专利名称：内化的制作方法
内化
本说明书中引用了各种文件。对于包括制造者的手册在内的这些 现有技术的文件的公开内容，在此以引用方式将其全部内容并入本 文。
背景技术：
通过对健康人和患病的患者的比较和统计分析、尤其是通过分析 来自所述患者的组织和/或血液来源的血浆，已经将新的靶标鉴定。
通常，比较分析可以在不同水平进行，例如DNA水平、RNA水平、 蛋白质水平和翻译后水平。 一种常用的技术基于基因差异性表达分 析。简单来说，对来自患病细胞和健康细胞的mRNA都进行标记， 随后与基因芯片杂交并量化。从量化信号得出的不同mRNA的上调 或下调揭示了潜在的新靶标。现有技术中公知的另一种方法是基于对 来源自健康人和患病的患者的DNA分子的DNA甲基化模式的鉴定 和比较。
然而，在上文中应该注意的是DNA修饰(即DNA甲基化模式) 和基因差异性表达分析(即细胞中表达的mRNA的水平)均不一定反 映出由相应DNA或相应mRNA编码的特定蛋白是否真正得到表达。 因而，差异性表达水平的鉴定，即健康细胞与患病细胞相比的蛋白表 达模式的定量和定性分析还是一个挑战。
鉴定蛋白差异性表达水平的方法是基于所述蛋白的差示二维凝 胶分析以及经由质谱的后续分析，这是本领域技术人员所公知的技 术。此外，基于蛋白质分级的方法，可以提及的少数几种例如有基于 蛋白质芯片的应用的技术、HPLC和FPLC相关的技术，这些均是本 领域技术人员所公知的。
噬菌体展示技术提供了例如这样一种可能性:在诸如源自例如健 康供体的组织或细胞等样品上排除(deplete)大型文库如结合部分
4(binding member)的表达文库，并且在诸如源自例如患病供体的组织 或细胞等样品上使用该文库的剩余群体(residual population)。通过排 除分析所追踪到的结合部分，即与患病组织/细胞而不是健康组织/细 胞的(多)肽靶标或配对物(counterpart)结合的结合部分，通常被认为可 与靶标细胞(例如患病细胞)上独特地(或至少是高得多地)表达的靶标 结合。随后，结合部分/(多)肽靶标复合体可以通过例如本领域技术人 员公知的质谱或蛋白质分析方法来进行鉴定。
尤其有趣的是可在与其耙标结合时内化的结合部分。本领域技术 人员知晓的是所述结合部分能够例如随后与可能对细胞有毒的任何 物质或任何小分子融合，从而触发对表达所述耙标的(优选患病的)细 胞的杀灭，所述细胞优选为患病的。同样在本领域中公知的是， 一旦 可内化的感兴趣的靶标被鉴定为例如患病细胞或癌细胞，就可以确定 其它结合部分，所述其它结合部分可具有例如对该靶标的较高亲和力 和/或触发所述革E标的内化的较高潜力。因而可以考虑将所述经改善 的结合部分作为例如用于治疗如表达一个或多个所述靶标的患病细 胞的药物。
为了有效地确定在与其相应结合部分结合时就已经内化到细胞 中的潜在耙标，理想的是将已内化的复合体与未内化的复合体分离。 然而，在现有技术中，还不能以满足定性和定量的方式实现所述分离， 从而使技术人员面临用以确定结合部分和可内化的耙标的耗时且复 杂的技术。
因而一直存在的需求是进一步开发并且改进使得可实现已内化 的复合体与未内化的复合体之间的有效分离的方法和工艺。
图1显示了 Fab结合时靶标内化的效率。
百分比(％)内化是由4。C时的细胞表面的细胞外信号对37。C时的 细胞表面的细胞外信号的比率而计算的；荧光的恢复是通过4匸时细 胞外加细胞内染色对37。C时细胞外加细胞内染色的比率而测定的， 显示在内化过程、皂草素(saporin)处理和/或染色期间没有或仅少量噬菌体颗粒丢失。Fab A显示80。/。的内化，FabB仅显示20。/。的内 化，而FabC根本未显示结合。
图2显示噬菌体耙标复合体内化的效率和通过DDT的表面结合 噬菌体的排除。
所显示的是经由二硫键而展示针对占优内化的抗原的Fab A的 噬菌体的内化，与经由二硫键而展示针对非占优内化的抗原的FabB 的噬菌体的内化的比较。
百分比(°/。)内化是由4"C时细胞表面的细胞外信号对37'C时细胞 表面的细胞外信号的比率而计算的；荧光的恢复是通过4'C时细胞外 加细胞内染色对37'C时细胞外加细胞内染色的比率而测定的。
具体实施例方式
本发明在一个方面涉及编码内化到细胞中的复合体的结合部分 的核酸分子的回收方法，所述方法包括如下步骤(a)使细胞与噬菌体 颗粒的多样性集合接触，其中每个或基本上所有的所述噬菌体颗粒均 在其表面上展示结合部分，其中所述结合部分被展示为具有所述噬菌 体颗粒的噬菌体衣壳蛋白的非融合(多)肽并且其中每个或基本上所 有的所述噬菌体颗粒均包含编码所展示的结合部分的核酸分子，(b) 使噬菌体颗粒上所展示的结合部分与其靶标结合，从而使得形成至少 一种复合体，所述复合体中每一种均包含带有其所展示的结合部分的 噬菌体颗粒和其靶标，(c)在可以使至少一种所述复合体内化到细胞中 的条件下培养细胞，(d)在基本不发生细胞裂解的条件下洗脱未内化 的编码结合部分的核酸分子，(e)使包含内化复合体的细胞裂解，和(f) 从裂解的细胞中回收源自至少一种的内化复合体的编码结合部分的 核酸分子。
术语"细胞"是指任何真核或原核细胞。与本发明相关的优选是 哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以包括健康细胞以及患病细胞。
在本发明的情况中，术语"多样性集合"是指在其组成、性质和 /或序列的至少一部分上有所不同的至少两个颗粒或分子的集合。
结合本发明而使用的术语"噬菌体颗粒的多样性集合"是指多个噬菌体颗粒。这样的多个噬菌体颗粒中每个或基本上所有成员均展示不同的结合部分。噬菌体颗粒的多样性集合的产生方法是本领域普通技术人员所公知的。
结合本发明而使用的术语"噬菌体"应以其最广泛的含义来解释。
在本发明的情况中，术语"噬菌体"因而涉及可形成包装(package)的任何细菌病毒，所述包装具有包含噬菌体复制所需的核酸的蛋白衣壳。所述核酸可以是DNA或RNA，可以是双链或单链、线状或环状。本领域普通技术人员所公知的有诸如噬菌体A或丝状噬菌体(如M13、 fd或fl)等噬菌体。
在本发明的情况中优选的是丝状噬菌体，例如M13噬菌体。更优选的是丝状噬菌体VCSM 13。
在本发明的情况中，术语"噬菌体颗粒"是指根据本发明的颗粒，即展示(多)肽/蛋白的颗粒。
在上文中，可以认为噬菌体颗粒的多样性集合的每个或基本上所有的成员均展示结合部分，其中每个结合部分优选在它们的序列的至少一个氨基酸位上有所不同。
本发明的术语"结合部分"是指能够与特定配对物或靶标结合从而形成复合体的任何(多)肽。所述术语在与本发明相关时应被理解为此外还包含本领域技术人员已知的任何构架(scaffold)。与本发明相关的"构架"是指具有通用框架和至少一个可变区的(多)肽的任何集合。本领域技术人员已知的构架是例如基于纤连蛋白的构架或基于锚蛋白重复蛋白的构架。本文所用的术语"(多)肽"描述了一组分子，包括肽组以及多肽组。所述肽组由具有至多30个氨基酸的分子组成，所述的多肽或蛋白组由具有多于30个的氨基酸的分子组成。与本发明相关的术语"(多)肽"应被解释为还包括抗体或抗体片段或者其衍生物。所述抗体应被理解为包含本领域技术人员已知的任何免疫球蛋白。"免疫球蛋白"(Ig)是属于类别IgG、 IgM、 IgE、 IgA或IgD(或者其任何亚类)的蛋白，并且包括所有通常已知的抗体和其功能片段。抗体/免疫球蛋白的"功能片段"因而被限定为保持抗原结合区域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如IgG的可变区)。术语"抗体片段或其衍
7生物"涉及单链抗体或其片段、合成抗体、抗体片段(如Fab、 a F(ab2)'、Fv或scFv等片段)、单域抗体等，或者这些中任何的化学修饰衍生物。可以使用本领域中已知的常规技术来对要根据本发明而采用的抗体或它们相应的免疫球蛋白链在基序外进一步修饰，例如通过单独或组合使用氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域中已知的任何其它修饰(例如翻译后化学修饰，如糖基化和磷酸化)。在以免疫球蛋白链的氨基酸序列为基础的DNA序列中引入所述修饰的方法是本领域技术人员公知的；例如见Sambrook等；Molecular Cloning:A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989年第2版和2001年第3版。
所述抗体分子的片段或衍生物是指作为上述抗体分子的部分的和/或通过化学/生物化学或分子生物学方法修饰的(多)肽。这在加以必要变更的情况下同样适用于任何构架。相应的方法在本领域中是已知的，此外在实验室手册中也有所描述(见Sambrook等，同上;Gerhardt等；Methods for General and Molecular Bacteriology; ASMPress, 1994; Lefkovits; Immunology Methods Manual: TheComprehensive Sourcebook of Techniques; Academic Press, 1997;Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2002)。
在本发明的情况中术语"展示为非融合的(多)肽"是指不经由本领域技术人员已知的任何常规融合技术来展示的任何(多)肽。常规展示可以通过例如基因融合来实现，其中由优选2个基因的融合产生作为表达产物的融合蛋白。本领域的技术人员知晓的是所述融合蛋白在现有技术中有时称作杂合蛋白或嵌合蛋白，其通过遗传工程学制成的杂合基因的表达而产生，并且其中组合了优选2个的单独的基因序列。
与本发明相关的术语"噬菌体衣壳蛋白"可以被看作不仅包括源自本领域技术人员公知的任何噬菌体的噬菌体衣壳蛋白，还包括源自其的片段，其中所述片段能够被引入到噬菌体颗粒的蛋白衣壳中。
结合本发明而使用的术语"靶标"是指(i)细胞上所表达的能够与结合部分结合的任何(多)肽或者(ii)能够被内化到细胞中并且能够与
结合部分结合的任何分子。优选的是任何细胞表面受体，更优选的是受体酪氨酸激酶。所述靶标包括不为本领域的技术人员所知且有待鉴定的任何靶标或者可能本身是已知的但在其内化能力方面还未知的任何靶标。在与本发明相关的情况中，表达至少一种潜在靶标的细胞也被称为"靶标细胞"。
术语"使至少一种所述复合体内化到细胞中"是指本领域技术人员公知的、可触发复合体内化到细胞中的任何技术。优选的是依赖温
度变换(temperature shift)的技术，例如将温度从4。C升高到37°C 。
结合本发明所用的短语"在基本上不发生细胞裂解的条件下洗脱未内化的编码结合部分的核酸分子"中的术语"基本上不发生细胞裂解"应被解释为不超过约50%、优选约40%、更优选约30%、更优选约20%、优选不超过约10%、更优选不超过约5%、进而更优选不超过约1%的细胞被裂解并且最优选没有细胞被裂解。
结合本发明而使用的术语"使包含内化的复合体的细胞裂解"包括本领域技术人员已知的任何裂解细胞的技术。对于哺乳动物细胞，优选由于三乙胺(triethylamin)的存在而导致的裂解。
如以上所列出的并换而言之，本发明通过提供使本领域技术人员可靠且有效地区分内化的复合体和未内化的复合体的方法从而解决了所述技术问题。通过基于融合蛋白的展示技术，通常只有通过应用以适当的缓冲液进行的相当严格的洗脱步骤(如通过使用pH梯度或盐梯度)从而也能排除高亲和力结合部分才能够实现内化的复合体和未内化的复合体的分离。会产生无法预测的细胞裂解事件，导致内化的复合体和未内化的复合体的混合，使得复杂化或者甚至阻碍了所有进一步的分析。本发明通过将非融合展示系统的优势(例如，温和的洗脱条件和不依赖结合部分与耙标之间的特异性亲和力)引入到内化复合体的领域中从而克服了上述情况。
在一个优选的实施方式中，本发明的方法进一步包括确定内化的复合体的耙标的序列的步骤。本领域技术人员知晓确定内化的复合体的靶标的序列的技术。优选的是，打算使用确定(多)肽靶标的氨基酸序列的技术。还可以参考下文中的实施方式。
在本发明的方法的另一优选实施方式中，所述展示为非融合的(多)肽的特征是噬菌体衣壳蛋白与结合部分之间的非肽键。
在本发明的方法的更优选实施方式中，所述非肽键为二硫键。
在本发明的最优选实施方式中，所述二硫键生成于所述噬菌体衣壳蛋白中所包含的第一半胱氨酸残基与所述结合部分中所包含的第二半胱氨酸残基之间。
在本发明的方法的另一个最优选实施方式中，所述洗脱未内化的编码结合部分的所述核酸分子是在使所述二硫键断裂的还原性条件下进行的。
这一实施方式和此前的实施方式涉及其中由二硫键负责连接的
情况。上述系统的细节公开于专利申请WO 01/05950，在此特将其内容以引用方式并入本文。
在本发明的方法的优选实施方式中，所述从裂解的细胞中回收编码结合部分的所述核酸分子通过PCR实现。在这一优选实施方式的情况中，可以使用例如能够扩增感兴趣的结合部分的PCR引物。以特定引物为基础通过聚合酶链式反应(PCR)来扩增核酸分子的技术是本领域技术人员公知的。
在本发明的方法的另一实施方式中，所述确定内化的复合体的靶标的序列的步骤通过质谱实现。
本领域技术人员知晓从裂解的细胞中回收核酸分子的技术和确定复合体中(多)肽的序列的技术。
本发明还涉及可通过本发明的方法而获得的靶标和/或结合部分。
最后，本发明涉及向细胞中输送有毒物质的方法，所述方法包括如下步骤:(a)获得由权利要求1所述的回收的核酸分子编码的(多)肽，
(b)将所述有毒物质与由权利要求1所述的回收的核酸编码的所述(多)
肽结合，和(c)对细胞施用从步骤(b)得到的有毒物质，从而触发所述
有毒物质向细胞内的内化。
如上所述并且换而言之，本发明能够被用于鉴定具有内化到细胞中的潜力的结合部分和/或靶标。优选的是，如以上所说明的，可以 将所述结合部分和/或靶标应用到例如杀灭患病细胞如癌细胞的方 面。然而应该注意的是，应该理解到无论怎样为本领域技术人员所熟 知并且基于能够内化到细胞中的结合部分和/或靶标的鉴定的任何应 用均被包含在本发明的范围内。
以下的实施例是用来阐释本发明而不应被理解为是对其的限制。
实施例
实施例1:
应用本发明的方法来鉴定内化靶标的实验程序 耙标和对照细胞的制备
1. 用5。/。FCSVPBSZ或如果细胞会固定就用PBS(见2,2.3)将靶标 细胞(经转染或抗原阳性)和对照细胞(经mock转染或抗原阴性)洗涤3 次。如果必须在所有缓冲液中添加Ca2+，应使用TBS或HBS(见第 1.3部分；在磷酸盐存在时钙沉淀为磷酸钙)。
1 FCS:胎牛血清，0.1 无菌过滤，经支原体检测。PAN BiotechGmbH, Aidenbach， # 3302-P971610。(或来自其它供应商的经支 原体检测的FCS)
2 PBS Dulbecco's:无l丐和镁以及无碳酸氢钠，Gibco BRL Life Technologies, # 14190-094。
2. 对靶标细胞计数并在2mL微离心管中调整为lmL的5% FCS/PBS中有5乂106个 1乂107个细胞以用于每次选择。
3. 在4"C的高架旋转器(over head rotator)上将所有后续步骤保持 在冰上的4'C的适当温度2小时以用于封闭(blocking)。
4. 将组合文库噬菌体的噬菌体滴度调整为1 ml的5% FCS/PBS (+补充剂)中有1 X 1013 2X 1013个噬菌体。在高架旋转器上于fC温 育2小时从而封闭噬菌体。
耙标细胞上的选择
5. 将经封闭的耙标细胞在2000 rpm离心2分钟并在0.5 ml l ml的预吸附噬菌体的溶液(pre-adsorbedphage-solution)中重悬。
6. 于4。C在摇床(rocker)上温育2小时。
li7. 将细胞在2000rpm离心2分钟。
8. 小心地吸出上清液并丢弃。
9. 第一次洗涤使用移液器将细胞沉淀小心地重悬在1 ml的5°/。 FCS/PBS (+补充剂)中。
10. 在4'C温育5分钟。
11. 将细胞在2000rpm离心2分钟。
12. 小心地吸出上清液并丢弃。
13. 第二次洗涤使用移液器将细胞沉淀小心地重悬在1 ml的 5°/。 FCS/PBS (+补充齐lJ)中。
14. 对于活细胞于4。C在摇床上温育5分钟，对于固定的细胞于 2(TC在摇床上温育5分钟。
15. 将细胞在2000rpm离心2分钟。
16. 小心地吸出上清液并丢弃。
17. 第三次洗涤使用移液器将细胞沉淀小心地重悬在1 ml的 5% FCS/PBS (+补充齐i」)中。将细胞转移到已经用5%FCS/PBS封闭的 新的无菌2ml管中3。
3该步骤有助于避免与选择用管非特异性结合的噬菌体的再次富
IS.对于活细胞于4。C在摇床上温育5分钟，对于固定的细胞于 2(TC在摇床上温育5分钟。
19. 将细胞在2000 rpm离心2分钟。
20. 小心地吸出上清液并丢弃。 噬菌体的内化
21. 使用移液器将细胞沉淀小心地重悬在1 ml的5% FCS/PBS (+
补充剂)中。
22. 将温度升高至37匸并温育30分钟。
未内化噬菌体的排除
23. 向细胞中加入300 pl pH8.0的处于10 mM Tris/HCl中的20 mMDTf并在RT (室温)温育10分钟5，在2000 rpm离心2分钟，
丢弃上清液。4 pH8.0的处于10 mM Tris/HCl中的20 mM DTT:应始终将该 DTT溶液储存于-2CTC。避免该溶液的多次冻融。
5替代DTT洗脱，这对于HuCALGOLD⑧文库是推荐的，也可以 使用常规洗脱方法(例如见Krebs等,2001)
24. 第四次洗涤使用移液器将细胞沉淀小心地重悬在1 ml的 5% FCS/PBS (+补充剂)中。
25. 于4。C温育5分钟。
26. 将细胞在2000rpm离心2分钟。
27. 小心地吸出上清液并丢弃。
28. 第五次洗涤使用移液器将细胞沉淀小心地重悬在1 ml的 5% FCS/PBS (+补充齐U)中。
29. 对于活细胞于4匸在摇床上温育5分钟，对于固定的细胞于 2(TC在摇床上温育5分钟。
30. 将细胞在2000 rpm离心2分钟。
31. 小心地吸出上清液并丢弃。 内化的噬菌体的回收
32. 加入500 (il的100 mM三乙胺(140 (il的TEA在10 ml PBS 中)并在RT温育10分钟(细胞将立即裂解)。加入400 ^ pH 7,0的1M Tris用于中和。中和后以pH指示剂棒(pH-indicator stick)检测pH。
33. 使用洗脱物来感染TG1 (DWCP)。
34. 以标准程序来将表达Fab的克隆体鉴定并表示。
实施例2:
检测抗原A、B和C在细胞上的流行性(prevalence)并检测Fab A、 B、 C的内化性质。 材料与方法 所测试的Fab:
-Fab_C_FH (溶菌酶结合物，阴性对照) -Fab—B_FS (ICAM结合物，未内化对照) -Fab—A—FH(抗原A，内化)-以1吗/ml来测试的Fab
细胞
-NCIH226:肺癌细胞 -lxl()5个细胞/测试
其它材料
-10%的皂苷将lg皂苷溶解于10ml的PBS中，0.5。/。皂苷/PBS， 储存于4°C
-4%PFA:将16%的储备溶液以1:4稀释在PBS中。储备溶液 16% (重量/体积)A〗phaAesar,LotE0S015
-FACS缓冲液(FB): PBS/3% FCS，储存于4°C
-羊抗人IgG (H+L)-PE, Jackson Dia丽a, 109-116掘,以1:200 稀释于FACS缓冲液(PBS/3。/。 FCS)中。
程序
1. 向处于FACS缓冲液中的2.5 X 106个NCI H226细胞的沉淀加 入100 (il Fab (1 )ig/ml)并在冰上温育1小时。使用200}il的FACS缓冲 液洗涤细胞2次，离心(2000rpm)并重悬于200^1培养基中。
2. 将100^1转移到96孔板并在4。C温育1小时，进而在冰上温 育10分钟。
3. 使用20(V1的FACS缓冲液洗漆2次细胞；200rpm。
4. 重悬于200jil的FACS缓冲液中，分为2X100nl并在1200rpm
离心2分钟。
对于未内化状况(4°。) 对于细胞外染色
5. 以lOOpl羊抗人IgG-PE重悬细胞并在4'C温育1小时，并以 200)^1的FACS缓冲液洗涤2次；200rpm。
6. 重悬于lOOpl的FACS缓冲液中。
7. 随后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yellow 420上进 行FACS的测定。
对于细胞内染色
8. 将来自步骤(4)的细胞重悬于100[il的4。/。PFA， 4°C 30分钟。
149. 以20(V1的FACS缓冲液洗涤细胞2次；2000rpm。
10. 将细胞重悬于0.5%的皂草素中，IO分钟RT。
11. 加入lOO(il抗人IgG-PE并于RT温育1小时。
12. 以0.5%皂草素洗涤细胞2次，200rpm。
13. 重悬于100pl的FACS缓冲液中。
14. 随后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yellow 420上进 行FACS的测定。
对于内化状况(37'C):
对于细胞外染色
15. 将来自步骤(4)的细胞用lOOjil羊抗人IgG-PE重悬并在37°C 温育1小时，并以200^d的FACS缓冲液洗涤2次；200rpm。
16. 重悬于100|il的FACS缓冲液中。
17. 随后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yellow 420上进 行FACS的测定。
对于细胞内染色
18. 将来自步骤(4)的细胞重悬于100jil的4°/。PFA， 4°C 30分钟。
19. 以200[il的FACS缓冲液洗涤细胞2次；2000rpm。
20. 将细胞重悬于0.5。/。的皂草素中，IO分钟RT。
21. 加入抗人IgG-PE并于RT温育1小时。
22. 以0.5%皂草素洗涤细胞2次，200rpm。
23. 重悬于lOOjil的FACS缓冲液中。
24. 随后在BD FACSARRAY FSC 50; SSC; 280; Yelow 420上进 行FACS的测定。
结果
如图1所示，80。/o的Fab耙标A被内化，相比之下只有20%的 Fab靶标B复合体被内化。内化过程、细胞透过性和染色不影响总的 噬菌体数目。
实施例3:
细胞外结合的噬菌体的经DTT切割的内化噬菌体的富集 材料与方法
15所测试的噬菌体
将编码Fab A、 B、 C的基因(见实施例l)亚克隆到Cys-Display 载体pMORPH23中并按照标准程序生产VCSM 13来源的噬菌体。 -噬菌体一FabC(溶菌酶结合物，阴性对照) -噬菌体-Fab—B_(ICAM结合物，未内化对照) -噬菌体—Fab-AJ抗原A，内化)
-各使用ixiow个噬菌体
剥离
-pH 8.0的处于10nM Tris/HCl中的20mM DTT， Roche目录号 1583786
抗体
-抗M13的mab: Amersham Biosciences, 27-9420-01 ， 1 mg/ml， 在FACS缓冲液FB (PBS/3% FCS)中稀释为1 |ig/ml
-羊抗鼠IgG Fc 7片段特异性PE， Jackson Dianova， 115-116-071 ， R14，以1:200稀释在FACS缓冲液(PBS/3。/。 FCS)中
细胞
-NCIH226:肺癌细胞 -1乂105个细胞/测试 其它材料
-10%的皂苷将1 g皂苷溶解于10ml的PBS中，0.5。/。皂苷/PBS -4%PFA:将16%的储备溶液以1:4稀释在PBS中。储备溶液 16% (重量/体积)AlphaAesar，LotE10S015 -FACS缓冲液(FB): PBS/3% FCS
-羊抗鼠IgG Fc y片段特异性PE, Jackson Dianova, 115-116-07， R14,以1:200稀释在FACS缓冲液(PBS/3。/。FCS)中 程序
1.向FACS缓冲液中的5X1()4个NCI H226细胞的沉淀加入1 Xl(T个噬菌体并在4'C温育1小时。使用400^1的FACS缓冲液洗 涤细胞2次，离心(2000 rpm)并重悬于600pl培养基中。
对于未内化状况(4'C):2. 将2xl00pl转移到96孔板中并于4'C温育1小时，进而在冰 上温育5分钟。
3. 以20(Hd的FACS缓冲液洗涤细胞2次；200rpm。
4. 重悬于200nl的FACS缓冲液，并在2000rpm离心2分钟
5. 将一个对照等分试样重悬于100pl的DDT中，另一个重悬于 50|al的DDT中。
6. 将细胞在冰上存放5分钟并以下述方式洗涤2次200^1的 FACS缓冲液和1200rpm。
7. 将细胞重悬于50|il的抗Ml3抗体(5吗/ml的FACS缓冲液)中。 S.将细胞在4"C温育45分钟。
9. 将细胞用200^1 FACS缓冲液洗涤2次。
10. 将细胞重悬于100^1的羊抗鼠IgG Fc Y片段特异性PE中 (1:100)。
11. 以200^1FACS缓冲液洗涤细胞2次。
12. 在BD FACSARRAY FSC 10; SSC335; Yellow 330上进行 FACS的测定。
对于内化状况(37'C):
13. 将2xl00W转移到96孔板中并于37X:温育1小时，进而在 冰上温育5分钟。
14. 以200[il的FACS缓冲液洗涤细胞2次；200rpm。
15. 重悬于200iil的FACS缓冲液中，并在2000rpm离心2分钟
16. 将一个对照等分试样重悬于100(il的DDT中，另一个重悬 于50(il的DDT中。
17. 将细胞在冰上存放5分钟并以下述方式洗涤2次200(^1的 FACS缓冲液和1200rpm。
18. 将细胞重悬于50)il的抗M13抗体(5pg/ml的FACS缓冲液)中。
19. 将细胞在4。C温育45分钟。
20. 将细胞用200|il FACS缓冲液洗涤2次。
21. 将细胞重悬于lOOpl的羊抗鼠IgG Fc y片段特异性PE中(1:100)。
22. 以200filFACS缓冲液洗涤细胞2次。
23. 在BD FACSARRAY FSC 10; SSC335; Yellow 330上进行 FACS的测定。
结果
在本实验的条件(具有/不具有DTT， 4匸或37'C)下，细胞保持完 好。如所预期的，未能检测到携带FabC的噬菌体的细胞结合。
如图2所示，当温度由4。C升高至37。C时，约65。/。的噬菌体A 和20%的噬菌体B被内化。
通过在4°C以20mM的DTT处理5分钟可以有效剥离细胞表面 上的噬菌体，且不影响细胞完整性。
内化时DTT的加入剥离了表面结合的噬菌体，同时使已内化的 噬菌体保持完好从而使得可以富集与内化靶标结合的噬菌体。
权利要求
1.一种回收内化到细胞中的复合体的编码结合部分的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤(a)使细胞与噬菌体颗粒的多样性集合接触，其中，每个或基本上所有的所述噬菌体颗粒均在其表面上展示结合部分，其中所述结合部分被展示为具有所述噬菌体颗粒的噬菌体衣壳蛋白的非融合的(多)肽并且其中每个或基本上所有的所述噬菌体颗粒均包含编码所展示的结合部分的核酸分子，(b)使所述噬菌体颗粒上展示的所述结合部分与其靶标结合，从而使得形成至少一种复合体，所述复合体中每一种均包含带有其所展示的结合部分的噬菌体颗粒和其靶标，(c)在能够使至少一种所述复合体内化到细胞中的条件下培养所述细胞，(d)在基本上不发生细胞裂解的条件下洗脱未内化的所述编码结合部分的核酸分子，(e)使包含内化复合体的所述细胞裂解，和(f)从裂解的细胞中回收源自至少一种的内化复合体的所述编码结合部分的核酸分子。
2. 如权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括确定所述内化复 合体的靶标的序列的步骤。
3. 如权利要求1所述的方法，其中，所述展示为非融合的(多)肽的 特征是所述噬菌体衣壳蛋白与所述结合部分之间的非肽键。
4. 如权利要求3所述的方法，其中，所述非肽键为二硫键。
5. 如权利要求4所述的方法，其中，所述二硫键生成于所述噬菌体 衣壳蛋白中所包含的第一半胱氨酸残基与所述结合部分中所包含的第二 半胱氨酸残基之间。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其中，所述洗脱未内化的所述编 码结合部分的核酸分子的步骤是在使所述二硫键断裂的还原性条件下进行的。
7. 如权利要求1 6中任一项所述的方法，其中，所述从裂解的细胞中回收所述编码结合部分的核酸分子通过PCR实现。
8. 如权利要求2所述的方法，其中，所述确定所述内化复合体的靶 标的序列的步骤通过质谱实现。
9. 能够通过权利要求1 8中任一项所述的方法而获得的靶标和/或 结合部分。
10. —种向细胞中输送有毒物质的方法，所述方法包括如下步骤(a) 获得由权利要求1所述的回收的核酸分子编码的(多)肽，(b) 将所述有毒物质与由权利要求1所述的回收的核酸编码的所述(多) 肽结合，和(c) 对细胞施用从步骤(b)得到的有毒物质，从而触发所述有毒物质向 细胞内的内化。
全文摘要
通过以下方式能够有效地鉴定内化到细胞内的靶标(和与其特异性结合的结合部分)将编码所述结合部分的遗传物质与编码结合到未内化的靶标的结合部分的遗传物质分离(或基本分离)。这能够通过采用结合部分的展示文库来实现，所述结合部分经由非融合蛋白的形式而具有基因型/表型关联，从而能够在不裂解所述细胞的情况下将编码未内化的靶标的遗传物质分离(或基本分离)。随后能够将内化的遗传物质分离并扩增。
文档编号C12N15/10GK101558156SQ200780045995
公开日2009年10月14日 申请日期2007年12月12日 优先权日2006年12月12日
发明者马库斯·恩岑贝格尔 申请人:莫佛塞斯公司