂)相接触。 所述第二结合剂可与可检测标记物或产生信号的分子或部分连接，以便能 检测所述的由此形成的三级免疫复合体。该体系可使信号放大。
涉及检测底物(例如一种蛋白或一种特定蛋白的抗体)的免疫测定包 括无标记测定、蛋白分离法(即电泳)、固体栽体捕获测定或体内检测。 无标记测定是确定样本中是否存在特定蛋白或特定蛋白的抗体的常用诊 断手段。蛋白分离法也用于评价蛋白的物理特性，例如分子大小或净电荷。 捕获测定通常在定量评价样本中特定蛋白或特定蛋白的抗体的浓度时更 为有用。最后，体内检测可用于评价物质的空间表达模式，即该物质可存 在于受试者体内组织或细胞中的何处。
如果浓度足够，抗体-抗原相互作用产生的分子复合体([Ab-Ag]/7) 为肉眼可见的，但量更少时也有可能因其能散射光束而被检测或测量到。 复合体的形成表明两种反应物均存在，在免疫沉淀测定中，恒定浓度的试 剂抗体被用于测量特定抗原([Ab-Ag]/ ),试剂抗原被用于检测特定抗体 ([Ab-Ag]/7)。如果试剂种类被预先包被于细胞(如在血细胞凝集测定中) 或微小颗粒(如在乳胶凝集测定中)上，包被颗粒的"凝集"在极低浓度 时都可见。基于上述基本原理的各种测定法都是常用方法，包括 Ouchterlony免疫扩散测定、火箭免疫电泳和免疫浊度分析和浊度测定。 这类测定的主要局限是与使用标记物的测定法相比，其灵敏度有限(较低
21的检测限)，并且某些情况下，极高浓度的分析物实际上可抑制复合体的 形成这一事实使得这些方法更为复杂。这些一线测定法中的某些可追溯到
发现抗体时，它们都没有真正的"标记物"(例如Ag-enz)。其他类型的 无标记免疫测定依赖于免疫传感器，目前已有许多可直接检测抗体-抗原 相互作用的市售仪器。大多数都需要在具有固定化配体的传感器表面上产 生隐失波，从而可以连续监测与配体的结合。免疫传感器使得可以很容易 进行动力学相互作用研究，并且随着低成本专业仪器的出现使其在未来可 广泛应用于免疫分析中。
使用免疫测定法检测特定蛋白可包括通过电泳分离蛋白质。电泳是指 溶液中的荷电分子响应于电场发生迁移。它们的迁移率取决于电场强度、 分子的净电荷、大小和形状，还取决于其中泳动分子的介质的离子强度、 粘度和温度。电泳是一种简单、快速且高灵敏的分析工具。它被用于分析 研究单一的荷电分子的性质，并且也可作为一种分离技术。
通常，在载体基质上泳动样本，例如在纸、醋酸纤维素、淀粉凝胶、 琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上。所述基质可抑制发热所致的对流混合，并且 提供电泳记录即在电泳结束时，可将基质染色并用于扫描、放射自显影 或保存。此外，最常用的载体基质一一琼脂糖和聚丙烯酰胺一一提供了通 过分子大小分离分子的工具，因为它们是多孔凝胶。多孔凝胶可通过延迟 或者某些情况下完全阻止大分子移动同时使小分子自由移动来起到分子 筛的作用。由于稀的琼脂糖凝胶通常比相同浓度的聚丙烯酰胺更硬并且更 容易处理，因此琼脂糖被用于分离较大的大分子例如核酸、大的蛋白质和 蛋白复合体。聚丙烯酰胺在较高浓度时容易处理和制备，因此被用于分离 需要较小的延迟凝胶孔径的多数蛋白和较小寡核苷酸。
蛋白质是两性化合物，因此可通过其悬浮介质的pH来测定它们的净 电荷。当溶液pH高于蛋白质等电点时，该蛋白带净负电，并在电场中向 阳极移动。低于其等电点时，蛋白带正电，向阴极移动。此外，蛋白质所 带的净电荷与其分子大小无关，即不同的蛋白质，每单位分子质量(或长 度，蛋白质和核酸是线性大分子时)所带电荷不同。因此，在给定的pH 下，并且在非变性条件下，同时通过分子的大小和电荷来确定蛋白质的电 泳分离。
十二烷差^Tu酸钠(SDS)是一种阴离子变性剂，它可通过"包围"多肽骨架而使蛋白质变性，SDS与蛋白质极特定地以1. 4:1的质量比结合。 由此，SDS将赋予多肽与其长度成比例的阴电荷。此外，通常还需要将蛋 白的二硫键还原(变性)，如此之后，蛋白质就可采取通过分子大小进行 分离所需的随机巻曲构型；还原可用2-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)实 现。因此，在变性SDS-PAGE分离中，迁移并不由多肽的内部电荷决定， 而是由分子量决定。
分子量的测定可通过将已知分子量的蛋白与待表征的蛋白一起进行 SDS-PAGE电泳来进行。SDS变性的多肽或天然核酸的分子量的对数与其Rf 之间存在线性关系。分子迁移距离与标准物染料前沿迁移距离之比即为 Rf。 一种通过电泳测定相对分子量(俯)的简单方法是，绘制已知样本迁 移距离相对loglOMW的标准曲线，并在测量样本在同一凝胶上的迁移距离 后读取样本的log俯。
在二维电泳中，首先基于物理特性将蛋白质分级分离，然后基于另一 种特性通过另一步骤分级分离。例如，等电聚焦法可用于第一维度，这可 方便地通过管式凝胶进行，而平板凝胶上的SDS电泳可用于第二维度。该 方法的一个实例是O'Farrell， P. H. ， High Resolution Two-dimensional Electrophoresis of Proteins, J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975) 中的方法，该文献就其二维电泳方法的教导通过引用的方式全文纳入本 文。其他的实例包括但不限于Anderson, L and Anderson, NG， High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins, Proc. Natl. Acad. Sci. 74:5421-5425 (1977)和0rnstein, L， Disc electrophoresis, L Arm. N. Y. Acad. Sci. 121: 321349 (1964) 中的方法，它们关于电泳方法的教导均通过引用的方式全文纳入本文。
Laemmli， U.K.， Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4， Nature 227: 680 (1970) 中公开了 一种用于分辨SDS变性蛋白的不连续系统，该文献就其电泳方法 的教导通过引用的方式全文纳入本文。Laemml i緩沖系统中的先导离子是 氯，尾随离子是甘氨酸。因此，该分辨凝胶和积层凝胶是用(不同浓度和 pH的)Tris-HCl緩冲液制备的，而电泳槽緩冲液为Tris-甘氨酸。所有緩 冲液均含有0. 1% SDS。
本发明方法中考虑到的使用电泳的免疫测定的一个实例为蛋白质印
23迹分析。蛋白质印迹或免疫印迹使得可以测定蛋白的分子质量，以及测量 不同样本中存在的蛋白的相对量。检测方法包括化学发光和显色检测。蛋
白质印迹分析的标准方法可参见例如D.M. Bollag et al.， Protein Methods (2d edition 1996)和E. Harlow & D. Lane, Antibodies, a Laboratory Manual (1988)以及美国专利4， 452， 901，它们每一篇关于蛋 白质印迹方法的教导均通过引用的方式全文纳入本文。 一般用凝胶电泳 (常用SDS-PAGE)分离蛋白质。将蛋白质转移到一种例如硝酸纤维素的特 殊印迹薄纸上，但也可使用其他类型的纸或膜。该蛋白保持其在凝胶上的 分离模式。使该印迹与一种例如乳蛋白的总蛋白一起孵育，以结合硝酸纤 维素膜上任何剩余的粘性区域。然后将能够结合其特异性蛋白的抗体加入 到该溶液中。
抗原的结合，通常使用生色底:^例如:碱性磷酸酶或:根过氧化物酶)
或发光底物。其他可能的探测方法包括使用荧光或放射性同位素标记物 (例如，荧光素、125I)。检测抗体结合的探针可以是缀合的抗免疫球蛋白、 缀合的葡萄球菌蛋白A (结合IgG)或生物素化一抗的探针(例如，缀合 的亲和素/链亲和素)。
该技术的有效性在于它能通过特定蛋白的抗原性同时检测出该特定 蛋白和它的分子量。首先，用SDS-PAGE根据质量分离蛋白质，然后通过 免疫测定步骤进行特异地检测。因此，可同时电泳蛋白质标准物(分子量 标准(ladder))，以估计异源样本中目的蛋白的分子量。
凝胶迁移测定或电泳迁移率测定(EMSA )可用于定性和定量地检测DNA 结合蛋白和其同源DNA识别序列之间的相互作用。示例性的技术如 0rnstein L., Disc electrophoresis—I: Background and theory, Amu NY Acad. Sci. 121: 321-349 (1964)和Matsudiara， PT and DR Burgess, SDS microslab linear gradient polyacrylamide gel electrophoresis, Anal. Biochem. 87:386-396 (1987)中所述，上述文献就其凝胶迁移测定 的相关教导均通过引用的方式全文纳入本文。
在常规的凝胶测定中，可将纯化的蛋白或细胞粗提物与一种标记(例 如"P放射标记)的DNA或RM探针一起孵育，然后通过非变性聚丙烯酰 胺凝胶使该复合体与游离的探针分离。该复合体穿过凝胶的迁移速度比不
24结合的探针更慢。根据所述结合蛋白的活性，标记的探针可以是双链或单
链的。对于例如转录因子的DNA结合蛋白的检测，可以使用纯化的或部分 纯化的蛋白或者核细胞提取物。对于RNA结合蛋白的检测，可以使用纯化 的或部分纯化的蛋白或者核或胞质细胞提取物。DM或RNA结合蛋白对于 推定结合位点的特异性可通过竟争性实验来确定，其中使用含有目的蛋白 结合位点的DNA或RNA片段或寡核苷酸，或者其他无关序列。在特异和非
特异竟争物的存在下形成的复合体的性质和强度差异使得可以识别特异
的相互作用。参见Promega的凝胶迁移测定FAQ，它可从
http: //www. promega, com/faq/gelshfaq, html (上一次访问于2005年3
月25日)获得，该内容就其凝胶迁移法相关教导通过引用的方式全文纳
入本文。
凝胶迁移法可包括，例如使用胶体形式的考马斯(Imperial Chemicals Industries, Ltd)蓝色染料检测凝胶(例如聚丙烯酰胺电泳凝胶)上的 蛋白质。这类方法在例如Neuhoff et al.， Electrophoresis 6: 427-448 (1985)和Neuhoff et al， Electrophoresis 9: 255-262 (1988)中有描述， 所述文献就其凝胶迁移方法相关教导均通过引用的方式全文纳入本文。除 了上述的常规蛋白质测定方法，美国专利5, 424, 000中还描述了一种联合 清洗和蛋白质染色的组合物，该文献就其凝胶迁移方法相关教导通过引用 的方式全文纳入本文。该溶液可包括磷酸、硫酸和硝酸以及酸性紫染料。
放射免疫沉淀测定(RTPA)是一种使用放射性标记的抗原来检测血清 中特异抗体的灵敏测定法。使抗原与血清反应，然后用特殊的试剂例如蛋 白A琼脂糖(sepharose )珠粒进行沉淀。之后，通常用凝胶电泳分析所 述结合的经放射性标记的免疫沉淀。放射性免疫沉淀测定(RIPA)常被用 作一种用于诊断是否存在HIV抗体的确诊测试。RIPA在本领域中也被称作 Farr测定、沉淀测定、放射免疫沉淀测定；放射免疫沉淀分析；放射免疫 沉淀分析和放射免疫沉淀分析。
虽然上述利用电泳分离和检测所述特定目的蛋白的免疫测定可以评 价蛋白质的大小，但它们在评价蛋白质浓度方面不太灵敏。然而，还考虑 了这样一种免疫测定其中所述蛋白或蛋白的特异性抗体与固体载体(例 如管、孑L、珠粒或细胞)结合以分别从样本中捕获所述抗体或目的蛋白， 并且将这种测定与 一种检测载体上的所述蛋白或蛋白的特异性抗体的方
25法相结合。这类免疫测定的实例包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸 附测定(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、多珠粒阵列和磁捕获。
放射性免疫测定UIA)是一种检测抗原-抗体反应的经典定量测定， 它使用了放射性标记的物质(放射性配体)，以直接地或间接地测量未标 记物质与特异抗体或其他受体系统的结合。可使用放射性免疫测定法例如 检测血液的激素水平，而不需要用生物测定法。非免疫源性物质(例如半 抗原)如与能诱导抗体形成的更大的栽体蛋白(例如，牛Y球蛋白或^^l 清白蛋白)偶联，则也可对其进行测定。RIA包括将放射性抗原(因为将 碘原子引入蛋白质的酪氨酸残基中较容易，所以通常使用放射性同位素 1251或1311)与该抗原的抗体混合。 一般，使该抗体与例如管或微珠的固体 栽体结合。然后，加入已知量的未标记抗原或"冷，，抗原，并测量被置换 的标记抗原的量。最初，所述放射性抗原与抗体结合。当加入冷抗原时， 两者会竟争抗体结合位点，更高浓度的冷抗原会更多地与该抗体结合，从 而置换出该放射性变体。使结合的抗原与溶液中未结合的抗原相分离，通 过各抗原的放射性来绘制结合曲线。这种技术极其灵敏并且特异性很高。
酶联免疫吸附测定(ELISA)——或者通常称之为EIA (酶免疫测 定) 一一是一种可检测蛋白的特异抗体的免疫测定。在该测定中，与抗体 结合试剂或抗原结合试剂相结合的可检测标记是一种酶。当酶与其底物接 触时，该酶以特定方式发生反应以产生例如可通过分光光度测定、荧光测 定或可见方式检测的化学部分。可用于可检测地标记检测试剂的酶包括但 不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶、 核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、天冬 酰胺酶、酵母乙醇脱氢酶、ot-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、6-磷 酸葡萄糖脱氢酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。关于ELISA方法的描述 参见Voller， A. et al. ， J. Clin. Pathol. 31: 507-520 (1978); Butler， J. E., Meth. Enzymol. 73: 482-523 (1981); Maggio， E. (ed.) ， Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton， 1980; Butler， J. E. ， In: Structure of Antigens, Vol. 1 (Van Regenmortel， M. ， CRC Press, Boca Raton, 1992， pp. 209-259; Butler, J. E. ， In: van 0ss, C. J. et al.， (eds)， Immunochemistry， Marcel Dekker， Inc., New York, 1994， pp. 759-803; Butler, J. E. (ed.) ， Immunochemistry of Solid—Phase
26Immunoassay, CRC Press, Boca Raton， 1991); Crowther， "EUSA: Theory and Practice," In: Methods in Molecule Biology, Vol. 42， Humana Press; New Jersey, 1995;美国专利4， 376， 110,上述每篇文献——特别 是关于ELISA方法的教导一一均通过引用的方式全文纳入本文。
ELISA技术的变化方案是本领域技术人员已知的。在一个变化方案中， 可将能与蛋白结合的抗体固定在显示出蛋白亲和性的选定表面上，例如在 聚苯乙烯微量滴定板的孔中。然后，向所述孔中加入怀疑含有标记抗原的 测试组合物。结合并洗去非特异性结合的免疫复合体后，可检测结合的抗 原。可通过加入特异性针对靶蛋白的二抗来进行检测，所述二抗与可检测 标记相连。这类ELISA是一种简单的"夹心ELISA"。也可通过先加入二 抗再加入对所述二抗有结合亲和性的三抗来进行检测，所述三抗与可检测 标记相连。
另一个变化方案是竟争ELISA。在竟争ELISA中，测试样本竟争性地 结合已知量的标记抗原或抗体。可通过在与包被孔一起孵育前或在孵育过 程中，使样本与所述已知的标记物混合来测定样本中反应物的量。样本中 存在反应物时会减少可结合孔的标记物的量，由此而减弱最终的信号。
无论采用何种形式，ELISA都具有某些共同的特征，例如包被、孵育 或结合、洗去非特异性结合的物质以及检测结合的免疫复合体。可使抗原 或抗体与固体载体相连，并将待分析的样本加到固定的抗原或抗体上，所
述固体载体例如为板、珠粒、杆、膜或柱基质的形式。用抗原或抗体包被 板时，通常用抗原或抗体溶液孵育板孔，并孵育过夜或者一段具体的时间 段。然后，清洗板孔以除去不完全吸附的物质。然后，用对于测试抗血清 呈抗原中性的非特异性蛋白"包被"任何剩余的可吸附的孔表面。它们包 括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和乳粉溶液。所述包被使得可以封闭固 定化表面上的非特异性吸附位点，并因此降低抗血清与表面非特异结合所 致的本底。
在ELISA中，还可^_用二次或三次检测手段，而不用直接方法。因此， 在使蛋白或抗体与孔结合，用无反应活性物质进行包被以降低本底并洗去 未结合物质后，使固定化表面与待测对照临床或生物样本在可有效使得免 疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下相接触。这样，该免疫复合体的检 测就需要一种标记的二级结合试剂或者与一种二级结合试剂和一种标记的三级结合试剂的组合。
"在可有效〗吏得免疫复合体(抗原/抗体)形成的条件下"意为该条
件包括用例如BSA、牛y球蛋白(BGG)和磷酸盐緩沖溶液(PBS) /吐温的 溶液稀释抗原和抗体，以减少非特异性结合并提高合理的信噪比。
合适的条件也可意为在使得有效结合的温度下和足够时间内进行孵 育。孵育步骤通常可在约20"C至30t:下进行约l分钟至12小时，或者可
在约ox:至约iox:下赙育过夜。
在ELISA中，进行所有孵育步骤后，洗涤接触表面以除去未复合的物 质。洗涤步骤可包括用例如PBS/吐温或硼酸盐緩冲液的溶液洗涤。在测试 样本与最初结合的物质之间形成特异免疫复合体并进行随后洗涤后，可以 测定甚至以很小量存在的免疫复合体。
为了提供一种检测手段，如上所述，所述二抗或三抗可带有结合的标 记物以便检测。它可以是一种在与合适的生色底物孵育后可产生颜色的 酶。因此，例如，可在利于进一步形成免疫复合体的条件下以及时间段内 使第一或第二免疫复合体与标记抗体相接触并一起孵育(例如在室温下， 在含PBS的溶液(例如PBS-吐温)中孵育2小时)。
与标记抗体一起孵育并且随后洗去未结合的物质后，可对标记物定 量，例如在以过氧化物酶作为酶标记时，可通过与生色底物例如脲和溴曱 酚紫或2, 2'-叠氮-二- ( 3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸[ABTS]和HA—起孵 育来定量。定量可通过测量生色程度来实现，例如使用可见光谱分光光度 计。
蛋白测定为利用了表面固定化蛋白的固相配体结合测定系统，所述表 面包括玻璃、膜、微量滴定孔、质谱仪平板和珠粒或其他颗粒。这些测定 高度平行(多重)并且常常是小型化的(微阵列、蛋白质芯片)。它们的 优点包括快速且自动化、高灵敏度、试剂经济并且单次实验可给出的大量 数据。生物信息学支持非常重要；数据的处理需要复杂的软件和数据比较 分析。然而，可对用于DNA阵列的软件加以修改得到上述软件，如同许多 硬件和检测系统一样。
一种主要的形式是捕获阵列，在该阵列中，配体结合剂被用于检测例 如血浆或组织提取物的混合物中的目的分子，所述配体结合剂通常为抗 体，但也可以是蛋白支架、肽或核酸适体。在诊断中，捕获阵列可用于平
28行进行多个免疫测定，既可测定例如单个血清中的多种分析物，也可同时 测定多个血清样本。在蛋白质组学中，捕获测定被用于对不同的健康和患 病样本的蛋白质水平定量并加以比较，即蛋白质表达作谱。除特异配体结 合物之外的蛋白被用在所述用于体外功能相互作用(例如蛋白质-蛋白质、
蛋白质-DNA、蛋白质-药物、受体-配体、酶-底物等等)筛选的阵列形式 中。可针对多种蛋白对捕获试剂自身进行选择和筛选，这也可通过针对多 重蛋白靶标的多阵列形式实现。
对于构建阵列而言，蛋白质的来源包括，用于重组蛋白的基于细胞的 表达系统、从天然来源纯化、通过无细胞翻译系统体外生产和肽合成方法。 这些方法中的许多种都可用于自动高通量生产。对于捕获阵列和蛋白功能 分析而言，重要的是，蛋白应正确折叠并具有功能；但事实并非总是如此，
例如当在变性条件下从细菌提取重组蛋白时。然而，变性蛋白的阵列可用 于筛选抗体的交叉反应性、识别自身抗体以及筛选配体结合蛋白。 蛋白阵列已被设计成，通常使用荧光读数并且用机器推进的微型化形
式的常用免疫测定方法(例如ELISA和点印迹)，以及能够平行进行多个 测定的高通量检测系统。常用的物理载体包括载玻片、硅、微孔、硝酸纤 维素或PVDF膜、以及磁微珠或其他微珠。尽管最常见的形式是加到平面 表面的蛋白微滴，其他的结构包括基于微流体(microfluidics)发展 (Gyros, Monmouth Junction, NJ )和特殊芯片设计的CD离心装置，例 如板上设计的微通道(例如The Living Chip , Biotrove， Woburn, MA) 和珪表面的微型3D杆(Zyomyx， Hayward CA)。悬浮颗粒也可作为阵列 基础，条件是需对它们进行识别编码；系统包括用于微珠(Luminex， Austin: TX; Bio-Rad Laboratories )和半导体纳米晶体(例如，QDots , Quantum Dot, Hayward, CA )的彩色编码和用于珠粒(UltraPlex , SmartBead Technologies Ltd, Babraham， Cambridge, UK)和多金属微杆(例如 Nanobarcodes 颗粒，Nanoplex Technologies, Mountain View, CA)的 条形编码。珠粒也可被组装到半导体芯片上的平面阵列中(LEAPS technology, BioArray Solutions, Warren， NJ)。
蛋白的固定化涉及偶联试剂和待偶联表面的性质。优良的蛋白阵列载 体表面在偶联过程前后都是化学稳定的、使得产生良好的点形态、表现出 非特异性结合最少、不会增加检测系统的本底并且与不同的检测系统兼容。使用的固定化方法有重现性、适用于具有不同性质的蛋白质(大小、 亲水、疏水)、适于高通量和自动化并且与完全功能蛋白活性的保留相容。 表面结合蛋白的定向被认为是将该蛋白以活性状态提供给配体或底物过
程中的重要因素；对于捕获阵列而言，可通过定向的捕获试剂获得最有效 的结合结果，所述捕获试剂通常需要对蛋白进行位点特异性标记。
共价的和非共价的蛋白固定化方法都可使用，它们都有各种优缺点。
表面被动吸附在方法上很简单，但几乎不能进行定量或定向控制；它可能 改变或者可能不改变蛋白的功能特性，并且可重复性和效率是可变的。共 价偶联法提供了一种稳定的连接，可应用于很多种蛋白质并且具有良好的 重复性；然而，取向可能是可变的，化学衍生可能会改变蛋白质功能并且 需要稳定的相互作用表面。利用蛋白上的标签的生物捕获方法可提供稳定 的连接，并且可特异地且以可重复的取向结合蛋白质，但首先须将所述生 物试剂充分固定，并且，该阵列可能需要特殊处理，其稳定性也可能变化。 用于蛋白质阵列构造的多种固定化学法和标签已有描述。用于共价结 合的底物包括用含氨基或醛的硅烷试剂包被的栽玻片。在Versalinxm系 统(Prolinx, Bothell， WA)中，可逆的共价偶联可通过用苯二硼酸衍生的 蛋白与载体表面上固定的水杨基氧肟酸之间的相互作用来实现。该法的本
底结合低，内部荧光弱，并且可使固定的蛋白保留功能。基于三维聚丙烯 酰胺凝胶，未修饰的蛋白的非共价结合发生在例如HydroGel (PerkinElmer， Wellesley， MA)的多孔结构的内部；据报道，该底物在玻 璃微阵列上的本底特别低，其蛋白容量高并且可保留蛋白功能。广泛使用 的生物偶联方法是借助于生物素/链亲和素或者六组氨酸/Ni相互作用，并 且已经对蛋白作过适当修饰。可将生物素缀合到例如二氧化钛(Zyomyx) 或五氧化二钽(Z印tosens， Witterswil, Switzerland)的表面上固定的 聚赖氨酸骨架上。
阵列制造方法包括机器连接印刷(robotic contact printing)、喷 墨、压电点印和照相平板印刷。许多商业化阵列(例如Packard Biosciences)以及手动设备(V&P Scientific )都是可获得的。可通过 机器将细菌集落网载到PVDF膜上以诱导原位蛋白表达。
纳米阵列是点的大小和密度的极限，点为纳米空间级时，能使成千上 万的反应在小于1平方毫米的单一芯片上进行。BioForce Laboratories
30已开发了具有1521个蛋白质点的85nm2的纳米阵列，这相当于每平方厘 米有二千五百万个点，达到了光学检测的极限；其读出方法为荧光法和原 子力显微术(AFM)。
荧光标记和检测方法被广泛使用。用于DNA微阵列读数的仪器同样可 适用于蛋白质阵列。为进行差异显示，可用来自两种不同细胞状态的荧光 标记蛋白探测捕获(例如抗体)阵列，其中将细胞裂解物与不同的荧光团
(例如Cy-3、 Cy-5 )直接缀合并将所述细胞裂解物混合，从而以颜色作为 靶标丰度改变的读数。可通过酪胺信号放大(TSA ) (PerkinElmer Lifesciences)将荧光读数灵敏度放大10-100倍。平面导波技术
(Zeptosens)能进行超灵敏荧光检测，另外还具有不干扰洗涤过程的优 点。也可以以藻红蛋白作为标记物(Luminex)或利用半导体纳米晶体
(Quantum Dot)的性质，通过悬浮珠粒或颗粒实现高灵敏度。特别是在 生物技术商业领域中，许多新的替代读数法已被开发出来。它们包括下述 方法的变换方法表面等离子共振(HTS Biosystems, Intrinsic Bioprobes, Tempe， AZ)、滚环醒扩增(Molecular Staging, New Haven CT)、质 谱(Intrinsic Bioprobes; Ciphergen， Fremont, CA)、共振光散射
(Genicon Sciences, San Diego， CA)和原子力显微术(BioForce Laboratories )。
捕获阵列构成了可进行表达作谱的诊断芯片和阵列的基础。它们通过 高亲和性捕获试剂以高通量方式结合并检测特异的靶标配体，所述高亲和 性捕获试剂例如为常规抗体、单一结构域、构建的支架、肽或核酸适体。
抗体阵列具备所需的特异性性质和可接受的本底，有些抗体阵列可商
购(BD Biosciences, San Jose， CA; Clontech， Mountain View， CA; BioRad; Sigma, St. Louis, M0)。用于捕获阵列的抗体可通过常规免疫法(多克 隆血清和杂交瘤)制备，或者作为从噬菌体或核糖体展示文库篩选后通常 用大肠杆菌表达的重组片段而制得(Cambridge Antibody Technology, Cambridge, UK; Biolnvent， Umd， Sweden; Affitech， Walnut Creek, CAj Biosite， San Diego, CA)。除了常规抗体，也可在阵列中使用Fab和scFv 片段、骆駝科抗体(camelid)的单一 V结构域或重构的人类等同物 (Domantis， Waltham， MA)。
术语"支架"是指蛋白的配体结合结构域，它被重构成能结合多种靶标分子的具有抗体样特异性和亲和性的多种变体。所述变体可通过遗传文 库的形式产生，并且可通过噬菌体、细菌或核糖体展示针对个体靶标进行
筛选。这类配体结合支架或骨架包括基于葡萄球菌蛋白A的"Affibody" (Affibody, Bromma， Sweden)、基于纤连蛋白的"Trinectin" (Phylos， Lexington, MA )和基于脂质运载蛋白结构的"Anticalin" (Pieris Proteolab， Freising-Weihenstephan， Germany)。它们在捕获阵列中的 使用方式类似抗体，并且具有鲁棒性好且容易生产的优点。
阵列中也可使用非蛋白捕获分子，特别是以高特异性和亲和性与蛋白 配体结合的单链核酸适体(SomaLogic, Boulder, CO)。适体是通过Selex 方法选自寡核苦酸文库的，它们与蛋白质的相互作用可通过掺入溴化脱氧 尿苷和UV活化的交联作用(光适体)，以共价连接方式得到增强。由于 有特定的空间要求，与配体的光交联可降低适体的交叉反应性。适体具有 容易通过自动寡核苷酸合成生产、DNA的稳定性且鲁棒性好的优点；对于 光适体阵列，可使用通用的荧光蛋白染色剂检测结合。
与抗体阵列结合的蛋白分析物的检测可直接进行或者通过夹心测定
中的二抗进行。直接标记用于比较具有不同颜色的不同样本。如果可获得 针对同 一蛋白配体的抗体对，夹心免疫测定则可提供较高的特异性和灵敏 度，并因此成为选择用于低丰度蛋白例如细胞因子的方法；该测定还能检 测蛋白修饰物。包括质谱、表面等离子共振和原子力显微术在内的无标记 检测方法可避免配体的改变。对于任何方法都要求有最佳的灵敏度和特异 性，以及较低背景以获得较高的信噪比。由于分析物浓度范围很宽，因此 需对灵敏度作适当调节；针对这一问题的解决方案是对样本连续稀释或者 使用不同亲和性的抗体。目的蛋白常常是体液或提取物中浓度很低的蛋白 例如细胞因子或细胞中低表达的产物，因此就需要在pg范围或更低水平 上的检测。
捕获分子的阵列的一个替代方案是通过"分子印迹"技术实现，其中 (例如来自蛋白C末端区域的)肽被用作模板以在可聚合基质中产生结构 上互补的序列特异的洞穴；该洞穴则可特异地捕获具有合适一级氨基, 歹'J的(变性)蛋白质(ProteinPrint , Aspira Biosystems， Burlingame， CA)。
另一种可用于诊断和表达作镨的方法是ProteinChip⑧阵列
32(Ciphergen， Fremont, CA)，其中固相色谱表面结合例如血浆或肿瘤提 取物的混合物中具有类似电荷或疏水性特征的蛋白质，并且SELDI-TOF质 镨被用于检测保留的蛋白质。
大型的功能芯片是通过固定大量的纯化蛋白来构建的，并用于测定多 种生物化学功能，例如与其他蛋白之间的蛋白相互作用、药物-靶标相互 作用、酶-底物相互作用等。通常它们需要一种表达文库，被克隆到大肠 杆菌、酵母等中，然后例如通过His标签从中纯化表达的蛋白并固定化。 对于不能在细菌或其他体内系统中良好表达的蛋白的合成而言，独立于细 胞的蛋白转录/翻译是可行的替代方法。
对于蛋白-蛋白相互作用的检测，蛋白质阵列可成为所述基于细胞的 酵母双杂交系统的体外替代方案，并且当该双杂交系统有缺陷时，例如相 互作用涉及分泌的蛋白或具有二錄u桥的蛋白时，该阵列是有用的。用阵列 对酵母蛋白激酶和酵母蛋白质组的各种功能(蛋白-蛋白和蛋白脂质相互 作用)进行的生物活性的高通量分析已有描述，其中酵母的所有可译框架 中的大部分都被表达并固定在微阵列上。大型"蛋白质组芯片"在识别功 能相互作用、药物筛选等方面具有4艮好的应用前景(Proteometrix， Branford， CT )。
作为个体元素的二维展示，蛋白阵列可用于筛选噬菌体或核糖体展示 文库，从而筛选出特异结合的配偶体，包括抗体、合成的支架、肽和适体。 可通过这种方式进行"文库对文库"的筛选。本方法的另一个应用是，从 针对一种阵列的组合化学文库中筛选药物候选物，所述阵列是基因组项目 中识别出的蛋白靶标的阵列。
例如BD 细胞计量珠粒阵列的多珠粒测定是一 系列可用于捕获可溶性 分析物并对其定量的光镨不连续颗粒。所述分析物再通过荧光发射检测和 流式细胞分析来测定。多珠粒测定产生与基于ELISA的测定相当的数据， 但是是以一种"多重"或同时的方式产生。以与任何夹心形式的测定法相 同的方式计算细胞计量珠粒阵列的未知物浓度，即通过^^用已知的标准样 并且将未知物绘制到标准曲线上。此外，多珠粒测定使得能够对样本中先 前由于样本体积限制而从未考虑的可溶性分析物进行定量。除了定量的数 据，还可产生显示独特谱或特征的有效可视图像，所述独特谱或特征提供 了用户只需扫视一眼即可获得附加的信息。本文公开的MMP/TIMP谙是基于对单独的醒P或TIMP的测量。可通过 任何已知可提供一种示出在所述分析样本中存在多少腿P或TIMP的可用 标识的方法测量它们的量。测量方法的实例在实施例部分给出。分析物(例 如MPP或TIMP )的定量方法包括对不存在的或者以不可检测量存在的分析 物的测量。
构成本发明的基础的用于测量醒P和TIMP的技术和方法是基于高灵 敏的免疫测定。这类免疫测定中有多种都是由本实验室开发的(即TIMP-4 测定的测量法)。通过酶联免疫测定(ELISA)进^f于免疫测定，该免疫测 定被标准化以提供表4所示的测量值。然而，本实验室施行了其他更灵敏 快速的用于测量腿P和TIMP血液水平的方法，它们包括使用多重测定系 统。在该实例中，可使用基于珠粒的多重夹心免疫测定来测量有限体积的 样本(例如血浆或其他生物样本)中的多种分析物。这种用于多重分析的 新技术是基于将ELISA的灵敏度和流式细胞检测相结合的技术之上的，从 而使得可以特异地测量不到50ja 1的单个样本中最多达100种的不同分析 物。该方法使得可以测量小量血样中的多种醒P和TIMP。这类方法非常适 合本文所描述的诊断、预后、预测和治疗的监测应用。具体而言，为同时 测量分析物浓度，将微珠与样本(即血样) 一起孵育，并使所述微珠与所 述特定目的分析物(即醒P)形成复合体。然后，向混合物中加入特异性 针对各分析物上第二表位的检测抗体(生物素化的)，并且使所述检测抗 体结合到所述已与分析物结合的微珠上。然后将该混合物与焚光报告分子 (链亲和素-藻红蛋白) 一起孵育，并使整个样本通过双激光流式细胞检
一个激光检测报告分子的荧光量，该量与所结合的分析物的量成正比。该 方法已被用于多种MMP以及CHF过程可能涉及的其他分析物，如图17和 表1所示。这只是如何用极少量血样测量单一或多种分析物的一个实例。 已施行的与醒P/TIMP分析物相关的测量的其他实例包括放射免疫测定和 免疫印迹测定。这些方法也是基于抗体。
表1:用于对计算的标准曲线进行校正和线性回归统计的分析物浓度
范围
347.抗体
特异性针对腿P和TIMP的抗体是已知的，并且可商购。表2给出了 抗体的实例。
表2:醒P/TIMP抗体
分析物目录编号供应商
MMP-1M52 PC311 IM35L AB806Oncogene Oncogens Oncogene Chemicon
分析物
范围(pg/mll
P值
MMP-114.1-3433.33
MMP-275.5-18333.33
MMP-313.0-3166.67
MMP-796.0-23333.33
MMP-883.7-20333.33
MMP-954.9-13333.33
MMP-1212.8-31000.00
MMP-1372.7-17666.70
TNF-a1.95-2000.0
IL-1131.95-2000.0
IL-21.95-2000.0
IL-61.95-2000.0
IL-81.95-2000.0
IL-101.95-2000.0
G-CSF1.95-2000.0
INF-Y1.95-2000.0
MCP-11.95-2000.0
MIP誦卩1.95-2000.0
0.0004 O扁l 0,0002 O扁l 0.0004 O扁l 0.0003 O細l 0扁2 0扁2 0扁1 0扁1 0扁7 0扁1 0扁1 0扁1 0扁1 0細8
69786878540000179961AB簡5Chemicon
MMP國2PC342 M33L MAB3308Oncogene Oncogene Chemicon
AB蘭5Chemicon
MAB13405Chemicon
AB809Chemicon
MMP國3PC310 AB810Oncogene Chemicon
AB811Chemicon
M36LOncogene
PC492Oncogene
MMP國7AB8118Chemicon
AB8117Chemicon
3528-100BioVision
MMP誦8PC493 IM38LOncogene Oncogene
AB19047Chemicon
MMP-9薩9 PC309 AB804Oncogene Oncogene Chemicon
MMP-llPC467Oncogene
AB19051Chemicon
MMP-12RPI-MMP-12TriplePointBiologics
PC494Oncogens
AB8114Chemicon
MMP-13PC542 3533-100Oncogene BioVision
AB19055Chemicon
AB815Chemicon
AB8102Ghemicon
MMP-14RDI-MMP14 MAB3317Res. Diagnostics, Inc. Chemicon
AB8221Chemicon
AB8103Chemicon
AB850Chemicon
MMP-15MAB3320Chemicon
AB855Chemicon
OPA1-08512ABR
AB8122Chemicon
TIMP-1AB770Chemicon
AB8116Chemicon
PC500Oncogene
AB801Chemicon
TIMP-2RP2T2 IM11L CL1T2Triple Point Biologies Oncogens CedarLane
MAB3310Chemicon
AB8107Chemicon
36CX2T3 CedarLane TIMP陽3 麵3L Oncogene _H-TIMP-3 Triple Point Biologies
AB816 Chemicon TIMP-4 MAB974 R&D Systems
Ab 19087 Chemicon
本文中术语"抗体"作广义使用，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。 除了完整的免疫球蛋白外，术语"抗体"还包括所述免疫球蛋白分子的片
段或多聚物以;^A类或人源化形式的免疫球蛋白分子或其片段，只要根据
它们与醒P或TIMP相互作用的能力来对其选择即可。可使用本文所述的 体外测定或类似方法来测试抗体的所需活性，之后根据已知的临床试验方 法测定它们的体内治疗和/或预防活性。
本文使用的术语"单克隆抗体"是指从基本上均一的抗体群体中获得 的抗体，即，该群体中的个体抗体相同，除了可存在于少量抗体分子中的
可能存在的天然突变。本文的单克隆抗体特别地包括"嵌合抗体"及其片 段，只要它们显示出所需的拮抗活性，其中所述"嵌合抗体"中重链和/ 或轻链的一部分与来自一种特定物种的抗体或属于一种特定抗体类别或 亚类的抗体的相应序列相同或同源，而该链的其他部分与来自另 一物种的 抗体或属于另一抗体类别或亚类的抗体的相应序列相同或同源(参见美国 专利4， 816, 567和Morrison et al.，JcaA it/. ra^， 81: 6851-6855 (1984))。
所公开的单克隆抗体可用任何生产单克隆抗体的方法制备。例如，可 用杂交瘤方法制备公开的单克隆抗体，例如Kohler andMilstein, Nature: 256: 495 (1975)中所述。在杂交瘤法中，通常用免疫剂免疫小鼠或其他合 适的宿主动物，以引发能产生或产生可与该免疫剂特异地结合的抗体的淋 巴细胞。或者，也可例如使用本文所描述的HIV Env-CD4辅助受体 (coreceptor )复合物在体外免疫'淋巴细胞。
也可用重组DM法制备单克隆抗体，例如美国专利4， 816， 567 (CabUly等人)中所述。编码所公开的单克隆抗体的DM可用常规方法 (例如，使用能特异地结合编码鼠类抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探 针)容易地分离和测序。也可采用噬菌体展示技术产生和筛选抗体或活性
37抗体片段的文库，例如，如Burton等人的美国专利5， 804， 440和Barbas 等人的美国专利6, 096， 441所述。
体外方法也适于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规方法消化抗 体以产生抗体片段，特别是Fab片段。例如，可使用木瓜蛋白酶进行消化。 木瓜蛋白酶消化的实例在1994年12月22日公开的W0 94/29348和美国 专利4, 342, 566中有描述。抗体的木瓜蛋白酶消化通常产生两个相同的抗 原结合片段以及余下的Fc片段，上述抗原结合片段称为Fab片段，每个 片段具有单一的抗原结合位点。胃蛋白酶处理可得到具有两个抗原结合位 点且仍能交联抗原的片段。
不论是否与其他序列相连接，所述片段也可包含特定区域或特定氨基 酸残基的插入、缺失、取代或其他选定的修饰，条件是，与未修饰的抗体 或抗体片段相比，不显著改变或损害该抗体或抗体片段的活性。这类修饰 可提供某些其他特性，例如，去除/添加能进行二硫键合的氨基酸、提高 其生物寿命、改变其分泌特征等。任何情况下，所述抗体或抗体片段都须 具有生物活性，例如与其相关抗原特异地结合。所述抗体或抗体片段的功 能性或活性区域可通过对蛋白质特定区域诱变以及随后进行表达并且测 试表达的多肽来识别。这类方法对于本领域技术人员而言是显而易见的， 可包括对编码所述抗体或抗体片段的核酸进行位点特异性诱变(Zoller, MJ. Curr. Opin. Biotechnol. 3: 348-354， 1992 )。
本文所使用的术语"抗体"也可指人类抗体和/或人源化抗体。很多 非人类抗体(例如来源于小鼠、大鼠或兔的抗体)天然地对人类具有抗原 性，因此，当将其给予人类时会产生不良的免疫反应。因此，在所述方法
8.参照值
提供了可指示受试者中LVD的存在或预测受试者中LVD的发生的廳P 和/或TIMP谙。所述指示受试者中LVD的存在或预测受试者中LVD的发生 的谱可以是相对于正常值的数值。给定分析物(醒P或TIMP)的正常值可 以是被证实无明显心血管疾病迹象的年龄匹配受试者的参照值。因此，所 述正常值可以是来自大量健康个体的群体值。这些参照正常值可通过群体 研究获得。已有大型群体研究例如测定出参比组的TIMP-1的相对水平
38(Framingham Heart Study, Circulation 2004; 109: 2850— 2856 )大约 为800 ng/mL，该值与表4所示参比对照值一致。
或者，所述正常值可以是4皮认为对于既定受试者而言是正常的数值。 例如，可以对健康个体的相关分析物进行基线测量，并将其用于和后来从 该个体获得的测量值相比较，以识别当前的疾病或向LVD发展的进程。
表7提供了每种丽P和TIMP的参照正常值和醒P-9/TIMP之比。
表4总结了其他参照正常值和患者在心肌梗塞后出现的参照正常值。 这些绝对值下面的是这其中的每一种分析物中的预测变化百分比，该预测 变化百分比被认为是显著的，并且可诊断疾病进程。多个醒P或TIMP检 测结果可特别用于高特异性诊断或提供最佳预后信息。例如，醒P-9增加 超过100%，而MMP-2或醒P-7无变化并伴有匪P/TIMP之比大于100%，会 提供最大的敏感度和特异性。
不连续观察(例如MMP-13的)是将连续变量(例如给定分析物的血 浆浓度)转变为二分变量。在该具体实例中，若大于10 ng/mL的值被认 为是可检测的或者阳性数值，小于IO ng/mL的值被认为是阴性数值时， 则可将一个+/一值赋予醒p一i3。
例如，提供了一种诊断受试者未患心肌梗塞或确定受试者没有增加由 于对心肌梗塞特异的不利心室重构而出现心力衰竭的危险的方法，包括测 量所述受试者组织或体液中的醒P和/或TIMP水平，并将所述水平与参照 值进行比较。因此，證-2、醒P-9、證-7、證-13、腿P-8、 TIMP-1、 TIMP-2 和TIMP-4中的一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种或/\种的正 常值即为未患心肌梗塞的指标。
在某些方面，正常范围内的醒P-2血浆水平表示未患心肌梗塞。在某 些方面，正常范围内的醒P-9血浆水平表示未患心肌梗塞。在某些方面， 正常范围内的MMP-8血浆水平表示未患心肌梗塞。在某些方面，正常范围 内的TIMP-1血浆水平表示未患心肌梗塞。在某些方面，正常范围内的 TIMP-2血浆水平表示未患心肌梗塞。在某些方面，正常范围内的TIMP-4 血浆水平表示未患心肌梗塞。
在某些方面，醒P-2血浆水平介于约1000至1500 ng/ml之间，包括 约1000、 1100、 1200、 1300、 1400和1500 ng/ml时，即表示未患心肌梗 塞。
39在某些方面，醒P-9血浆水平低于约20 ng/ml，包括低于约20、 19、 18、 17、 16、 15、 14、 13、 12、 11、 10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3、 2或1 ng/ml 时，即表示未患心肌梗塞。
在某些方面，MMP-8血浆水平低于约3 ng/ml，包括低于约3、 2或1 ng/ml时，即表示未患心肌梗塞。
在某些方面，TIMP-l血浆水平低于约1000 ng/ml,包括高于约1000、 900、 800、 700、 600、 500、 400、 300、 200、 100、 50、 40、 30、 20或10 ng/ml时，即表示未患心肌梗塞。
所述方法可进一步包括测量两种或多种醒P和/或TIMP的血浆水平。 例如，所述方法可包括测量丽P-2、画P-9、應P-7、醒P-13、丽P-8、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或八种。因 此，所述方法可包括测量醒P-2和醒P-9或者醒P-2和醒P-7、醒P-2和 MMP-13、證-2和醒P-8、醒P-2和TIMP-1、醒P-2和TIMP-2、醒P-2和 TIMP-4、MMP-9和醒P-7、MMP-9和薩P-13、醒P-9和MMP-8、醒P-9和TIMP-1、 醒P-9和TIMP-2、醒P-9和TIMP-4、 ,-7和證-13、薩P-7和醒P-8、 腿P-7和TIMP-1、 ,-7和TIMP-2、證-7和TIMP-4、薩P-13和醒P-8、 MMP-13和TIMP-1、廳P-13和TIMP-13、MMP-13和TIMP-4、薩P-8和TIMP-1、 醒P-8和TIMP-2、醒P-8和TIMP-4、 TIMP-1和TIMP-2、 TIMP-1和TIMP-4、 TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量醒P-2、薩P-13和TIMP-1; 醒P-2、醒P-13和TIMP-2; MMP-2、 MMP-13和TIMP-4;薩P-13、 TIMP-1 和TIMP-2;腿P-13、 TIMP-1和TIMP-4;醒P-13、 TIMP-2和TIMP-4。因此， 所述方法可包括测量匪P-2、醒P-13、 TIMP-1和TIMP-2;画P-2、薩P-13、 TIMP-1和TIMP-4;醒P-2、 MMP-13、 TIMP-2和TIMP-4;醒P-13、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4;醒P-2、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法 可包括测量醒P-2、 MMP-13、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4。本文也考虑和/> 开了这些分析物的其他组合。
所述方法可进一步包括计算一种或多种醒P或TIMP与其他的醒P或 TIMP的比值，例如，所述方法可包括计算醒P-9与TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4 的比值。
例如，在某些方面，醒P-9/TIMP-l血浆水平之比低于约15x103,包 括低于约15x103、 14xl03、 13x103、 14x103、 11xl03、 10xl03、 9xl03或8乂1()3时，即表示未患心肌梗塞。
在某些方面，MMP-9/TIMP-2血浆水平之比低于约50 x 104，包括低于 约50xl04， 40 x 104， 30 x 104或20 x 104时，即表示未患心肌梗塞。
在某些方面，MMP-9/T頂P-4血浆水平之比小于约10，包括小于约10、 9、 8、 7、 6、 5、 4、 3或2时，即表示未患心肌梗塞。
9.诊断
可在MI后的早期获得醒P和/或TIMP的血浆谱。这被限定在MI约 72小时内一一最常发生在对MI介入治疗(血栓溶解、血管成形术、支架 等)时。根据该谱，LV心肌基质断裂的程度得到评估，并且将提供关于 有多少心肌被MI影响的确定的和独特的量度。该系列的醒P/TIMP测量 可与目前使用的可鉴定MI发生的生物标记(如肌钙蛋白或肌酸激酶水平) 结合使用。然而，不同于这些生物标记，醒P/TIMP谱可鉴定有多少心肌 被MI影响(损伤的心肌和"边缘"或良性中立心肌(innocent bystander myocardium))。本文描述的特异醒P/TIMP谱可提供关于MI后心肌结 构发生改变的程度的信息，并且可预测性和定量地评估这些结构改变会 如何导致心室几何形态(即容积)发生变化。另外，可构建数学模型， 该数学模型可通过将目前常规的测量工具生物标记与丽P/TIMP水平相结
合来指导对全部心肌损伤程度和潜在受影响心肌的诊断。例如，使用与 固P/TIMP测量结果相结合的肌钓蛋白数值，可鉴别在MI后的早期有急剧 血液动力学补偿风险的患者并将其分为不同的等级。举例来讲，MI后24 小时肌钓蛋白水平是正常值的2.5倍、同时醒P-9水平是正常值的3倍 且TIMP-4水平低于正常值2倍的患者应可能有充分的理由要求更为仔细 的监护以及额外的药剂，以防潜在的致命性心律失常。对于这一实例的 合理解释在于，致命性心律失常是一个在MI后的早期引发疾病和死亡的 重要因素，其出现本质上并非是由于心肌不可逆受损的程度，而是由于 有活力的再次充盈的心肌的急剧重构程度，该重构主要受匪P/TIMP的改 变所支配。
例如，提供了一种诊断受试者心肌梗塞的方法，包括测量所述受试者 组织或体液中的醒P和/或TIMP水平，并将所述水平与参照值进行比较。 在某些方面，所述组织或体液取自胸痛发作约72小时内的受试者。
在某些方面，醒P-2血浆水平低于约1000 ng/ml，包括低于约1000、
41990、 980、 970、 960、 950、 940、 930、 920、 920、 900、 890、 880、 870、 860、 850、 840、 830、 820、 810、 800、 790、 780、 770、 760、 750、 740、 730、 720、 710、 700、 650、 600、 550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 250或100 ng/ml时即表示有心肌梗塞。
在某些方面，醒P-9血浆水平高于正常值时即表示有心肌梗塞。例如， 醒P-9的量比正常平均值至少高约100%时，可表示有心肌梗塞。在某些方 面，醒P-9血浆水平高于约20 ng/ml，包括高于约20、 21、 22、 23、 24、 15、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95或100 ng/ml时即表示有心肌梗塞。
在某些方面，醒P-8血浆水平高于正常值时即表示有心肌梗塞。例如， MMP-8的量比正常平均值至少高约50%时，可表示有心肌梗塞。在某些方 面，醒P-8血浆水平高于约3ng/ml，包括高于3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 25、 30、 35、 40、 45或50ng/ml
时，即表示有心肌梗塞。
在某些方面，TIMP-1血浆水平高于正常值时即表示有心肌梗塞。例如， TIMP-1的量比正常平均值至少高约50%时，可表示有心肌梗塞。在某些方 面，TIMP-l血浆水平高于约1000 ng/ml，包括高于约1000、 1010、 1020、 1030、 1040、 1050、 1060、 1070、 1080、 1090、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1400或1500 ng/ml时即表示有心肌梗塞。
在某些方面，TIMP-2血浆水平在正常范围内时即表示有心肌梗塞。在 某些方面，TIMP-4血浆水平在正常范围内时即表示有心肌梗塞。在某些方 面，醒P-7血浆水平在正常范围内时即表示有心肌梗塞。在某些方面， MMP-13血浆水平在正常范围内时即表示有心肌梗塞。
所述方法可进一步包括测量两种或多种醒P和/或TIMP的血浆水平。 例如，所述方法可包括测量醒P-2、醒P-9、 MMP-7、醒P-13、醒P-8、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或/\种。因 此，所述方法可包括测量醒P-2和MMP-9;或者醒P-2和醒P-7;醒P-2 和腿P-13;醒P-2和醒P-8;醒P-2和TIMP-1;醒P-2和TIMP-2;醒P-2 和TIMP-4;醒P-9和醒P-7;醒P-9和MMP-13; ,-9和腿P-8;醒P-9和 TIMP-1; ,—9和TIMP-2; ,-9和TIMP-4;證一7和醒P-13;醒P-7和
42醒P-8;腿P-7和TIMP-1; MMP-7和TIMP-2; MMP-7和TIMP-4;醒P-13和 醒P-8;醒P-13和TIMP-1;醒P-13和TIMP-13; MMP-13和TIMP-4;醒P-8 和TIMP-1;醒P-8和TIMP-2; MMP-8和TIMP-4; TIMP-1和TIMP-2; TIMP-1 和TIMP-4; TIMP-2和TIMP-4。因此，本方法可包括测量MMP-2、醒P-13 和TIMP-1;醒P-2、 MMP-13和TIMP-2;醒P-2、 MMP-13和TIMP-4;醒P-13、 TIMP-1和TIMP-2;醒P-13、 TIMP-1和TIMP-4; MMP-13、 TIMP-2和TIMP-4。 因此，本方法可包括测量醒P-2、醒P-13、TIMP-1和TIMP-2;醒P-2、醒P-13、 TIMP-1和TIMP-4;醒P-2、醒P-13、 TIMP-2和TIMP-4; MMP-13、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4;醒P-2、 TIMP-1 、 TIMP-2和TIMP-4。因此，本方法可 包括测量醒P-2、醒P-13、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4。本文考虑并公开了 上述分析物的其他组合。
所述方法可进一步包括计算一种或多种醒P或TIMP与其他醒P或 TIMP的比值。例如，所述方法可包括计算丽P-9与TIMP-1 、TIMP-2或TIMP-4 的比值。
在某些方面，醒P-9/TIMP-1血浆水平之比高于正常值时即表示有心肌 梗塞。例如，MMP-9/TIMP-l之比高于正常平均值至少约100%时，可表示 有心肌梗塞。例如，在某些方面，醒P-9/TIMP-l血浆水平之比高于约15
x 103,包括高于约15 x103、16 x103、17x103、18x103、19x103、20x
103、21xl03、 22 x103、23x103、24 x103、15 x103、26 x103、27 x103、
28 x103、 29 x 103、30 x103、31 x103、32 x103、33 x103、34 x103、35 x
103、36 x 103、 37 x103、38 x103、39 x103、40x103、41 x103、42 x103、
43x103、 44 x 103、45 x103、46 x103、47 x103、48 x103、49 x103、50 x
103、55xl03、 60 x103、65 x103、70 x103、75 x103、80 x103、85 x103、
90 x 103、 95xl()3或100xl03时,即表示有心肌梗塞。
在某些方面，醒P-9/TIMP-2血浆水平之比高于正常值时即表示有心肌 梗塞。例如，固P-9/TIMP-2之比高于正常平均值至少约100%时，可表示 有心肌梗塞。在某些方面，醒P-9/TIMP-2血浆水平之比高于约50 x 104, 包括高于约50 x 104、 51xl04、 52 x 104、 53 x 104、 54 x 104、 55 x 104、 56
x104、 57 x 104、 58 x 104、 59 x 104、 60 x 104、 65 x 104、 70 x 104、 75 x 104、 80 x 104 、 85 x 104、 90 x 104、 95 x 104、 100 x 104、 105 x 104、 110 x104、 115
x104、 120 x 104、 125 x 104、 130 x 104、 135 x 104、 140 x 104或150 x 104
43时，即表示有心肌梗塞。
在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比高于正常值时即表示有心肌 梗塞。例如，MMP-9/TIMP-4之比高于正常平均值至少约100%时，可表示 有心肌梗塞。在某些方面，MMP-9/TIMP-4血浆水平之比高于约10，包括 高于约IO、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95或100时，即表示有心肌梗塞。
在某些方面，MMP-9/TIMP-1血浆水平之比高于约15 x 103， MMP-9/TIMP-2血浆水平之比高于约50 x 104，以及醒P-9/TIMP-4血浆水平 之比高于约10时，即表示有心肌梗塞。
在某些方面，醒P-2血浆水平小于约1000 ng/ml，廳P-8血浆水平高 于约3 ng/ml， MMP-9/TIMP-1血浆水平之比高于约15 x 103,醒P-9/TIMP-2 血浆水平之比高于约50 x 104,以及醒P-9/TIMP-4血浆水平之比高于约10 时，即表示有心肌梗塞。
10.预后
MMP/TIMP分析可在MI后的早期的几天内进行检测，例如优选为在1-7 天内的某个时间。这是一个非常普通的随访期，因此MI后5-7天的时间 段被用于下面报告的可行性研究。然而，如本文其他位置注明的，有用 的预后和诊断信息可在急性疾病或康复的整个过程中获得。因此特异的 醒P/TIMP诿的改变可用于识别那些在随后的数月/数年中严重不利LV重 构和扩张的危险增加的患者。如在实施例中指明的，已经产生了支持 醒P/TIMP镨的预后值的大量数据。例如，在患者MI后的7天中的某些时 间点对匪P-9、醒P-8、 TIMP-l和TIMP-4的水平的检测证明了一种特异 时间模式。这种时间模式可用于预测将在MI后大约1个月发生的LV扩 张的程度。因此，通过另外的影像研究、MMP/TIMP谱和更积极的给药方 案的介入，该预后信息可用于更积极地追踪那些患病风险增加的患者。
例如，提供了 一种识别由于对心肌梗塞特异的不利心室重构而患心力 衰竭的风险增加的受试者的方法，包括测量所述受试者组织或体液中的 腿P和/或TIMP水平，并将所述水平与参照值进行比较。
在某些方面，腿P-2血浆水平低于约1000 ng/ml,包括低于约1000、
44990、 980、 970、 960、 950、 940、 930、 920、 920、 900、 890、 880、 870、 860、 850、 840、 830、 820、 810、 800、 790、 780、 770、 760、 750、 740、 730、 720、 710、 700、 650、 600、 550、 500、 450、 400、 350、 300、 250、 200、 250或100 ng/ml时，即表示发生心力衰竭的风险增加。
在某些方面，廳P-9血浆水平高于正常值时表示发生心力衰竭的风险 增加。例如，MMP-9的量比正常平均值高至少约100%时，可表示发生心力 衰竭的风险增加。在某些方面，醒P-9血浆水平高于约20 ng/ml，包括高 于约20、 21、 22、 23、 24、 15、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95或100 ng/ml时，即表示发生心 力衰竭的风险增加。
在某些方面，TIMP-1血浆水平高于正常值时即表示发生心力衰竭的风 险增加。例如，TIMP-1的量比正常平均值高至少约50%时，可表示发生心 力衰竭的风险增加。在某些方面，TIMP-1血浆水平高于约50 ng/ml，包 括高于约50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95或100ng/ml时，即表示发生心力衰竭的风险增加。
在某些方面，T頂P-2血浆水平在正常范围内时即表示发生心力衰竭的 风险增加。在某些方面，TIMP-4血浆水平在正常范围内时即表示发生心力 衰竭的风险增加。在某些方面，TIMP-2血浆水平高于约1000 ng/ml，包 括高于约1000、 1010、 1020、 1030、 1040、 1050、 1060、 1070、 1080、 1090、 1100、 1150、 1200、 1250、 1300、 1350、 1權或1500 ng/ml时， 即表示发生心力衰竭的风险增加。
在某些方面，醒P-7血浆水平在正常范围内时即表示发生心力衰竭的 风险增加。在某些方面，醒P-8血浆水平在正常范围内时即表示发生心力 衰竭的风险增加。在某些方面，MMP-13血浆水平在正常范围内时即表示发 生心力衰竭的风险增加。在某些方面，TIMP-4血浆水平在正常范围内。
所述方法可进一步包括测量两种或多种薩P和/或TIMP的血浆水平。 例如，所述方法可包括测量醒P-2、醒P-9、 MMP-7、醒P- 13、醒P-8、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4中的两种、三种、四种、五种、六种、七种或/\种。因 此，所述方法可包括测量醒P-2和觀P-9 、醒P-2和醒P-7 、醒P-2和画P-13、 MMP-2和證一8、醒P-2和TIMP-1、匿一2和TIMP-2、 MMP-2和TIMP-4、
45醒P-9和MMP-7、MMP-9和醒P-13、MMP-9和薩P-8、MMP-9和TIMP-l、醒P-9 和TIMP-2、顧P-9和TIMP-4、醒P-7和薩P-13、醒P-7和證-8、醒P-7 和TIMP-1、 MMP-7和TIMP-2、醒P-7和TIMP-4、 MMP-13和薩P-8、薩P-13 和TIMP-1、醒P-13和TIMP-13、丽P-13和TIMP-4、醒P-8和TIMP-1、醒P-8 和TIMP-2、 MMP-8和T頂P-4、 TIMP-1和TIMP-2、 TIMP-1和TIMP-4、 TIMP-2 和TIMP-4。因此，所述方法可包括测量醒P-2、 MMP-13和TIMP-1;醒P-2、 醒P-13和TIMP-2;醒P-2、 MMP-13和TIMP-4;醒P-13、 TIMP-1和TIMP-2; 腿P-13、 TIMP-1和TIMP-4;醒P-13、 TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法 可包括测量腿P-2、 MMP-13、 TIMP-1和TIMP-2;應P-2、 MMP-13、 TIMP-1 和TIMP-4; MMP-2、 MMP-13、 TIMP-2和TIMP-4;醒P-13、 TIMP-1、 TIMP-2 和TIMP-4;匿-2、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4。因此，所述方法可包括测 量醒P-2、丽P-13、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4。本文还考虑和公开了这些 分析物的其他组合。
所述方法可进一步包括计算一种或多种MMP或TIMP与其他MMP或 TIMP的比值。例如所述方法可包括计算醒P-9与TIMP-1、TIMP-2或TIMP-4 的比值。
在某些方面，MMP-9/TIMP-l血浆水平之比高于约15时，包括高于约
15 x103、16 x103、17 x103、18 x103、19 x103、20x103、21 x103、22 x
103、23x103、24 x103、15 x103、26 x103、27 x103、28 x103、29 x103、
30 x103、31 x103、32 x103、33 x103、34 x103、35 x103、36 x103、37 x
103、38 x103、39 x103、40 x103、41 x103、42 x103、43x103、44 x103、
45 x103、46 x103、47 x103、48 x103、49 x103、50x103、55 x103、60x
103、65 x103、70x103、75 x103、80x103、85 x103、90 x103、95 x103
或100xlO"时，即表示发生心力衰竭的风险增加。
在某些方面，醒P-9/TIMP-2血浆水平之比高于正常值时即表示发生心 力衰竭的风险增加。例如，醒P-9/TIMP-2之比高于正常平均值至少约100% 时，可表示发生心力衰竭的风险增加。在某些方面，醒P-9/TIMP-2血浆水 平之比大于约500，包括大于约50xl04、 51x104、 52xl04、 53 x 104、 54 x104、 55 x 104、 56 x 104、 57 x 104、 58 x 104、 59 x 104、 60 x 104、 65 x 104、 70 x 104、 75 x 104、 80 x 104、 85xl04、 90 x 104、 95 x 104、 100 x 104、 105 x104、 110 x104、 115 x104、 120 x 104、 125 x 104、 130 x 104、 135 x 104、
46140 x 104或150 x 104时，即表示发生心力衰竭的风险增加。
在某些方面，醒P-9/TIMP-4血浆水平之比高于正常值时即表示发生心 力衰竭的风险增加。例如，薩P-9/TIMP-4之比高于正常平均值至少约100% 时，可表示发生心力衰竭的风险增加。在某些方面，醒P-9/TIMP-4血浆 水平之比高于约IO，包括高于约IO、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95或100时，则表示发生心力衰竭的 风险增加。
在某些方面，醒P-9/T頂P-1血浆水平之比高于正常值时即表示有发生 心力衰竭的风险增加。例如，MMP-9/TIMP-l之比高于正常平均值至少约 100%时，可表示发生心力衰竭的风险增加。在某些方面，MMP-9/TIMP-l 血浆水平之比高于约15 x 103,醒P-9/TIMP-2血浆水平之比高于约50 x 104,及MMP-9/TIMP-4血浆水平之比高于约10时，即表示发生心力衰竭的 风险增加。
在某些方面，画P-2血浆水平小于约1000 ng/ml，醒P-8血浆水平大 于约3 ng/ml，醒P-9/TIMP-l血浆水平之比高于约15 x 103, MMP-9/TIMP-2 血浆水平之比高于约50x 104,及醒P-9/TIMP-4血浆水平之比高于约10 时，即表示发生心力衰竭的风险增加。
11.指导治疗性干预
急性MI期后，醒P/TIMP镨的监测可用作LV心肌重构的生物标记。 在此文中，醒P/TIMP谱可作为药物疗效的监测结果。尽管有很多依照本 申请建立的临床实例，但是本文将只提供用于举例说明的实例。美国心脏 病协会(American Heart Association/ American College of Cardiology) 的现行指导方针清楚地说明患者在MI后应该被施以当前的药物治疗他 汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂、P-阻滞剂和血小板拮抗剂。尽管 提倡使用这些药物治疗，但是为具体患者提供最佳疗效的具体剂量尚不 清楚。此外，当这些药物中的数种的剂量增加(逐步增高剂量)时会增 加不希望的副作用(低血压、性副作用等)。因此使用可提供在MI后患 者中出现的心肌重构程度指数的一 系列可靠的生物标记，提供了 一种建 立理论给药方案的方法。治疗目标是使在MI后的时期的醒P和TIMP水
47平正常化，连续监测这些丽P/TIMP水平，如必要的话调整药物以保持正 常固P/TIMP水平。有一系列严密的研究说明如例他汀类药物和血管紧张 素转换酶抑制剂的药物可影响心血管系统内的醒P/TIMP水平。因此，实 施例1、 2、 3和4显示的数据与现有的药物可影响画P/TIMP水平这一事 实相结合，提供了将MMP/TIMP作镨用作指导在MI后的时期的疗效的手 段的基础。
12. 组合
本文^^开的方法可进一步包括检测心力衰竭的其他标记。例如，本文 公开的方法可进一步包括测量所述受试者组织或体液中的NT-proBNP水 平，并将所述水平与参照值进行比较。本文公开的方法可进一步包括测量 所述受试者组织或体液中的肌钓蛋白-I的水平，并将所述水平与参照值进 行比较。
13. 检测时枳i
检测时机分为两个阶段。第一是确定或排除基本疾病过程的存在， 并提供预后信息。第二是将血浆分析用于筛选并识别可能有发生心力衰 竭风险的患者。如下面所述和对诊断、预后和治疗监测所阐明的，检测 时机是病例特异的。对于诊断，初始检测时机应在MI发生后的72小时 内。这被定义为患者出现MI体征和症状(胸痛等)的时间，这些症状被 可指示MI是否存在的ECG确认。随后，医师会通过验血以检测醒P/TIMP 谱的异常程度和由于MI而出现的心肌重构的程度。这会指导医师进行进 一步的诊断测试和治疗计划。另一个采集血样时机的实例是当患者的急 性MI被成功地治疗，但医师想获得预后信息以指导将来的医疗/干预处 理时。在这种情况下，连续监测MI后的早期(最多7天)的MMP/TIMP 谱可用作LV重构(如实施例1所述的LV扩张)进展的预测工具。因此， 本申请中所述测试的采集血样时机是由病例决定的。对任何给定的受试 者，这些测试可作为诊断工具只应用一次，或连续应用多次。
在心肌梗塞背景下，可从确认心肌梗塞起的72小时内进行血浆分析。 血浆分析可在住院期间(2-7天)连续进行，然后在例行安排的随访中进 行。这可提供腿P-9和醒P/TIMP比例的时间图，并鉴别醒P和醒P/TIMP 水平更高的那些患者。这些患者被认为在心力衰竭过程中出现不利心室 重构的风险增加。这些检测一般在确定心肌梗塞后的前2年每季度进行
48一次，但是每天、每周或每月进行检测达2-96个月也在考虑之中。可用 于追踪和识别在心肌梗塞(冠状动脉综合征)后出现心力衰竭的风险增 加的患者的可能算法的示意图如图16所示。
一旦患者被鉴别出具有MMP、醒P-TIMP阈值水平，那么可开始更强 力的常规医药治疗。这可包括P肾上腺素能激动剂的增量滴定(up titration)、血管紧张素抑制(转化酶和受体抑制)、抑制素治疗、以 及其他血管形成术介入(基于导管和外科手术)。然后每月检测一次醒P 和MMP/TIMP比例，并将其用于检测医疗/干预方案的效果。
因此，本文提供一种提高心脏病患者保健的方法，包括监测醒P的 量和固P/TIMP比例、以这些检测结果和比例为基础识别有患心力衰竭风 险的患者以及向所述患者提供合适的药物或更高水平合适的药物(P肾 上腺素能激动剂、血管紧张素抑制(转化酶和受体抑制)、抑制素)或 其他血管形成术介入(基于导管和外科手术)。
具有心肌梗塞、心血管胸痛或其他冠状病情史的患者可在初级护理 或医药筛选过程中进行血浆分析。如果MMP/TIMP水平达到或超过表4中 所鉴定的水平，那么这些患者可被更为有力地评估并且可开始进一步随 访。
可在通过ECG标准确认MI后进入ER/胸部疼痛门诊时采集第一个样 本。可在这一时间点检测匪P/TIMP镨。可在此第一次检测的72小时内 第二次检测醒P/TIMP语。然而，也可在初次和第二次检测之间间歇采样 (8-12小时间隔)，以提高醒P/TIMP镨的时间精确度。在患者准备出院 时，醒P/TIMP语改变的相对幅度可适用本申请所述的算法。这使得可对 有出现不利LV重构和心力衰竭的风险的患者进行风险分级。随后对 薩P/TIMP镨改变较大的那些患者可使用更强力的药疗方法和更频繁的门 诊访问。门诊访问的方法如下所述。
如果患者被诊断出醒P/TIMP谱显著改变，那么每间隔一月进行一次 重复访问，此时检测醒P/TIMP镨并调整药物，从而试图使这些谱"正常 化"。随着这些值正常化，所述患者可在每个季度被检测一次。
可对经诊断醒P/TIMP谱改变较小的患者进行每两年一次的重复测 量。如果这些镨向上改变，那么可进行上述增加给药和取样频率的方法。
过去具有MI史的患者，其薩P/TIMP谱未在指示事件(因MI急性治
49疗而入院)发生时被初始检测，那么也可适用这种诊断方法。在这种情
况下，对因过去有MI史而有出现不利LV重构的高风险的患者可在第一 次门诊访问时进行取样。醒P/TIMP镨与正常参照范围进行比较，对于那 些具有指示不利LV重构风险的高醒P/TIMP谱的患者可考虑进行前面部 分所述的强力治疗。
C. 试剂盒
本文公开的试剂盒装有可用于实施本文公开的方法的试剂。所述试剂 盒可包括本文所述的任何试剂或试剂的组合，或者被认为是实施本文公开 的方法所需的或对其有益的试剂或试剂的组合。如前文所述，醒P/TIMP 试剂盒的组分可包括使目的醒P和/或TIMP与一种检测试剂复合所必需的 试剂。在免疫测定方法的实例中，可将血样与针对特定的顧P或TIMP的 荧光标记的抗体一起孵育，并在洗涤和非特异性结合清除步骤之后，通过 测量荧光相对强度计算与所述目的MMP或TIMP结合的抗体量。它可以是 一种非常简单的可用于筛选的试剂盒，或者是一种更为复杂的测量单个样 本中的多种醒P/TIMP的系统。从测量一种目的醒P或TIMP到同时测量多 种MMP/TIMP的多层次方法的基本原理已在前文中描述。对于筛选测定(例 如醒P-9),可将小量血样处理成血浆(离心)，并将该血浆与抗醒P-9 抗体混合。可将混合物再次离心，通过荧光分析系统读取特异性结合醒P-9 的抗体。该设备和测量系统可容易地制成小型手提箱或桌面系统。上述系 统的读数可指示醒P-9是否低于或高于(如前文中所定义的)特定的测量 阈值。
D. 实施例
下面的实施例用于向本领域的普通技术人员提供关于本文要求保护 的化合物、组合物、物品、设备和/或方法是如何建立和评估的完整公开 和描述，并且只是意图例证本发明而不意图限制发明人所认定的其发明的 范围。我们已经尽力保证数字的精确性(如量、温度等)，但某些错误和 偏差不可避免。除非另外指出，份数是指重量份数，温度是摄氏度或室温， 压力处于或接近大气压。
50实施例1:在心肌梗塞后的患者中基质金属蛋白酶释放的特异时间谱 与左心室重构的关系
潜论在MI后患者中出现醒P/TIMP的特异的时间模式，包括醒P-9 和醒P-8的早期强烈提高，TIMP-2的晚期增加和心脏特异的TIMP-4 —律 下降。这些独特发现表明了 MI后出现特异的MMP/TIMP血浆谱对预后和诊 断都4艮重要。
方法
菱试者32名被确定患有心肌梗塞(MI)的患者和53名参照对照受试 者在签订知情同意书后参与本研究。MI的确定是通过心电描记术和阳性 心肌酶检测。MI受试者的准入标准是从到急诊科开始48小时内所记录到 的肌钙蛋白I的值为实验室参照值的2. 5倍。如果有以下情况，则患者 被排除1) MI病史，2)在过去24个月内进行过冠状动脉重建术，3)预 测需要紧急冠状动脉重建术，4)非缺血性心脏病的心脏疾病状态(如淀 粉样变性、结节病、艾滋病、遗传肥大性栓塞性心肌病、心脏瓣膜病)， 5)在过去三年内有活性恶性肿瘤史，6)显著的肾脏或肝脏功能不全，7) 需要大量抗炎剂、类固醇或免疫抑制剂的进行性或活动性风湿性疾病， 8)显著的滥用药物史。下段中描述的研究时间基于指示性事件即被规定 为首次到急诊科的时间。对于本研究而言，最初的这一系列测量被定在 MI后第一天。对于本研究，从2001年秋天到2002年春天公开进行招募。 治疗干预距症状发作的平均时间为3. 5±0. 9小时，距研究开始的时间为 71±8小时，中点时间为50小时。在此MI后患者群中，33%接受血栓溶 解疗法，89%接受经皮冠状介入治疗(有或无支架的血管成形术)。根据 心电图描"^的检测，Ml的分布是36。/d前部，61%下方和3%后部。在84°/。的 MI患者中出现了 ST段抬高，在48W的MI患者中出现了 Q波。肌钓蛋白 水平峰值为166士30 ng/mL。入院时的平均白细胞计数有略微升高，为 10. 7±0. 72"03个细胞/mm3。
参照对照组由未显示心血管疾病的受试者组成。通过完整的医疗史、 全面的的体格检查、心电图和超声心动图来排除心血管疾病。对参照对 照和MI受试者的患者人口统计和药物谱如表3所示。对于MI患者，药 物镨是在MI后第一天开始使用并在整个研究期间持续使用。MI患者的药 物谱由主治医师根据美国心脏病协会/美国心脏病学会指导方针确定。对
51于对照受试者，使用P拮抗剂、ACE抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂治疗 收缩压轻微升高，但基于超声心动图研究表明不存在肥大。提供给一名 患者洋地黄，以治疗#^久以前的单次心房颤动发作。阿司匹林或抗炎药 作为关节痛的日常治疗的一部分用于参照对照组。
表3.正常对照受试者和心肌梗塞后患者的人口统计学数据
数目
男性
女性
年龄(岁) 体表面积(m2) 药物谱(占患者样 本的％) ACE-1 BB
利尿剂 抑制素 ASA
oc阻滞剂 CCB
洋地黄 ARB
血管扩张剂 抗炎剂
对照
53
20 (38%) 33 (62%) 59 ±1
1.87 ±0.03
9 9
15
17
23
0
0
11 0
11
MI
P值
32
24 (75%) 8(25%) 58 ±2
1. 99±0. 04
p=0. 65 p=0. 07
72 90 31 78 97 6
25
3
3
16 16
ACE-I =血管紧张素转换酶抑制剂，BB阻滞剂，ASA =阿斯匹林， CCB =钩通道阻滞剂，ARB =血管紧张素n受体拮抗剂，MI后(Post M) I =肌酸酐激酶或肌钙蛋白I大于2. 5倍正常或具有典型的ECG改变的患 者，对照-未显示出患心肌梗塞或心血管疾病的患者。
才法步嚴对MI患者，在研究准入时("MI后第一天")即进行试 验初始试验包括完整的医疗史、全面的体格检查、12导联心电图、超
52声心动图和用于检测應P和TIMP谱的血浆收集。从外周静脉收集血液， 再离心收集血浆。在MI后第2-5天、以及MI后第28天、第90天和第 180天的血浆用于检测固P和TIMP谱。在MI后第5天、第28天、第90 天和第180天还得到了超声心动图。进行每次实验前，所有患者均禁食 过夜但在早上服用开出的药物。对于对照受试者，在MI后第一天进行与 对MI后患者相同的完整试验。
M/P希77V戶^:对本研究，来自不同醒P种类的代表性醒P被测量。 具体地有，间质胶原酶匪P-8、明胶酶(MMP-2和MMP-9)和属于基质溶 解因子子类的醒P-7 (SpinaleFG, 2002; Woessner FJ. 1998; Gunasinghe SK， et al. 2001)。选择这些醒P种类的原则是它们已经在动物研究中 被鉴定出在MI后期被改变并且与急性损伤后的基质重构有关(Peterson JT, et al. 2001; Creemers EE， et al. 2002; Ducharme A， et al. 2000; Mukherjee R, et al. 2003; Wilson EM， et al. 2003; Schulze CJ， et al. 2003)。 MMP的组织抑制剂TIMP-l和TIMP-2在此研究中被测量，因 为它们在患者的血浆中被成功地鉴定，并显示出在MI动物模型中被改变 (Mukherjee R， et al. 2003; Wilson EM， et al. 2003; Bradham WS， et al. 2002; Joffs C， et al. 2001; Wilson EM， et al. 2002)。所有测 量方法均4吏用一种双位酶联免疫吸附测定(ELISA; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)，使用方法如前所述(Bradham WS， et al. 2002; Joffs C， et al. 2001 ; Wilson EM, et al. 2002)。简言之， 在受试者仰卧20分钟后收集血液。将样本立即离心，然后取出血浆层。 将分离的血浆分为3等份并在-801C冷冻。样本不能冻融。将血浆和各醒P 标准品加入含有目的醒P或TIMP的抗体的预包被孔中，并洗涤。在波长 450 nm处读取所得到的反应结果(Labsystems Multiskan MCC/340, Helsinki, Finland) 。 MMP-2测定(Amersham, RPN 2617)检测了醒P-2 的前体形式以及与TIMP-2复合的醒P-2。醒P-9测定(Amersham, RPN 2614) 检测了该酶的前体形式以及与TIMP-1复合的该酶。MMP-8测定系统 (Amersham, RPN2619)检测前体形式及活性形式。MMP-7测定(R&D Systems; DMP700)检测前体形式及活性形式。TIMP-1测定(Amersham, RPN 2611) 检测游离TIMP-1及与醒P复合的TIMP-1。 TIMP-2测定(Amersham, RPN 2618)检测游离TIMP-2及与活性醒P复合的TIMP-2。这些是高度灵敏的
53测定系统，检测范围是0. 016-1 ng/mL。所有样本被分析两次再取平均值。 这些测量值的批内变异系数小于6%。过去的研究证明了 TIMP-4在心血管 系统尤其是心肌中特异地和高度地表达(Li YY， et al. 1999; Greene J， et al. 1996)。另外，过去的研究还证明这种特异TIMP在MI动物模型 中被改变(Mukherjee R， et al. 2003; Wilson EM， et al, 2003; Yarbrough西，et al. 2003)。本实验室以前才艮道过通过免疫测定方法 可测量TIMP-4 (Stroud RE， et al. 2005)。因此，使用高灵敏度(0.008 ng/mL)和高特异性(与其他TIMP或蛋白酶没有交叉反应)的ELISA (R&D Systems, MN)。这个试验检测到游离TIMP-4和结合TIMP-4,且在TIMP-4 标准品的很大范围内(0. 003-0. 018 ng/mL)都是高度线性的(r2= 0. 95)。 这个ELISA也是用此实验室前述的定量免疫测定(Stroud RE， et al. 2005) 交互校准和验证的。除了通过定量ELISA检测醒P-2和醒P-9，还通过明 胶酶镨法进行半定量检测(Peterson JT, et al. 2001; Mukherjee R， et al. 2003; Wilson EM， et al. 2003; Spinale FG， et al. 2000)。
;^,心动塚才法用装有S-4MHz换能器的Sonos 5500系统进行经胸 超声心动图显像。使用美国超声心动图学会标准进行测量(Schiller NB， et al. 1989 )。用标准短轴位和胸骨旁长轴位进行二维超声心动图研究 以测量LV容积和射血分数。用圆盘法(Schiller NB， et al. 1989 )计 算LV舒张末期容积和收缩末期容积。每个检测都使用3次心跳的平均值。 进行二尖瓣的多普勒和彩色超声心动图研究以检测二尖瓣回流的程度并 对其定量。通过盲法编码并读取图像，这种分析直到本研究完成才发现 与MMP/TIMP水平的相关性。
数据分析基于偏度和峰度检验，对超声心动图检测结果与醒P和 TIMP血浆检测结果的分布的正态性进行检验。这种评估揭示了所述数据 可被认为符合正态分布，并因此使用参数统计。因此，所有本研究显示 的醒P/TIMP数据都以未转化的形式显示。用双尾Student t检验在参比 对照样本和MI后患者之间进行基线比较。使用重复测量ANOVA分析随时 间的变化情况，并通过Bonferroni界限进行均值分离(mean separation)。 <吏用线性回归方法考察在MI后的时期里醒P/TIMP水平的 变化与LV容积之间的关系。峰值肌钾蛋白水平不是正态分布的 (Shapiro-WilkW检验，p=0. 001)，因此用Spearman相关方法考察薩P
54水平改变和LV容积之间的关系。p值〈0. 05就被认为是显著的。所有数值 表示为平均值和平均值的标准误差(SEM)。所有统计方法都是用Stata Statistical Software (StataCorp， Rel 8.0， College Station, TX) 进行的。本文作者可获得全部所述数据并对其完整性负全责。所有作者 已阅读并同意原始书写稿。
结果
表4总结了年龄相当的对照和MI后患者在研究一开始获得的LV几何 形态和功能以及全身血压和心率的测量结果。在这个MI后的早期时间点， 与参照对照受试者相比，LV舒张末期容积增大，全身动脉血压降低。如 图l所示，在MI后的组次中LV舒张末期容积以依赖时间的方式增加。 MI后第28天相对于第一天LV舒张末期容积增加。尽管在MI后的组次中 出现了LV扩张，但是LV射血分数在MI后的早期少量增加，然后在MI 后研究期间的剩余时间里落入参照对照范围内。多普勒研究在整个MI后 研究期间评估时发现有72W的MI后患者没有明显的二尖瓣回流(MR)， 有19%的MI后患者有痕量MR,有9%的患者存在l+MR。
表4:参照对照受试者和心肌梗塞后患者的左心室结构和功能数据
对照1MI后 第一天2P值
LV舒张末期容积(mL)96 ±2111±50. 004
LV收缩末期容积33±135 ±30. 54
LV射血分数(％ )65±169 ±20. 035
心率(bpm)70±168 ±20.47
动Ji^收缩压力(mmHg)126 ±2119±30. 06
动脉舒张压力(mmHg)75 ±167 ±20. 0008
数据以平均值士SEM表示
1. 参照对照受试者；n=53
2. 指示性事件发生的72小时内的首次检测；n=32
表5总结了参照对照组和MI后的组次在首次检测点中获得的醒P-2、
55MMP-7、 MMP-8、 MMP-9、 TIMP-1、 TIMP-2和TIMP-4的血浆水平的绝对值。 这些检测结果也被计算为相对参照对照值的变化百分比。匪P-2水平在 MI后第1天比参照对照值低。相反，醒P-8和醒P -9的水平在MI后第1 天明显比参照对照值高。例如，血浆醒P-9水平在MI后第l天比参照对 照值高200%以上。血浆TIMP-1水平在MI后第l天比参照对照值高，而 TIMP-2和TIMP-4水平相对于参照对照值不变。为了考察MMP-9和TIMP-1 相对水平的变化之间的化学计量关系，计算了醒P-9/TIMP的比值(表4 )。 MI后第l天，醒P-9/TIMP的比值与参照对照值相比增加了超过100。yi,而 醒P-9/TIMP-2和MMP-9/TIMP-4增加了超过200%。
表5:醒P和TIMP数据；参照正常值和早期心肌梗塞值；诊断临界 点百分比(diagnostic percent cutpoint)
对照MI后: .第赢.相对对照的 变化%
MMP-2 (ng/hiL)1387±39-3帖
MMP-7 ittg/mL52.2±0.1-10±5
MMP-8 &g/m42.8±0.64.7±0.3*他19*
MMP-9ing/mLi13±349 ±4*27關*
TIMP-1 ing/mL)997±361632±47*64±12*
44±446 :t24.&U0.0
T證'4 fng/ntLi1.9±0.1-2雄9
MMP-9/T酸4 (xlO,14±333±5132B7*
MMP-9/nMP-2(xlO巧1350±250*248±64*
MMP-9/TIMP"47.8±1.628.1±4.0*261±52*
*相对于对照(r^53)，p <0. 05
在MI后患者中测得的随时间变化的醒P镨如图2所示。前体形式 醒P-2的血浆水平与对照相对值相比保持下降。全部MMP-7的血浆水平在 整个研究期间都与参照对照值相当。MMP-8水平在MI后第l天有明显升 高，在MI后第3天又有一个尖峰。前体形式MMP-9的血浆水平一直到MI 后第90天都有明显升高。对血浆样本进行凝胶酶谙法分析，可清楚地观 察到一条92kDa的蛋白水解条带，可能反映出醒P-9的水平(图3)。在 MI后的早期时间点，该92kDa区域的酶诿法活性相对参照正常对照增加。 一条对应醒P-2的72kDa的蛋白水解条带，在MI后第28天显示增加， 但在其他所有MI后时间点都在正常参照值范围内。
56TIMP镨的一系列血浆测量结果如图4所示。TIMP-1水平在整个MI 后研究期间都保持显著提高，TIMP-2水平在MI后第28天和第90天相对 于参照对照值增加。TIMP-4血浆水平在所有MI后时间点都比参照对照值 低。醒P-9和TIMP-4依赖时间的变化之间的关系如图4所示。在MI后的 早期时间点醒P-9/TIMP-4比例明显增加，且在MI后第180天再次增加。 从MI后第l天到第5天血浆醒P-9水平变化的各个反应曲线图如 图5所示。在这段时间内出现了各个醒P-9水平的混杂反应，因此各个 反应被计算为相对于MI后第1天的值的变化百分比。然后将这些值与MI 后第28天的LV舒张末期容积的变化联系起来(图5)。在那些在MI后 第5天醒P-9水平持续升高或增加的患者中，LV舒张末期容积在第28天 有极大的增加。基于MI后第一天到第五天匪P-9水平增加35%，将血浆 醒P-9水平的早期变化的相对幅度分级。在那些血浆醒P-9水平相对于 MI后第一天的值进一步增加的患者中，LV舒张末期容积更大的变化百分 比出现在MI后第90天(图6 )。没有观察到醒P-2、醒P-7、醒P-8或 TIMP-1、 TIMP-2水平的早期变化和LV扩张程度之间有明显相关性(r分 别=0. 27、 0.10、 0.04、 -0.20、 -0.24，全部都p〉0. 20)。然而，在醒P-9 的早期变化和LV扩张程度之间存在明显相关性。具体地，MI后第1至3 天之间检测到的廳P-9水平更强烈的变化与MI后第90天更大程度的LV 扩张相关(r-O. 63， p=0. 03)。峰值肌钓蛋白水平与醒P-9水平的早期变 化无关0:=0.01， p=0.94)，也与LV舒张末期容积的变化无关(r--O. 32, p-0.17)。关于其他协变量(coviate)，当通过MI位置或MI后给药情 况进行分级时，MMP/TIMP水平上没有显著差异(p>0. 40)。
本研究对MI后患者的代表性醒P和TIMP类型的血浆谱及LV几何形 态进行了一系列测量。从此研究中得到的独特和显著的发现分为2个层 面。首先， 一种独特的醒P和TIMP释放时间模式出现在MI后患者中。 具体地，MI后出现了血浆MMP-9和醒P-8的急剧提高，但其他类型醒P 如丽P-7和醒P-2相对参照对照保持不变或降低。MI后血浆TIMP-l水 平增加，但心脏特异的TIMP-4降低。第二，观察到某种类型醒P(醒P-9) 的早期增加与MI后的晚期出现的LV扩张程度有关系。这些结果表明MI 后患者的醒P和TIMP水平发生了动态变化，且这种蛋白水解系统的推测 作谱分析可应用于临床上的MI后不利LV重构方面。在MI后的时期里，属于明胶酶子类的醒P的血浆i普中存在独特且有差异的变化。具体地，匪P-2水平在MI后的早期降低，然后在更长的MI后的时期恢复到正常范围内。相反，在MI后最长达30天里，血浆醒P-9水平显著升高，之后就恢复到正常范围内。MI后患者的MMP-2和醒P-9谱的这些差别的基础可能是由于这些固P类型的转录调控以及细胞来源上的不同。醒P-9在启动子区域内含有不存在于醒P-2启动子区域内的若干转录因子结合结构域，例如AP-1结合位点(Borden P, et al. 2004)。细胞因子例如肿瘤坏死因子在MI后的早期的作用非常复杂，并被证明可在体外资导醒P-9转录(Esteve P0， et al. 2002; Etoh T, et al. 2001)。然而，细胞因子介导的醒P-2转录的类似的强烈增加还未被报道。因此，
能会差异性诱导匪P-9。虽然所有细胞类型均可表达醒P-9，如肌细胞和成纤维细胞，但是醒P-9的一个重要来源是嗜中性粒细胞(Woessner FJ.1998; Gunasinghe SK， et al. 2001)。因此，在MI后的初期，见察到的MMP-9水平的强烈增加可能是由于嗜中性粒细胞的局部募集和脱粒。
本研究提供了在MI后的时期里血浆醒P-9早期变化和晚期出现的不利LV扩张之间的关系。本临床报告的结果说明在MI后的早期观察到的血浆匪P-9水平的强烈增加可能反映出不利心肌重构过程的开始，这在MI后的晚期表现为LV扩张。在本研究中，这种LV重构与收缩功能的显著受损没有相关性，证据是LV射血分数没有变化。在早期时间点观察到的LV射血分数的增加可能是由于神经激素系统活性的增加。
在MI后患者中检测到胶原酶MMP-8血浆水平的早期增加。薩P-8主要由炎症细胞(如嗜中性粒细胞和巨噬细胞)合成和释放，但也有可在其他细胞类型(包括心肌成纤维细胞和肌细胞)中表达的报道(Wilson EM，et al. 2003)。在MI后第1天鉴定出的醒P-8血浆水平的增加可能反映了急性炎性过程。第二个峰，尽管高度不稳定，出现在MI后第3天。醒P-8的这个第二个峰可能反映了在MI治疗过程的该时期出现巨噬细胞的流入。
TIMP是一个小分子量蛋白家族，可与所有固P的活性催化结构域结合并因此抑制该酶的蛋白水解活性。虽然这在以前被认为是这些小分子量蛋白的唯一功能，但是现在认识到TIMP具有多种其他生物学性质，包
58括影响细胞生长和活力以及参与MMP活化级联反应(Baker AH， et al.2002)。在本研究中，TIMP-1的血浆水平在患者MI后的6个月随访期中明显增加。本研究说明醒P-9与TIMP-1或TIMP-2的比例在MI后的早期保持提高，这会有利于延长MMP活性状态，但这些比例关系在MI后的晚期得到正常化或逆转。这是在MI后患者中检测TIMP-4 ( —种在心肌中高度表达的特异TIMP)的第一次研究(Greene J， et al. 1996; Stroud RE，et al. 2005)。与年龄相当的对照受试者相比，血浆TIMP-4水平降低，并且醒P-9/TIMP-4的相对比值增加。这些发现表明在MI后患者中出现了心肌醒P抑制控制的明显和延长的改变。
本研究包括在MI后患者的血浆中观察到的醒P和TIMP水平的时间性变化，这反映了心肌内出现的动态变化。本研究说明了 MI后患者中独特的和随时间不同的MMP和TIMP血浆语可被定量，并可用于预后和诊断。
本申请通篇参考了多篇出版物。这些出版物的公开内容以引用的方式整体纳入本申请中，从而更为完整地描述本发明所属领域的情况。
2.实施例2:在肥大性栓塞性心肌病中酒精中隔消融(alcohol septalablation)后基质金属蛋白酶的释放
本研究检测了肥大性栓塞性心肌病(HOCM)患者在酒精诱发MI前后某些MMP和TIMP种类的血浆水平。
才法和潜果在51名HOCM患者(年龄为55 ± 2岁)的中隔动脉穿支中注射酒精以诱发MI，然后获得在基线和最长达60小时内一系列的明胶酶醒P-2和匪P-9和胶原酶MMP-8和MMP-13的血浆7JC平，以及TIMP-1镨(通过ELISA)。指示心肌损伤的血浆肌酸激酶(MB同种型)在MI后18小时增加了 2150% (p<0. 05)。 MI后12小时，血浆MMP-9比基线值增加了超过400%, MMP-8增加了超过100% (相对于基线，p<0. 05)。对腿P-2和MMP-13未观察到相似的时间镨。另外，MI后血浆TIMP-1水平也未伴随增加。因此，MI后醒P/TIMP化学计量值(MMP-9/TIMP-1比值)明显增加，表明TIMP-1介导的醒P-9抑制下降，这可能会增强细胞外心肌重构。
潜论这些独特的结果表明受控制的人类心肌损伤的诱导，尤其是
59通过酒精诱导的MI，导致种类和时间依赖性干扰醒P/TIMP化学计量值，这可促进MI后的早期环境下的心肌重构。
肥大性栓塞性心肌病(H0CM)是一种遗传疾病，最常见的特征是LV流出血管的中隔主动脉下区的心肌过度生长(Maron BJ. 2002)。因此H0CM可导致血流动力学上明显的LV流出血管阻塞，最后导致LV泵功能障碍和随后的LV衰竭的症状。目前一种减轻HOCM患者中LV流出血管阻塞的方法是在中隔主动脉下区选择性诱导MI(Maron BJ. 2002; Naguch SF， etal. 1999a; Naguch SF， et al. 1999b; Spencer WH， et al. 2000)。通过将酒精定向注射到中隔动脉穿支，在大量患者中成功地进行了涉及LV流出血管阻塞的心肌的选择性破坏(Naguch SF, et al. 1999a; NaguchSF， et al. 1999b; Spencer WH， et al. 2000)。概念上，这种治疗方法导致酒精诱导的MI，并因此提供可解决跟患者腿P和心肌损伤关系有关的几个关键问题的独特机会。首先，在酒精诱导MI后患者血浆中的某些MMP种类的时间镨是什么？第二，被酒精诱导的MI诱导的心肌损伤程度和血浆薩P水平之间有无关系？本研究的目标是通过在酒精诱导MI前后，对HOCM患者中的醒P和TIMP血浆水平进行一系列测量来解决这些具体问题。
方法
,悉者获得知情同意后，被诊断患有HOCM和计划进行选择性酒精中隔消融的患者(n-51)参与本研究。这一计划经过贝勒医学院和南卡罗来纳医科大学的机构审查委员会的审查和批准。患者年龄为55±2岁，由32名男性和19名女性组成。在导管插入时，基线LV与主动脉压的梯度为62土6mmHg,表明明显的LV流出血管阻塞。酒精中隔消融过程的进行如前人所述(Naguch SF， et al. 1999a; Naguch SF， et al. 1999b)。简言之，将气嚢式导管安装在中隔动脉穿支中并注射2-5 mL酒精。所述气嚢在注射后保持膨胀5分钟然后取出。在酒精注射后6周，重复导管插入显示梯度为25 ± 4 mmHg (p<0. 05)，这表示LV流出血管阻塞的减轻。酒精诱导MI之后HOCM患者的LV功能和血流动力学的改变在文献中有很好的描述(Maron BJ. 2002; Naguch SF， et al. 1999a; Naguch SF， etal. 1999b; Spencer WH， et al. 2000)。
60i^炎漠从外周静脉收集血液样本(5cc)，装入预冷的EDTA管中。将所述样本离心，将轻轻倒出的血浆部分等分并储存在-701C直至试验。在基线(导管插入和中隔消融步骤之前)收集样本，并在酒精注射后最长达60小时内每隔4-6小时收集一次样本。
i^/P弄77#户试發本研究关注两类已知的醒P:包括醒P-8和醒P-13的间质胶原酶，以及包括醒P-2和醒P-9的明胶酶(Edwards DR， et al.1996; Creemers EEJM, et al. 2001; G腿singhe SK， et al. 1997)。最具特征性的TIMP是TIMP-1 (Edwards DR, et al. 1996; Vincenti MP.2001)。因此，本研究也对TIMP-1进行了检测。用前人所述的双位结合法(Spinale FG， et al. 2000; Joffs C. et al. 2001 )通过酶联免疫吸附观'J定(ELISA)系统(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire,England)对各种MMP和TIMP进行了定量。对于腿P-2 (RPN 2617),使用的抗血清与醒P-2的前体形式(pro醒P-2)反应，而不与活性形式反应。对于丽P-9 (RPN 2614)，抗血清检测到该酶的前体形式(pro醒P-9)。对于醒P-8 (RPN 2619)，抗血清既检测匪P-8的酶原也检测其活性形式。对于MMP-13 (RPN 2621)，抗血清用于检测该酶的前体形式。对于TIMP-l，抗血清用于检测功能蛋白(RPN 2611)。这些检测系统的变异系数为3-5%,不与其他蛋白酶交叉反应，且灵敏度至少为0.02 ng/mL。
通过微粒酶免疫测定法平行检测血浆样本以获得总血浆肌酸激酶浓度及MB1同种型浓度(AxSYM, Abbot Laboratories, 111)。
炎疾#糸使用方差分析(AN0VA)首先对醒P、 TIMP和肌酸激酶血浆水平进行检查，其中处理效应是在酒精注射后的时间。之后，所述值被计算为相对基线的改变百分比。将每个时间点的这些结果进行ANOVA，然后使用Bonferonni校正的t检验进行事后(post-hoc)均值分离，其中无效假设是相对基线的变化为零。为了检测肌酸激酶和醒P值之间的关系，用多边形积分算法对每个患者的浓度-时间曲线下面积进行计算(SigmaPlot， Jandel， San Rafeal, CA)。然后将这些点用于线性回归。值表示为平均值± SEM。所有统计操作都使用SYSTAT统计软件(SPSS Inc，Chicago, Ill)进行。
结果
61在全部51名HOCM患者中成功地进行了中隔动脉穿支酒精注射，并收 集了一系列血液样本。基线肌酸激酶和MB1部分如表6所示。酒精注射 后血浆肌酸激酶和MB1同种型的变化如图7所示。到酒精注射后6小时 血浆总肌酸酐激酶和MB1同种型出现显著升高，并在大约24小时达到峰 值。基线醒P和TIMP-1血浆水平总结于表5中，且在以前才艮道的患者的 血浆水平范围之内(Inokubo Y, et al. 2001; Joffs C， et al. 2001)。 酒精注射后的血浆匪P-2和醒P-9的变化如图8所示。酒精注射后4小 时血浆醒P-2发生了微小但在统计学上显著的增加。相反，酒精注射后6 小时血浆MMP-9发生了强烈的增加，并在注射后最长达50小时内保持提 高。血浆薩P-8水平也在注射后6小时增加，并在注射后最长达60小时 内保持提高(图9)。血浆MMP-13水平在酒精注射后的任何时间点均没 有明显增加，而实际上在注射后24小时下降，变化轻微但明显(图9)。 血浆TIMP-1在酒精注射后较晚的时间点有增加的趋势，但在统计学上不 显著(图10; p>0.15)。然而，血浆MMP-9/TIMP-l比值在注射后6小时 增加，并在酒精注射后最长达60小时内保持增加(图10 )。醒P-8/TIMP-l 比值也发生了类似的变化，其中该比值在酒精注射后明显地增加。对每 位患者的血浆肌酸激酶MB1曲线下的面积和醒P-9时间曲线下的面积作 图，如图11所示。观察到在肌酸酐激酶MB1的释放和血浆醒P-9水平的 释放之间明显有线性关系。
表6:将酒精注射到中隔动脉穿支前患者的基线血浆CK酶和醒P水平
基线值
肌酸激酶IU/L79. 8 ±6. 6
MB1部分IU/L2. 9 ± 0. 4
醒P-9 (ng/mL)21.0 ±2. 2
MMP-8 (ng/mL)10. 2 ±1.6
醒P-13(ng/mL)0. 1 ± 0.1
醒P-2 (ng/mL)833. 9 ±69. 8
TIMP-1 (ng/mL)1464. 7 ±86, 8
醒P-9/TIMP-10.019 ±0.003讨论
由肥大性栓塞性心肌病(HOCM)导致的LV流出阻塞可以通过引起目标 心肌损伤而緩解(Maron BJ. 2002; Naguch SF， et al. 1999a; Naguch SF， et al. 1999b; Spencer WH， et al. 2000)。具体地，将乙醇注射到给 LV肥大区提供养分的冠状动脉中导致静脉硬化，和随后目标心肌的局部 缺血/梗塞。然而，对HOCM患者在酒精诱导的心肌梗塞(MI)后促成LV重 构的细胞和胞外事件知之甚少。因此，本研究对HOCM患者在酒精诱导心 肌梗塞后选定种类的醒P和TIMP的血浆水平的变化进行了一系列测量。 本研究新的和独特的发现分为两个层面。首先，HOCM患者在冠状动脉内 酒精注射后其某些种类的固P (MMP-8、 MMP-9)出现了强烈释放，但不伴 随TIMP-1水平的增加。这导致可促进心肌基质降解的醒P/TIMP化学计 量。第二，某些廳P在酒精诱导的MI后最长达48小时内持续释放，并 与心肌损伤程度有关。这些发现提供了人类离散心肌损伤后独特的MMP 和TIMP释放时间镨。
本研究首次对酒精诱导MI后患者的血浆各种廳P和TIMP水平进行 了分析。本研究表明患者中诱导的离散心肌损伤会导致时间和种类依赖 的MMP血浆释放。
在酒精诱导MI后的早期，MMP-2血浆水平出现少量增加，但很快恢 复到基线。这一少量增加可能是由于心肌损伤区域醒P-2的细胞内储存 的释放。与醒P-2相比，匪P-9血浆水平在酒精诱导MI后出现强烈和持 久的增加。因此，血浆醒P-9在酒精诱导MI后急剧升高的基础可能是 MMP-9从浸润性嗜中性粒细胞的释放以及血小板在心肌损伤位点的聚集。 因为免疫测定只检测到醒P-9的前体形式，这种醒P的血浆水平的持续 提高说明发生了从头合成。因此，廳P-9水平增加会改变肌细胞与胞外基 质的界面从而促进LV重构。
间质胶原酶醒P-8的血浆水平在酒精诱导MI后显著增加。醒P-8首 先在嗜中性粒细胞中被识别(Edwards DR， et al. 1996; Creemers EEJM， et al. 2001; Gunasinghe SK， et al. 1997; Woessner JF， et al. 2000j Vincenti MP. 2001)。然而，最新的数据表明醒P-8可能在若干类型的 心肌细胞中被表达(Herman MP， et al. 2001)。因此，血浆醒P-8水平
63在MI诱导后增加可能是急性炎症反应以及从心肌释放的结果。醒P-13在 人类LV心肌中被检出，并在末期CHF患者中增加(Spinale FG， et al. 2000)。醒P-13血浆水平在酒精诱导MI后轻微下降然后恢复到基线水平。 对醒P-13的免疫测定是针对醒P-13的前体形式。因此，循环醒P-13的 轻微下降可能是由于活化加强和随后的清除。若干细胞外蛋白已被证明 为醒P-8和醒P-13的底物，包括纤维胶原。因此，这类醒P在酒精诱导 MI后的活化显著改变心肌细胞外结构和组成。
在本研究中，TIMP-1血浆水平在H0CM患者被酒精诱导MI后没有明 显变化。计算醒P对TIMP的相对化学计量用于定义净醒P蛋白水解能力 (Spinale FG， et al. 2000; Goldberg GI， et al. 1989)。醒P-9/TIMP-l 的化学计量在H0CM患者被酒精诱导MI后被计算。到MI后12小时，血 浆醒P-9/TIMP-l比值相对于基线增加了超过500%。这些醒P-9/TIMP-l 化学计量值的改变可能促进MMP-9在心肌组织中活性的延长。尽管TIMP-1 是最具代表性的TIMP,但是全部4种TIMP都已在人心肌细胞中被识别 (Thomas CV, et al. 1998; Spinale FG， et al. 2000; Li YY， et al. 1998)。尽管某些TIMP优先与醒P的某些前体形式结合，但是所有TIMP 均以1: 1的化学计量比与被活化的MMP相结合。
,g潜本研究表明酒精诱导MI后心肌肌酸激酶和醒P释放具有相关 性。本研究清楚地表明某些种类的醒P释放到血浆中发生在酒精诱导MI 之后。这是对人类离散且确定的心肌损伤后腿P和TIMP水平时间变化的 首次定量研究。本研究表明了患者在酒精诱导MI后释放到血浆的醒P的 独特谱，其与心肌损伤程度直接相关。本研究的结果说明监测醒P和TIMP 镨提供了一种监测MI后创伤愈合和心肌重构过程的新方法。
3.实施例3:肥大性栓塞性心肌病酒精中隔消融后醒P-4的血浆监测 《餘本研究的总体目标是建立检测血浆TIMP-4相对丰度的半定量 测定方法，然后利用此方法测定肥大性栓塞性心肌病(HOCM)患者在急性 心肌梗塞(MI)后TIMP-4水平的动态变化。
才法/潜^:在正常(n-18)和HOCM (n=16)患者酒精诱导MI后(通过 半定量免疫印迹)检测其血浆TIMP-4水平。在HOCM患者在酒精诱导MI 后的最长达60小时内对其血浆TIMP-4水平进行一系列测量。HOCM患者的非糖基化血浆TIMP-4水平与正常对照相比增加了 250%。总血浆TIMP-4 水平在酒精诱导MI后30小时下降了 20%。
潜论该独特结果表明受控制的心肌梗塞的诱导，尤其是通过酒精 诱导，导致HOCM患者在酒精诱导MI后其血浆TIMP-4水平下降，这会促 进MI后的早期环境下的心肌重构。
肥大性栓塞性心肌病(HOCM)是一种遗传疾病，其最常见特征是左心 室流出血管的中隔主动脉下区的心肌过度生长(Maron BJ. 2002)。通过 将乙醇定向注射到中隔动脉穿支，在大量患者中成功地进行了涉及左心 室(LV)流出血管阻塞的心肌的选择性破坏(Naguch SF， et al. 1999a; Naguch SF， et al. 1999b; Spencer WH， et al. 2000)。因此，本研究 检验了血浆TIMP-4水平的时间变化出现在HOCM患者在酒精诱导MI后这 一假设。
方法
,悉j:正常患者(n=18)和被诊断患有HOCM并计划进行选择性酒精 中隔消融的患者(n-16)在知情同意后参加本研究。正常患者平均年龄为 47±5岁，由9名男性和9名女性组成，他们被彻底检查以确保没有心脏 疾病或其他相关健康问题。HOCM患者的平均年龄为53±4岁，由ll名男 性和5名女性组成。在导管插入时，基线LV与主动脉压的梯度为62 ±6 mmHg，表明明显的LV流出血管阻塞。酒精中隔消融过程的进行如前人所 述(Naguch SF, et al. 1999a; Naguch SF， et al. 1999b)。简言之， 将气嚢式导管安装在中隔动脉穿支中并注射2-5 mL酒精。所述气嚢在注 射后保持膨胀5分钟然后取出。在酒精注射后6周，重复导管插入显示 梯度为"士4mmHg (p<0. 05)，这表示LV流出血管阻塞的减轻。酒精诱 导MI之后HOCM患者的LV功能和血流动力学的改变在文献中有很好的描 述(MaronBJ. 2002; Naguch SF, et al. 1999a; Naguch SF， et al. 1999b; Spencer WH, 2000)。
if炎桌々浙备从外周静脉收集血液样本(5 cc)，装入预冷乙二 胺四乙酸管中。将所述样本在41C下以3000RPM离心IO分钟，然后将轻 轻倒出的血浆分成小份并储存在-70lC直至试验。在基线(导管插入和中 隔消融步骤之前)收集HOCM患者的样本，并在酒精注射后10、 20、 30
65和60小时收集H0CM患者的样本。血浆样本首先在阳离子交换柱(C-18 Sep-Pak; Waters Associates, Milford Mass)上洗脱，然后通过真空离 心干燥。离心后，将样本重新溶解在含有50mM还原试剂三(2-羧乙基)膦 (Pierce)和2X十二烷基硫酸锂电泳样品緩冲液(Invitrogen)的溶液 中。首先进行了一系列稀释以确定血浆与样品緩沖液的最佳体积比。综 上，确定了初始体积为100/iL的血浆和重溶体积为36laL的样品緩冲液 对于本测定是理想的。
"f定:f^^伊遂数据采集之前，对各种可商购的TIMP-4抗体进行 了多次试验以确定灵敏度和特异性。筛选了下列抗体小鼠抗人TIMP-4 的单抗,974， R and D Systems)、兔抗人TIMP-4的抗体loop #3 (RP3T4, Triple Point Biologies)、兔抗人TIMP-4的抗体loop #1 (RP1T4， Triple Point Biologies)、绵羊抗TIMP-4多克隆抗体(PC434, Oncogene)、兔 抗TIMP-4多克隆抗体(AB816， Chemicon)和兔抗TIMP-4的多克隆抗体 loop #2(AB 19087， Chemicon)。就其识别23 kDa和29 kDa处的条带或 者分别识别非糖基化和糖基化形式的TIMP-4的能力来筛选所述抗体 (Radomski A， et al. 2002)。所有免疫印迹均包括分子量标记(SeeBlue Plus 2， Invitrogen)，以及作为阳性对照的纯化的重组人类 TIMP-4 (H-T頂P-4， Triple Point Biologics)。 Loop弁2多克隆抗体(AB 19087， Chemicon)由于其与TIMP-4两种形式都可结合的能力而被选为本 试验使用的TIMP-4抗血清。为了测定最佳TIMP-4抗血清浓度，将多张 膜与范围在0. 05-0. 6 ng/mL的不同浓度的loop #2 TIMP-4抗体一起孵 育。这些结果提供了用于此免疫印迹的抗体的最佳浓度，即0.5ng/mL 的loop #2 TIMP-4抗体。为了确定TIMP-4抗血清对TIMP-4蛋白的反应 是否是线性的，配制不同浓度的重组TIMP-4标准品。建立了 TIMP-4浓 度在10到80lig/mL之间的线性关系(r^0. 99)。
对本方案，通过半定量免疫印迹检测了 TIMP-4的相对水平，具体内 容如前人所述(Spinale FG， et al. 2000)。将血浆样本(12 p L)上样到 4%到12%的BisTris胶上进行电泳分离。然后将分离的蛋白转移到硝酸纤 维素膜上。在封闭和洗涤步骤之后，将所述膜同与糖基化和非糖基化形 式TIMP-4的Loop 2的肽序列相对应的抗血清(AB 19087， Chemicon) (0. 5 ju g/mL) —起孵育。在与二抗孵育之后，用化学发光法(Western Lightning
66Chemiluminescence Reagent Plus, Perkin Elmer)检领'J免疫活性信号。 另外，对每个免疫印迹，均使用阴性对照(只使用二抗)以检测与血浆 中其他蛋白可能的非特异性结合。使用光密度法分析所述免疫印迹物以 获得积分光密度(IOD)值。并通过重复测定同一样本的IOD值，测得批 内变异系数为IO. 5%。所有测量都进行两次。
炎蕃为、糸从HOCM受试者获得非糖基化和糖基化形式的血浆TIMP-4 的IOD值，并将其标准化为相对每个免疫印膜上所包含的参照对照样本 的平均IOD值。通过Student，s t检验比较了参照对照和HOCM受试者之 间的基线血浆TIMP-4水平。在酒精诱导MI期间和之后的血浆TIMP-4水 平相对各自的基线值的时间变化被计算并以百分比表示。此外，对所述 HOCM受试者，还计算了非糖基化和糖基化的IOD值之和以测定总血浆 TIMP-4。用单因素方差分析(ANOVA)比较了在不同时间点记录的血浆 TIMP-4水平的变化。用Bonferroni校正的成对t检验进行了事后均值分 离(post-hoc mean separation)。最终确定参照对照和HOCM受试者的 血浆TIMP-4水平是否存在性别特异的差别。对于此比较，血浆TIMP-4 IOD 值被标准化为浓度已知的重组TIMP-4标准品的IOD值，以消除胶与胶之 间的差别。具体地，血浆TIMP-4 IOD值被基于性别和临床情况分组。通 过ANOVA比较组之间的差异。对于此比较，用Bonferroni校正的成对t 检验进行了事后均值分离。所有统计过程都使用Systat (SPSS)进行。结 果以平均值士 SEM的形式表示。若所述校正的Bonferroni概率成对t检 验值p<0. 05，则被认为是统计上显著的。
结果
表示正常患者和HOCM患者的血浆样本中TIMP-4相对水平的代表性 免疫印迹结果如图12所示。观察到了对应23kDa和29kDa的免疫反应条 带。 一抗的替换导致对应TIMP-4的条带完全消除。制备另一块检测血浆 样本的电泳胶，并对糖基化蛋白染色(Weber KT， et al. 1991)。在所有 血浆样本中都观察到对应29 kDa的糖基化条带，其可能反映了糖基化 TIMP-4 (Radomski A, et al. 2002)。图13总结了 HOCM患者相对参照正 常对照的血浆TIMP-4水平。H0CM患者的非糖基化(23kDa)和糖基化(29kDa) 形式的TIMP水平都有所增加。
67H0CM患者在酒精诱导MI后其血浆TIMP-4水平依赖于时间的变化如 图14所示。与基线相比，非糖基化血浆TIMP-4水平在酒精诱导MI后10 小时增加，但在酒精诱导MI后30小时降低。对于糖基化TIMP-4，其水 平在酒精诱导MI后30和60小时相对基线降低。总TIMP-4 (非糖基化和 糖基化形式)也在酒精诱导MI后30和60小时降低(图14 )。与性别相 关的血浆TIMP-4相对水平如图15所示。H0CM女性患者的非糖基化TIMP-4 值高于HOCM男性患者的值。不论性别，H0CM组的非糖基化TIMP-4值明 显较高。在糖基化血浆TIMP-4水平中同样观察到相似的趋势。然而，正 常男性的糖基化TIMP-4水平高于正常女性的糖基化TIMP-4水平。
本研究首次建立免疫印迹方法来检测患者血浆中的TIMP-4的相对水 平。在本研究中，HOCM患者的血浆TIMP-4水平高于正常对照的血浆 TIMP-4水平。HOCM的特征是LV流出血管中隔主动脉下区的心肌过度生 长(肥大)(Maron BJ. 2002)。所述LV流出血管的阻塞会最终导致整个 左心室的肥大(Maron BJ. 2002)。由长期压力负荷过大引起的LV肥大包 括胞外基质沉积(胶原积聚)的增加(Steinberg TH， et al. 2001)。在 本研究中，HOCM患者的血浆TIMP-4水平较高，这又可能反映了心肌内 TIMP-4的平行增加。因此，HOCM患者TIMP-4水平的增加又会降低心肌 醒P活性，从而促进胶原积聚。实际上，心肌活检显示HOCM患者的胶原 积聚增加(Nuegh SF， et al. 2001)。
本研究首次对酒精诱导MI后的血浆TIMP-4水平的时间变化进^f亍了 分析。对受控制的心肌损伤(如酒精诱导的MI)中MMP和TIMP之间不平 衡的检测加强了对本文显示的发生在急性心肌损伤后的TIMP释放的时间 关系的理解。如实施例l所示，本研究的结果可扩展到具有导致心肌损 伤的更常见原因一一因梗塞导致的冠状动脉闭塞的患者。
有趣的是，本研究表明了血浆TIMP-4相对水平相对于性别的变化。 然而，调控TIMP-4这些变化的上游机制仍然不清楚(Greene J， et al. 1996) 。 TIMP-4蛋白表达受控制其他TIMP表达的相似细胞因子和其他生 物分子如类固醇所影响(Greene J， et al. 1996)。过去的研究表明各种 TIMP的表达在月经周期有所改变，这暗示了卵巢类固醇的影响(GoffmF， etal. 2003)。在本研究中，正常女性的TIMP-4血浆水平较男性的要低。 正常女性TIMP-4水平较低的现象可能是由卵巢类固醇水平的不同引起的。然而，在H0CM组，女性血浆TIMP-4水平较H0CM男性的要高。这可 能是由患这种肥大病症的患者具有促进TIMP-4上调的其他优势生物信号 引起的。
4.实施例4:区分、预测和诊断在心肌梗塞后的患者中的心室重构和 心力衰竭的标准
表7中提供了在所述年龄范围内和跨性别的人类受试者的一系列清楚 的正常值。此前没有过包含在此的醒P/TIMP正常参照值的汇编列表，并 且由于年龄匹配的未患心脏病的受试者也包括在内，该汇编列表进一步提 供了正常参照范围。而且，提供了顧P/TIMP谱的新的化学计量比值，可 证明该语涵盖了下表详述的重要诊断和预后信息。从100多名受试者中收 集这些数据并对其加以分析。
表7:正常人类参照范围
MMP/TTMP血:縱水平(ng/mL产
MMP-210004500
MMP-90"20
MMP扁70^5
MMP-13
MMP-80"3
醇1卿
TMP-225-50
TIMP40-2
MMP-9mMT比傯*
MMP-9/TIMP-l7-15
MMP-9/TMP-2100-500
MMP-9/TIMP"41-10
*正常成人年龄25-70岁
表8给出了患者心肌梗塞(心脏病发作)72小时之内的醒P和HMP 绝对值、醒P/TIMP比值绝对值以及相对于正常参照绝对值的变化百分比。 按照原始申请中所述，收集这些数值。证实了一种独特的血浆谱，该谱无 法从过去在以前公开的动物研究或有限临床研究中的报告预测出。该独特 i普包括醒P-2下降、醒P-9增加以及更重要的醒P-9/T頂P-4比值的增加。 MMP-9/TIMP-4比值增加具有心脏特异性，因为TIMP-4只从心血管来源释 放。因此，这是提供具有心血管特异性的手段和心肌梗塞早期发展期间匪P和TIMP独特谱的首份数据。而且，如以前申请中所示，醒P-9和 MMP-9/TIMP-4比值的这一早期变化能够预测在MI后最长达6个月里的不 利心肌重构和发生心力衰竭风险增加。这些数据首次实际上将心血管特 异谱(顧P-9/TIMP-4比值)的早期变化(72小时内)与晚期不良事件和 预后(心室扩张)之间以因果关系联系起来。原始申请给出了如何利用 这些新数据来指导治疗和作出临床决定。
表8:心肌梗塞的诊断
血桨MMP/TIMP水平(ng/raL)*
MMP-2 <1000
MMP-9 >25
MMP-7 0"5
MMP-13 (MO
MMP-8 >5
TIMP-1 >1000
TIMP陽2 25-50
TIMP"4 0-2
MMP/TIMP比值承
MMP-9/TMP-l >20
MMP-9/TIMP-2 >600
MMP-9/T諸"4 >15
MMP/TIMP血浆水平变化百分比*
MMP-2 (-25) - (-75)
MMP-9 150 - 500
MMP-7 (-10) -10
MMP-13 (-10) -10
MMP-8 50 - 200
TIMP-1 10-100
TIMP-2 (-10) -10
TIMP4_(-10) - 10
*在症状出现72小时内测定 表9提供了患者在首次心脏病发作(心肌梗塞)后尤其是一个月后出 现的独特和有差异的醒P/TIMP血浆语。此时，出现醒P和TIMP的特异和 有差异的变化，该变化可用于识别由于对心肌梗塞特异的不利心室重构而 使患心力衰竭的风险增加的患者。在这种情况下，醒P-9保持提高，TIMP-1 水平也增加。这改变了丽P-9/TIMP-l和醒P-9/TIMP-4的比值，它们对患 者出现不利心室重构、心室扩张和最终射血能力减退(收缩性心力衰竭) 的风险增加具有诊断作用。
表9:心力衰竭风险增加的心肌梗塞后患者
70血浆MMP/TIMP水平(ng/mL)
MMP-2
MMP-9
MMP-7
MMP-13
MMP-8
UMP-1
TIMP-2
T1MIM
<1000 >50 0^5 (M0 0-3
>1000 >50 0-2
血浆MMP/TIMP比值*
MMP-9/TIMP-1 MMP-9/TIMP-2 MMP-9/TIMP"4
>20
>500
>15
*首次心肌梗塞之后1个月测定
最后，本文公开的独特血浆特征首次提供了区分心力衰竭患者的根本 病因的能力。具体而言，如表10所示，由于心肌梗塞或其他心血管疾病 例如高血压而导致具有发生心力衰竭风险或表现出心力衰竭的患者中出 现了独特且非常不同的血浆i普。这些数据取自我们所完成的构成本申请基 础的研究。因此，可对这些谱进行鉴别诊断，更重要的是，考虑更了具有 针对性的临床决策和治疗策略。该镨的临床应用的实例，以及如何利用这 些镨进行临床决策的内容在原始申请中已给出。
表10:收缩性(MI后)或舒张性(高血压性心脏病)心力衰竭的谱和鉴别诊
收缩性HF
舒张性HF
血浆醒P/TIMPMMP-2
MMP-7 MMP-13
丽P-1
TMP-4 血浆醒P/TIMP比值
MMP-9/TIMP-l MMP-9/TIMP-2
MMP-9/TMP-4
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权利要求
1. 一种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检测所述受试者体液中高于正常值的MMP-9的量。
2. 权利要求1的方法，其中所述醒P-9的量高于正常值至少约100%。
3. —种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检测 所述受试者体液中高于正常值的TIMP-1的量。
4. 权利要求3的方法，其中所述TIMP-1的量高于正常值至少约50%。
5. —种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检测 所述受试者体液中醒P-9与TIMP-4的比值与正常比值相比的增加。
6. 权利要求5的方法，其中所述比值与正常比值相比至少增加了约 100%。
7. —种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检测 所述受试者体液中MMP-9与TIMP-1的比值与正常比值相比的增加。
8. 权利要求7的方法，其中所述比值与正常比值相比至少增加了约 100%。
9. 一种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检测 所述受试者体液中醒P-9与TIMP-2的比值与正常比值相比的增加。
10. 权利要求9的方法，其中所述比值与正常比值相比至少增加了 约100%。
11. 一种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检 测所述受试者体液中高于正常值的腿P-8的量。
12. 权利要求ll的方法，其中所述醒P-8的量高于正常值至少约 50%。
13. —种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检 测所述受试者体液中醒P-9与TIMP-4的比值与正常比值相比的增加， 以及醒P-8与TIMP-4的比值与正常比值相比的增加。
14. 权利要求13的方法，其中所述羅P-9与TIMP-4的比值与正常 比值相比至少增加了约100%。
15. —种检测或预测受试者心肌梗塞后左心室扩张的方法，包括检 测所述受试者体液中醒P-9的增加，醒P-8的增加，TIMP-l的增加，醒P-9与TIMP-4的比值的增加，醒P-9与TIMP-1的比值的增加，醒P-9 与TIMP-2的比值的增加。1
16. 权利要求15的方法，其中所述醒P-9的量与正常值相比至少高 约100%，所述醒P-8的量与正常值相比至少高约50%,所述TIMP-l的 量与正常值相比至少高约50%,所述MMP-9与TIMP-4的比值与正常比 值相比至少增加了约100%，所述醒P-9与TIMP-1的比值与正常比值相 比至少增加了约100%，且所述醒P-9与TIMP-2的比值与正常比值相比 至少增加了约100%。
17. 权利要求l-16任一项的方法，其中所述体液是血液。
18. 权利要求l-16任一项的方法，其中所述体液是血浆、尿液、滑 液、唾液或心包积液。
全文摘要
本文公开了检测或预测受试者舒张性心力衰竭的方法，包括从受试者体液中识别基质金属蛋白酶(MMP)和基质金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)的谱，所述谱在本文中与可能发生左心室扩张(LVD)相关。
文档编号C12Q1/37GK101512010SQ200780033296
公开日2009年8月19日 申请日期2007年7月11日 优先权日2006年7月11日
发明者F·G·斯皮纳尔, M·R·齐利, R·E·斯特劳德 申请人:南卡罗来纳州医科大学研究发展基金会