分泌性白细胞蛋白酶抑制剂通过糜酶的加工的制作方法

专利名称：分泌性白细胞蛋白酶抑制剂通过糜酶的加工的制作方法
技术领域：
本发明涉及分析糜酶(chymase)活性的方法。具体而言，本发明涉 及诊断糜酶相关疾病或者通过测量SLPI加工来评价人受试者的糜酶 相关疾病的治疗效率。
背景技术：
分泌性白纟田月包蛋白酶4卬制剂(Secretory Leukocyte Protease Inhibitor, SLPI)作为弹性蛋白酶和组织蛋白酶G的11.7kD抑制剂而被 首次发现(Thompson等，Proc Natl Acad Sci U S A (《美国国家科学院 院刊》)1986; 83:6692-6)。 SLPI由肥大细胞表达(Westin等，BiolChem 1999; 380:489-93)，并存在于上气道粘膜(Fryksmark等，Ann Otol Rhinol Laryngol 1982; 91:268画7l)和痰(Kramps等，J Histochem Cytochem 1981; 29:712-9)中。已在鼻腔(Lee等，Am Rev Respir Dis 1993; 147:710-6)、气管和支气管(Kramps等，Am Rev Respir Dis 1984; 129:959-63; Mooren等，J Histochem Cytochem 1982; 30:1130-4)、上 颌窦(Fryksmark等，出处同上)以及细支气管上皮的杯状细胞(Willems 等，Am Rev Respir Dis 1989; 139:1244-50)中测量出大量的SLPI。SLPI的晶体学研究已表明，该分子属于乳清酸性蛋白样家族中的 成员(Grutter等，Embo J 1988; 7:3M-:51)。这些蛋白质具有两组4个 二硫4建连接起来的结构域。每个结构域的4个二辟b键以及螺旋结构使 SLPI成为非常稳定的蛋白质。已经表明，牛(Grutter,出处同上)和绵 羊(Pemberton等，Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34)的肥大细胞 蛋白酶在Leu72-Met73处裂解SLPI。其它研究显示出SLPI的一种较 低分子量的加工产物，但还没有描述负责这种裂解的酶的特征(Ota等， Hum Reprod 2002; 17:2517-22)。 SLPI被描述为糜酶的最有效抑制剂 (Walter等，Arch Biochem Biophys 1996; 327:81-8;以及Fink等，Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367:567-71)。糜酶是一种属于肽酶家族SI的糜蛋白酶型丝氨酸蛋白酶，其在皮肤和肺的肥大细胞和小球白细胞中表达，并祐:认为在胞外基质的降 解、粘膜下腺体分泌的调节和血管活性肽的生成中起作用。 一旦肥大细胞激活后，该糜酶被释放进胞外基质，其立即具有最大活性(Takai 等，FEBS Lett467: 141-144， 2000)。有两种形式的哺乳动物糜酶，即 a糜酶和p糜酶，它们在物种上不同并具有不同的功能。在人和狒狒 中，只发现了a-糜酶，而在狗、大鼠和小鼠中a-糜酶和(3-糜酶两者都 有(Dell，Italia等，Curr Opin Cardiol 2003 17: 374-379)。尽管糜酶确切的病理生理作用仍有待确定，但是已经发现其参与 微血管渗漏、嗜中性粒细胞积聚、粘液分泌的刺激以及细胞因子的调 节等方面。有效的糜酶选择性抑制剂可能适用于肥大细胞介导的疾 病，如孝喘、肺部炎症和慢性阻塞性肺疾病(COPD)。因为糜酶可以在 心脏和血管壁的血管紧张素II的生成中起作用，因此糜酶抑制剂可能 在作为血管壁损伤和炎症(动脉粥样硬化/再狭窄)以及心脏肥大的抗高 血压治疗方面具有潜在的应用。糜酶是心血管疾病治疗的靶标 (Doggrell等，Can J Physiol Pharmacol. 2005 Feb; 83(2): 123-30)。另夕卜， 已经提出糜酶在诸如类风湿性关节炎(Kobayashi等，Jpn J Pharmacol. 2002 Sep; 90(1):7-11)、糖尿病性肾病(Huang等，J Am Soc Nephrol. 2003 Jul; 14(7):1738-47)以及炎性疾病(Muto等，Idrugs.， 2002, 12， 1141-50) 之类的疾病中起重要作用。因此，设计用以抑制糜酶的生物活性的化合物可以在多个疾病领
域中提供治疗效果。已经研发了选择性糜酶抑制剂，包括TY-51076、 SUN-C8257、 BCEAB、 NK320和TEI-E548 (参见Doggrell等，出处同 上)。这些糜酶抑制剂在心肌梗塞、心肌病和心动过速诱发的心力衰竭 等的动物模型中已取得极具前景的结果。为了有利于糜酶抑制剂在人 体进行试验，以及一般情况下人体内糜酶活性的研究，需要开发人体 内糜酶活性的生物标记。发明内容本发明发现了人糜酶在特异性位点裂解人SLPI,并且发现这种裂 解可用作糜酶活性的指示剂。当试验一系列已知与SLPI相互作用的 蛋白酶(包括类胰蛋白酶、组织蛋白酶G、弹性蛋白酶和蛋白酶3)时， 这种裂解是糜酶特异性的。在一个一般方面，本发明提供了检测人受试者的糜酶相关疾病的 方法，该方法包括以下步骤a)从人受试者获得生物样品；b)测量该 生物样品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c)将步骤b)所测水平与在 健康人受试者中人糜酶裂解人SLPI的对照水平相比较，其中人糜酶 裂解人SLPI的水平与所述对照相比升高表明所述人受试者患有糜酶 相关疾病或患糜酶相关疾病的风险增加。在另 一个一般方面，本发明提供了评价治疗人患者的糜酶相关疾 病的效果的方法，该方法包括以下步骤a)从人患者获得生物样品； b)测量在所述生物样品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c)将步骤b) 所测水平与人患者治疗前人_糜酶裂解人SLPI的对照水平相比较，其 中人糜酶裂解人SLPI的水平与所述对照相比P争低表明对所述患者的 糜酶相关疾病的所述治疗是有效的。本发明还提供了一种测量人糜酶生物活性的方法，该方法包括以 下步骤a)使人糜酶与人SLPI在测定混合物中接触；b)在所述人糜酶 裂解所述人SLPI的条件下孵育所述测定混合物；和c)测量所述测定 混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平。 本发明还提供了 一种鉴定降低人糜酶生物活性的化合物的方法，该方法包括以下步骤a)使试验化合物与人糜酶和人SLPI在测定混合 物中接触；b)在所i^A糜酶裂解所逸人SLPI的条件下孵育所述测定混 合物；c)测量所述测定混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平；和d)将步 骤c)检测的水平与从对照的检测水平相比较，在对照中，所述测定混 合物中未包含所述试-验化合物。另外，本发明还提供了与本发明的方法相关的试剂盒。 本发明的另 一 方面是一种篩分具有更好机会响应涉及糜酶抑制 剂的治疗的患者的方法，该方法包括以下步骤a)从患者获得生物样 品；b)测量所述生物样品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c)将步骤 b)所测水平与健康人受试者中人糜酶裂解人SLPI的对照水平相比较， 其中人糜酶裂解人SLPI的水平与所述对照相比升高表明所述患者具 有更好机会响应涉及糜酶抑制剂的治疗。根据以下的公开，包括本发明详细的描述和其优选的实施方案以 及所附的权利要求书，本发明的其它方面、特征和优点将显而易见。


图1表示人糜酶对重组人SLPI (rSLPI)的消化。每一泳道的样品 是1 -蛋白质分子量标准品(BechMark， Invitrogen); 2 - SLPI， 0小 时；3 -糜酶+ SLPI， 20分钟；4 -糜酶+ SLPI, 140分钟；5 -糜 酶+SLPI, 4小时；6-糜酶+SLPI, 21小时；7 - SLPI， 21小时；8 -糜酶21小时；9 - 1 ug糜酶；10 -蛋白质分子量标准品(Mark-12, Invitrogen)。图2说明已知的糜酶抑制剂降低了糜酶对rSLPI的裂解水平。数 字0、 8、 80、 800表示存在于测定混合物中以皮摩尔浓度为单位的糜 酶抑制剂的量。 ，图3说明糜酶能够裂解存在于人唾液样品中的SLPI，并且说明糜 酶抑制剂降低了裂解水平。
图4比较了取自正常人受试者和患有糜酶相关疾病的患者的唾液 样品中SLPI裂解的水平。图5说明cSLPI的增加与变应性症状的增加相关。通过蛋白质印 迹分析测定了抗原攻击前0.75小时和0.5小时以及抗原攻击后0.5小 时和7小时从个体获得的鼻灌洗液中cSLPI与总SLPI的比率(图5b)。 在相同时间点，对患者的症状强度进行评分(Lebel评分)(图5a)。图6说明嗜喘的痰样品中的cSLPI/总SLPI百分比要比正常痰样 品的高，并与这些个体的糜酶水平相关。痰样品是从正常受试者和哮 喘受试者获得的。通过蛋白质印迹分析测定了 cSLPI与SLPI的比率 和糜酶水平两者。通过光密度测定分析法测定各值。
具体实施方式
本文引用的所有出版物均以引用方式并入本文。除非另有说明， 否则本文使用的所有科技术语均与本发明所属领域的普通技术人员 通常所理解的意思相一致。本文所用的术语"含有，，、"包含，，、"具有"和"包括"以它 们开放的、非限制性的意思使用。下列为本说明书中时常用到的缩写词bp =碱基对cDNA=互补DNACOPD= 'f曼性阻塞性肺疾病ELISA=酶联免疫吸附测定；kb=千》威基；1000》威基对PAGE=聚丙烯酰胺凝胶电泳PCR=聚合酶链式反应SDS=十二烷基石危酸钠SLPI =分泌性白细胞蛋白酶抑制剂本文所用的术语"糜酶的生物活性"是指根据标准技术在体内或
者体外测定的由糜酶发挥的活性。示例性的糜酶生物活性，包括但不 限于其将血管紧张素I转化为血管活性肽血管紧张素II的能力、将大 内皮素1选择性地转化为31个氨基酸长的肽内皮素1的能力、降解 胞外基质的能力、裂解干细胞因子以产生具有生物活性的可溶性产物 的能力、加工前胶原酶、炎性细胞因子和其它生物活性肽(包括本文所描述的SLPI)的能力，等等。本文所用的"生物样品"是指包含细胞或组织物质或者由细胞或 组织物质组成的样品，例如从受试者分离的细胞或者生物体液。"受 试者"可以是已成为治疗、观察或实验对象的哺乳动物，例如大鼠、 小鼠、猴或人。生物样品的实例包括(例如)痰、血液、血细胞(例如白 细胞)、羊水、血浆、精液、唾液、骨髓、组织或细针活组织检查样品、 尿液、^JI液、胸膜液和细胞培养物。生物样品也可以包括组织切片， 例如用于组织学目的的冷冻切片。试验生物样品是已成为分析、监测 或观察对象的生物样品。对照生物样品可以是试验生物样品的阳性对 照或阴性对照。通常，对照生物样品包含与试验生物样品类型相同的 目标组织、细胞和/或生物体液。在具体实施方案中，生物样品是"临 床样品，，，其为源自人患者的样品。"细胞"是指适于检测方法的灵敏度的至少一个细胞或多个细胞。 细胞可以存在于培养的细胞培养物中。细胞也可以存在于其天然环境 (例如生物组织或者生物体液)中。适用于本发明的细胞可以是细菌的， 但优选是真核的，并且最优选是哺乳动物的。本文所用的"人糜酶"是指最初^^A体分离的糜酶。糜酶为属于 肽酶家族Sl的糜蛋白酶型丝氨酸蛋白酶。糜酶的异名包括肥大细胞 蛋白酶I;骨骼肌蛋白酶；皮肤糜蛋白酶型蛋白酶；肥大细胞丝氨酸 蛋白酶，肥大细胞丝氨酸糜酶；以及骨骼肌(SK)蛋白酶。糜酶裂解的 优先顺序是Phe-|-Xaa>Tyr+Xaa>Trp+Xaa〉Leu+Xaa。示例性的 "人糜酶"具有SEQ ID NO:l的氨基酸序列，其在GenBank蛋白质ID: NP—001827中已有描述。本文所用的"人糜酶，，包括在SEQIDNO:l
中描述的人糜酶的结构和功能多态性。"多态性"是指群体中个体之 间在特定遗传基因座的 一组遗传性变型。本文所用的"糜酶相关疾病"或"糜酶相关障碍"是指与糜酶的 过度活性或过度表勤目关的疾病或障碍，或者是可通过在受试者中降 低糜酶的生物活性或P争低糜酶的量来治疗或改善的疾病或障碍，以及 在受试者中伴有这种疾病或障碍的亚临床表现或状态。示例性的"糜 酶相关疾病"包括但不限于哞喘、变应性鼻炎、纤维变性、高血压、 心脏肥大、心力衰竭、类风湿性关节炎、糖尿病性肾病、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和炎性疾病。本文所用的"人SLPI"是指最初/AA体分离的分泌性白细胞肽酶 抑制剂。SLPI的异名包括ALP、 MPI、 ALK1、 BLPI、 HUSI、 WAP4、 WFDC4和HUSI-I。 SLPI保护上皮组织免受丝氨酸蛋白酶的破坏。其 已在多种分泌物(包括精液浆、宫颈粘液和支气管分泌物)中发现，并 且对于胰蛋白酶、白细胞弹性蛋白酶和组织蛋白酶G具有亲和性。它 的抑制作用通过保护上皮表面免受内源性蛋白水解酶的攻击而有助 于免疫应答；这种蛋白还被认为具有广谱抗生素活性。示例性的"人 SLPI"具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其为在GenBank蛋白质ID: NP_003055中描述的蛋白质的成熟部分。本文所用的"人SLPI"包括 在SEQ IDNO:2中描述的人SLPI的结构和功能多态性。"人糜酶裂解人SLPI的水平"是指由人糜酶裂解或蛋白水解的人 SLPI的程度或数量。本文所用的"人糜酶裂解人SLPI的水平"可测 量为存在于试验生物样品或测定混合物中的糜酶裂解得到的人SLPI 片段与全长SLPI的比率。"糜酶裂解得到的人SLPI片段"是指由糜酶蛋白水解或裂解SLPI 而产生的人SLPI部分。在本发明中发现，人糜酶在Leu72-Met73之 间裂解人SLPI,其中数字72或73是指从人SLPI的氨基端开始计数 的氨基酸残基的位置。因此，示例性的"糜酶裂解得到的人SLPI片 段"可以是SEQ ID NO:2的Serl—Leu72片段或Met73—Alal07片段， 其分别包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。本文所用 的"糜酶裂解得到的人SLPI片段"包括SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 中描述的人SLPI片段的结构和功能多态性。"核苷酸序列"是指单链或双链形式的多聚体中脱氧核糖核苷酸 或核糖核苷酸残基的排列。核酸序列可由以下;威基的天然核苷酸构 成胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟噤呤和尿嘧啶，分别缩写为T、 A、 C、 G和U;和/或由天然核苷酸的合成类似物构成。"分离的"核酸分子是与天然来源的核酸中存在的至少一种其它 核酸分子基本上分离的核酸分子，或者当核酸分子经化学合成时，基 本上不含至少一种化学前体或其它化学物质。"分离的，，核酸分子还 可以是例如基本上不含至少一个这样的核苷酸序列的核酸分子在核 酸所来源的生物体的基因组DNA中，该核苷酸序列在其5'端和3，端 天然邻接所述核酸分子。在核酸分子的制备中，当有少于大约30%、 20%、 10%或5% (以干重计)的其它核酸分子或其它化学物质(本文也 称为"污染核酸分子"或"污染化学物质")时，所述核酸分子与其它 核酸分子或其它化学物质"基本上分离"或者"基本上不含"其它核 酸分子或其它化学物质。分离的核酸分子包括但不限于独立于其它序列的单独核酸分子 (例如由PCR或限制内切核酸酶处理产生的cDNA或基因组DNA片 段)，以及整合到载体、自主复制质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病 毒或疱渗病毒)中或整合到原核生物或真核生物的基因组DNA中的核 酸分子。另外，分离的核酸分子可以包括作为杂交或融合核酸分子的 组成部分的核酸分子。分离的核酸分子可以是如下所获得的核酸序 列(i)通过(例如)聚合^式反应(PCR)体外扩增；(ii)通过(例如)化学 合成方法合成；(iii)通过克隆而重组产生；或(iv)通过裂解和电泳或色 谱分离而纯化。术语"寡核苷酸"或"寡"指的是长度相对短，例如长度小于100 个残基的单链DNA或RNA序列。对于许多方法，大约16-25个核苷
酸长的寡核苷酸是有用的，尽管有时也可以利用大于大约25个核苷 酸的较长寡核苷酸。某些寡核香酸可以用作合成互补核酸链的"引 物"。例如，DNA引物可以与互补核酸序列杂交，以在使用DNA聚 合酶的反应中引发互补DNA链的合成。寡核苷酸在几种核酸检测方 法(例如RNA印迹或原位杂交)中也可用于杂交。术语"多肽，，、"蛋白质，，和"肽"在本文中可互换使用，是指 氨基酸残基通过肽键或经修饰的肽键连接起来的氨基酸链。氨基酸链 可以是大于两个氨基酸的任何长度。除非另有说明，否则术语"多肽"、 "蛋白质，，和"肽"还涵盖其多种修饰形式。这种修饰形式可以是天 然存在的修饰形式或化学修饰形式。修饰形式的实例包括但不限于糖 基化形式、磷酸化形式、豆蔻酰化形式、棕榈酰化形式、核糖基化形 式、乙酰化形式、泛素化形式等。修饰也包括分子内交联和共价结合 至多种部分，例如脂质、黄素、生物素、聚乙二醇或者其衍生物等。 此外，修饰还可以包括环化、支化和交联。另外，除了由基因密码子 编码的常规的二十种氨基酸以外的氨基酸也可以包含在多肽中。"分离的蛋白质"是与天然来源的蛋白质中存在的至少一种其它 蛋白质基本上分离的蛋白质，或者当蛋白质经化学合成时，基本上不 含至少一种化学前体或其它化学物质。在蛋白质的制备中，当有少于 大约30%、 20%、 10%或5%(以干重计)的其它蛋白质或其它化学物质 (本文也称为"污染蛋白质"或"污染化学物质")时，所述蛋白质与 其它蛋白质或其它化学物质"基本上分离"或者"基本上不含"其它 蛋白质或其它化学物质。分离的蛋白质可具有几种不同的物理形式。分离的蛋白质能够以 全长新生多肽或未经加工的多肽，或以经部分加工的多肽或经加工多 肽的组合的形式存在。全长的新生多肽可以通过特异性蛋白酶解事件 进行翻译后修饰，导致形成全长新生多肽的片段。 一个片段或者是多 个片段的物理締合可以具有与全长多肽有关的生物活性；然而，与各 个片段有关的生物活性的程度可以变化。
分离的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，"分离的多肽"可 以是"杂交多肽"。"分离的多肽，，还可以是通过氨基酸的添加或缺 失或取代而衍生自天然多肽的多肽。分离的多肽也可以是"纯化多 肽"，"纯化多肽，，在本文中用于指基本均质制剂中的特定多肽，该制剂基本上不含其它细胞组分、其它多肽、病毒材料或培养基；或者 当多肽经化学合成时，基本上不含与化学合成有关的化学前体或副产 物。"纯化多肽"可通过标准纯化技术从天然或重组宿主细胞获得或 者通过化学合成获得，这对于技术人员来说是显而易见的。术语"杂交蛋白"、"杂交多肽"、"杂交肽"、"融合蛋白"、 "融合多肽"和"融合肽"在本文中可互换使用，是指非天然存在的 多肽或者分离的多肽，其具有特定多肽分子及与其共价连接的一个或 多个其它多肽分子，所述的其它多肽分子在天然情况下并不与该特定 多肽相连接。因此，"杂交蛋白，，可以是通过共价键结合在一起的两 种天然存在的蛋白质或片段。"杂交蛋白，，还可以是通过将两种人工 多肽通过共价键结合在一起而形成的蛋白质。通常但不是必然地，两 个或更多个多肽分子通过形成单条非分支多肽链的肽键结合或"融 合"在一起。本文所用的术语"蛋白片段"是指代表部分蛋白质的多 肽。"重组(的)"是指已经用分子生物学技术修饰为某些方面不同于其 天然状态的核酸、由核酸编码的蛋白质、细胞或病毒颗粒。例如，重 组细胞可以包含细胞的天然(非重组)形式中未发现的核苷酸序列，或 者可以表达其他异常的、表达不足的或根本不表达的天然基因。重组 细胞还可以包含在细胞的天然形式下发现的基因，其中该基因#^务饰 并通过人工手段重新导入该细胞中。该术语还涵盖含有内源核酸的细 胞，该内源核酸已被修饰而没有将该核酸从该细胞中除去；此种修4牟 包括例如通过基因置换和定点突变获得的那些修饰。"重组宿主细胞"是已将重组DNA序列导入其中的细胞。重组 DNA序列可用任何适合的方法(包括例如电穿孔、磷酸钓沉淀、显微
注射、转化、基因枪和病毒感染)导入宿主细胞中。重组DNA可以或 不可以整合进(共价连接至)构成细胞基因组的染色体DNA中。例如， 重组DNA可以保持在游离型元件，例如质粒上。或者，对于稳定转 化或转染的细胞，重组DNA已整合进染色体中，使得其通过染色体 复制为子细胞所遗传。这种稳定性通过稳定转化或转染的细胞建立由 一群含有该外源DNA的子细胞组成的细胞系或克隆的能力来i正明。 重组宿主细胞可以是原核的或真核的，包括细菌(例如大肠杆菌)、真 菌细胞(例如酵母)、哺乳动物的细胞(例如人、牛、猪、猴和啮齿动物 来源的细胞系)以及昆虫细胞(例如源自果蝇属(Drosophila)和蚕的细胞 系)。还应该理解，术语"重组宿主细胞"不仅指特定的主题细胞，还 指这种细胞的子代或潜在的子代。因为由于突变或者由于环境影响， 在后代中可能发生某些修饰，因此这种子代实际上可能与母体细胞不 相同，^f旦仍包括在本文所用的术语的范围内。"序列，，是指在多聚体中单体的线性顺序，例如，多肽中氨基酸 的顺序或多核苷酸中核苷酸的顺序。如本领域所知的，"序列同一性或相似性"是两个或更多个多肽 序列或两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，可通过比较所述序列 确定。如本文所用的，在两个或更多个核酸序列或两个或更多个多肽 序列之间的关系的内容中，"同 一性"分别指在将序列进行最佳比对 和分析时，相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。为了将查询序列与 (例如)氨基酸序列SEQ ID NO:2比较，将该查询序列与SEQ ID NO:2 进行最佳比对，并获得在SEQ ID NO:2的整个长度上的最佳局部比对。分析可通过人工进行或用序列比较算法实现。对于序列比较，通 常将一个序列作为参考序列，将查询序列与其进行对比。当使用序列 比较算法时，将待测序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标 (如果必要的话)，并指定序列算法的程序参数。用于比较的序列的最佳比对可以(例如)通过使用同源性比对算法 (Needleman和Wunsch, J Mol. Biol., 48:443 (1970))进行。执行Needleman和Wunsch分析的软件可以通过在巴斯德研究所(法国)生物 丰欠4牛网http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/ interfaces/needle.html公开i也获 得。当考虑两个序列的全长时，NEEDLE程序利用Needleman-Wunsch 全局比对算法来发现它们的最佳比对(包括空位)。将同一性计算为在 报告的比对区域(包括该长度中的任何空位)上两个序列间的相同匹配 的百分比。还提供了相似性分数，其中相似性计算为在报告的比对区 域(包括该长度中的任何空位)上两个序列间的匹配百分比。标准的对 比利用了用于蛋白质序列的EBLOSUM62矩阵和用于核苷酸序列的 EDNAFULL矩阵。空位开放罚分(gap openpenalty)是产生空位减去的 分数；使用空位开放罚分的默认设置为10.0。对于空位延伸(gap extension),对于空位中的每一个碱基或残基，罚分被力n入标准的空位 罚分；默认设置为0.5。杂交也可被用作测试来表明两种多核苷酸基本上与彼此相同。具 有高度同一性的多核苷酸在严格杂交条件下彼此杂交。"严格杂交条 件"具有本领域已知的含义，如Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)中描述的一样。示例性的严格杂交条 件包括在约45'C下在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中杂交，然后在 50-65。C下在0.2xSSC和0.1% SDS中进行一次或多次洗涤，视杂交的 多核苷酸共享互补性长度的不同而异。"载体"是指异源核酸可以插入或被插入其中的核酸分子。 一些 载体可以被导入允许该载体复制或允许由该栽体或构建体编码的蛋 白质表达的宿主细胞中。载体通常具有选择标记，例如，编码耐药性 蛋白的基因、复制起点序列以及允许插入异源序列的多克隆位点。载 体通常是基于质粒的，并且质粒由小写字母"p"后面跟着字母和/或 数字的组合进行命名。本文所公开的起始质粒是市售的、可在不受限 制的基础上可公开获得的，或者可以通过应用本领域已知的方法从可 获得的质粒构建。根据本发明可以使用的许多质粒和其它克隆载体和表达载体对于本领域技术人员是熟知的并且容易获得。此外，技术人 员可容易地构建适用于本发明的任何数量的其它质粒。根据本公开内 容，本发明中这种质粒以及其它载体的特性、构建和使用，对技术人 员将是显而易见的。
在实践本发明时，使用了分子生物学、」微生物学和重组DNA中 的许多常规技术。这些技术是熟知的，并且在例如以下文献中有详细 说明F.M. Ausubel编辑,Current Protocols in Molecular Biology,第I、 II和III巻(1997); Sambrook等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press， Cold Spring Harbor, NY (2001)。
本发明提供了通过测量人糜酶裂解人SLPI的水平来测量人糜酶 的生物活性的一般方法。
在一个一般方面，本发明提供了通过测量生物样品中人糜酶裂解 人SLPI的水平，检测人受试者的糜酶相关疾病的方法。患有糜酶相 关疾病的人受试者可能具有过度活性的糜酶或者水平升高的糜酶。因 此，与健康人受试者的生物样品相比，从这类人受试者中取得的生物 样品包含更多由糜酶在特异性位点Leu72-Met73处进行的SLPI裂解。
任何类型的生物样品都可用于本发明。在具体实施方案中，生物 样品可以为唾液、痰、鼻腔渗出液、ELF或者灌洗液。生物才羊品可以 以本领域技术人员已知的方式从人受试者中得到。对照生物样品包含 与试验生物样品类型相同的目标组织、细胞和/或生物体液，并且可从 一个或一群未被诊断患有糜酶相关疾病的健康人中获得。
全长人SLPI的水平和由糜酶裂解产生的SLPI片段的水平都可从 生物样品中测得，并可用于定量人糜酶裂解人SLPI的水平。生物样 品中全长人SLPI的水平和由糜酶裂解产生的SLPI片段的水平可通过 本领域技术人员已知的用于蛋白质定量的任何手段测量。
在一个实施方案中，SLPI或SLPI片段可从生物样品分离或纯化 并测定其含量。使用本领域已知的方法，例如基于大小的分离方法(例 如凝胶过滤)，SLPI或SLPI片段可容易地从剩余的生物样品中分离出
来。另外，样品还原以后，样品中SLPI或者SLPI片段可在凝胶(例如 聚丙烯酰胺凝胶)上进行分离，随后利用与蛋白质复合物有免疫反应的 抗体作免疫印迹。或者，SLPI或SLPI片段的水平可在生物样品中确定而无需分离 或纯化。为此目的，优选的是在免疫测定法中使用与SLPI或SLPI片 段选择性发生免疫反应的抗体。例如，可使用免疫细胞化学方法。也 可以使用其它熟知的基于抗体的技术，包括例如酶联免疫吸附测定 (ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)、萸光免疫测定、 蛋白A免疫测定和免疫酶测定(EMA)。例如，参见美国专利第 4，376，110和4，486，530号，两者都以引用的方式并入本文。然后，将人糜酶裂解人SLPI的水平计算为存在于试验生物样品 或测定混合物中糜酶裂解产生的人SLPI片段与全长SLPI的比率。与 对照样品相比，试验样品中人糜酶裂解人SLPI的水平升高表明，人 受试者患有糜酶相关疾病或发生糜酶相关疾病的风险增高。在另一个一般方面，本发明通过测量治疗前、治疗期间或治疗后 人糜酶裂解人SLPI的水平，提供了评价治疗人患者的糜酶相关疾病 的效果的方法。对糜酶相关疾病的有效治疗将P条低人患者体内糜酶的 生物活性或者降低糜酶的含量。因此，将在有效治疗后在取自这种人 患者的生物样品中观察到糜酶在特异性位点Leu72-Met73对人SLPI 的裂解较少。作为对照，包含与试验生物样品相同类型的目标组织、 细胞和/或生物体液的生物样品可在治疗前从同一人患者获得。与对照 样品相比，试验样品中人糜酶裂解人SLPI水平的降低表明对所述患 者的糜酶相关疾病的治疗是有效的。本发明的方法还包括分析与糜酶相关疾病相关的其它生物标记、 表型或生理学变化的步骤。例如，在哞喘中，最近据报道在哞喘患者 中，VEGF水平和气道血管通透性指数与气道阻塞和气道对乙酰曱胆 碱反应性过高的程度呈负相关(Kanazawa等，Clin Exp Allergy 2005年 11月，35(11): 1432-6)。具体而言，发现在不患溃疡性结肠炎(UC)的哮
喘患者和患有溃疡性结肠炎的哞喘患者中，诱导的痰中VEGF水平和 气管血管通透性指数显著高于正常对照或溃疡性结肠炎患者(出处同上)。因此，在诊断哮喘症的本发明方法中，或在评价治疗哞喘症有效 性的本发明方法中，该方法还包括在人受试者诱导的痰中分析VEGF 表达水平的步骤。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种炎症性肺疾病，与不是完全可 逆的进行性气流限制相关。COPD包括通常与吸烟相关的慢性阻塞性 支气管炎和肺气肿。尽管COPD精确的病因学未知，医学文献提出在 某些情况下，COPD可能代表了自非常严重的慢性哮喘开始的病理学 发展。因此，目前可用于治疗COPD的疗法主要是那些设计来减轻与 哞喘相关的气道炎症和肺部炎症的方法。目前的疗法包4舌口力良或吸入 皮质类固醇和支气管扩张药，例如|32-肾上腺素能激动剂和胆碱能拮抗 剂。因此，可以预期用于哞喘的新疗法也将是COPD的可能疗法。关 于COPD的综述参见de Boer, W. I. ， Perspectives for cytokine antagonist therapy in COPD， Drug Discovery Today, 10(2):93， 2005;和Barnes, P.J.， New Treatments for COPD, Nature Reviews-Drug Discovery, 1: 437， 2002。.同哮喘一样，COPD的炎症方面可通过包括白细胞(例如 嗜中性粒细胞和巨噬细胞)流入肺和气道的炎症反应来表征。这种流入 是与哮喘和COPD两者都相关的气道和肺部炎症的特点之一。因此， 在诊断COPD症的本发明方法或评价治疗COPD症的有效性的本发明 方法中，所述方法还包括测量白细胞流入肺和气道的步骤。细胞因子是哮喘和COPD中的关键炎性介质。促炎细胞因子尤其 包括白介素(IL)-1、胂瘤坏死因子(TNF)-a和巨噬细胞趋化因子 (MCP)-1。治疗译喘和COPD的有效治疗剂往往降低这些促炎细胞因 子的水平。因此，在诊断哮喘或COPD症的本发明方法或评价治疗哮 喘或COPD症的有效性的本发明方法中，所述方法还包括测量受试者 细胞因子水平的步骤。本发明的另 一方面是筛分有较好机会响应糜酶抑制剂治疗的患
者的方法，该方法包括测量这些患者的SLPI裂解水平的步骤。具有 更多SLPI裂解的患者可能具有机能亢进的糜酶，并因而可能更能响 应糜酶抑制剂疗法。例如，哮喘可由缩窄相关的(应用支气管扩张器) 和/或气道构造相关的(粘液过度产生)活动产生。仍需确定肥大细胞及 其释放的糜酶的作用是否涉及嗜喘的异常病理生理学特征中的任一 个或两者。因此，哮喘可能是糜酶依赖性机理和/或糜酶非依赖性机理 的结果。为此目的，糜酶对SLPI的特异性裂解可用于糜酶非依赖性 哮喘人群与糜酶依赖性哮喘人群的联系或验证或将这两种人群分开， 以加强糜酶抑制剂的效力性能。本发明还提供了鉴定降低人糜酶生物活性的化合物的方法，该方 法包括以下步骤a)使试验化合物与人糜酶和人SLPI在测定混合物中 接触；b)在其中人糜酶裂解人SLPI的条件下孵育测定混合物；c)测量 测定混合物中由糜酶裂解产生的人SLPI片段的水平；和d)将乂人步骤 c)中检测的量与来自对照样品的检测结果比较，其中测定混合物中未 包含试验化合物。化合物鉴定方法可利用常规的实验室形式，或在适用于高通量的 测定法中进行。术语"高通量"是指允许容易同时地和/或快速连续地 筛选多个样品的测定设计，并且可包括机器人操作的能力。高通量测 定的另一个理想的特征为一种优化以减少试剂使用，或使操作次数最 小化以便实现所需分析的测定设计。测定形式的实例包括用于液体处 理实验的96孔板或384孔板、悬浮液滴(levitatingdroplet)和"芯片实 验室"微通道芯片。本领域技术人员熟知，随着塑料模具和液体处理 设备小型化的发展，或随着设计出改进的测定设备，可以用本发明的 设计处理更大量的样品。任何试验化合物可在本发明的筛选测定法中筛选，以选择本发明 的蛋白质复合物的调节剂。术语"鉴定"化合物旨在既涵盖(a)从先前 未知为糜酶调节剂的群组中选择化合物；又涵盖(b)测试已知能够结合 或调节糜酶功能和活性的化合物。这两种类型的化合物在本文中都统 称为"试验化合物"或"候选化合物"。候选化合物涵盖大量的化学 类别，包括但不限于小的有机或无机化合物、天然或合成的分子，例如抗体、蛋白质或其片段、反义核酸、干扰RNA (iRNA)和核酶以及 它们的衍生物、模拟物和类似物。优选地，它们为小分子有机化合物， 即分子量不大于10,000道尔顿，更优选分子量小于5，000道尔顿。优 选的是，试验化合物是以本领域已知的文库形式提供，例如以化学合 成文库(一般参见Gordan等，J. Med. Chem.， 37:1385-1401 (1994))、重 组表达文库(例如噬菌体展示文库)以及基于体外翻译的文库(例如核 糖体展示文库)的形式提供。候选化合物包括与多肽的结构相互作用所必需的化学官能团，并 且通常包括至少一个胺基、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官 能团，更优选至少三个化学官能团。候选化合物可以包含环碳或杂环 结构和/或被一个或多个上述官能团取代的芳族结构或聚芳族结构。候 选化合物还可为生物分子，例如肽、糖类、脂肪酸、甾醇、类异戊二 烯、嘌呤、嘧啶、上述物质的衍生物或结构类似物或者其组合等。如 果化合物为核酸，则该化合物通常为DNA或RNA分子，尽管还可以 想到具有非天然键或亚单元的修饰核酸。候选化合物从各种来源获得，包括合成化合物文库或天然化合物 文库。例如，大量手段可用于各种有机化合物和生物分子的随机合成 和定向合成，包括随机化寡核苷酸的表达、合成的有机组合文库、随 机肽的噬菌体展示文库等。候选化合物还可用本领域已知的组合文库 方法中的多种方法的任何一种获得，包括生物文库；空间可寻址平行 固相或液相文库需要重叠合法的合成文库方法；"一珠一化合物" 文库方法以及用亲和色语选择的合成文库方法(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145)。或者，可以得到或容易地产生细菌、真菌、植物 和动物提取物形式的天然化合物文库。另外，天然的文库和化合物以 及合成产生的文库和化合物可以容易地通过常规的化学、物理和生化 手段进行修饰。
此外，已知的药理性药物可以经过定向或随机的化学修饰，例如 酰化、烷基化、酯化、酰胺化等来产生药理性药物的结构类似物。候 选化合物可以随机选择或者可基于结合和/或调节糜酶活性的功能的 现有化合物。因此，候选药物的来源是一个或多于一个的分子文库， 所述的分子是基于一种或多种提高或降低糜酶活性的已知化合物，其 中所述化合物的结构在分子的一个或多个位置经过改变以包含更多 或更少的化学部分或不同的化学部分。在产生类似物激活剂/抑制剂的 文库时对分子所做的结构改变可以是定向的、随机的或定向和随机的 组合的取代和/或添加。在制备组合文库时，本领域普通技术人员可以 基于现有化合物容易地制备这种文库。多种其它试剂也可被包含于混合物中。这些试剂包括诸如盐、緩 冲剂、中性蛋白质(例如白蛋白)、去垢剂等之类的试剂，其可用以促 进最佳的蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-核酸的结合。这种试剂还可降低 反应组分的非特异性或背景相互作用。也可以使用提高测定效果的其 它试剂，例如核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。分子文库的合成方法的实例可在本领域中找到，例如在Zuckermann等(1994) J Med. Chem. 37:2678中找到。化合物文库可存 在于溶液中(例如Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421)或微珠上 (Lam (1991) Nature 354:82-84)、 芯片上(Fodor (1993) Nature 364:;555-556)、细菌中(美国专利第5，223，409号)、孢子中(美国专利第 5，571，698号)、质粒中(Cull等(1992) Proc, Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869)或噬菌体中(例如参见Scott和Smith (1990) Science 249:3 86-390)。可以测试选择的化合物降低糜酶在特异性位点Leu72-Met73裂 解SLPI的生物活性的能力。在测试过程中，可以将试验化合物在SLPI 之前、之后或同时加入糜酶中，作为SLPI蛋白酶活性的底物。通常， 进行了对照测定，在该对照测定中上述筛选测定法是在不存在试-验化 合物时进行。然后，将该对照试验的结果与试验化合物存在情况下获
得的结果相比较。筛选测定中的糜酶或SLPI可以是分离的或不分离的。在一个实 施方案中，基本纯化的糜酶或SLPI可用于筛选测定中。对技术人员 显而易见的是，任何重组表达方法都可用于本发明，用以表达和纯化 SLPI或糜酶。可用于本发明的示例性核酸分子包括编码人糜酶或SLPI 的核酸分子。通常，核酸，优选DNA形式的核酸， 一旦导入宿主细胞后，就 整合进载体中以形成能够指导产生相互作用蛋白成员的表达载体。许 多类型的载体可用于本发明。了解了本发明后，构建用于本发明目的 的表达载体的方法对技术人员来说将是显而易见的。(一般参见 Current Protocols in Molecular Biology,第2巻，Ausubel等主编，Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience,第13章，1988; Glover, DNA Cloning,第II巻，IRL Press, Wash.， D.C.,第3章，1986; Bitter 等，Methods in Enzymology， 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Strathern等主编，Cold Spring Harbor Press, 第I和II巻,1982;和Sambrook等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989)。一般来讲，表达载体包括表达盒，该表达盒具有启动子及与其有 效连接的编码相互作用蛋白质成员的DNA。该启动子可以是天然启动 子，即在天然存在的细胞中发现的负责所述相互作用蛋白质成员在所 述细胞中表达的启动子。或者，表达盒可以为嵌合型表达盒，即具有 不是天然启动子的异源启动子，其负责所述相互作用蛋白质成员在天 然存在的细胞中表达。表达载体还可以包含用于该载体在宿主细月包中 复制的DNA复制起点。优选的是，表达载体还包括用于载体在(例如) 大肠杆菌中扩增的复制起点，以及用于选择和仅维持包含该表达载体 的宿主细胞的选择标记。这样构建的表达载体可通过本领域已知的任何技术，例如，通过 直接DNA转化、显微注射、电穿孔、病毒感染、脂转染、基因枪等 技术导入宿主细胞中。目标蛋白质的表达可以是瞬时的或稳定的。表 达载体可以在宿主细胞中以染色体外状态，即作为自我复制质粒或病 毒而保持。或者，表达载体可通过常规技术，例如稳定细胞系或位点 特异性重组的选择而整合到宿主细胞的染色体中。在稳定细胞系中， 至少表达载体的表达盒部分被整合到宿主细胞的染色体中。载体构建体可以设计为适于在多种宿主细胞中表达，所述宿主细 胞包括但不限于细菌、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞以及哺乳动物 和人细胞。制备表达载体用于在不同宿主细胞中表达的方法对于技术人员来i兌应该是显而易见的。糜酶或SLPI的同系物和片段也可用上述重组方法容易地表达。 例如，为了表达蛋白片段，可以选择掺入表达载体的DNA片段，使 得其仅编码该蛋白片段。同样，特定的杂交蛋白可用编码该杂交蛋白 的重组DNA进行表达。类似地，同系物蛋白质可用编码该同系物蛋 白质的DNA序列进行表达。编码同系物的DNA序列可以通过用重组 DNA技术操纵天然蛋白质编码序列得到。为此目的，可用本领域公知 的技术进行随机诱变或定点诱变。为了制备蛋白质衍生物，例如，天 然的相互作用蛋白成员的氨基酸序列可以通过定点DNA诱变以预定 方式来改变，以产生或移除共有序列。在另一个实施方案中，本发明涉及的糜酶或SLPI可以存在于生 物样品，例如唾液、痰、鼻腔渗出物、ELF和灌洗液等中。糜酶或SLPI 还可以与细胞締合或存在于细胞溶解产物中。本发明还包括在糜酶活性的 一个或多个其它测定中对化合物进 行测试的步骤。可以针对其它的糜酶活性对化合物作进一步测试，所 述的其它活性包括但不限于其将血管紧张素I转化为血管活性肽血 管紧张素II的能力、将大内皮素1选择性地转化为31个氨基酸长的 肽内皮素l的能力、降解胞外基质的能力、裂解干细胞因子以产生具 有生物活性的可溶性产物的能力、加工前胶原酶、炎性细胞因子和其 它生物活性肽的能力，等等。在一个具体实施方案中，可以在包含糜
酶和显色底物的酶抑制测定中进一步测试化合物(参见例如Garavilla 等，TheJ.Bio. Chem.2005, 280:18001-18007)。本发明的方法还包括在糜酶相关疾病的动物模型中测试该化合 物的步骤。例如，公认的气道炎症模型是猪蛔虫(^yc^ly犯w附)抗原诱 发的哮喘绵羊模型。将试验化合物给予该绵羊模型后，嗜中性粒细胞 和巨噬细胞流入的减少将给本领域普通技术人员提示，该化合物将可 用于治疗与哮喘和COPD相关的气道和肺部炎症。气道炎症的另 一个 模型是大鼠的脂多糖(LPS)诱发的气道中性白细胞增多，其中，将LPS 导入肺时，白细胞流入支气管肺泡灌洗液中。将试验化合物给予该大 鼠模型后，逆转的LPS诱发的气道炎症，和支气管肺泡灌洗液中的中 性白细胞数降低，将给本领域普通技术人员提示，该试验化合物将可 用于治疗哮喘和COPD。哮喘和COPD的又一个模型是大鼠的糖原诱 发的急性腹膜炎模型。当将试验化合物给予该大鼠模型后，经糖原处 理的大鼠的腹水和血浆中促炎细胞因子(尤其是包括IL-1、 TNF-a和 MCP-1)的水平降低证明，该试验化合物将可用于治疗孝喘和COPD。实施例1人糜酶在特异性位点裂解重组人SLPI 尽管有研究人员已经报道了牛(Grutter等，Embo J 1988; 7:345-51) 和绵羊(Pemberton等，Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34)肥大细 胞蛋白酶能裂解人SLPI，但是没有报道it^糜酶裂解SLPI的研究。 本实施例研究了人糜酶裂解重组人SLPI (rSLPI)的能力。重组人SLPI和山羊抗SLPI多克隆抗体从R&D systems (Minneapolis, MN)获得。兔抗SLPI抗体从Abeam (Cambridge, MA) 获得。人糜酶和类胰蛋白酶从Cortex Biochem (San Leandro, CA)获得。 组织蛋白酶G和弹性蛋白酶购自Biodesign International (Saco, ME), 蛋白酶3购自Fitzgerald Industries International (Concord, MA)。除非 另有说明，否则本文包括的其它实施例中也可以使用类似的试剂。
将重组人SLPI与人糜酶(摩尔比40:1)在37。C下于0.1 M Tris-HCl， pH8.0， 0.5MNaCl中孵育。在多个时间点后收集样品。将 还原的样品在4-12% SDS-PAGE (NuPAGE, Invitrogen)(每孔2ug rSLPI)上分离并用考马斯染料染色。图1显示将rSLPI与人糜酶孵育大约20分钟后观察到重组人SLPI 的裂解。甚至在rSLPI十倍过量于糜酶时，大部分rSLPI蛋白仍被裂 解(数据未显示)。全长人SLPI被裂解成两个片段。质语分析表明，大 约11.7 kD的全长人SLPI被裂解为大小大约7.9 kD和3.8 kD的两个 片段。为确定裂解的确切位点，对全长(图1,条带A)和裂解片段的条 带(图1，条带B和C)进行N-端测序。测序分析表明重组人SLPI在 Leu72-Met73处祐人糜酶裂解。该结果表明，已知的糜酶抑制剂SLPI (Fink等，BiolChemHoppe Seyler 1986; 367:567-71)还充当糜酶的底 物。这与牛和绵羊肥大细胞蛋白酶裂解人SLPI的活性一致(Grutter等， 出处同上；和Pemberton等，出处同上)。利用LC/MS分析测试了一系列蛋白酶(包括弹性蛋白酶、组织蛋 白酶G、类胰蛋白酶和蛋白酶3)裂解重组人SLPI的能力。已知这些 蛋白酶受SLPI抑制。将重组人SLPI(l吗)与试验蛋白酶(50ng)孵育5 小时。然后在50mM NH4HCO3緩冲液中将样品稀释至大约0.1吗蛋 白/^d。使用Agilent 1100 LC/MSD进行液相色镨测定。将稀释样品(IO pl)以0.2 mL/min的流速注入Zorbax SB300 5u C8, C18 (150x2.1 mm) 柱上。使用30分钟的15%至60%的溶剂A中的溶剂B梯度洗脱样品 内的蛋白质，其中溶剂A为(0.1%曱酸+0.02%TFA)/H2O;和溶剂 B为(0.1%曱酸+ 0.02% TFA)/ACN。在10.7分钟的保留时间检测到 裂解的rSLPI，而在12.2分钟检测到完整的SLPI。 Agilent 1100 MSD SL 质谱仪通过电喷射电离源与1100HPLC系统相接。系统控制和数据获 取使用10.02版的Chemstation软件。通过LC/MS，天然rSLPI得以分离并且已检测到11708道尔顿的 预期大小。与糜酶孵育后，从HPLC解析出第二个峰。这第二个峰具
有另外的18个质量单位，与水添加至有切口的或裂解的rSLPI分子一 致。因此，第二个峰的存在表明糜酶的确裂解了 rSLPI,如从SDS-PAGE 分析所观察到的。rSLPI与所述蛋白酶组中其它蛋白酶的孵育没有导 致形成第二个峰，表明测试的其它蛋白酶不裂解rSLPI。在蛋白酶存 在情况下rSLPI样品的还原确实导致了 SLPI蛋白的裂解，表明其它蛋 白酶能够裂解还原形式的rSLPI。其它蛋白酶不能裂解SLPI与Vogelmeier等人的研究一致，该研 究表明SLPI没有被弹性蛋白酶和组织蛋白酶G裂解(J Clin Invest 1991; 87:482-8)。实施例2糜酶抑制剂降^A糜酶对人rSLPI的裂解本实施例研究了糜酶抑制剂对人糜酶裂解人SLPI的影响。对多 种浓度的两种糜酶抑制剂进行了测试糜酶抑制剂A: [2-(3-{曱基 -[1-(萘-2-羰基)-哌啶-4-基]-氨曱酰基}-萘-2-基)-1-萘-1-基-氧代-乙基]-膦酸)，其在US20030195172中已有描述；和糜酶抑制剂B: {(5-氯-苯并|>]噻吩-3-基)-[2-(3-氯-5-氟-苯基)-乙烯基氨曱酰基]-曱基}-曱基 次膦酸，其在US20050176769中已有描述。在存在或不存在糜酶抑制剂的情况下，将重组人SLPI (80皮摩尔) 与人糜酶(80皮摩尔)在1M Tris緩沖液(pH 7.5)或PBS中于37。C下孵 育30分钟。进行蛋白质印迹分析，以对rSLPI的量和较大的SLPI裂 解产物(根据质谱分析，大约为7.9 kD)的量进行定量。将样品用等体 积的含SDS緩冲液和含|3-巯基乙醇的緩冲液变性和还原。将每种样品 加到4-20%的梯度聚丙烯酰胺凝胶或15%的聚丙烯酰胺凝胶上。样品 进行电泳，再转移至PVDF膜(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)上。 将印迹于室温下在5。/。乳/PBS-吐温(PBS/0.4。/。吐温-20)中阻断1小时。 将印迹与在封闭溶液稀释的一抗(山羊抗SLPI以1:1000稀释的或兔抗 SLPI以1:2000稀释)在4。C下孵育过夜。用PBS-吐温洗涤三次后，将
印迹与在封闭稀释液中以1:2500稀释的二抗(山羊抗兔HRP或兔抗山 羊HRP)在室温下將育1小时。将印迹用PBS-吐温洗涂6次，与Wester Lightning化学发光试剂(Perkin Elmer， Boston, MA)在室温下孵育1 分钟，并在暗室中对Biomax Light胶片(Eastman Kodak ， Rochester ， NY)进行显影。将购自Alpha Innotech (San Leandro, CA)的光密度计 FluorChem(tm) 8000凝月交成4象系统(Advanced Fluorescence ， Chemiluminescence and Visible Imaging System)用于观'J量与显影月交片 上rSLPI的量和较大SLPI裂解产物的量相关的密度。用以下公式计算SLPI裂解的百分比lOOx (较大的SLPI裂解产 物的密度/(rSLPI的密度+较大的SLPI裂解产物的密度))。图2显示了糜酶抑制剂对糜酶裂解SLPI的影响。抑制的量与所 加入的糜酶抑制剂的量直接相关。这说明了该测定法对确定糜酶抑制 剂化合物的功效的有用性。实施例3人糜酶裂解临床样品中的人SLPI本实施例说明了测定SLPI裂解的离体测定法，该SLPI来自可容 易获取的临床样品-人唾液。将10 pl人唾液与糜酶(4吗/0.1U/5 MM)和/或糜酶抑制剂(100 pM) 在37°C (用PBS使总体积达到30 pl)孵育30分钟。将10 jal唾液稀释 于20 pi PBS作为未消化的唾液样品。如实施例2所述，进4亍蛋白质 印迹分析以测定唾液样品中SLPI的量和较大的SLPI裂解产物的量， 并计算SLPI裂解的百分比。图3显示了外源性糜酶裂解唾液样品中的SLPI,如同其对rSLPI 的裂解。还显示了糜酶抑制剂对糜酶裂解SLPI的能力的影响。糜酶 抑制剂{(5-氯-苯并[1)]噻吩-3-基)-[2-(3，4-二氟-苯基)-乙烯基氨曱酰基]-甲基卜曱基次膦酸，在US20050176769中已有描述。抑制剂降低了糜 酶活性并抑制了对来自唾液的SLPI的裂解(图3)。这些结果表明，可
以用唾液样品监测糜酶的活性以及糜酶抑制剂的效果。与实施例1的结果一致，测试的一系列蛋白酶中，唾液中SLPI 的裂解对于糜酶是独特的。当将唾液样品与组织蛋白酶G、类胰蛋白 酶和蛋白酶3孵育时，没有观察到较大SLPI裂解产物。唾液与弹性 蛋白酶孵育后观察到SLPI的少量消化。然而，所得的消化产物双条 带(SDS-PAGE分析后大约为11 kD和10.5kD)与糜酶消化产生的裂解 产物的大小不同。实施例4SLPI加工作为糜酶相关疾病的生物标记测量来自正常受试者和变态反应患者的人唾液样品中SLPI的裂 解，所述变态反应与糜酶活性过强相关。唾液样品是从人受试者获得的 一名受试者主诉由于暴露于小鼠 而诱发的变应性症状(变态反应)，另一名受试者没有呼吸性疾病(正 常)。样品在-80。C下冷冻保存。样品在水上解冻，涡旋。将唾液(10pl) 用PBS(15fxl)稀释。如实施例2所述，进行蛋白质印迹分析以测定唾 液样品中SLPI的量和较大的SLPI裂解产物的量，并计算SLPI裂解 的百分比。图4显示了正常受试者和变态反应患者的唾液样品之间SLPI裂 解量的差异。在变态反应唾液样品中观察到更高百分比的SLPI裂解， 表明SLPI加工可以用作糜酶相关疾病的生物标记。实施例5将下列方法用于研究患有变应性鼻炎的受试者中，在基线时和响 应相关变应原时的鼻内上气道炎症的可溶性组分(介质、细胞因子)。材料1支移液管(>10 cc)或10 cc注射器无菌洗鼻液0.9%NaCl， 1个鼻孔10ml，预热至37°C
预热装置 棉纸漏斗(40 mm) 注射器(10cc) 塑料容器 鼻镜冰的0.1%塞洛唑啉鼻喷雾剂(根据De Graaf-In't Veld C等，Clin Exp Allergy 1995; 25:966-73 的有效技术改进)1. 0.9%NaCl无菌溶、^i口热至37°C。2. 用鼻镜和足够光照检查鼻子的可达性。3. 受试者就座后伸长其脖子大约30°。用移液管或注射器向该 名受试者的一个鼻孔内滴入lOcc已加热的0.9%NaCl溶液。 指导受试者在操作过程中不要吞咽或呼吸。4. IO秒钟后，让受试者弯腰躬身并逐渐从其鼻子中排出洗涤液 至漏斗(与10 cc注射器连接)中。5. 攻击前，总共采用了 4次鼻腔洗涤以除去碎片。6. 为测试第1天研究的可重复性，第2天(攻击前)分析了第一 次洗涤液；第2天第一次洗鼻后，在另外3个NAL操作过程 前每个鼻孔用0.1%赛洛唑啉喷雾1次IO分钟(不允许受试者 擤鼻涕)。7. 数分钟后，进行第二次和第三次洗鼻(并处理)。8. 将第4次洗涤液保存于水上的塑料容器中直至处理。9. 1小时内进行所有的NAL,并保存在水上直至处理时。结果见图5。图5说明了 cSLPI的增加与变应性症状的增加相关。 通过蛋白质印迹分析测定了抗原攻击前0.75小时和0.5小时和抗原攻 击后0.5小时和7小时从个体获得的鼻灌洗液中cSLPI与总SLPI的比 率(图5b)。在相同时间点，对患者的症状强度进行评分(Lebel评分)(图 5a)。 ，实施例6使用欧洲呼吸协会(ERS)推荐法和包括高渗或等渗盐溶液吸入的 规程从受试者收集痰。在轻度至中度哞喘患者中，用高渗盐水诱发痰， 其中盐水:帔气雾化并以3-4个5分钟的周期吸入。在更严重的哮喘患 者中，使用改良ERS规程，以吸入正常盐水开始，更緩慢发展至高渗 盐水，只要FEVi没有显著下降。结果见图6。图6说明了哮喘的痰样品中的cSLPI/总SLPI百分 比要比正常痰样品的高，并且与这些个体的糜酶水平相关。痰样品是 从正常受试者和哮喘受试者获得的。通过蛋白质印迹分析确定cSLPI 与SLPI的比率和糜酶水平。通过光密度测定分析法测定各值。
权利要求
1. 一种检测人受试者的糜酶相关疾病的方法，包括以下步骤a. 从所述人受试者获得生物样品；b. 测量所述生物样品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c. 将步骤b)所测水平与健康人受试者的人糜酶裂解人SLPI的对照水平相比较，其中人糜酶裂解人SLPI的水平与所述对照相比升高表明所述人受试者患有糜酶相关疾病或患糜酶相关疾病的风险增加。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是唾液。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述糜酶相关疾病选自p孝 喘、变应性鼻炎、纤维变性、高血压、心脏JI巴大、心力衰竭、类风湿 性关节炎、糖尿病性肾病、嚢性纤维化、COPD和炎性疾病。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI的 水平以所述生物样品中存在的糜酶裂解产生的人SLPI片段与全长 SLPI的比率来测量。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人SLPI 片段基本上由SEQIDNO:3的氨基^列组成。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人SLPI 片段基本上由SEQIDNO:4的氨基酸序列组成。
7. 根据权利要求4所述的方法，其中所述全长人SLPI基本上由 SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
8. —种评价治疗人患者的糜酶相关疾病的有效性的方法，包括以 下步骤a. 从人患者获得生物样品；b. 测量所述生物样品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c. 将步骤b)所测水平与人患者治疗前人糜酶裂解人SLPI的对照 水平相比较，其中人糜酶裂解人SLPI的水平与所述对照相比降低表 明对所述患者的糜酶相关疾病的治疗是有效的。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述生物样品是唾液。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述糜酶相关疾病选自哮 喘、变应性鼻炎、纤维变性、高血压、心脏肥大、心力衰竭、类风湿 性关节炎、糖尿病性肾病、嚢性纤维化、COPD和炎性疾病。
11. 根据权利要求8所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI 的水平以所述生物样品中存在的糜酶裂解产生的人SLPI片段与全长 SLPI的比率来测量。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人 SLPI片IS:基本上由SEQIDNO:3的氨基酉齡列组成。
13. 根据权利要求11所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人 SLPI片段基本上由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成。
14. 根据权利要求11所述的方法，其中所述全长人SLPI基本上 由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。
15. 根据权利要求8所述的方法，其中所述对人患者的糜酶相关 疾病的治疗包括应用降低糜酶生物活性的化合物。
16. —种测量人糜酶的生物活性的方法，包括以下步骤a. 使人糜酶与人SLPI在测定混合物中接触；b. 在其中所述人糜酶裂解所述人SLPI的条件下孵育所述测定混 合物；和c. 测量在所述测定混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人糜酶包括SEQ ID NO:l的氨基酸序列。
18. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人SLPI包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
19. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI 的水平以所述生物样品中存在的糜酶裂解产生的人SLPI片段与全长 SLPI的比率来测量。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人　SLPI片段基本上由SEQIDNO:3的氨基酸序列组成。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人 SLPI片段基本上由SEQ IDNO:4的氨基酸序列组成。
22. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人SLPI是分离的。
23. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人SLPI是在生物样 品内。
24. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人糜酶是分离的。
25. 根据权利要求16所述的方法，其中所述人糜酶是在生物样品内。
26. —种鉴定降低人糜酶生物活性的化合物的方法，包括以下步骤a. 使试验化合物与人糜酶和人SLPI在测定混合物中接触；b. 在其中所述人糜酶裂解所述人SLPI的条件下孵育所述测定混 合物；c. 测量在所述测定混合物中人糜酶裂解人SLPI的水平；和d. 将步骤c)所检测的水平与从对照检测到的水平相比较，其中所 述测定混合物中未包含所述试验化合物。
27. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人糜酶包括SEQ ID NO:l的氨基酸序列。
28. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人SLPI包括SEQ ID NO:2的氨基^列。
29. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人糜酶裂解人SLPI 的水平以所述生物样品中存在的糜酶裂解产生的人SLPI片段与全长 SLPI的比率来测量。
30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人 SLPI片段基本上由SEQ IDNO:3的氨基^列组成。
31. 根据权利要求29所述的方法，其中所述糜酶裂解产生的人 SLPI片段基本上由SEQ IDNO:4的氨基斷列组成。
32. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人SLPI是分离的。
33. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人SLPI是在生物样 品内。
34. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人糜酶是分离的。
35. 根据权利要求26所述的方法，其中所述人糜酶是在生物样品内。
36. —种试剂盒，包括a. 特异性结合SLPI片段的抗体，该SLPI片段基本上由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；和b. 用于将所述SLPI片段的测量水平与人糜酶生物活性相关联的 说明书。
37. —种篩分具有更好机会响应涉及糜酶抑制剂的治疗的患者的 方法，包括以下步骤a. 从患者获得生物样品；b. 测量所述生物样品中人糜酶裂解人SLPI的水平；和c. 将步骤b)所测水平与健康人受试者的人糜酶裂解人SLPI的对 照水平相比较，其中人糜酶裂解人SLPI的水平与所述对照相比升高 表明所述患者具有更好的才凡会响应涉及糜酶抑制剂的治疗。
全文摘要
现在发现，人糜酶在特异性位点裂解人SLPI，并且这种裂解可以用作糜酶活性的指示。本发明提供了通过测量SLPI加工来诊断人受试者的糜酶相关疾病或评价对人受试者的糜酶相关疾病治疗效果的方法，以及其它相关方法和组合物。
文档编号G01N33/53GK101401001SQ200780008605
公开日2009年4月1日 申请日期2007年1月12日 优先权日2006年1月12日
发明者M·R·德安德里, S·贝尔科夫斯基 申请人:詹森药业有限公司